UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

CURSO : Alimentación y Nutrición Humana

TEMA : Determinación de la digestibilidad in vitro del almidón

PROFESOR : Aguilar Gálvez, Ana

ALUMNOS : Abensur Trigoso, Evelyn

Ratto Vergaray, Bruno Alejandro

2012

I. INTRODUCCION

La digestibilidad, es la propiedad por la cual, se disocia y luego asimila un alimento, teniendo en consideración la facilidad con la que es convertido en sustancias de menor peso molecular en el aparato digestivo, siendo estas más útiles y fáciles de asimilar para el organismo.

Los carbohidratos representan una gran proporción de los alimentos diarios que consume el ser humano, pues constituyen la fuente de energía más importante para la población mundial.

En el presente trabajo se determina la digestibilidad in vitro del almidón del pan blanco de molde. Esto con el fin de cuantificar la capacidad de absorción que se podría llegar a tener de este producto. Se utilizara enzimas amilasas para la disociación del almidón y para la cuantificación de las mismas se empleara el el método del ácido dinitrosalicílico (DNS). El grado de hidrólisis se expresa como el porcentaje de almidón hidrolizado por la enzima con relación al almidón total, en unidades internacionales de maltosa.

Así mismo debemos decir que la digestibilidad de nutrientes en el organismo humano, dependerá de muchos factores, que se relacionan con la propia salud de la persona.

El presente informe cumple los siguientes objetivos.

Conocer el método estándar para la hidrólisis de almidón con α – amilasa y su aplicación en productos alimenticios con el fin de conocer su grado de digestibilidad in vitro.

Determinar el grado de digestibilidad del almidón de muestras sometidas a cocción por tiempos diferentes.

II. MARCO TEORICO

2.1. Definición del almidón resistente

La fracción del almidón que escapa a la acción de las enzimas digestivas se denominó “almidón resistente” y fue definida como: “la suma del almidón y sus productos de degradación que no son absorbidos en el intestino delgado de individuos sanos. Esta definición surge de la concentración de diferentes grupos de trabajo de la Comunidad Europea, en un proyecto multinacional conocido como EURESTA, el cual en una forma organizada acometió el estudio del almidón resistente, abordando tema como el desarrollo de técnicas para su análisis, la producción tecnológica de almidón resistente, así como los efectos fisiológicos y la contribución energética de éste (Asp 1992, citado porMaría y Wenzel, 2006). Así mismo, surge también la elaboración de tablas para la clasificación del almidón de acuerdo a la velocidad y extensión de la hidrólisis por la amilasa pancreática, propuestas por Englystet al. (1992), estrategia que permitió establecer tres subtipos relevantes desde el punto de vista nutricional: ARD – almidón rápidamente digerible, ADL – almidón lentamente digerible y AR – almidón resistente.

2.2. Digestión de carbohidratos

La función que cumplen los carbohidratos en el metabolismo es la de un combustible que va a ser oxidado para suministrar energía para otros procesos metabólicos, a nivel celular y principalmente en forma de monosacáridos: glucosa (Muñoz 1990, citado por Tarazona, 1995). Los carbohidratos que incluye a los azúcares, almidón, celulosa, gomas y sustancias a fines no se encuentran como tales en los tejidos del cuerpo, donde sí encontramos glucosa y glucógeno como productos finales del metabolismo de os diversos carbohidratos.

Según Tarazona (1995), cuando el alimento (que contiene almidón) es masticado se mezcla con la saliva, que lo hidroliza en el disacárido maltosa y otros pequeños polímeros de glucosa y se mantiene en la boca sólo un corto tiempo, probablemente no más del 3 a 5 % de todos los almidones que son ingeridos se hidrolizan al momento en que pasan al esófago; esto porque los gránulos del almidón al estado natural tienen una membrana protectora muy fina hecha de celulosa, a menos que el alimento haya sido cocido a fin de destruir la membrana protectora.

Al salir del quimo del estómago hacia el duodeno, se mezcla con el jugo pancreático que contiene gran cantidad de α- amilasa hidrolizándose todo el almidón en maltosa y muy pocos pequeños polímeros de glucosa, los que al pasar por las secreciones intestinales de células epiteliales que secretan lactasa, sucrasa, maltasa y α-dextrinasa degradan los disacáridos y los pequeños polímeros de glucosa en sus monosacáridos constituyentes, los que son absorbidos inmediatamente en la circulación portal. En la dieta ordinaria que contiene mucho almidón que sucrosa o lactosa, la glucosa representa más del 80% de los productos finales de la digestión de los carbohidratos (Guyton 1986, citado por Tarazona, 1995).

La susceptibilidad a las enzimas digestivas entre almidones de diferentes fuentes es variable. Tsou y Hong (1989), citados por Tarazona (1995), dicen que almidones de raíces y tubérculos son generalmente más resistentes a la digestión, aunque la razón de este comportamiento aun no es muy clara.

El cocimiento con calor húmedo produce la gelatinización del almidón haciéndose más susceptible al ataque enzimático durante el metabolismo (Muñoz 1990, citado por Tarazona, 1995).

2.3. Rol nutricional del almidón “resistente”

En algún sentido el conocido rol de las dietas de almidón ha sido negativo. Se pensó que la diferencia entre el almidón y los azúcares simples recaía solamente en la relativa lenta digestión del primero (almidón). Esta hidrólisis lenta se manifiesta en los índices glicémicos cuando se determina glucosa en la sangre como respuesta de varios alimentos a base de carbohidratos, que generalmente (pero no siempre) producen valores de índice glicémico. Consecuentemente la hidrólisis del almidón varía de muy rápida a muy lenta. Esto puede indicar que la digestión intestinal de almidones pequeños pueda ser tan retardada que el almidón se pase al intestino grueso. Esta fracción se ha ganado el nombre de almidón “resistente” y los factores que lo controlan están dando una dirección completamente nueva a las investigaciones en la dieta de almidones complejos. Estos factores incluyen atributos físicos y químicos ya sea del almidón o del alimento completo tanto como las consecuencias fisiológicas de que el almidón entre en el intestino grueso (Annison y Topping 1994, citados por Tarazona, 1995).

Cuadro 2.1: Clasificación de los almidones resistentes

Tipo de almidón Ejemplo de ocurrenciaProbable digestión en el intestino delgado

Almidón digestible rápidamente

Alimento amiláceo recientemente cocinado.

Rápido

Almidón digestible lentamente

La mayor parte de cereales crudos.

Lento pero completo

Almidones resistentes:1) Almidones

indigestible físicamente

2) Gránulos de almidón resistente.

3) Almidón retrogradado

Granos y semillas parcialmente molidos.

Raíces, papas y banana.

Almidón frío, papa cocida, pan y hojuelas de maíz

Resistente

Resistente

Resistente

Fuente: Englystet al. 1992, reportados por Tarazona, 1995.

2.4. Factores de la digestibilidad

Entre los principales factores del almidón se tiene el tamaño de las partículas, que pueden afectar la digestión del mismo por las amilasas como un resultado de su área de superficie, debido a que las pequeñas partículas son digeridas más rápidamente que las grandes (Tarazona 1995).

Otro factor es el tamaño de los gránulos, porque cuanto menores el tamaño del gránulo mayor es la digestión in vitro por la α-amilasa bacteriana y amiloglucosidasa fúngica.

La digestión incompleta de carbohidratos en el intestino delgado puede resultar en una mala absorción de los carbohidratos simples, lo cual puede llevar a serios problemas de salud. La intolerancia a la lactosa es consecuencia de la falta de la disacaridasa apropiada. Los síntomas son los mismos que los de los otros azúcares pobremente absorbidos cuando se ingieren en cantidad: diarrea, dolores abdominales y entumecimiento. Estas reacciones resultan de la acumulación de los azúcares en el intestino grueso en cantidades muy grandes para la fermentación por la microflora lo cual conduce a una diarrea osmótica.

2.5. Método del DNS

Esta prueba se basa en la colorimetría. Su eficacia consiste en que los azucares reductores reaccionan con el 3.5 ácido dinitrosalicilico en una solución alcalina. La prueba positiva da un color rojo-marrón. La coloración se mide con un espectrofotómetro para mediciones cuantitativas. Esta prueba funciona para la glucosa, y otros azucares reductores. El manejo del DNS es complicado, cabe anotar que su preparación debe realizarse muy cuidadosamente, el color debe ser amarillo, al añadir distintas cantidades de fenol, se obtiene un color rojizo. (Garzón, 2003)

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Muestra alimenticia

Pan de molde blanco

3.2. Materiales

Material de vidrio: Erlenmeyer, pipetas, tubos de ensayo. Micropipeta de 20-200 μL y de 100-100 μL

3.3. Reactivos

α- amilasa SIGMA TIPO IA 1200U/mg (27 mg/mL). Diluir 56 μL de tampón fosfato (preparar 30 minutos previos al comienzo de la hidrolisis).

Tampón fosfato. Disolver en aproximadamente 700 mL de agua destilada 3.03g de KH2PO4, 3.96g de NaHPO4.2H2O y 0.40 g de NaCl. Llevar a pH 6.9 y aforar a 1000mL.

Solución de DNS. disolver 11g de NaOH, 10g de ácido dinitrosalicilico (DNS), 2g de fenol y 0.5g de bisulfito de sodio en agua destilada; enrasar en una fiola de 1000mL.

Sal de Rochelle. Preparar una solución al 40% (p/v) de tartrato de sodio y potasio en agua destilada.

Maltosa anhidra (solución estándar de 2mg/mL).

3.4. Equipos

Balanza analítica Baño maría con agitación Cocina Espectrofotómetro Vortex

3.5. Procedimiento experimental

Grafico 1: Diagrama de flujo para la determinación de la digestibilidad in vitro del almidón

Seguidamente se lee la curva de calibración de maltosa preparada según se indica en el cuadro 3.2.

Cuadro 3.1. Procedimiento de la batería de trabajo

Muestra DNS (mL) Muestra (μL) Agua (μL) Estándar (μL)BM 3.0 0.0 500 500

0 min 3.0 200 300 5005 min 3.0 200 800 0.015 min 3.0 200 800 0.030 min 3.0 20 800 0.060 min 3.0 200 800 0.0

BT 3.0 200 tampón 800 0.0

Cuadro 3.2. Curva estándar de maltosa

Maltosa (mg) Estándar (μL) Agua (μL) DNS (mL)0.0 0.0 1000 3.00.4 200 800 3.00.6 300 700 3.00.8 400 600 3.01.0 500 500 3.01.3 650 350 3.0

IV. RESULTADOS Y DISCUCIONES

Porcentaje de hidrólisis de almidónREPETICIONES PROMEDIO D.S. C.V.

Tiempo

(min)

M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3 M1 M2 M3

0 0.000

0.000

0.000 0.000

8.632

8.446 0.000

0.000

8.539

0.620

0.030

0.132

- - 0.015

5 1.917

5.533

5.025 1.871

0.918

0.986 3.725

3.448

0.952

2.557

2.231

0.048

0.687

0.647

0.051

15 3.002

9.511

6.566 8.253

1.735

5.476 6.257

7.409

3.605

4.603

1.193

2.646

0.736

0.161

0.734

30 2.134

7.052

9.793 3.044

1.667

3.231 4.593

6.419

2.449

3.478

4.772

1.106

0.757

0.743

0.452

60 2.857

7.942

16.102

2.971

6.225

10.238

5.399

9.537

8.231

3.596

9.285

2.838

0.666

0.974

0.345

Cuadro 4.1.- Porcentaje de hidrólisis del almidón de pan blanco de molde PyC durante 60 minutos de acción.

0 10 20 30 40 50 60 70

-2.000

-

2.000

4.000

6.000

8.000

10.000

12.000

Comparación del porcentaje de hidrólisis de almidón en las 3 mesas respecto al tiempo de

acción de enzima

M1M2M3

Tiempo (min)

% H

idró

lisis

Gráfico 2.- Comparación del porcentaje de hidrólisis promedio de almidón de pan de molde PyC durante 60 minutos de acción de las muestras analizadas por las mesas 1, 2 y3.

Al observar el gráfico 2 y el cuadro 4.1 podemos decir que los porcentajes de hidrólisis iniciales obtenidos por la mesa 3 son erróneos ya que el blanco reportado por este grupo hace variar los resultados, por lo tanto los datos obtenidos por esta mesa no se tomarán en cuenta ya que son ilógicos.

Al comparar los resultados obtenidos por la mesa 1 y la mesa 2, vemos que la mesa 2 obtiene datos mayores con respecto a la uno.

Entonces según lo anteriormente expuesto vemos que la máxima hidrólisis se da a los 15 minutos, luego comienza a descender, esto no coincide con lo encontrado en la literatura, ya que según Tejero (2012): la alfa amilasa se produce a partir de la bacteria Bacillus subtilis, y es muy resistente al calor por lo que a temperaturas de 70 a 90º C alcanza su máxima velocidad de reacción. Además actúa en el enlace α -1,4. Por lo que el porcentaje de hidrólisis debió aumentar a mayor temperatura, este error en el laboratorio puede deberse a que la fuente de calor no era buena y por esto no se llegó a la temperatura adecuada.

Según García (2009) la digestibilidad en pan blanco a los 30 minutos es de 3% ±1,12%, este valor es cercano al obtenido por la mesa 1 (4,603%). El mismo autor indica que a los 60 minutos la digestibilidad del almidón es de 10,08% ± 1,09%; Este valor es cercano al obtenido por la mesa 2 (9,285 %)

El mismo autor nos muestra el gráfico 3, en el cual se ve que el porcentaje de hidrólisis es creciente conforme avanza el tiempo en un pan blanco, esto se observó en la práctica pero solo hasta el minuto 15, donde se produce un descenso, por lo que los resultados obtenidos en el laboratorio no serían los correctos. Estos errores los demuestra el coeficiente de variabilidad ya que es muy variable para cada mesa y cada tiempo.

Gráfico 3. Porcentaje de hidrólisis versus tiempo en pan blanco

Fuente: García (2009)

Gráfico 4. Hidrólisis de almidón nativo

Fuente: Barrera et. al (2004).

En el gráfico 4, se presenta la hidrólisis enzimática progresiva de los diferentes almidones nativos, con α-amilasa a 37º C. A través de su acción hidrolítica se alcanzó el grado de hidrólisis de 16 % en trigo, por lo que una vez más se demuestra que los datos obtenidos en el laboratorio son errados.

Además según Taggart (2004) citado por FAO (2012) el trigo posee almidón con un contenido de 25% de amilosa y 75% de amilopectina, su temperatura de gelatinización es 58-64°C, es por esto que al final de realizar los tiempos de acción de la enzima se llevo al baño maría por 5 minutos con la finalidad de inactivar a la enzima y además gelatinizar el almidón.

Según Ortega, R; López, A; Requejo, A y Carvajales (sin año) en Info alimentación (2012) el pan molde posee 49.9% de carbohidratos.

V. CONCLUSIONES

El porcentaje de hidrólisis de almidón es mayor conforme mayor tiempo de hidrólisis ha transcurrido.

Los datos obtenidos en el laboratorio presentan errores, sin embargo se observó que la gráfica de hidrólisis es creciente a mayor tiempo.

A los sesenta minutos el porcentaje de hidrólisis de almidón en pan molde debe ser alrededor de los 10,08% ± 1,09%.

La enzima α amilasa hidroliza al almidón en amilosa y amilopectina escindiendo el enlace α- 1,4.

VI. CUESTIONARIO

VI.1. ¿Qué factores afectan la digestibilidad de los almidones?

El principal factor viene dado por la proporción entre amilasa/amilopectina y a la longitud de las cadenas de estos polímeros, ya que esta última tiene influencia sobre la formación de complejos con otras moléculas, o entre ellas mismas, favoreciendo la retrogradación, en cuya forma física los almidones son menos susceptibles al ataque enzimático.

La estructura del gránulo, por su parte, también influye en la digestibilidad, debido a que los gránulos de menor tamaño presentan una relación mayor entre la superficie y el volumen, por lo que el área expuesta para la hidrólisis se incrementa; de igual forma ocurre con el tamaño de la partícula del alimento que dependerá a su vez del tiempo y de la intensidad de la masticación.

La presencia en el alimento de otros componentes, como ciertos tipos de lípidos, puede dar lugar a la formación de complejos con los glucanos, traduciéndose esto en un descenso en la digestibilidad; un efecto similar puede atribuirse a las proteínas que a menudo rodean a los gránulos de almidón, lo cual se ha sugerido como explicación para el incremento de la digestibilidad in vitrodel almidón después de un tratamiento con proteasas (Tovar et al.1990ª, citado por María y Wenzel, 2006).

Algunos otros factores que pueden modular la digestibilidad son propios del individuo, y entre ellos se mencionan: el tiempo de tránsito intestinal, tiempo de masticación, estado de salud y cantidad de enzimas secretadas (Tharanathan&Mahadevamma 2003, citado por María y Wenzel, 2006)

VII. ¿Qué relación existe entre la digestibilidad in vitro del almidón y porcentaje de gelatinización?

La principal relación entre almidón en alimentos procesados y la gelatinización, es que estos pueden ser parcial o totalmente gelatinizado o retrogradados. Los almidones crudos son altamente resistentes a la hidrólisis enzimática comparada con los almidones gelatinizados. La hidrólisis del almidón de arvejas, maíz, trigo y papa es aumentada gradualmente por la gelatinización particularmente a bajos niveles de enzimas hidrolíticas (Tarazona, 1995). Esto debido a que se obtiene un acomodo molecular favorable para la interacción entre sustrato y encima.

VIII. BIBLIOGRAFIA

- BARRERA, V; TAPIA, C y MONTEROS, A. 2004. Raíces y tubérculos andinos: Alternativas para la conservación y uso sostenible en el Ecuador. Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agroprecuarias (INIAP).

- FAO, 2012. Capítulo 3: Productos Alimenticios. Visitado el 8 de setiembre del 2012. Disponible en: ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/010/a1028s/a1028s02.pdf

- GARCÍA, F. 2009. Estudio comparativo de la adición de almidón modificado en un pan tipo “muffin” horneado en microondas y convencionalmente. Tesis para obtener el grado de Magister en Ciencias Químico-biológicas. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. México. Visitado el 8 de setiembre del 2012. Disponible en: http://itzamna.bnct.ipn.mx:8080/dspace/bitstream/123456789/4405/1/ESTUDIOCOPARATIVO.pdf

- GARZÓN, S Y TÉLLEZ, R. 2003.Cuáles son los azucares que contienen los dulces "con azúcar" y “sin azúcar” y la diferencia entre estos dos. Disponible en: http://wwwprof.uniandes.edu.co/~infquimi/VI_feria/id70.htm. Visitado el 2 de Septiembre del 2012

- INFO ALIMENTACIÓN, 2012. Propiedades nutricionales del pan y otros productos de bollería. Visitado el 8 de setiembre del 2012. Disponible en: http://www.infoalimentacion.com/panaderia/propiedades_nutricionales_pan_y_produtos_bolleria.htm

- MARÍA, F. Y WENZEL, E. 2006. Carbohidratos en alimento regionales iberoamericanos (versión en línea). Sao Paulo: Editorial de la Universidad de Sao Paulo.Visitado el 2 de Septiembre del 2012 Disponible enhttp://books.google.com.pe/books?id=JfGTwqKTdRMC&pg=PA70&dq=digestibilidad+in+vitro+del+almid%C3%B3n&hl=es&ei=eEV5TvbaOIGDgAeA85DLAQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=1&ved=0CCoQ6AEwAA#v=onepage&q=digestibilidad%20in%20vitro%20del%20almid%C3%B3n&f=false

- TARAZONA, C.M. 1995. Características físico-químicas y nutricionales de los almidones de seis clones de camote (Ipomoea batatas L. Lam). Tesis presentada para optar por grado de Magister Scientiae. Lima – UNALM.

- TEJERO, f. 2012. Las enzimas en la panificación. Visitado el 8 de setiembre del 2012. Disponible en http://www.franciscotejero.com/tecnica/mejorantes/las%20encimas.htm