INFLAMACIÓN, ESTRÉS OXIDATIVO Y SISTEMA
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INFLAMACIÓN, ESTRÉS OXIDATIVO Y SISTEMA
INMUNE EN EL DESARROLLO DE DISFUNCIÓN
ENDOTELIAL ASOCIADA A ENFERMEDADES
INFLAMATORIAS CRÓNICAS
Tesi presentada per
Susana Martín Rodríguez
Per obtenir el títol de doctor/a per la Universitat de Barcelona
Dirigida per:
Dra. Maribel Diaz-Ricart
Dr. Ginés Escolar Albaladejo
Programa de doctorat Medicina
Universitat de Barcelona
“Not all those who wander are lost”.
J.R.R.Tolkien
AGRADECIMIENTOS
7
Esta tesis constituye para mí la constatación de que sí se puede llegar donde nunca
hubiéramos imaginado. Puedo decir que me siento orgullosa y afortunada por
haberme plantado un día y variar el rumbo de lo que parecía mi vida profesional con
una premisa muy clara: “Quiero investigar”. Y aunque no las tenía todas conmigo,
pues allá donde iba, difícil y raro parecía que una recién licenciada en Odontología se
sumergiera en el mundo de la investigación entre probetas (siempre discreparé sobre
ello), el gran apoyo que he tenido a lo largo de los años de toda las personas que me
han acompañado por el camino y el esfuerzo han sido las mejores armas para vencer
todos los obstáculos y conseguir llegar hasta aquí.
Sí, he de reconocer que no ha sido fácil. Han sido muchos días de remar
contracorriente, con una intensidad de trabajo que ha hecho que los días duplicaran
sus horas, de dedicar mi vida a ponerme al día con lo que no estaba familiarizada,
aunque eso implicara decir bye bye a los fines de semana, las cervecitas con los
amigos, o a ver la luz del sol, y renunciar a vivir un ratito, para poder mantenerme,
entre clínicas y ratones, en esta lucha. Pero esta página no es para narrar “una serie
de catastróficas desdichas de la doctoranda”, sino para darle protagonismo a las
personas que en todo momento han estado a mi lado en estos años. (Aunque si
tuviera que ser proporcional, necesitaría un libro, una colección tamaño Planeta de
Agostini, o quizá un monumento.)
En primer lugar, y no puede ser de otra manera, agradeceré eternamente a mis padres
el amor y la paciencia que han depositado en mí, que aunque no llegaran a entender
el porqué de mis locuras y aun tengan la ilusión de que sea yo su “dentista de
confianza”, siempre han estado a mi lado apoyándome. Sin ellos no hubiera sido
posible nada de esto. Gracias Papá y Mamá por todos los sacrificios que habéis hecho
porque tuviera un futuro. Gracias Belén por ser la mejor hermana siempre llena de
consejos. No encontraría la forma de devolvéroslo aunque sepa que bajo ningún
concepto me dejaríais hacerlo. Gracias de corazón.
Agradecida enormemente estaré siempre también a mi directora de Tesis, Maribel, por
apostar por mí cuando no tendría por qué haberlo hecho. Aún sin una sola evidencia
de que pudiera salir bien, te arriesgaste y me diste la oportunidad de poder entrar en el
laboratorio de Hemoterapia y Hemostasia del Hospital Clínic como una estudiante más.
Gracias por las horas invertidas en situarme en un mundo totalmente nuevo para mí,
tu paciencia, tus clases magistrales sobre el endotelio, por enseñarme a redactar
AGRADECIMIENTOS
8
artículos y a defender presentaciones, a mantener la calma en situaciones difíciles y
por buscar y rebuscar la manera de que pudiera continuar con mi trabajo siendo un
momento tan difícil para la ciencia. Agradecimiento especial a Ginés Escolar, mi co-
director, por las charlas científicas (y no científicas) que llenaban de experiencia el
laboratorio, por las infinitas revisiones de mis trabajos que siempre mejoraban tras
pasar por tu ojo crítico y, por qué no, por los chistes y anécdotas que hacían más
distendido un día de trabajo. Para mí ha sido un placer haber podido aprender de
vosotros. Formáis un gran equipo de investigadores que comparte con todos los que
pasamos por allí todos los años de experiencia y nos animan a seguir soñando.
Y, por supuesto, gracias a todas esos grandísimos profesionales y mejor personas que
forman el laboratorio. Gracias Irene por la infinita paciencia para enseñarme a hacer
Westerns, ELISAS, y lo que se nos pusiera por delante; por guiarme cuando me
perdía entre papers y cuadernos, por tu imborrable sonrisa y tu disposición. Gracias
Marc por enseñarme tu manejo maestro del ADAMTS13, tu apoyo musical, también
por prestarte cada viernes a traernos lo mejor de cada paradeta del mercat. Gracias
Alba porque desde el primer día te pusiste mano a mano conmigo delante de la cabina
de flujo hasta que aprendiera a domesticar células, por demostrar que más que una
compañera eres una amiga, y esperar pacientemente a ese café que tan difícil se nos
hace tomar (la loca de tu amiga que se mete en mil historias a la vez, ya te sabes la
historia). Gracias Patri La Mejor, porque eres única, eres el ejemplo de toda mujer
valiente, trabajadora y segura de sí misma, muchísimas gracias por haberme apoyado
tantísimo, por tu ayuda dentro y fuera de laboratorio, por esos consejos que no tienen
precio, fruto de esa psicología moderna made in L’Hospitalet. Gracias también a Marta,
porque aunque no coincidimos mucho, siempre has estado ahí para lo que se tercie,
eres la maga del defibrotide y la comunicación. A Quique por esos ratos de
conversación y música bien elegida, a Sergi por ser un magnífico alumno y amigo, y a
toda la gente que ha pasado por el laboratorio y he tenido la suerte de conocer.
Muchísimas gracias a Marcelina Parrizas, del CEK, por acogerme y enseñarme tanto
sobre RNA y epigenética, para mí ha sido una suerte poder aprender de una gran
investigadora como tu porque hiciste que me entusiasmara aún más la investigación,
¡y también de poder seguir compartiendo frikadas acompañadas de esa cerveza que
diluye todas las tensiones del día! (No todo va a ser investigar…)
AGRADECIMIENTOS
9
A todas las personas que durante esta aventura he conocido, ya fuera como
compañeros de piso o como compañeros de clase, y que con el tiempo se han
convertido compañeros de vida: gracias Irene por cada ratito que has invertido en
sacarme a que me diera el aire y la vida, gracias Carmen, María y Pepe por las horas
que disfrutamos hablando de ciencia y los momentos que hemos compartido y que
compartiremos. Gracias Adri, porque sin ti todo esto no hubiera sido posible, por
recordarme que existe vida más allá del trabajo, por mantenerte a mi lado en los
buenos y malos momentos, por tu absoluta paciencia y tu granito (o granote) de arena
para hacer posible que esta tesis y yo salgamos adelante.
En definitiva, gracias a todos, porque con vosotros esta experiencia se ha convertido
en el mejor experimento de mi vida.
Prometo solemnemente que es mi última tesis.
Prometido.
11
Índice
ÍNDICE
ÍNDICE
13
ABREVIATURAS ....................................................................................................... 15
CONTENIDO .............................................................................................................. 21
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 25
1.- EL ENDOTELIO ................................................................................................. 27
1.1.- DEFINICIÓN ................................................................................................ 27
1.2.- LA CÉLULA ENDOTELIAL .......................................................................... 28
1.3.- ENDOTELIO Y HEMOSTASIA .................................................................... 29
1.4.- ENDOTELIO E INFLAMACIÓN ................................................................... 32
1.5.- ENDOTELIO Y RESPUESTA INMUNE ....................................................... 36
2.- DISFUNCIÓN ENDOTELIAL Y COMPLICACIONES CARDIOVASCULARES . 39
2.1.- DISFUNCIÓN ENDOTELIAL EN LA INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA ... 40
2.2.- DISFUNCIÓN ENDOTELIAL EN EL LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO 46
3.- EVALUACIÓN DE LA FUNCIÓN Y DISFUNCIÓN ENDOTELIALES ................ 51
3.1.- MODELOS CELULARES ............................................................................ 51
3.2.- BIOMARCADORES DE DAÑO ENDOTELIAL ............................................. 52
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ........................................................................................ 55
RESULTADOS ........................................................................................................... 59
Martin-Rodriguez S, Caballo C, Gutierrez G, Vera M, Cruzado JM, Cases A, Escolar G,
Diaz-Ricart M. TLR4 and NALP3 inflammasome in the development of endothelial
dysfunction in uraemia. Eur J Clin Invest. 2015 Feb;45(2):160-9.
Martin-Rodriguez S, Reverter JC, Tàssies D, Espinosa G, Heras M, Pino M, Escolar G,
Diaz-Ricart M. Reduced ADAMTS13 activity is associated with thrombotic risk in
systemic lupus erythematosus. Lupus. 2015 Oct;24(11):1143-9.
DISCUSIÓN ................................................................................................................ 85
CONCLUSIONES ..................................................................................................... 103
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 107
ÍNDICE
15
Abreviaturas
ABREVIATURAS
17
ADAMTS13 Metaloproteinasa número 13 (“A disintegrin and
metalloproteinase with thrombospondin type 1 motif, member
13”)
AGE Productos finales de glucosilación avanzada (“Advanced
glycation end products”)
AKT Proteína quinasa B (“Protein kinase B”)
aPLs Anticuerpos antifosfolípidos (“Antiphospholipid antibodies”)
ASC Proteína adaptadora del inflamasoma NALP3 (“Apoptosis-
associated speck-like protein containing a caspase recruitment
domain”)
CE Célula endotelial
CEC Célula endotelial circulante
DAMPs Patrones moleculares asociados a peligro (“Danger associated
molecular patterns”)
FvW Factor de von Willebrand
FT Factor tisular
FT/VIIa Complejo factor tisular/ factor VIIa
GAGs Glucosaminoglucanos
GPIb Glicoproteína plaquetaria Ib
GPIIb/IIIa Glicoproteína plaquetaria IIb/IIIa
LDL Lipoproteínas de baja densidad (“Low density lipoprotein”)
HMGB1 Proteína “High mobility group box 1”
HMEC-1 Línea celular endotelial microvascular inmortalizada humana
(“Human microvascular endothelial cell-1”)
ABREVIATURAS
18
HUVEC Célula endotelial macrovascular primaria procedente de vena de
cordón umbilical humano (“Human umbilical vein endothelial
cell”)
ICAM-1 Molécula de adhesión endotelial (“Intercellular adhesion
molecule 1”)
IL Interleuquina
IL-1 Interleuquina 1
IL-6 Interleuquina 6
IRC Insuficiencia renal crónica
LES Lupus eritematoso sistémico
LPS Lipopolisacárido
NALP3 Inflamasoma NALP3 (“NACHT, LRR and PYD domains-
containing protein 3”)
NFκB Factor de transcripción nuclear kappa B (“Nuclear factor kappa
B”)
NO Óxido nítrico (“Nitric Oxide”)
NLR Receptores tipo NOD (“NOD-like receptors”)
PAI-1 Inhibidor del activador de plasminógeno-1 (“Plasminogen
activator inhibitor-1”)
PAMPs Patrones moleculares asociados a patógenos (“Pathogen
associated molecular patterns”)
PEC Progenitores endoteliales circulantes
PECAM-1 Molécula de adhesión endotelio-plaquetaria 1 (“Platelet-
endothelial cell adhesión molecule 1”)
PRR Receptores de reconocimiento de patrones (“Pattern recognition
receptor”)
PTT Púrpura trombocitopénica trombótica
ABREVIATURAS
19
ROS Especies reactivas de oxígeno (“Reactive oxygen species”)
SAF Síndrome antifosfolípido
SLAM Índice “Systemic lupus activity measure”
SLEDAI Índice de actividad lúpica “Systemic lupus erythematosus
disease activity Index”
SLICC-ACR Índice de daño orgánico “The Systemic Lupus International
Collaborating Clinics/ American College of Rheumatology
Damage”
TFG Tasa de filtración glomerular
TLRs Receptores tipo TOLL (“Toll-like receptors”)
TLR4 Receptor tipo TOLL 4 (“Toll-like receptor 4”)
TNF-RI Receptor soluble de tipo I del factor de necrosis tumoral
(“Tumor necrosis factor receptor 1”)
TNFα Factor de necrosis tumoral alfa (“Tumor necrosis factor alpha”)
TRR Terapia de reemplazo renal
TXNIP Proteína “Thioredoxin-interacting protein”
USRDS Sistema de registro de datos renales de Estados Unidos (“United
States renal data system”)
VCAM-1 Molécula de adhesión endotelial 1 (“Vascular cell adhesion
molecule 1”)
VE-Cadherina Cadherina de endotelio vascular (“Vascular endothelium-
cadherin type 2”)
VMF Vasodilatación mediada por flujo
21
Contenido
CONTENIDO
23
La enfermedad cardiovascular constituye una de las principales causas de muerte
en pacientes con enfermedades inflamatorias. Esta alta incidencia se asocia a un
proceso de aterosclerosis acelerada que no se relaciona exclusivamente con los
factores de riesgo cardiovascular tradicionales como son la edad, el tabaco, la
dislipidemia, la hipertensión arterial y la diabetes mellitus. El estado de inflamación
crónica parece jugar un papel determinante en el desarrollo de aterosclerosis
acelerada, pues el propio proceso inflamatorio provocaría una alteración de las
funciones normales del endotelio facilitando la aparición de disfunción endotelial,
condición previa y necesaria al desarrollo eventos cardiovasculares en estas
patologías. Estos hechos hacen evidente la necesidad de conocer los mecanismos
moleculares que se llevan a cabo en la activación y disfunción endotelial, así como
biomarcadores que permitan diagnosticar la enfermedad cardiovascular incluso antes
de que ésta se instaure. El hecho de que la disfunción endotelial pueda ser
diagnosticada prezcomente permitiría conocer aquellas situaciones que dañan el
endotelio y prevenir y/o orientar su tratamiento antes de que una lesión estructural
definitiva se haya establecido.
La hipótesis que esta tesis doctoral plantea es que las alteraciones de la función
endotelial en las patologías con un elevado componente inflamatorio tienen aspectos
coincidentes. Moléculas o anticuerpos circulantes en estas patologías pueden
constituir o generar señales de alarma (“danger associated molecular patterns,
DAMPs) que podrían ser reconocidas por el endotelio expuesto, generando una
respuesta posiblemente excesiva, con la liberación de marcadores de lesión endotelial
hacia la circulación. Los modelos celulares in vitro permitirán la caracterización de los
mecanismos moleculares precisos así como seleccionar y ensayar posibles
estrategias farmacológicas. Por otro lado, los biomarcadores de daño endotelial
identificados deben ser validados para su aplicación en el diagnóstico temprano de
estas complicaciones y su posible traslado a la práctica clínica.
Los resultados de esta tesis doctoral han permitido conocer, utilizando un modelo in
vitro de disfunción endotelial en la uremia, la participación de receptores del sistema
inmune innato en la aparición y desarrollo de la disfunción endotelial en la uremia,
participando en la propagación del estímulo infamatorio y la instauración de un estado
prooxidante. Los mecanismos descritos en los estudios incluidos en esta tesis pueden
constituir una diana preventiva y/o terapéutica para las complicaciones
cardiovasculares asociadas a patologías inflamatorias crónicas.
CONTENIDO
24
Por otra parte, los estudios incluidos han permitido conocer en mayor profundidad la
posible relación entre marcadores de disfunción endotelial y el riesgo cardiovascular
en patologías crónicas. Los resultados de esta tesis indican que en el lupus
eritematoso sistémico existe una deficiencia moderada de la proteína ADAMTS13
junto con niveles elevados de moléculas proinflamatorias, lo que evidencia un estado
protrombótico en esta patología. Los resultados demuestran además que esta
condición es constante y significativa en pacientes con enfermedad activa y/o que han
sufrido eventos protrombóticos, por lo que sugiere un aumento en el posible riesgo de
sufrir eventos cardiovasculares de tipo trombótico en episodios activos de la
enfermedad, en los que la inflamación excesiva y la disfunción endotelial parecen jugar
un rol relevante.
Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral constituyen un importante avance en el
conocimiento de la disfunción endotelial en enfermedades inflamatorias. Emerge a su
vez la posibilidad de que estos resultados puedan ser explorados en otras patologías
inflamatorias y cardiometabólicas, para mejorar el diagnóstico precoz de la disfunción
endotelial, la predicción y monitorización del riesgo trombótico asociado, así como el
desarrollo de estrategias preventivas en este tipo de patologías.
25
Introducción
INTRODUCCIÓN
27
1.- EL ENDOTELIO
1.1.- DEFINICIÓN
El endotelio vascular es un tejido formado por células endoteliales que reviste el
interior de los vasos sanguíneos y que constituye el órgano mayor del cuerpo, siendo
capaz de alcanzar una superficie de hasta 1.500 m2 y una masa de aproximadamente
entre 1 y 2 kg (Sumpio B. et al, 2002; Félétou M., 2011).
Durante mucho tiempo el endotelio se consideró una simple barrera física que
contenía la sangre y la separaba de los demás tejidos, con el mantenimiento de la
permeabilidad de la pared del vaso como única función esencial. No fue hasta el siglo
XIX cuando el endotelio pasó de ser definido como una membrana inerte a un órgano
permeable con capacidad secretora (Cines DB. et al, 1998). Actualmente se conoce
que el endotelio es un sistema dinámico, heterogéneo, con múltiples funciones entre
las que destacan la circulación del torrente sanguíneo, la regulación de la
permeabilidad y difusión de células, moléculas y líquidos hacia los tejidos, la
modulación del tono vascular y la fluidez de la sangre. Además, tiene capacidad
sintética y metabólica, participa en la regeneración, angiogénesis y vasculogénesis, e
incluso contribuye en mecanismos de defensa como el proceso inflamatorio y la
respuesta inmune (Cines DB. et al, 1998; Rajendran P. et al, 2013).
Debido a su localización particular y gracias a la gran especialización de las células
endoteliales que lo forman, el endotelio es capaz de captar señales químicas,
mecánicas e inmunológicas y actuar en respuesta, por lo que tiene un papel funcional
relevante en salud y enfermedad (Hunt BJ., 1998).
En condiciones normales el endotelio es responsable de mantener una superficie
antitrombótica, facilitando las funciones de circulación y tránsito a lo largo del vaso.
Cuando es perturbado por fuerzas físicas o determinados factores químicos, el
endotelio pasa a un estado protrombótico.
En condiciones fisiológicas existe un equilibrio dinámico que permite al endotelio
volver a su estado fisiológico. Sin embargo, esta capacidad de adaptación puede
verse afectada ante determinados estímulos en función de su duración e intensidad,
llegando a producirse alteraciones morfológicas y funcionales permanentes,
desembocando en un estado patológico denominado disfunción endotelial.
INTRODUCCIÓN
28
1.2.- LA CÉLULA ENDOTELIAL
La célula endotelial (CE) es, como definición general, la unidad celular que compone
el endotelio vascular. Se caracteriza por una morfología poliédrica aplanada y una
longitud de aproximadamente 50 µm de largo, 10 µm de ancho y 0.2 µm de alto. Está
conformada por un núcleo aplanado, filamentos contráctiles, pocas mitocondrias,
retículo endoplasmático liso y rugoso y gran cantidad de vesículas pinocíticas y
endocíticas (Jaffe EA. et al, 1973). La CE se dispone de manera que permite sintetizar
y secretar proteínas y mediadores químicos tanto hacia la luz vascular como hacia la
matriz extracelular, la cual es generada por ella misma y que recibe el nombre de
subendotelio. El subendotelio es una superficie con características trombogénicas
que participa, junto con la propia CE, en la hemostasia, favoreciendo la adhesión
plaquetaria y la activación del sistema de coagulación.
Figura 1. A) Micrografía de tinción con hematoxilina y eosina de células endoteliales
macrovasculares primarias procedentes de vena de cordón umbilical humano
(HUVEC) en cultivo. B) Micrografía de inmunofluorescencia (VE-Cadherina) de
células endoteliales microvasculares inmortalizadas humanas (HMEC-1) que
muestra la continuidad de células endoteliales microvasculares en cultivo.
(Micrografías tomadas por Susana Martín-Rodríguez)
Las células endoteliales se organizan orientadas longitudinalmente a la dirección del
flujo sanguíneo, disponiéndose en una monocapa continua gracias a uniones
adherentes formadas por proteínas de adhesión de tipo cadherina, las cuales son
responsables del contacto célula-célula y del mantenimiento estructural del propio
endotelio. Sin embargo, no todas las células endoteliales se comportan e interaccionan
de la misma manera, ya que esto está condicionado por el lugar y la función que
INTRODUCCIÓN
29
deban desempeñar. Esta situación de heterogeneidad suma complejidad al estudio y
caracterización del endotelio (Aird WC., 2007; Dejana E., 1996).
Las células endoteliales son capaces de detectar cambios a su alrededor, que pueden
ser de origen tanto físico como bioquímico, de adaptarse y de generar una respuesta
funcional en consecuencia. La facultad de actuar como “sensor” es debida a la
presencia de receptores en la superficie celular, quienes se encargan de captar
estímulos de diferente índole, incluyendo proteínas, hormonas, metabolitos y
moléculas derivadas o asociadas a otras especies celulares. Una vez detectado el
estímulo se activan mecanismos intracelulares que permitirán a las células
endoteliales efectuar las funciones, dotando al endotelio de esa gran variabilidad de
reacciones biológicas en situaciones fisiológicas y patológicas (Hunt BJ., 1998).
1.3.- ENDOTELIO Y HEMOSTASIA
En condiciones fisiológicas, las plaquetas generalmente no interactúan con el
endotelio sano ya que este posee una superficie antitrombótica que impide la adhesión
a la superficie celular endotelial debido a la presencia de moléculas que imposibilitan
la activación endotelial y plaquetaria, como la trombomodulina, así como la puesta en
marcha de la cascada de la coagulación, como el inhibidor de la vía del factor tisular
(FT). Por otra parte, el subendotelio actúa como segunda barrera de contención de la
sangre. Sin embargo, y aunque se conoce que la matriz luminal contiene moléculas de
tipo antitrombogénico, como el heparán sulfato y los glucosaminoglucanos (GAGs), el
subendotelio tiene carácter predominantemente trombogénico (Cines DB. et al, 1998).
Cuando se produce una lesión en el endotelio, la barrera se rompe y la sangre entra
en contacto con el subendotelio; se desencadenan fenómenos de control de la
hemorragia y posterior reparación del daño tisular. Este proceso, denominado
hemostasia, comienza con un cambio del estado antitrombótico a protrombótico de la
CE y la exposición del subendotelio subyacente, de modo que las plaquetas
circulantes comienzan a interaccionar con los componentes proadhesivos del
subendotelio, hecho que conlleva a la adhesión plaquetaria y la activación de la vía de
la coagulación. Esta respuesta fisiológica promueve la formación de fibrina hasta
desarrollar un coágulo estable de fibrina, último responsable de detener la hemorragia.
INTRODUCCIÓN
30
Figura 2. Endotelio y hemostasia: fases de la interacción entre plaquetas y el
subendotelio para la formación del agregado plaquetario.
Inmediatamente después de la disrupción de la superficie endotelial, las plaquetas
contactan y se adhieren al subendotelio gracias a las interacciones de la glicoproteína
plaquetaria Ib (GPIb) con el factor de Von Willebrand (FvW) anclado en el
subendotelio. Está interacción plaqueta-subendotelio será estabilizada mediante otras
proteínas del subendotelio como colágeno, fibrinógeno, fibronectina y trombospondina.
El FvW es una proteína multimérica sintetizada por la propia CE, almacenada en
gránulos dentro de las células endoteliales (cuerpos de Weibel Palade) y las plaquetas,
y secretada esencialmente hacia el plasma y el subendotelio (Jaffe EA. et al, 1974).
Esta proteína es, junto con la trombina y el factor tisular, la encargada de la activación
de las plaquetas. El FvW induce cambios conformacionales y mecanismos
intracelulares que resultan la activación de integrinas plaquetarias de tipo GPIIb/IIIa.
Una vez activadas, las plaquetas se agregarán entre sí, gracias a la unión entre FvW y
el fibrinógeno plasmáticos con el receptor plaquetario GPIIb/IIIa, permitiendo la
expansión del trombo y posterior formación del tapón plaquetario (Peyvandi F., 2011).
La unión de la trombina provoca cambios en la expresión de moléculas protrombóticas
y antitrombóticas sobre la CE, incluyendo el FT. El FT induce el proceso de la
coagulación al unirse al factor VIIa formando el complejo FT/VIIa que activa al factor X
y IX (Zilmann A. et al, 2001). La generación de trombina permite la conversión de
fibrinógeno en fibrina, la cual formará una red alrededor del trombo que servirá para
estabilizar el coágulo y detener la salida de sangre del vaso sanguíneo (Stern D. et al,
1985).
GPIb
CONTACTO
GPIa-IIa
GPIV
GPVI
GPIIb-IIIaFT
VWF
GPIIb-IIIa
ADHESIÓN AGREGACIÓN/ LIBERACIÓN
FACTOR VON WILLEBRAND Colágeno
INTRODUCCIÓN
31
Una vez contenida la hemorragia es necesario restituir las condiciones iniciales del
vaso por lo que ha de activarse un proceso de degradación del coágulo que tiene por
nombre fibrinolisis.
El factor de von Willebrand es, por tanto, uno de los principales factores que
garantizan el correcto desarrollo de la hemostasia primaria (Peyvandi F., 2011). El
FvW es una una glicoproteína multimérica sintetizada principalmente por las células
endoteliales y megacariocitos (Jaffe EA. et al, 1974; Sporn LA. et al, 1985). La función
normal de FvW dependerá de su tamaño multimérico, el cual es fisiológicamente
regulado por la metaloproteinasa ADAMTS13 (del inglés “A disintegrin and
metaloproteinase type trombospondin 1 motif, member 13”). Esta proteasa es
sintetizada por las células estrelladas hepáticas humanas y células vasculares
endoteliales (Xiang Y., 2011; Crawley JT., 2011). Actúa escindiendo por proteólisis los
multímeros de FvW ultragrandes en el dominio A2, generando multímeros globulares
de menor longitud cuya presencia es habitual en el torrente sanguíneo. Cuando existe
un déficit de actividad proteolítica el FvW queda anclando en la superficie de las
células endoteliales desplegándose estos multímeros ultragrandes que, al ser más
propensos a unirse a las plaquetas, provocan una agregación plaquetaria
descontrolada que conllevará a la formación de trombos patológicos. (Moake JL. et al,
1986)
Figura 3. Mecanismo de escisión de multímeros de FvW ultragrandes por
ADAMTS13. Deficiencias en la actividad ADAMTS13 provocan la formación de
trombos plaquetarios que pueden obstruir la microvasculatura. (Figura adaptada de
Sadler JE., 2008)
Flujo sanguíneo
TTP
ADAMTS13
ADAMTS13
INTRODUCCIÓN
32
El defecto grave de ADAMTS13 (<5-10% de la actividad de ADAMTS13) se considera
la causa de la púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), un síndrome
caracterizado por trombocitopenia, anemia hemolítica y eventos trombóticos en la
microvasculatura que da lugar a daño de los órganos afectados, siendo la insuficiencia
renal y los síntomas neurológicos las características clínicas más comunes (Bedi N.,
2008; George JN., 2006). La deficiencia absoluta de actividad de ADAMTS13 puede
estar causada por mutaciones en el gen de ADAMTS13 (Síndrome de Upshaw-
Schulman) (Levy GG. et al, 2001) o por el desarrollo de autoanticuerpos contra la
proteasa (PTT adquirida) (Tsai HM. et al, 2001). Sin embargo, recientemente se ha
demostrado que la actividad de ADAMTS13 también puede encontrarse reducida en
otras condiciones patológicas como la sepsis (Kremer Hovinga JA. et al, 2007), la
cirrosis (Matsuyama T. et al, 2007), el cáncer (Blot E. et al, 2002), trastornos
autoinmunes y en otras condiciones clínicas tales como el trasplante de órganos o
asociada a la administración de fármacos específicos (Mannucci PM. et al, 2001; Zhou
Z. et al, 2010). Esta deficiencia, aún siendo moderada, también podría contribuir a
aumentar el riesgo de trombosis en enfermedades cuya característica común es el
desarrollo de un estado inflamatorio multisistémico (Franchini M. et al, 2007; Ardoin SP.
et al, 2008)
1.4.- ENDOTELIO E INFLAMACIÓN
Las células endoteliales juegan un papel crítico en el proceso inflamatorio tanto a nivel
local como sistémico, participando íntegramente en la respuesta a la lesión tisular
producida por agentes físicos, químicos y/o biológicos.
El endotelio vascular es capaz de activarse como consecuencia del reconocimiento de
moléculas liberadas por una lesión próxima, como las citoquinas proinflamatorias y
aminas vasoactivas. Por una parte, ello conlleva un aumento de la permeabilidad
endotelial y, por otra, la propia CE es capaz de cambiar sus propiedades adhesivas
sintetizando mediadores proinflamatorios como citoquinas y moléculas de adhesión, lo
que permitirá la adherencia y migración de leucocitos y neutrófilos hacia el tejido
subyacente dañado, proceso denominado diapédesis (Cines DB. et al, 1998).
INTRODUCCIÓN
33
Figura 4. Fases de la interacción endotelio-leucocito en la respuesta inflamatoria
1.4.1.- MOLÉCULAS DE ADHESIÓN
Las moléculas de adhesión son proteínas de superficie celular de tipo glicoproteína
que participan en la interacción célula-célula, bien entre células idénticas (interacción
homotípica), entre células diferentes o entre célula y matriz extracelular (interacción
heterotípica) (Barreiro O. et al, 2004). Las CE son capaces de sintetizar y secretar
estas moléculas de adhesión tanto hacia la matriz extracelular como al torrente
circulatorio en forma de molécula soluble. Los principales grupos de moléculas son: las
selectinas, la familia de las integrinas, la superfamilia de las inmunoglobulinas y las
cadherinas (Lorenzet R. et al, 1998).
Selectinas
La familia de las selectinas se compone principalmente de tres tipos, cuya
nomenclatura hace referencia a la célula donde fueron halladas: L-Selectina
(leucocitos), P-Selectina (plaquetas) y E-selectina (endotelio) (Bevilacqua MP. et al,
1993). Sin embargo, se conoce que el endotelio activado es capaz de expresar tanto
E-Selectina como P-Selectina (Barreiro O. et al, 2004). Las selectinas son moléculas
receptoras transmembrana de tipo glicoproteína que, al interaccionar con hidratos de
carbono y secuencias peptídicas en presencia de calcio, median, en una primera
etapa, la adhesión de los leucocitos al endotelio. Esta adherencia débil de los
leucocitos circulantes hace que se enlentezca su movimiento, lo que permite un mayor
INTRODUCCIÓN
34
contacto con la CE activada (Rolling) y favorece su completa adhesión (Miyasaka M. et
al, 1997).
Integrinas
Se trata de un grupo de receptores transmembrana glicoproteicos, compuestos por
dos subunidades (alfa y beta). Aunque poseen baja afinidad por sus ligandos, son
capaces de modular rápida y reversiblemente su adhesividad, facilitando la unión entre
células o entre células y matriz extracelular (Springer TA. et al, 2004).
Existen diversas subfamilias: la subfamilia beta1, expresada en diversos tipos
celulares incluyendo la CE, media la adhesión celular al fibrinógeno, colágeno y
laminina de la matriz extracelular; la subfamilia beta2 o integrinas leucocitarias, de
expresión limitada a leucocitos, actúan como ligandos de moléculas de la familia de las
inmunoglobulinas del endotelio activado, permitiendo la adhesión y la infiltración de
leucocitos al endotelio (Vestweber D., 2015); y la subfamilia beta3 o citoadhesinas,
entre las que encontramos ligandos del FvW de origen endotelial, que participan en la
agregación plaquetaria (Woodside DG. et al, 2001).
Superfamilia de las inmunoglobulinas
Estas moléculas se denominan superfamilia de las inmunoglobulinas ya que tienen
una o más regiones estructurales similares a las de los anticuerpos. Dentro de la
superfamilia, con gran variabiliad funcional, encontramos moléculas necesarias para la
adherencia celular entre leucocitos y células endoteliales. Éstas se clasifican en tres
subgrupos: ICAM (“intercellular adhesion molecule”), VCAM (“vascular cell adhesion
molecule”) y PECAM (“platelet-endothelial cell adhesion molecule”).
VCAM-1 se expresa en las células endoteliales activadas por mediadores de la
inflamación y su interacción con integrinas constituye un segundo mecanismo
de adhesión al endotelio y extravasación de los linfocitos (Matheny HE. et al,
2001).
ICAM-1 facilita el paso de leucocitos del espacio vascular a través de los tejidos
mediante su unión con la integrina beta2. Los niveles de expresión de estas
moléculas se pueden aumentar y regular por varias citoquinas (Campbell JJ. et
al, Science 1998)
PECAM-1 regula la migración de los leucocitos a través del endotelio (Muller
WA., 1995).
INTRODUCCIÓN
35
Cadherinas
Las cadherinas son glicoproteínas responsables de la adherencia entre células del
mismo tipo mediante interacciones dependientes de calcio (Ca2+) y de mantener la
integridad de las uniones intercelulares. En el endotelio, la VE-cadherina (“vascular
endothelium-cadherin type 2”) controla la permeabilidad y también participa en la
migración celular (Gavard J., 2013).
1.4.2.- CITOQUINAS PROINFLAMATORIAS
Las citoquinas son un grupo de proteínas de bajo peso molecular (normalmente entre
15 y 30 kDa), que actúan como mensajeros intercelulares en la respuesta
inflamatoria. Las citoquinas son producidas principalmente por el sistema inmune,
pero también por otros tipos celulares, entre los que se incluye la CE. En general no
se detecta una producción constitutiva de estas moléculas, siendo necesaria la
activación celular para que se produzcan citoquinas en cantidades suficientes para
ejercer sus efectos biológicos. La mayoría de las citoquinas son entonces secretadas
al espacio extracelular donde se unen a receptores específicos de la membrana de las
células diana, iniciando una cascada de transducción de señales intracelulares y
generando una determinada respuesta biológica. Tienen la capacidad de ejercer
efectos autocrinos, paracrinos y endocrinos (Olson TS. et al, 2002; Luster AD., 1998).
Figura 5. Acciones de las citoquinas sobre el endotelio y liberación de citoquinas
proinflamatorias por la CE activada: capacidad autocrina, paracrina y endocrina de
las citoquinas.
INTRODUCCIÓN
36
Es importante destacar que, cuando es activada por citoquinas proinflamatorias, la CE
libera a su vez otras citoquinas promoviendo un efecto de potenciación de la respuesta
inflamatoria. Las principales citoquinas proinflamatorias son el factor de necrosis
tumoral α (TNFα), y las interleuquinas (IL) 1 y 6, que promueven la expresión de
moléculas adhesivas de superficie, como ICAM y selectinas, así como la síntesis de
citoquinas proinflamatorias y mediadores solubles (Brouckaert P. et al, 1993). Las IL
se consideran las moléculas que interconectan la inflamación y la inmunidad innata.
1.5.- ENDOTELIO Y RESPUESTA INMUNE
El sistema inmune innato se ha descrito clásicamente como la primera línea de
defensa del organismo contra la infección y organismos patógenos, actuando de
manera inmediata e inespecífica. Durante el siglo XX surgieron diversas teorías para
intentar explicar cómo se producía la respuesta inmune y su relación con la
inflamación. Basándose en la hipótesis inicial de que el sistema inmune es el
encargado de discriminar lo “propio” de lo “no propio”, Charles Janeway en 1989
propuso la existencia de receptores a los que denominó “receptores de
reconocimiento de patrones” (del inglés “pattern recognition receptor” PRR),
capaces de reconocer de manera específica patrones moleculares procedentes de
productos microbianos y agentes infecciosos, que recibieron el nombre de “patrones
moleculares asociados a patógenos” (“pathogen associated molecular patterns”,
PAMP), permitiendo diferenciar lo propio no infeccioso de lo no propio infeccioso
(Janeway CA Jr. et al, 2002). Sin embargo, esta explicación no podía aplicarse en
situaciones de respuesta inmune de tipo no infeccioso, tales como el rechazo post-
transplante o las enfermedades autoinmunes.
En 1994 se propuso que no era únicamente el papel de los PAMPs, sino también de
“señales de peligro” procedentes de células o tejidos que estaban siendo lesionados
sin importar su naturaleza (“danger associated molecular patterns”, DAMP)
(Matzinger P., 1994). El término DAMP engloba moléculas de distinta naturaleza:
productos de degradación, moléculas liberadas por una célula o tejido dañado, o
procedentes de la matriz extracelular, toxinas, etc. Por lo tanto, los PRR serían
capaces de reconocer señales tanto exógenas como endógenas de peligro, poniendo
en marcha el sistema inmune y generando una respuesta inflamatoria (Rubartelli A. et
al, 2007). La familia de receptores toll-like (TLR) son los receptores de membrana
mejor caracterizados. Se trata de un conjunto de receptores transmembrana que
INTRODUCCIÓN
37
fueron descritos en células del sistema inmune, como monocitos, linfocitos y células
dendríticas. Pero en la actualidad han sido descritos en otros tipos celulares, entre los
que destaca la CE (Kawai T. et al, 2010).
En este contexto, recibe especial atención la subfamilia de TLR4. La activación de
este receptor fue asociada inicialmente a la presencia extracelular del lipopolisacárido
(LPS) bacteriano. Actualmente se conoce que una amplia variedad de ligandos
exógenos y endógenos, como “heat shock proteins”, “high mobility group box 1”
(HMGB1) y ácido úrico, pueden incrementar la expresión de TLR4, lo que a su vez
provoca la activación de vías de señalización relacionadas con el factor de
transcripción “nuclear factor kappa B” (NFκB), encargado de controlar la expresión
de múltiples genes proinflamatorios. Este proceso da como resultado el desarrollo de
la respuesta inmunoinflamatoria mediante la liberación de diferentes citoquinas
(Anderson KV., 2000). Por otro lado, la unión de los ligandos a los TLRs también
puede estimular fenómenos como la fagocitosis y la producción de especies reactivas
del oxígeno (ROS), amplificando la respuesta inflamatoria (Kawai T. et al, 2007).
Otros de los PRR más conocidos son los inflamasomas. Se trata de complejos
multiproteicos citoplasmáticos capaces de reconocer productos exógenos y
endógenos. Existen diferentes tipos, entre los que encontramos los inflamasomas NLR
(del inglés “NOD-like receptors”). De ellos, el inflamasoma mejor caracterizado es el
inflamasoma NALP3 (NATCH, LRR and pyrin domain containing protein), encargado
de promover la respuesta inflamatoria mediante la liberación de citoquinas
proinflamatorias IL-1β. Estas citoquinas son liberadas en forma inactiva en el
citoplasma celular tras un primer estímulo inflamatorio y necesitan ser
proteolíticamente activadas. La recepción del estímulo por el inflamasoma NALP3
provoca cambios conformacionales en los que la proteína adaptadora ASC
(“apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain”) es
imprescindible para el ensamblaje multiproteico, ya que ASC interacciona con NALP3
promoviendo el reclutamiento y la activación de otra proteína denominada caspasa-1.
Caspasa-1 es la encargada de la conversión de pro-IL1β en IL-1β funcionalmente
activa, iniciando la respuesta inflamatoria (Strowig T. et al, 2012; Martinon F. et al,
2005).
Aunque apenas se conoce el mecanismo por el cual se activa el inflamasoma NALP3,
recientemente se ha postulado que uno de los principales inductores del inflamasoma
INTRODUCCIÓN
38
NALP3 es la producción de ROS, gracias a su interacción con la proteína TXNIP
(“thioredoxin-interacting protein”) (Zhou R. et al, 2010).
Figura 6. Esquema de los mecanismos moleculares implicados en la recepción y
propagación del estímulo inmunoinflamatorio: receptores TLR4 e inflamasoma
NALP3. (Figura adaptada de Zaki MH. et al, 2011)
Descubrimos cada vez más funciones de la CE, lejos ya de conformar una simple
barrera física. Recientemente se ha reconocido que participa activamente en la
respuesta inmune, debido a su gran capacidad de reclutamiento de células
inflamatorias, y contribuye a su vez a la instauración y progresión del infiltrado
inflamatorio. El descubrimiento de la presencia y activación del receptor TLR4 en la CE
abre una nueva vía de investigación en la encrucijada entre inmunidad innata e
inflamación, en la que el TLR4 podría tener un papel clave en la respuesta
inmunoinflamatoria, tanto fisiológico como patológica y, por tanto, en aquellas
patologías inflamatorias del endotelio: la disfunción endotelial y la aterosclerosis.
ASC
DAMPSPAMPS
TLR4
IkB
pIkB
NFkB
NFkBPro- IL-1β IL-1β
INFLAMASOMA NALP3
Caspasa 1
DAMPSROS
Respuesta inflamatoria
Respuesta inmune
Membrana plasmática
Núcleo
INTRODUCCIÓN
39
2.- DISFUNCIÓN ENDOTELIAL Y COMPLICACIONES CARDIOVASCULARES
La enfermedad cardiovascular constituye una de las principales causas de muerte
en pacientes con enfermedades inflamatorias. Esta alta incidencia se asocia a un
proceso de aterosclerosis acelerada que no se relaciona exclusivamente con los
factores de riesgo cardiovascular tradicionales como son la edad, el tabaco, la
dislipidemia, la hipertensión arterial y la diabetes mellitus (Kullo IJ. et al, 2000; Martin-
Martinez MA. et al, 2014). El estado de inflamación crónica parece jugar un papel
determinante en el desarrollo de aterosclerosis acelerada (Mansell H. et al, 2013), ya
que el propio proceso inflamatorio provocaría una alteración de las funciones normales
del endotelio facilitando así la aterogénesis y la trombosis (Hansson GK., 2005;
Schnabel RB., 2013). En respuesta a un estímulo inflamatorio, la CE cambia desde un
fenotipo quiescente (anticoagulante, antiadhesivo, vasodilatador) a uno activado
(procoagulante, proadhesivo, vasoconstrictor). Cuando el estímulo es permanente en
el tiempo el endotelio pierde la capacidad adaptativa y se producen cambios
estructurales y funcionales de carácter patológico e irreversible, instaurándose así la
disfunción endotelial (Rajendran P. et al, 2013).
Figura 7. Fisiología y patología del endotelio: cambio de fenotipo en la disfunción
endotelial.
INTRODUCCIÓN
40
La disfunción endotelial se caracteriza por una reducción de la vasodilatación debida a
una producción disminuida de óxido nítrico (NO), un aumento de vasoconstrictores
como endotelina 1 y angiotensina II, niveles elevados de dimetilarginina asimétrica
(inhibidor competitivo endógeno de la óxido nítrico sintetasa) y el desequilibrio entre la
elevada producción intracelular de radicales libres de oxígeno y una capacidad
antioxidante insuficiente, fenómeno conocido como estrés oxidativo. Además, se
puede encontrar una expresión aumentada de moléculas de adhesión y citoquinas que
promueven una respuesta inflamatoria, así como la producción del inhibidor del
activador de plasminógeno-1 (“plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1) y FT, que
contribuyen a un estado protrombótico (Aird WC., 2008). Estas alteraciones
patológicas que determinan la disfunción endotelial constituyen el paso previo y
necesario para la instauración de aterosclerosis acelerada en enfermedades
inflamatorias multisistémicas (de Leeuw K. et al, 2005).
La disfunción endotelial ha sido descrita en múltiples patologías como diabetes
mellitus (Ceriello A. et al, 2013), obesidad (Hanzu FA. et al, 2011), enfermedades
autoinmunes (Frostegård J., 2005), e insuficiencia renal crónica (Serradell M., 2002),
entre otras. El hecho de que la disfunción endotelial se observe precozmente en el
desarrollo de la aterosclerosis tiene una gran importancia clínica, pues permitiría
conocer aquellas situaciones que dañan el endotelio y comenzar su tratamiento antes
de que una lesión estructural definitiva se haya establecido (Gimbrone MA Jr., 1995).
2.1.- DISFUNCIÓN ENDOTELIAL EN LA INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA
La insuficiencia renal crónica (IRC) consiste en el deterioro progresivo e irreversible
de la función renal. Clínicamente es definida cuando la tasa de filtración glomerular
(TFG), es decir, el volumen de plasma del que puede ser eliminada una sustancia
completamente por unidad de tiempo, disminuye por debajo de 60 ml/min/1.73 m2, y/o
existe presencia de daño renal mantenido durante más de tres meses (National Kidney
Foundation, 2002; KDIGO CKD Working Group, 2012). La IRC tiene una etiopatogenia
múltiple, siendo las causas más frecuentes la hipertensión arterial, la vasculopatía
isquémica renal, la glomerulonefritis, poliquistosis renal o nefropatías secundarias a
otras patologías como la diabetes mellitus, el lupus eritematoso sistémico o la
toxicidad por fármacos (Mohanram A. et al, 2003). Esta función alterada y disminuida
conlleva la acumulación de tóxicos urémicos en el plasma sanguíneo produciendo
toxicidad celular, la cual se manifiesta a nivel sistémico en múltiples alteraciones como
INTRODUCCIÓN
41
las del equilibrio electrolítico, del metabolismo óseo, hematológicas y complicaciones
cardiovasculares.
La pérdida estructural y funcional del tejido renal da lugar a la puesta en marcha de
mecanismos compensatorios que intentarán mantener una adecuada TFG. Este
proceso de hipertrofia e hiperfunción adaptativa es mediado por moléculas
proinflamatorias y vasoactivas que a su vez inducirán un deterioro renal progresivo.
Dependiendo del grado de afectación renal, la progresión de la enfermedad se divide
en distintos estadíos. En las etapas iniciales de la IRC el mecanismo compensatorio
consigue mantener una TFG adecuada o aumentada sin manifestaciones clínicas
(TFG ≥ 90ml/min/1.73m2). En un segundo estadío el daño renal empieza a instaurarse
provocando una ligera disminución de la TFG (89 y 60 ml/min/1.73m2) aunque aún
asintomático. En la IRC moderada la función renal está deteriorada, reflejándose en
una disminución notable de la TFG (59 y 45 ml/min/1.73m2). El riñón no tiene
capacidad para eliminar productos de desecho y otras toxinas, las cuales comienzan a
acumularse en el torrente sanguíneo dando lugar a la aparición de la uremia. La IRC
avanzada o estadío 4 se caracteriza por una progresión incesante del deterioro renal,
con una disminución de hasta 15 ml/min/1.73m2 de la TFG. Se considera un estadío de
transición hacia la IRC terminal, también denominada prediálisis. Los pacientes
presentan múltiples alteraciones, entre las que destacan las complicaciones
cardiovasculares. El tratamiento está orientado a contrarrestrar los problemas
derivados y el mantenimiento de la funcionalidad remanente hasta la necesidad de una
terapia renal sustitutiva. Por último, en la IRC terminal la enfermedad progresa hacia el
fallo renal, instaurándose el síndrome urémico o el deterioro funcional de múltiples
sistemas orgánicos debido a la acumulación de productos del metabolismo, sustancias
tóxicas derivadas de la propia disfunción renal (National Kidney Foundation, 2002;
KDIGO CKD Working Group, 2012). En la IRC terminal es requerida la terapia de
reemplazo renal (TRR), que puede ser la diálisis, hemodiálisis o diálisis peritoneal; o
el transplante. Aunque la diálisis es necesaria para la vida del paciente, se ha
demostrado que puede contribuir al desarrollo de comorbilidades asociadas a la IRC,
entre ellas la disfunción endotelial (Kurokawa K. et al, 2002).
INTRODUCCIÓN
42
Figura 8. Estadíos de progresión de la insuficiencia renal crónica. (Acorde con
National Kidney Foundation, 2002; KDIGO CKD Working Group, 2012)
2.1.1.- COMPLICACIONES HEMOSTÁTICAS EN LA UREMIA
A medida que se deteriora la capacidad del riñón para realizar sus funciones de filtrado,
la acumulación de productos derivados del metabolismo, productos de desecho y
toxinas da lugar a la aparición de manifestaciones clínicas de diversa índole. Entre
ellas destacan las alteraciones del equilibro ácido-base, alteraciones del metabolismo
óseo, hipertensión arterial, alteraciones hemostáticas o neuropatía periférica, entre
otras.
En cuanto a las alteraciones de la hemostasia, los pacientes urémicos pueden
desarrollar trastornos hemostáticos complejos. Tradicionalmente, los pacientes
manifestaban diátesis hemorrágicas como consecuencia de la uremia misma y de la
aparición de anemia secundaria al mal funcionamiento renal. El sangrado urémico se
manifiesta frecuentemente en forma de púrpura, sangrado en zonas de punción o de
mucosas (epistaxis, gingivorragias, etc.) y más raramente en forma de hemorragias
graves o incluso potencialmente letales, como sangrado gastrointestinal, hemotórax o
sangrado retroperitoneal. La introducción de la eritropoyetina recombinante humana en
el tratamiento de la anemia asociada a la IRC y en la diátesis hemorrágica del paciente
INTRODUCCIÓN
43
urémico redujo considerablemente el riesgo de sangrado de estos pacientes (Tassies
D. et al, 1998; Diaz-Ricart M. et al, 1999). Aunque aparentemente paradójico, las
estrategias de prevención y tratamiento de la hemorragia pusieron en evidencia la
coexistencia de un estado protrombótico, con una alta prevalencia de enfermedades
cardiovasculares y complicaciones trombóticas (Sagrispanti A. et al, 1999).
Existe una extensa evidencia en la literatura que indica que las enfermedades
cardiovasculares son la causa principal de una mortalidad de más del 50% de los
pacientes con IRC (Brown JH. et al, 1993), mientras que el riesgo de sufrir
complicaciones trombóticas es de entre 20 y 30 veces mayor que el de la población
general (Levey AS. et al, 1999; Parfrey PS. et al, 1999). En los pacientes urémicos
este riesgo elevado no es posible ser explicado por los factores de riesgo
cardiovasculares tradicionales como la hipertensión arterial, dislipidemias, edad
avanzada, diabetes mellitus y tabaquismo; por lo que se ha postulado que alteraciones
asociadas a la uremia como la homocisteinemia, la anemia, la hipervolemia, la
inflamación, y el estrés oxidativo serían responsables de aumentar el riesgo
cardiovascular (Levey AS. et al, 1999; Eberst ME. et al, 1994). Se ha demostrado que
existe una asociación entre aterosclerosis acelerada y eventos cardiovasculares en
pacientes con IRC, la cual sería debida al desarrollo previo de disfunción endotelial
(Lindner A. et al, 1974). Por tanto, la disfunción endotelial parece tener un papel clave
en la aparición de complicaciones cardiovasculares, contribuyendo a las complejas
alteraciones hemostáticas presentes en la uremia.
Figura 9. Factores de riesgo cardiovascular en la IRC.
Factores de riesgo clásicos
Edad
HTA
Diabetis Mellitus
Hiperlipemia
Tabaquismo
Factores de riesgo nuevos
Lipoproteína (a)
Hiperhomocisteinemia
Hiperfibrogenemia
Estrés oxidativo
Inflamación
Factores intrínsecosde la IRC
Anemia
Hipervolemia
Hiperfosfatemia
Inhibidores NO
INTRODUCCIÓN
44
2.1.2.- CARACTERIZACIÓN DE LA DISFUNCIÓN ENDOTELIAL EN LA UREMIA
La IRC es un ejemplo de patología de tipo crónico en la que la inflamación junto con el
desarrollo de estrés oxidativo condicionan un ambiente proclive a la aparición de daño
endotelial. La continua exposición del endotelio a toxinas urémicas acumuladas en el
plasma por la imposibilidad del riñón de eliminarlas, así como a factores derivados de
la activación celular producida por el propio estado urémico y las terapias sustitutivas,
provocaría un daño en el endotelio instaurándose, como consecuencia, la disfunción
endotelial (Ringoir S., 1997; Herbelin A. et al, 1991). Sin embargo, la etiopatogenia del
desarrollo de disfunción endotelial en la uremia parece ser compleja, por lo que
muchos de los esfuerzos científicos en este campo han sido destinados a caracterizar
la disfunción endotelial. Nuestro grupo ha reproducido en el laboratorio la disfunción
endotelial asociada a la IRC mediante la utilización de un modelo in vitro de células
endoteliales en cultivo expuestas a medio conteniendo suero procedente de pacientes
urémicos.
Estas células presentan alteraciones morfológicas y un crecimiento acelerado, con un
incremento de células en fase S+G2M y sin evidencias de apoptosis (Serradell M. et al,
2003). Cuando las células se encuentran en condiciones de flujo la adherencia al
subendotelio es inferior, hecho confirmado por una mayor presencia de células
endoteliales circulantes. Al desprenderse dejan al descubierto una matriz extracelular
mucho más trombogénica debido, en parte, a una mayor presencia de FT y FVW
(Serradell M. et al, 2001; Aznar-Salatti J. et al, 1995).
Figura 10. El medio urémico induce cambios morfólogicos y funcionales de la CE en
cultivo (B) y de su matriz extracelular (D, F). (A, C y D) corresponden a una imagen
control. (Serradell M. et al, 2001)
INTRODUCCIÓN
45
Además, estudios inmunocitoquímicos han evidenciado aumentos en la expresión de
los receptores de adhesión VCAM-1 e ICAM-1 en la superficie celular, moléculas
características de los procesos inflamatorios. La utilización de técnicas proteómicas
nos ha permitido detectar incrementos en la expresión de proteínas de carácter
proinflamatorio, como dos componentes del proteasoma, la citoquina HMGB1 y la
proteína enzimática aldosa reductasa, así como de una proteína antiinflamatoria, la
superóxido dismutasa (Carbo C. et al, 2008).
Estas evidencias ponen de manifiesto un estado inflamatorio y procoagulante del
endotelio en condiciones urémicas.
Figura 11. Caracterización del fenotipo proinflamatorio de células endoteliales en
cultivo expuestas a medio urémico: aumento de la expresión del receptor de
adhesión VCAM-1 (B), y mayor adhesión de leucocitos circulantes (C). (A)
corresponde a una imagen control. (Cortesía del Laboratorio de Hemostasia de la
Dra. Diaz-Ricart y Dr. Escolar).
Por otra parte, la existencia de estrés oxidativo en estos pacientes, confirmada
mediante estudios ex vivo, podría ser en gran parte responsable de la lesión citotóxica
que sufre el endotelio de estos pacientes ya que la generación de radicales libres y de
productos oxidados en la uremia supera la de los antioxidantes intra y extracelulares.
Así mismo, la exposición de la CE al medio urémico genera una respuesta de
adaptación con una mayor expresión de proteínas antioxidantes y antiapoptóticas,
como la glutatión peroxidasa, la superóxido dismutasa y la peroxiredoxina (Tbahriti HF.
et al, 2013; Himmelfarb J. et al, 2003.)
INTRODUCCIÓN
46
Es interesante destacar que algunas de las proteínas identificadas están directa o
indirectamente relacionadas con el NFkB, cuya activación por la condición urémica y
las terapias sustitutivas ha sido recientemente demostrada (Caballo C. et al, 2012).
La evidencia de la activación de NFkB es de gran importancia ya que es el
responsable de la regulación de la expresión de genes relacionados con el desarrollo
de procesos inflamatorios, inmunológicos y de estrés oxidativo.
A pesar de los avances realizados, los mecanismos moleculares precisos implicados
en el desarrollo de la disfunción endotelial en la IRC continúan sin ser plenamente
esclarecidos, siendo éste uno de los principales objetivos de esta tesis.
2.2.- DISFUNCIÓN ENDOTELIAL EN EL LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO
La importancia del sistema inmune radica en la detección precoz de elementos que
pueden constituir un daño potencial o real para nuestro organismo y la lucha contra
éstos a la vez de ser tolerante con lo propio. Sin embargo, cuando el sistema inmune
escapa a sus propios mecanismos de control y reconoce erróneamente lo propio como
dañino se provoca una reacción de gran intensidad en la que se generan
autoanticuerpos e inmuncomplejos, unión de anticuerpos con antígenos circulantes,
que pueden ser extravasados y depositados en diferentes tejidos y órganos, dando
lugar a una reacción inflamatoria incontrolada contra células, tejidos y órganos del
propio organismo. Esta situación patológica se denomina enfermedad autoinmune
(Davidson A. et al, 2001). Las enfermedades autoinmunes comprenden un amplio
abanico de patologías que pueden actuar tanto a nivel local como a nivel más amplio,
atacando de manera combinada diferentes tejidos y órganos.
El lupus eritematosos sistémico (LES) se define como una enfermedad autoinmune
de tipo sistémico que se caracteriza por un estado inflamatorio descontrolado junto con
la producción de anticuerpos circulantes y depósito de inmunocomplejos en el tejido
conjuntivo, provocando lesiones graves en el tejido o tejidos diana, que pueden llegar
a ser permanentes. El LES puede aparecer en cualquier parte del organismo, siendo
más frecuente la afectación de la piel, las articulaciones, el riñón, el sistema nervioso
central y los vasos sanguíneos, entre otros (Ardoin SP. et al, 2008; Rhaman A. et al,
2008).
Aunque se trata de una patología crónica, su progresión resulta de la sucesión de
episodios de reactivación combinados con períodos de remisión de la enfermedad,
INTRODUCCIÓN
47
dando una amplia diversidad de síntomas cuya aparición, desarrollo e intensidad varía
entre un paciente y otro, y donde los tejidos y órganos comprometidos pueden ser
distintos en diferentes individuos con la misma enfermedad.
La etiología no está del todo esclarecida, pero parecen estar implicados mecanismos
genéticos o hereditarios, factores hormonales, ambientales e inmunológicos.
Actualmente se ha postulado que partiendo de una predisposición de base o primer
evento (“first hit”), una exposición a un factor determinante (“second hit”) como, por
ejemplo, una infección, daría lugar a la expresión de la enfermedad (Couser WG. et al,
2014). Es importante destacar que en el LES puede existir una predisposición genética,
aunque sin embargo no es determinante en su desarrollo. Los factores
desencadentantes pueden ser de diversa índole: infecciones por virus o bacterias,
inmunodeficiencias o determinados fármacos (Tsokos GC., 2011).
El LES puede desarrollarse a cualquier edad y tanto en ambos sexos, siendo mucho
más frecuente en mujeres que en hombres, en proporción 1 a 10, y en edades
comprendidas entre los 15 y 50 años. También existe un componente racial en la
aparición de la enfermedad, siendo ésta más común en individuos de raza negra
(Bernatsky S. et al, 2006; Lisnevskaia L. et al, 2014).
La alta heterogeneidad de tejidos afectados hace que la sintomatología del LES no
pueda ser definida con exactitud. Si bien estos pacientes muestran síntomas
generales a menudo inespecíficos, como la fatiga y la fiebre mantenida, las
manifestaciones clínicas estarán determinadas por el tipo de tejido que sea atacado
por autoanticuerpos e inmunocomplejos (Petri M. et al, 2012).
Dado el amplio espectro de manifestaciones clínicas y su heterogeneidad, nos
limitaremos a destacar las más relevantes para esta tesis doctoral.
Se conoce que unos de los órganos más afectados es el riñón (aproximadamente
hasta el 50% de los pacientes lúpicos). Interesantemente, el LES se considera una de
las causas más importantes de la IRC. El endotelio glomerular es diana de depósito de
inmunocomplejos específicos, y también se ha destacado la participación de
moléculas proinflamatorias en el daño a los glomérulos (Tsokos GC., 2011; Couser
WG. et al, 2014). La afectación renal en LES progresa hacia un estado de insuficiencia
renal de tipo terminal que requiere de un tratamiento renal sustitutivo, con la aparición
de las complicaciones comentadas en el apartado referente a la IRC.
INTRODUCCIÓN
48
2.2.1.- COMPLICACIONES TROMBÓTICAS EN EL LUPUS ERITEMATOSO
SISTÉMICO
El estado inflamatorio existente en el LES se ha considerado una de las causas
principales de muerte en pacientes lúpicos, sobretodo unido al momento en que la
patología debuta por primera vez o a periodos de activación de la enfermedad (Trager
J. et al, 2001). El incremento de la supervivencia en pacientes con LES debida a la
mejora de los tratamientos inmunosupresores ha puesto de manifiesto que las
complicaciones cardiovasculares son la causa más frecuente de morbimortalidad en
pacientes con LES de larga evolución, resultantes de la aparición y progresión de
aterosclerosis acelerada y eventos trombóticos (Cervera R. et al, 2003). Estudios
clínicos recientes evidencian que los pacientes diagnosticados de LES, en especial las
mujeres, presentan un riesgo de hasta cinco veces mayor de aparición de eventos
aterotrombóticos relacionados con aterosclerosis acelerada en comparación con la
población general (Manzi S. et al, 1997; Weinstein PK. et al, 2014). Los eventos
trombóticos tienen una prevalencia de aproximadamente 8-10% en los pacientes
lúpicos y, aunque se conoce que una de las complicaciones es la aparición de púrpura
trombocitopénica trombótica (PTT), se ha descubierto que la mayor parte de las
complicaciones trombóticas, aun siendo clínicamente similares a la PTT, no son tales
(Palatinus A. et al, 2009; Erkan D. et al, 2006).
Figura 12. Factores de riesgo cardiovascular en el LES. (Figura adaptada de
Frostegård J. et al, 2005)
Complicaciones
Cardiovasculares
LUPUS
ERITEMATOSO
SISTÉMICO
Presencia
de
anticuerpos
Dislipidemia
Hipertensión
Patología
renal
asociada
Estado
inflamatorio
Síndrome
antifosfolipí
dico
Estrés
oxidativo
INTRODUCCIÓN
49
2.2.2.- CARACTERIZACIÓN DE LA DISFUNCIÓN ENDOTELIAL EN EL LUPUS
ERITEMATOSO SISTÉMICO
Los factores desencadenantes del aumento del riesgo de sufrir aterotrombosis no son
aún conocidos dada la característica tan heterogénea del LES, aunque parecen ser
múltiples. A los factores de riesgo clásicos se suman factores relacionados con el
desarrollo de la propia enfermedad como la conjunción de un estado inflamatorio
intenso y mantenido, de estrés oxidativo, moléculas de daño tisular, y generación de
inmunocomplejos dirigidos contra factores de la coagulación y el endotelio (Narshi CB.
et al, 2011; van Hinsberg VW., 2012).
Se ha observado un nivel elevado de células endoteliales apoptóticas, que se
correlacionan fuertemente con el daño de la función vascular y el incremento en la
concentración del FT soluble; de marcadores de activación de CE, como PAI-1, y de
moléculas relacionadas con la coagulación, como el FvW (Attia FM. et al, 2011;
Somers E. et al, 2005). Asimismo se ha comprobado un elevado estado
proinflamatorio, con altas concentraciones de marcadores proinflamatorios, como IL-1β
y IL-6, y un aumento de moléculas de adhesión VCAM-1 e ICAM-1 en respuesta a
estímulos proinflamatorios y autoinmunes (Manzi S. et al, 1999).
Figura 13. Signos de daño endotelial y formación de trombos en histologías de
pacientes con LES. (Micrografías extraídas de Cines DB. et al, 1998)
Sin embargo, es importante enfatizar que la determinación de la causa de muerte de
los pacientes con LES puede ser complicada en muchos casos. La compleja
naturaleza de esta enfermedad puede enmascarar o ser enmascarada por otros
procesos.
INTRODUCCIÓN
50
2.2.3.- EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD LÚPICA Y DAÑO ASOCIADO
El hecho de que el LES sea una patología que cursa con periodos de reactivación y
remisión dentro de un marco progresivo crónico, junto con el comportamiento tan
diverso entre pacientes, ha llevado a la necesidad de monitorizar la actividad lúpica y
el daño crónico inducido por la enfermedad con el objetivo de establecer guías
estandarizadas para un mejor conocimiento y clasificación del LES, de su progresión
y el estudio de las respuestas producidas por determinadas terapias farmacológicas y
experimentales.
Entre estas herramientas encontramos sistemas de medición global de la actividad
lúpica: la guía SLAM (del inglés “systemic lupus activity measure”) y el índice SLEDAI
(“systemic lupus erythematosus disease activity index”) y el daño crónico producido
por LES mediante el método de SLICC (“The Systemic Lupus International
Collaborating Clinics/American College of Rheumatology Damage”).
Índice de actividad lúpica: Systemic lupus erythematosus disease activity index
(SLEDAI)
Desarrollado inicialmente en 1985 y modificado por Gladman y cols. en 2002, esta
herramienta está destinada a cuantificar el grado de actividad lúpica total utilizando
una evaluación sistemática de 24 items en 9 órganos, incluyendo manifestaciones
sistémicas, neurológicas, vasculares, músculo- esqueléticas, renales, hematológicas,
cutáneas, serosas, inmunológicas. Se basa en la recogida de datos mediante la
historia y exploración física junto con resultados de laboratorio en un período de 10
días. De esta evaluación según la presencia de actividad por ítem se obtiene una
puntuación total comprendida entre 0 y 105 puntos que se encuentra directamente
relacionada con el grado de actividad total: Inactividad (0 puntos), leve (1-5 puntos),
moderada (6-10 puntos), alta (11-20 puntos) y muy alta (>20 puntos). Por consenso, a
partir de los 6 puntos se considera una actividad lúpica con relevancia clínica, con
implicación directa en la intención de tratamiento (Gladman D. et al, 2002).
Índice de evaluación de daño orgánico: Systemic Lupus International
Collaborating Clinics / American College of Rheumatology (SLICC-ACR)
El índice SLICC/ACR evalúa el daño orgánico irreversible de la patología lúpica, sin
entrar en especificación de la causa e independientemente de la actividad. En este
caso, la guía de evaluación está dividida en 12 órganos o sistemas y recoge hasta 37
manifestaciones o ítems. La presencia de daño orgánico se recoge con una
puntuación de 1 por cada ítem una vez la enfermedad haya sido diagnosticada y
INTRODUCCIÓN
51
siempre y cuando este daño se haya mantenido durante 6 meses. La misma lesión no
puede puntuar más de una vez, por lo que las lesiones recurrentes sólo añaden
puntuación si éstas han ocurrido espaciadas en el tiempo como mínimo 6 meses. La
puntuación está comprendida entre 0 y 47, donde 0 significa ausencia y 1 es tomado
como criterio de daño orgánico existente que puede aumentar hasta una puntuación
máxima de 47 (daño orgánico severo). Está clínicamente demostrada la relación entre
el índice de daño orgánico y con el pronóstico: a mayor puntuación, más desfavorable
será el pronóstico (Gladman D. et al, 1992; Gladman D. et al, 1996).
3.- EVALUACIÓN DE LA FUNCIÓN Y DISFUNCIÓN ENDOTELIALES
El endotelio juega un papel primordial en la función y en la patología cardiovascular.
La disfunción endotelial es una condición previa y necesaria al desarrollo de la
aterogénesis. Estos hechos hacen evidente la necesidad de concentrar todos los
esfuerzos en el estudio del endotelio, pues nos permitirá tanto conocer los procesos
que se llevan a cabo en la activación y disfunción endotelial, como diagnosticar y
prevenir la enfermedad cardiovascular incluso antes de que ésta se instaure.
3.1.- MODELOS CELULARES
A pesar de su indudable atractivo para la biología vascular, el estudio de los
mecanismos patogénicos está muy limitado debido a su localización. Por ello los
modelos experimentales, in vitro y animales, nos permiten evaluar el endotelio desde
una perspectiva de laboratorio, aportándonos nueva información sobre los
mecanismos moleculares implicados en la disfunción endotelial (Aoki T. et al, 2007).
Las primeras aproximaciones se centran en el efecto de uno u otro mediador
extracelular en monocapas de células endoteliales en cultivo (Bouïs D. et al 2001). En
el contexto de un organismo complejo, el endotelio es expuesto a muchos factores,
tanto biomecánicos como bioquímicos, que pueden variar en espacio o tiempo. Por
ello, el estudio no debe estar limitado a moléculas seleccionadas sino que una
aproximación más acertada es la exposición al “microambiente” que constituye el
todo (Carbo C. et al, 2008; Caballo C. et al, 2012). Otra de las ventajas de utilizar
modelos in vitro es la de poder obtener células de distintos territorios y características
dependiendo del estudio que se pretenda abordar, lo que además contribuye a
explicar el concepto de la heterogenicidad del endotelio (Bouïs D. et al, 2001).
INTRODUCCIÓN
52
Por otra parte, nos permite la evaluación de la efectividad de posibles estrategias
preventivas o terapéuticas (Palomo M. et al, 2011; Carmona A. et al, 2013). Pero aún
siendo el cultivo celular una herramienta muy potente, el poder extrapolar los
resultados obtenidos a la clínica está lejos de nuestro dominio.
3.2.- BIOMARCADORES DE DAÑO ENDOTELIAL
La evaluación clínica de la función endotelial ha sido clásicamente realizada mediante
una técnica directa considerada el “gold standard”: la angiografía coronaria combinada
con la infusión de moléculas vasodilatadoras, como serotonina o acetilcolina. Sin
embargo, esta técnica es cruenta e invasiva, con morbilidad asociada y no permite ser
usada de manera generalizada para la detección precoz de disfunción endotelial en
individuos de riesgo como, por ejemplo, en pacientes con IRC.
El desarrollo de técnicas diagnósticas no invasivas está permitiendo evaluar la
respuesta del endotelio de manera más orientada y sin suponer un problema añadido
para los pacientes (Lekakis J. et al, 2011). Las metodologías clínicas más utilizadas
actualmente se basan en la medición de la capacidad contráctil del vaso en respuesta
a determinados estímulos físicos o farmacológicos. Entre ellas podemos destacar la
evaluación mediante ultrasonidos de la vasodilatación mediada por flujo (VMF) de la
arteria humoral, la pletismografía post-isquemia compresiva o post-infusión
farmacológica de la arteria humeral, o el estudio de flujo de la microvasculatura digital
mediante láser doppler, entre otros (Arrebola-Moreno AL. et al, 2012; Rubinshtein R. et
al, 2010)
Existe un abordaje desde el laboratorio dedicado al estudio y la cuantificación de
productos y moléculas relacionadas con la activación y daño endotelial que son
liberados por el endotelio y, por tanto, pueden constituirse como biomarcadores de
disfunción endotelial. Si bien no existe un claro consenso a favor de uno u otro
marcador, entre los valores aceptados actualmente como marcadores de disfunción
endotelial destacan: las fracciones solubles vehiculizadas en plasma de receptores de
adhesión, como ICAM-1 y VCAM-1 solubles (Mocco J. et al, 2001), o moléculas
relacionadas con la hemostasia, como el FvW o la actividad de la metaloproteinasa
ADAMTS13 (Gombos T. et al, 2009). Las variaciones en las concentraciones y grado
de actividad funcional de estas moléculas están relacionadas con la presencia de un
INTRODUCCIÓN
53
estado proinflamatorio y de daño celular (Constans J. et al, 2006; Al-Qaisi M. et al,
2008).
Por otra parte, las poblaciones celulares de tipo endotelial que se encuentran
circulantes en el torrente sanguíneo pueden considerarse un propio marcador, ya que
la cantidad de células endoteliales circulantes (CEC) y de progenitores endoteliales
circulantes (PEC) parece asociarse con variaciones en la capacidad adhesiva y
regenerativa del endotelio, respectivamente (Jourde-Chiche N. et al, 2009; Szmitko PE.
et al, 2003).
Figura 14. Principales moléculas relacionadas con el endotelio, susceptibles de ser
consideradas posibles marcadores de disfunción endotelial. (Figura adaptada de
Lekakis J. et al, 2011)
El establecimiento y validación de biomarcadores permitirá la detección precoz de
disfunción endotelial, incluso antes de instaurarse un proceso aterotrombótico,
aportando un valor diagnóstico y predictivo del riesgo vascular y permitiendo su
uso de forma generalizada con el fin de identificar pacientes de riesgo (Stoner L. et al,
2013). El análisis de biomarcadores de disfunción endotelial y su correlación con
características clínicas y otras técnicas de evaluación pueden permitir no sólo un
diagnóstico anticipado, sino mayor conocimiento de la condición patológica, la
monitorización del progreso de la enfermedad cardiovascular, y una herramienta
INTRODUCCIÓN
54
metodológica clave en el ensayo de nuevas estrategias preventivas y farmacológicas
en la lucha contra el desarrollo de la enfermedad cardiovascular.
55
Hipótesis y
objetivos
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
57
A partir de la información expuesta en el texto introductorio precedente, queda bien
establecido que enfermedades sistémicas con un elevado componente inflamatorio,
sea de origen tóxico o inmunológico, son capaces de alterar la funcionalidad del
endotelio y contribuir al desarrollo de complicaciones trombóticas, ya sea en territorios
arteriales o venosos.
La insuficiencia renal crónica (IRC) es un claro ejemplo de patología crónica en la
que coexiste un estado inflamatorio con estrés oxidativo, dando lugar a alteraciones
funcionales del endotelio y desarrollo de aterotrombosis acelerada. En el desarrollo de
estos procesos patológicos intervienen factores humorales y factores derivados de la
activación celular. El componente humoral está constituido por tóxicos circulantes
vehiculizados por el plasma en los pacientes con fracaso renal. Estos tóxicos serían
capaces de alterar el funcionalismo de distintos elementos celulares implicados en la
hemostasia (endotelio, plaquetas y leucocitos). La activación de estos elementos
inducen la liberación de citoquinas que pasarían a su vez a engrosar el componente
humoral. El tratamiento sustitutivo con la hemodiálisis, que es imprescindible para la
supervivencia del paciente, potencia a su vez la activación celular y la liberación
subsiguiente de citoquinas que realimentan y potencian el proceso inflamatorio. .
Las enfermedades autoinmunes, y en concreto el lupus eritematoso sistémico (LES),
son un claro ejemplo de patología inflamatoria multiorgánica en la que la presencia de
disfunción endotelial tiene traducción clínica evidente, con la aparición de
manifestaciones cardiovasculares debidas a la progresión de aterosclerosis acelerada
y complicaciones trombóticas, más frecuentes en el territorio venoso.
Disponemos de un modelo in vitro de disfunción endotelial que nos ha permitido su
caracterización fisiológica, bioquímica y proteómica, pero desconocemos los
mecanismos concretos que conducen al desarrollo de daño endotelial. La hipótesis de
esta tesis doctoral propone que las alteraciones de la función endotelial en las
patologías con un elevado componente inflamatorio tienen aspectos coincidentes.
Moléculas o anticuerpos circulantes en estas patologías pueden causar alteraciones
en los procesos de señalización celular y respuestas anómalas como la generación de
señales de alarma (“danger associated molecular patterns, DAMPs) y la la liberación
de marcadores de lesión endotelial hacia la circulación. Los receptores mejor
reconocidos para DAMPs son los TLR y los complejos de proteínas del inflamasoma
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
58
Para la confirmación de esta hipótesis nos proponemos utilizar modelos celulares in
vitro que nos permitirán la caracterización de los mecanismos moleculares precisos.
Por otro lado, pretendemos identificar, evaluar y validar biomarcadores de daño
endotelial que puedan ser aplicados al diagnóstico temprano de estas complicaciones
y su posible traslado a la práctica clínica.
El objetivo general de esta tesis doctoral es investigar los mecanismos moleculares
implicados en el desarrollo de disfunción endotelial asociada a enfermedades
sistémicas crónicas caracterizadas por la aparición de inflamación, estrés oxidativo o
agresión inmunológica.
Los objetivos concretos de esta tesis son los siguientes:
1. Profundizar en los mecanismos moleculares implicados en el
desencadenamiento del estímulo proinflamatorio y prooxidante que conlleva a
disfunción endotelial.
2. Investigar el papel de la inmunidad innata en la recepción y perpetuación del
estímulo proinflamatorio y prooxidante en la célula endotelial en el modelo in
vitro de disfunción endotelial.
3. Evaluar la implicaciones de DAMPs, TLR4 e inflamososma NALP3 en la
disfunción endotelial en la uremia y el efecto de las diferentes procedimientos
de diálisis en la activación de estos mecanismos.
4. Identificar posibles marcadores de predicción de riesgo trombótico en una
patologías inflamatoria sistémica como el LES, en la que también se ha
definido la presencia de disfunción endotelial.
5. Valorar la relación entre niveles de la metaloproteasa ADAMTS13, el daño
endotelial y el riesgo trombótico en pacientes con LES.
59
Resultados
RESULTADOS
61
PUBLICACIONES
1. Martin-Rodriguez S, Caballo C, Gutierrez G, Vera M, Cruzado JM, Cases A,
Escolar G, Diaz-Ricart M. TLR4 and NALP3 inflammasome in the development of
endothelial dysfunction in uraemia. Eur J Clin Invest. 2015 Feb;45(2):160-9.
2. Martin-Rodriguez S, Reverter JC, Tàssies D, Espinosa G, Heras M, Pino M,
Escolar G, Diaz-Ricart M. Reduced ADAMTS13 activity is associated with
thrombotic risk in systemic lupus erythematosus. Lupus. 2015 Oct;24(11):1143-9.
RESULTADOS
63
TLR4 and NALP3 inflammasome in the development of endothelial dysfunction
in uraemia.
Martin-Rodriguez S, Caballo C, Gutierrez G, Vera M, Cruzado JM, Cases A, Escolar G,
Diaz-Ricart M.
Eur J Clin Invest. 2015 Feb;45(2):160-9.
Abstract
The increased cardiovascular risk present in chronic kidney disease (CKD) is related to
the development of endothelial dysfunction, whose mechanisms are still unclear.
Accumulation of toxins and pro- inflammatory cytokines may constitute danger-
associated molecular patterns (DAMP) to which endothelial cells are continuously
exposed. Potential involvement of mechanisms recognizing DAMP, such as TLR and
inflammasomes, has been explored.
Endothelial cells in culture were exposed to sera samples collected from patients with
CKD: (i) stages 4–5 not on dialysis (PreD), (ii) on maintenance haemodialysis (HD) and
(iii) peritoneal dialysis (PD). Changes in TLR4 and ICAM-1 expression, reactive oxygen
species (ROS) production and TLR4 signalling were explored. Assembly of NALP3
inflammasome components was also investigated.
TLR4 was expressed at the cell surface and increased significantly in response to PreD,
HD and PD sera, paralleling with the activation of the cell stress protein Akt and the
inflammation-related transcription factor NFjB, with elevated surface ICAM-1
expression and ROS production. TLR4 blockade partially decreased these effects.
Exposure of cells to uraemic sera induced assembly of NALP3 components, with
caspase-1 activation, especially in response to HD and PD sera.
TLR4 and NALP3 inflammasomes, crucial elements of innate immunity, contribute to
the development and perpetuation of endothelial dysfunction in response to the
uraemic toxicity. These mechanisms constitute potential therapeutic targets to improve
endothelial dysfunction and to reduce the increased cardiovascular risk in CKD.
Keywords: Chronic kidney disease, endothelial dysfunction, innate immunity, NALP3,
TLR4, uraemia.
RESULTADOS
64
Resumen
El aumento del riesgo cardiovascular presente en la insuficiencia renal crónica (IRC)
está relacionado con el desarrollo de disfunción endotelial, cuyos mecanismos aún no
están claros. La acumulación de toxinas y citoquinas proinflamatorias puede constituir
patrones moleculares asociados al peligro (DAMP) a los que las células endoteliales
están continuamente expuestas. Se ha explorado la participación potencial de
mecanismos que reconocen DAMP, como TLR e inflamasomas.
Las células endoteliales en cultivo fueron expuestas a muestras de suero recogidas de
pacientes con IRC: (i) etapas 4-5 en prediálisis (PreD), (ii) en hemodiálisis (HD) y (iii)
diálisis peritoneal (DP). Se estudiaron los cambios en la expresión de TLR4 y ICAM-1,
la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la señalización de TLR4.
También se investigó el ensamblaje de componentes del inflamasoma de NALP3.
TLR4 se expresó en la superficie celular y aumentó significativamente en respuesta a
PreD, HD y suero DP, en paralelo con la activación de la proteína de estrés celular Akt
y la inflamación relacionados con NFκB factor de transcripción, con elevada expresión
en ICAM-1 superficial y producción intracelular de ROS. El bloqueo de TLR4
disminuyó parcialmente estos efectos. La exposición de células a sueros urémicos
indujo el ensamblaje de componentes de NALP3, con activación de caspasa-1,
especialmente en respuesta a sueros HD y DP.
El receptor TLR4 y el inflamasoma NALP3, elementos cruciales de la inmunidad innata,
contribuyen al desarrollo y perpetuación de la disfunción endotelial en respuesta a la
toxicidad urémica. Estos mecanismos constituyen potenciales dianas terapéuticas para
mejorar la disfunción endotelial y reducir el aumento del riesgo cardiovascular en la
IRC.
Palabras clave: Insuficiencia renal crónica, disfunción endotelial, inmunidad innata,
NALP3, TLR4, uremia.
TLR4 and NALP3 inflammasome in the development ofendothelial dysfunction in uraemiaSusana Martin-Rodriguez*,a, Carolina Caballo*,a, Gabriela Gutierrez*, Manel Vera†, Josep M. Cruzado‡, AleixCases†, Gines Escolar* and Maribel Diaz-Ricart*
*Department of Hemotherapy-Hemostasis, Institut d’Investigacions Biom�ediques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), HospitalClinic, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain, †Department of Nephrology, Institut d’Investigacions Biom�ediquesAugust Pi i Sunyer (IDIBAPS), Hospital Clinic, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain, ‡Diaverum Institut Hemodi�alisis,Barcelona, Spain
ABSTRACT
Background The increased cardiovascular risk present in chronic kidney disease (CKD) is related to thedevelopment of endothelial dysfunction, whose mechanisms are still unclear. Accumulation of toxins and pro-inflammatory cytokines may constitute danger-associated molecular patterns (DAMP) to which endothelial cellsare continuously exposed. Potential involvement of mechanisms recognizing DAMP, such as TLR and inflam-masomes, has been explored.
Materials and methods Endothelial cells in culture were exposed to sera samples collected from patients withCKD: (i) stages 4–5 not on dialysis (PreD), (ii) on maintenance haemodialysis (HD) and (iii) peritoneal dialysis (PD).Changes in TLR4 and ICAM-1 expression, reactive oxygen species (ROS) production and TLR4 signalling wereexplored. Assembly of NALP3 inflammasome components was also investigated.
Results TLR4 was expressed at the cell surface and increased significantly in response to PreD, HD and PDsera, paralleling with the activation of the cell stress protein Akt and the inflammation-related transcription factorNFjB, with elevated surface ICAM-1 expression and ROS production. TLR4 blockade partially decreased theseeffects. Exposure of cells to uraemic sera induced assembly of NALP3 components, with caspase-1 activation,especially in response to HD and PD sera.
Conclusions TLR4 and NALP3 inflammasomes, crucial elements of innate immunity, contribute to the devel-opment and perpetuation of endothelial dysfunction in response to the uraemic toxicity. These mechanismsconstitute potential therapeutic targets to improve endothelial dysfunction and to reduce the increased car-diovascular risk in CKD.
Keywords Chronic kidney disease, endothelial dysfunction, innate immunity, NALP3, TLR4, uraemia.
Eur J Clin Invest 2015
Introduction
The pathophysiology of the enhanced atherothrombotic risk in
CKD is complex. In vivo and in vitro evidence indicates the
coexistence of endothelial dysfunction together with a chronic
inflammatory state and oxidative stress in uraemic patients. In
the development of these pathological processes, there are at
least two components: a humoral and a cellular one. The
humoral component consists of the presence of uraemic toxins
[1,2] and factors released by activated blood cells [3,4]. Uraemic
toxins are accumulated in the sera of patients with CKD and
alter the function of the different blood cell populations,
involved in haemostasis and atherosclerosis that release
cytokines enriching the humoral component. In response to
cytokines, endothelial cells produce chemokines, pro-inflam-
matory cytokines and also express adhesion molecules, pro-
moting the adhesion of circulating leucocytes that translocate
into the intima, initiating the atherosclerotic process. Although
endothelial dysfunction in CKD has been well characterized
before, the precise molecular mechanisms potentially involved
remain to be fully elucidated.
Factors inducing endothelial dysfunction in CKD include
pulsatile blood flow and shear stress, oxidized LDL particles,
hyperphosphatemia, reactive oxygen species, advanced
glycation end products, microbial-derived products,
endogenous damage-associated molecules and circulatingaThese authors contributed equally to the manuscript
European Journal of Clinical Investigation 1
DOI: 10.1111/eci.12392
ORIGINAL ARTICLE
pro-inflammatory cytokines. Many of the above-mentioned
ligands act by activating scavenger receptors and pattern rec-
ognition receptors (PRR), key elements of the innate immunity
expressed on the surface of endothelial cells [5]. Toll-like
receptors (TLR) are PRR responsible for the detection and rec-
ognition not only of exogenous pathogen-associated molecular
patterns (PAMP) but also of endogenous damage-associated
molecular patterns (DAMP).
Previous proteomic studies by our group revealed that cul-
turedhumanumbilical vein endothelial cells (HUVECs) exposed
to uraemic media increase the expression of molecules related to
inflammation, such as the high mobility group box protein 1
(HMGB1), as well as to oxidative stress, such as superoxide
dismutase and glutathione peroxidase [6], some of them recog-
nized asDAMP [7]. DAMPs are protein- and nonprotein-derived
molecules that can initiate and perpetuate immune responses in
the noninfectious inflammatory response, acting through spe-
cific inflammation-related receptors. The best known receptors
for DAMPs are TLR and the protein complexes called inflam-
masomes. Some DAMPs can engage TLRs, especially TLR2 and
TLR4, to induce and amplify the inflammatory response [8]
through the transcription factor NFjB activation. In addition,
new theories point to the action of multiprotein complexes, the
inflammasomes, that mediate the production of proinflamma-
tory cytokines by regulating the enzymatic activity of caspases
[9]. The best characterized is NALP3, consisting of a sensor
molecule (the receptor protein NALP3) connected to an adapter
protein (ASC) responsible for the activation of the inflammatory
enzyme caspase-1 [10]. Assembly of these components
activates inflammation signalling networks [11,12], with the
participation of NFjB and protein p38 [13], among others, both
reported by our group to be activated in HUVECs exposed to
uraemic conditions [6,14]. Interestingly, presence of oxidative
stress seems to induce the activation of the inflammasome
through theprotein thioredoxin-interactingprotein (TXNIP) [12].
Based on our previous evidence, our present hypothesis is
that uraemic DAMPs may strengthen the uraemic toxicity and
perpetuate endothelial dysfunction through TLR4 engagement
and the assembly of the NALP3 inflammasome components. In
addition, the contribution of uraemia and the possible role of
renal replacement therapies (RRT) in the activation of these
signalling mechanisms has been explored. Studies have been
carried out by exposing HUVEC to sera from patients with
CKD under conservative treatment (CKD stages 4–5) and under
maintenance haemodialysis or peritoneal dialysis.
Subjects and methods
Experimental designHumanumbilical vein endothelial cells (HUVECs)were exposed
to sera samples from patients under conservative treatment
(PreD, n = 11), undergoing maintenance haemodialysis (HD,
n = 15) and under peritoneal dialysis (PD, n = 9). Healthy
donors were also enrolled as controls (C, n = 15). Changes in the
expression of TLR4, the activation of associated signalling pro-
teins Akt and NFjB, the reactive oxygen species (ROS) produc-
tion and the association of the NALP3 inflammasome
components, were explored by immunofluorescence, immuno-
precipitation, SDS-PAGE and Western blot techniques.
Patients and sample collectionDiabetic patients and patients with dyslipidemia and/or pre-
vious cardiovascular disease and smokers were excluded. Most
of the patients had no hypertensive renovascular disease as a
cause of CKD. Patients’ characteristics are detailed in Table 1.
All HD patients were dialysed with biocompatible membranes,
ultrapure water, for ≥ 4 h, with a Kt/V ≥ 1�3. None of the
patients were dialysed through a haemodialysis catheter.
Samples were always obtained before the second or third HD
session of the week. In the PD group, patients only used bio-
compatible solutions with low levels of GDP. None of the PD
patients had had a peritonitis episode in the previous
2 months. Samples from healthy donors were obtained as
controls, as indicated in Table 1.
Plasma and sera samples were obtained from each patient by
centrifugation of citrated blood (800 g, 15 min) and non-anti-
coagulated blood (3000 g, 15 min), respectively, and stored at
�20 °C until use. All patients gave their written informed
consent to participate in the study, and the study was approved
by the Hospital Clinic Ethical Committee of Clinical
Investigation.
Human umbilical vein endothelial cell culturesHUVECs were isolated from human umbilical cord veins [15]
and grown with culture medium (Mem 199; Gibco BRL, Life
Technologies, Scotland, UK) supplemented with 100U/mL
penicillin, 50 mg/mL streptomycin and 20% human serum
(37 °C, 5% CO2). Culture medium was replaced every 48 h.
Cells were used at the second passage.
Immunofluorescence detection of TLR4 and ICAM-1on HUVECsHUVECs were seeded on 6-well plates (TPP, Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, USA) and stimulated with media containing 20%
sera from uraemic patients (16 h), according to our previous
work [6,14,16–19]. Cells were fixed with 4% paraformaldehyde
in 0�15 M PBS, pH 7�4 (4 °C, 10 min), blocked with 1% BSA and
incubated with a primary antibody against TLR4 (MoAb)
(Abcam, Cambridge, UK) (dilution 1 : 50, 1 h, at RT) or against
ICAM-1 (Millipore, Temecula, CA, USA) (dilution 1 : 200, 1 h,
RT), and a secondary antibody anti-mouse IgG conjugated with
alexa 555 (Molecular probes, New York, NY, USA) (dilution
2 ª 2014 Stichting European Society for Clinical Investigation Journal Foundation
S. MARTIN-RODRIGUEZ ET AL. www.ejci-online.com
1 : 2000 1 h, at RT). Samples were evaluated by light micros-
copy (Leica DM4000B, Barcelona, Spain), images were captured
through a video camera (Leica DFC310FX, Barcelona, Spain),
and the density of labelling was calculated by computerized
morphometric analysis (ImageJ, National Institutes of Health,
Bethesda, MD, USA).
TLR4-related signalling pathwaysHUVECs grown in 6-well plates were incubated with the
patients sera at different time points to evaluate changes in both
the expression and/or activation of TLR4, Akt and NFjB, andin the activation of the NALP3 inflammasome-associated pro-
teins (TXNIP, NALP3 and ASC).
Considering that translocation of NFjB to the nucleus is
preceded by the phosphorylation and degradation of IjB, we
analysed the phosphorylation of the IjB protein in the presence
of N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal (ALLN), which prevents
its degradation by the 26S proteasome [20].
HUVECs were lysed with Laemmli buffer, sonicated to
shear DNA and reduce viscosity (15s), and heated to 90 °Cfor 5 min. Protein concentration in the supernatants was
determined using Coomassie Plus (Pierce, Barcelona, Spain).
Samples were resolved by 8% or 12% SDS-PAGE, proteins
transferred to nitrocellulose membranes, probed with specific
antibodies against TLR4 (Abcam, Cambridge, UK), phospho-
Akt and total Akt, phospho-IjB and total IjB (Cell signaling,
Danvers, MA, USA), TXNIP, ASC (from Santa Cruz
Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) and NALP3 (Pierce
Antibodies, ThermoScientific, Rockford, IL, USA).
Membranes were incubated with a peroxidase-conjugated
Table 1 Main demographic characteristics and biochemical parameters
Control (n = 15) PreD (n = 11) HD (n = 15) PD (n = 9)
Age, yr, mean � SD 43 � 10�0 63�1 � 11�3 52 � 14�6 62�1 � 19�8Gender male/female 7/8 6/5 8/7 5/4
Mean glomerular filtration rate (mL/min/1�73 m2 � SD) > 60 19�5 � 8�3 – –
Residual renal function (mL/min) mean � SD – – 0 5�2 � 4�5Mean time on dialysis, months � SD – – 56�6 � 70�6 16�8 � 6�3Serum Albumin (g/dL) mean � SD 4�3 � 0�3 4�4 � 0�2 4�3 � 0�4 3�9 � 0�2Haemoglobin (g/dL) mean � SD 12�5 � 2 12�8 � 2 11�9 � 1�6 12�1 � 1�2Leucocytes (109/L) mean � SD 7�8 � 1�4 7�5 � 1�2 6�32 � 2�01 7�2 � 1�6Causes of CKD n (%)
Glomerulonephritis 3 (27�3%) 4 (26�7%) 0
Interstitial nephropathy 2 (18�2%) 0 0
Renal hypoplasia 1 (0�9%) 0 0
Polycystic kidney disease 0 3 (20�0%) 2 (22�2%)
Systemic lupus erythematosus 0 1 (0�7%) 0
Haemolytic uraemic syndrome 0 1 (0�7%) 0
Bilateral nephrectomy 0 1 (0�7%) 0
Obstructive kidney disease 0 1 (0�7%) 0
Nephrosclerosis 0 0 2 (22�2%)
Unknown 4 (36�4%) 4 (26�7%) 5 (55�6%)
Hypertension n (%) 0 9 (81�8%) 15 (100%) 4 (44�4%)
Use of statins n (%) 0 7 (63�6%) 6 (40%) 8 (88�9%)
Use of vitamin D n (%) 0 8 (72�7%) 5 (33�3%) 9 (100%)
Use of erythropoietin n (%) 0 3 (27�3%) 12 (80�0%) 8 (88�9%)
Use of inhibitors of the renin-angiotensin system 0 5 (45�5%) 1 (6�7%) 4 (55�5%)
European Journal of Clinical Investigation 3
TLR4 AND NALP3 IN ENDOTHELIAL DYSFUNCTION
anti-rabbit immunoglobulin G and developed by
chemiluminescence.
Immunoprecipitation of the NALP3 inflammasomeadaptor protein ASCHUVECs grown in 6-well plates exposed to the uraemic con-
ditions were lysed and scrapped in RIPA buffer 19 (1 9 106
cells/mL) (10 mM Tris, pH 7�4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100,
0�1% SDS, 6�4 mM deoxycholic acid, 10 mM EDTA, 186 mM
PMSF, 10 mM N-ethylmaleimide, 10 mM benzamidine and
2 mM Na3VO4). Samples were centrifuged (21 000 g for 15 min,
at 4 °C), and supernatants were incubated with an anti-ASC
antibody (2 lg antibody/100–500 lg protein, overnight at 4 °C)(Santa Cruz Biotechnology). Protein G agarose beads (Cell
Signaling) were washed with RIPA buffer (93) and conjugated
with swine anti-rabbit IgG antibody (Dako, Barcelona, Spain)
(30 min at 4 °C). Both fractions were incubated for 30 min at
4 °C. After extensive washing (69) with RIPA buffer, samples
were resuspended in Laemmli’s buffer containing 5% TCEP,
heated at 95 °C for 5 min and centrifuged at 21 000 g. Super-
natants, containing the solubilized immunoprecipitated pro-
teins, were resolved by 8% SDS-PAGE, as described before [21].
Production of intracellular reactive oxygen species(ROS)ROS generation was explored using the cell-permeable ROS
detection reagent 5-(and 6)-chloromethyl-2’, 7’-dichlorodihy-
drofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) (Molec-
ular Probes). HUVECs seeded on 6-well plates (TPP, Sigma-
Aldrich) were incubated with 10 lM CM-H2DCFDA (37 °C for
15 min). Cells were washed with PBS (39) followed by cell
stimulation with the different sera for 30 min. Intracellular ROS
production was monitored by fluorescence microscopy (Leica
DM4000B, Barcelona, Spain), images captured through a video
camera (Leica DFC310FX, Barcelona, Spain), and the density of
labelling was calculated by computerized morphometric
analysis (ImageJ, National Institutes of Health).
Inhibition of TLR4HUVECs were incubated with an anti-hTLR4-IgG antibody
(InvivoGen, San Diego, CA, USA) at a final concentration of
5 lg/mL (1 h at 37 °C) before exposure to the uraemic sera.
Changes in the expression of ICAM-1, ROS production and
phosphorylation levels of Akt, IjB, and TXNIP were analysed
as described before. A class-matched unspecific IgG (IgG
InvivioGen) was used as a control.
StatisticsResults are expressed as mean � standard error of the mean
(SEM). Statistical analyses were performed with the SPSS statis-
tical package 17.0.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) with raw data
using ANOVA. Results were considered statistically significant
when P < 0�01.
Results
Expression of TLR4 and ICAM-1 in HUVECs inresponse to uraemic mediaTLR4 was constitutively expressed on HUVECs surface (Fig. 1).
When exposed to culture media containing PreD, HD or PD
sera, there was a significant increased expression of TLR4 in
comparison with controls (average fold increases of 1�8 � 0�3,2 � 0�1 and 2�3 � 0�2, respectively, n = 5, P < 0�01 for all the
conditions).
Figure 1 Expression of TLR4 and ICAM-1 in HUVECs.Micrographs show TLR4 and ICAM-1 expression on HUVECsexposed to media containing sera from healthy donors (C) andpatients with CKD under conservative treatment (PreD),undergoing haemodialysis (HD) and under peritoneal dialysis(PD). Both TLR4 and ICAM-1 were detected using a specificprimary antibody that was visualized with a secondary IgGconjugated with alexa 555.
4 ª 2014 Stichting European Society for Clinical Investigation Journal Foundation
S. MARTIN-RODRIGUEZ ET AL. www.ejci-online.com
Expression of the adhesion receptor ICAM-1 also increased
in response to PreD, HD and PD sera (average fold increases of
1�6 � 0�1, 1�8 � 0�2 and 2�1 � 0�1, respectively, vs. control,n = 5, P < 0�01 for all the conditions) (Fig. 1). No unspecific
staining was observed when cells were incubated with a sec-
ondary antibody conjugated with the fluorochrome.
TLR4 signalling in HUVECs after exposure to uraemicmediaImmunoblots with lysates of HUVECs grown in the presence of
control serum confirmed presence of TLR4 (Fig. 2). Exposure of
HUVECs to media containing PreD, HD and PD sera resulted
in a time-dependent increase in the presence of TLR4 (average
fold increases vs. control of 1�7 � 0�2, 1�8 � 0�2 and 2�2 � 0�1after 15 min; 2�3 � 0�3, 3�8 � 0�5 and 2�1 � 0�1, after 4 h; and
2 � 0�2, 1�9 � 0�1 and 2 � 0�3, after overnight exposure, n = 4,
P < 0�01) (Fig. 2).Activation of the cell stress-related protein Akt and the
transcription factor NFkB was also explored (n = 4) (Fig. 2).
Phosphorylation of Akt occurred rapidly (at 1 min) after cells
was exposed to media containing PreD, HD and PD sera and
lasted up to 15 min in response to PreD and PD samples, and
persisted up to 1 h in response to the HD sample. Phosphory-
lation of Akt was also detected in response to control sera,
although it was less intense and only clearly detected after
1 min. Activation of NFkB, evaluated through the activation of
IkB, occurred in response to the three uraemic conditions and
was maximal after 15 min of incubation (Fig. 2).
Presence and activation of the NALP3 inflammasomein HUVECs exposed to uraemic mediaIn cell lysates, NALP3 protein was equally present in cells
exposed to all the conditions assayed, including control sera,
whereas TXNIP expression increased in response to PreD, HD
and PD (average fold increase of 1�4 � 0�3, 1�6 � 0�1, 1�5 � 0�1,respectively, P < 0�01 vs. control for all the conditions, n = 4)
(Fig. 3).
Considering that activation of the NALP3 inflammasome
requires oligomerization of the proteins NALP3, ASC, TXNIP
and procaspase, we explored changes in the association of these
proteins in response to the sera under study (n = 4). After
immunoprecipitation of ASC, there was an increase in the asso-
ciation of TXNIP and NALP3 in those cells exposed to PreD, HD
and PD sera (increases for TXNIP: 1�4 � 0�4, 1�7 � 0�2 and
1�3 � 0�1, respectively, P < 0�01; increases for NALP3: 1�6 � 0�2,2�2 � 0�0 and 2�7 � 0�1, respectively P < 0�01). Procaspase was
associated with ASC, although no changes were detected in
response to the different media. However, an increased in the
fraction of activated (cleaved) caspase-1 was found, especially in
response to HD and DP conditions (2 � 0�2 and 2�6 � 0�1,respectively P < 0�01) (Fig. 3).
Production of ROS in HUVECs in response to uraemiaUraemic media induced a statistically significant increase in
intracellular ROS levels in HUVECs (n = 4), with average fold
increases of 1�7 � 0�1 (PreD), 2�1 � 0�2 (HD) and 2�7 � (PD),
vs. control P < 0�01(Fig. 4).
Effect of TLR4 blockade in HUVECsIn the presence of an anti-TLR4 antibody, there was a decrease
of the cell surface ICAM-1 expression induced by PreD, HD
and PD sera (decreases of 38% � 4%, 42% � 2% and
28% � 4%, respectively, P < 0�01 for all) and downregulation
of endogenous ROS levels (decreases of 32 � 5%, 41 � 2% and
45 � 6%, respectively, P < 0�01 for all). Phosphorylation levels
of IkB induced by HD and PD also decreased (to 50%, at 30 min
and 40% at 15 min, P < 0�05), whereas no changes were found
in Akt phosphorylation. Expression of the NALP3 inflamma-
some-associated protein TXNIP decreased when TLR4 was
inhibited (up to 38% at 30 min, P < 0�05) (Fig. 5).
Discussion
Results from the present study indicate that two crucial ele-
ments of the innate immune response, TLR4 and the multi-
protein oligomer NALP3 inflammasome, participate in the
development of endothelial activation in response to uraemic
media. Our findings demonstrate that TLR4 is constitutively
expressed in HUVECs and becomes upregulated in response to
the uraemic environment, which also promote the generation of
intracellular reactive oxygen species. In addition, the inflam-
matory response induced by the uraemic conditions on HU-
VECs appears to be mediated by the assembly of the different
components of the NALP3 inflammasome, more notably in
response to the uraemic media from patients under renal
replacement therapies (RRT). These effects were partially
prevented by TLR4 blockade.
Using HUVECs in culture, our group has previously char-
acterized the endothelial activation and damage associated
with CKD. When exposed to growth media containing sera
from patients on haemodialysis, cells showed morphological
alterations, increased proliferation [16], signs of inflammation
[16,17] and an increased thrombogenicity of the generated
extracellular matrix [18,19]. A proteomic approach revealed
changes in the expression of molecules related to inflammation,
such as the high mobility group box protein 1 (HMGB1) and
aldose reductase, and others related to oxidative stress, such as
superoxide dismutase and glutathione peroxidase. These
changes were associated with the activation of the transcription
factor NFjB and seemed more significant in response to urae-
mic media from patients under RRT [14]. Despite the evidence
generated until now, the precise mechanisms involved in the
detection of the damage signals and the activation of the
European Journal of Clinical Investigation 5
TLR4 AND NALP3 IN ENDOTHELIAL DYSFUNCTION
inflammatory response are not yet determined. In this regard,
our results point towards the presence of damage-associated
molecular patterns (DAMPS) in the uraemic media, such as
some of those identified through the proteomic approach that
could activate TLR and the innate immunity.
DAMPs include toxins but also molecules released by acti-
vated or necrotic cells and the extracellular matrix (ECM)
molecules that are upregulated upon injury or degraded fol-
lowing tissue damage, and constitute vital danger signals that
alert our immune system of tissue damage [22]. The innate
immune system is rapidly activated and initiates an inflam-
matory cascade in response not only to infection, but also to
tissue injury and trauma. DAMP activation of TLRs induces
inflammatory gene expression to mediate tissue repair [23].
DAMPs have also been implicated in diseases where excessive
inflammation plays a key role in their pathogenesis [24]. All
TLR signalling pathways culminate in the activation of NFjB,which controls the expression of an array of proinflammatory
Figure 2 TLR4 signalling pathway in HUVECs exposed to uraemic media. Images show immunoblots corresponding to time-dependent changes in the presence of TLR4, phospho-Akt and phospho-IjB in endothelial cells exposed to media containing serafrom healthy donors (C) and patients with CKD under conservative treatment (PreD), undergoing haemodialysis (HD) and underperitoneal dialysis (PD) during the times indicated.
6 ª 2014 Stichting European Society for Clinical Investigation Journal Foundation
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cytokine genes [25]. In view of our previous results, in which
NFjB seems to play a crucial role, we hypothesized the
potential role of TLRs in recognizing those DAMPs present in
the uraemic media.
Results from the present study demonstrate the presence of
TLR4 in HUVECs and upregulation of this receptor in response
to uraemia. This effect was associated with the activation of
NFjB. Although the cell stress-related protein Akt was also
found to become activated under our experimental conditions,
no correlation with TLR4 could be established. NFjB is an
important transcription factor that is activated by a wide vari-
ety of stimuli, controls the expression of a large number of
genes and mediates the pathogenesis of various diseases
[26,27]. Activation of NFjB is important for eliciting innate
immune responses, as well as for the subsequent development
of adaptive immune responses [20]. NFjB is an attractive target
for therapeutic intervention but, due to its ubiquity, its unse-
lective inhibition could result in complex side effects. In con-
trast, modulation of receptor mechanisms, such as TLR, could
be beneficial in the termination, prevention and/or modulation
of inflammation.
There is an evidence on the presence of recognized DAMPs
such as HMGB1 [7,28], overexpressed in endothelial cells
exposed to uraemia [6], and advanced glycation end products
(AGEs), oxidized LDL, among other factors commonly accu-
mulated in CKD patients [28]. Furthermore, the role of
microbial-derived end products from the microbiota could also
play a role in the activation of TLR. Both, presence of DAMPs
in plasma and production of reactive oxygen species (ROS)
[29], have been reported to be implicated in the regulation of
inflammasome activation [12,30]. The NALP3 inflammasome is
a protein complex that stimulates caspase-1 activation to pro-
mote the processing and secretion of proinflammatory cyto-
kines [10,31], thus constituting a feedback mechanism to
perpetuate the inflammatory response. The present study
demonstrates that the uraemic condition per se and dialysis
procedures induce the inflammatory phenotype in endothelial
cells through ROS production and activation of the TXNIP-
NALP3 pathway, with the activation of the caspase-1.
Assembly of TXNIP, NALP3 protein and caspase-1 was more
notable in response to sera from patients under RRT. More-
over, the decrease of both intracellular ROS and TXNIP
expression in the presence of a neutralizing anti-TLR4 anti-
body demonstrate that there is an association between TLR4
and NALP3 inflammasome. It is also important to emphasize
that in our study, patients were carefully selected to elucidate
(a)
(b)
Figure 3 Expression and assembly of theinflammasome NALP3 components inHUVECs in response to uraemic media.HUVECs were exposed to media containingsera from healthy donors (C) and patientswith CKD under conservative treatment(PreD), undergoing haemodialysis (HD) andunder peritoneal dialysis (PD) to evaluate:A. Changes in the presence of thethioredoxin-interacting protein (TXNIP) andNALP3 in cell lysates. B. The association ofTXNIP, NALP3, procaspase-1, caspase-1and ASC, after immunoprecipitation of ASCwith a specific antibody, followed byimmunoblotting for each protein.
European Journal of Clinical Investigation 7
TLR4 AND NALP3 IN ENDOTHELIAL DYSFUNCTION
the role of the uraemic state per se on EC dysfunction, rather
than other comorbidities associated with CKD and endothelial
dysfunction, such as diabetes.
According to the USRDS 2011 Annual Data Report, mortality
rates of dialysed patients have declined in the last years
probably reflecting changes in catheter utilization, improved
Figure 4 ROS production in HUVECsexposed to uraemic media. HUVECs werestained with the cell-permeable ROSdetection reagent H2DFFDA (10 lM,10 min), washed with PBS, and exposed tomedia containing sera from healthy donors(C) and patients with CKD underconservative treatment (PreD), undergoinghaemodialysis (HD) and under peritonealdialysis (PD), for 30 min. ROS productionwas detected by fluorescence microscopy.
Figure 5 Effect of TLR4 inhibition onHUVECs exposed to uraemic media.HUVECs were pretreated with a neutralizinganti -TLR4 antibody (5 lg/mL) for 1 h.Micrographs show the reduction on theexpression of ICAM-1 and ROS generationin the presence (+ IgG anti -TLR4) of theantibody, compared to the absence (w/oIgG anti -TLR4), when cells were exposed tosera from PD patients. Images are alsorepresentative of the results obtained withPreD and HD samples. Immunoblotscorrespond to phosphorylation kinetics andpresence (pIjB, IjB, respectively) of IjB andto TXNIP presence in response to sera fromPD patients. The inhibition of TLR4decreased pIjB levels, without affectingIjB, and also inhibited TXNIP increases dueto the exposure of cells to the PD sera.Images are also representative of theresults obtained with the HD sera.
8 ª 2014 Stichting European Society for Clinical Investigation Journal Foundation
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cardiovascular disease care and changes in infectious
complications. However, cardiovascular disease is still the
major cause of the limited life expectancy in patients on sub-
stitutive therapies [32]. In a previous study, we observed
changes in molecules related to inflammation in endothelial
cells in response to the sera obtained from the three groups of
uraemic patients, being more evident in response to those
samples from patients under RRT [14]. Haemodialysis,
although necessary, induces cell activation and the release of
cytokines to the humoral component, in a similar manner as
that produced by inflammatory states. Furthermore, patients
under peritoneal dialysis are often hypertensive and sometimes
volume overloaded [33], two factors contributing to endothelial
damage in these patients [34]. In addition, through our previ-
ous studies [14], we also demonstrated that the high glucose
concentrations and glucose degradation products present in the
fluid for peritoneal dialysis could contribute to this endothelial
damage. Therefore, it is plausible to expect an additional pro-
inflammatory effect due to the RRT.
In conclusion, our study provides compelling evidence of the
presence and role of two basic elements of the innate immune
response, TLRs and the inflammasome NALP3, in inflammation
and the progression of endothelial dysfunction associated with
chronic kidney disease. Specifically, we identified TLR4
expression in primary cultures of endothelial cells. Further-
more, our findings link Akt and NFjB activation, ROS produc-
tion and NALP3 expression with surface stimulation of TLR4,
thus suggesting that this pathway contributes to inflammation
mediated endothelial dysfunction in CKD. In addition, the
humoral conditions present in the uraemic state per se and,
specially, in those due to the RRT, activate an alternative path-
way of inflammation, such as that occurring through the
assembly of the multiprotein oligomer NALP3 inflammasome.
These results may have important clinical implications as the
prevention and treatment strategies based on the inhibition of
TLR4 signalling and also on the blockade of any of the different
components of the NALP3 inflammasome may become future
targets to improve endothelial dysfunction, reduce inflamma-
tion and improve the CV risk in patients with CKD.
AddressDepartment of Hemotherapy-Hemostasis, Institut d’Investiga-
cions Biom�ediques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Hospital
Clinic, Universitat de Barcelona, Villarroel 170, 08036 Barce-
lona, Spain (S. Martin-Rodriguez, C. Caballo, G. Gutierrez, G.
Escolar, M. Diaz-Ricart); Department of Nephrology, Institut
d’Investigacions Biom�ediques August Pi i Sunyer (IDIBAPS),
Hospital Clinic, Universitat de Barcelona, Villarroel 170, 08036
Barcelona, Spain (M. Vera, A. Cases); Diaverum Institut He-
modi�alisis, Arıstides Maillol 15, 08028 Barcelona, Spain (J. M.
Cruzado).
AcknowledgementsWe wish to thank the staff of the Hospital of Sant Joan de D�eu
and Hospital de la Maternitat, Barcelona, for providing the
umbilical cords. We would like to thank Patricia Molina for her
technical support.
FundingThis work has been supported partially by grants SAF2011-
28214 (Secretar�ıa de Estado de Investigaci�on, Desarrollo e
Innovaci�on, Ministerio de Econom�ıa y Competitividad, Spain,
Fondos FEDER) and RD12/0042/0016 (Red de Investigaci�on
Cardiovascular, Instituto de Salud Carlos III, Spain).
Correspondence to: Maribel Diaz-Ricart, Hemotherapy-
Hemostasis, Hospital Clinic, Villarroel 170, 08036 Barcelona,
Spain. Tel.: 34 93 227 54 00; fax: 34 93227 98 89; e-mail:
Received 16 June 2014; accepted 9 December 2014
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Lupus. 2015 Oct;24(11):1143-9.
Abstract
Severe deficiency of ADAMTS13 activity leads to von Willebrand factor (VWF)
ultralarge multimers with high affinity for platelets, causing thrombotic
thrombocytopenic purpura. Other pathological conditions with moderate ADAMTS13
activity exhibit a thrombotic risk. We examined the ADAMTS13 activity in systemic
lupus erythematosus (SLE) and its value as a thrombotic biomarker.
ADAMTS13 activity, VWF antigen and multimeric structure, and vascular cell adhesion
molecule 1 (VCAM-1) were measured in plasma samples from 50 SLE patients and 50
healthy donors. Disease activity (systemic lupus erythematosus disease activity index;
SLEDAI) and organ damage (systemic lupus international collaborating clinics) scores,
thrombotic events, antiphospholipid syndrome (APS) and anti-phospholipid antibodies
(aPLs) were registered.
SLE patients showed decreased ADAMTS13 activity and high VWF levels compared
with controls (66 27% vs. 101 8%, P < 0.01, and 325 151% vs. 81 14%, P < 0.001).
VCAM-1 levels were higher in SLE patients (P < 0.05). Considering three groups of
SLE patients depending on ADAMTS13 activity (>60%, 60–40% and <40%),
comparative analysis showed significant association between ADAMTS13 activity and
SLEDAI (P < 0.05), presence of aPLs (P < 0.001), APS (P < 0.01) and thrombotic
events (P < 0.01). Reduced ADAMTS13 activity together with increased VWF levels
were especially notable in patients with active disease and with aPLs.
ADAMTS13 activity, in combination with other laboratory parameters, could constitute a
potential prognostic biomarker of thrombotic risk in SLE.
Key words: Systemic lupus erythematosus; ADAMTS13 activity; SLEDAI
RESULTADOS
76
Resumen
La deficiencia severa de la actividad de ADAMTS13 conduce a multímeros
ultragrandes de factor von Willebrand (FvW) con alta afinidad por las plaquetas,
causando púrpura trombocitopénica trombótica. Otras afecciones patológicas con
actividad ADAMTS13 moderada presentan un riesgo trombótico. Se examinó la
actividad de ADAMTS13 en el lupus eritematoso sistémico (LES) y su valor como
biomarcador trombótico.
Se midió la actividad ADAMTS13, el antígeno FvW y la estructura multimérica, y la
molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1) en muestras de plasma de 50
pacientes con LES y 50 donantes sanos. Se registraron los índices de actividad de la
enfermedad (índice de actividad del lupus eritematoso sistémico, SLEDAI) y daños en
los órganos (clínicas colaboradoras internacionales de lupus sistémico), eventos
trombóticos, síndrome antifosfolípido (SAF) y anticuerpos antifosfolípidos (aPLs).
Los pacientes con LES mostraron una disminución de la actividad de ADAMTS13 y
altos niveles de FvW en comparación con los controles (66 27% vs. 101 8%, P <0,01 y
325 151% vs. 81 14%, P <0,001). Los niveles de VCAM-1 fueron mayores en los
pacientes con LES (p <0,05). El análisis comparativo mostró una asociación
significativa entre la actividad de ADAMTS13 y SLEDAI (P <0,05), la presencia de
aPLs (P <0,001), SAF (P <0,01) y eventos trombóticos (P <0,01). La actividad reducida
de ADAMTS13 junto con un aumento de los niveles de FvW fueron especialmente
notables en pacientes con enfermedad activa y con aPLs.
La actividad de ADAMTS13, en combinación con otros parámetros de laboratorio,
podría constituir un potencial biomarcador pronóstico del riesgo trombótico en el LES.
Palabras clave: Lupus eritematoso sistémico; Actividad ADAMTS13; SLEDAI
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Lupus (2015) 0, 1–7
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PAPER
Reduced ADAMTS13 activity is associated with thrombotic risk in
systemic lupus erythematosus
S Martin-Rodriguez1, JC Reverter1, D Tassies1, G Espinosa2, M Heras3, M Pino1, G Escolar1 and M Diaz-Ricart11Hemotherapy-Hemostasis Department; 2Systemic Autoimmune Diseases Department; and 3Cardiology Department. Institut Clinic del Torax.
Institut d Investigacions Biomediques August Pi i Sunyer, Hospital Clınic, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain
Background: Severe deficiency of ADAMTS13 activity leads to von Willebrand factor (VWF)ultralarge multimers with high affinity for platelets, causing thrombotic thrombocytopenicpurpura. Other pathological conditions with moderate ADAMTS13 activity exhibit a throm-botic risk. We examined the ADAMTS13 activity in systemic lupus erythematosus (SLE) andits value as a thrombotic biomarker. Methods: ADAMTS13 activity, VWF antigen and multi-meric structure, and vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) were measured in plasmasamples from 50 SLE patients and 50 healthy donors. Disease activity (systemic lupus erythe-matosus disease activity index; SLEDAI) and organ damage (systemic lupus internationalcollaborating clinics) scores, thrombotic events, antiphospholipid syndrome (APS) and anti-phospholipid antibodies (aPLs) were registered. Results: SLE patients showed decreasedADAMTS13 activity and high VWF levels compared with controls (66� 27% vs.101� 8%, P< 0.01, and 325� 151% vs. 81� 14%, P< 0.001). VCAM-1 levels were higherin SLE patients (P< 0.05). Considering three groups of SLE patients depending onADAMTS13 activity (>60%, 60–40% and <40%), comparative analysis showed significantassociation between ADAMTS13 activity and SLEDAI (P< 0.05), presence of aPLs(P< 0.001), APS (P< 0.01) and thrombotic events (P< 0.01). Reduced ADAMTS13 activitytogether with increased VWF levels were especially notable in patients with active disease andwith aPLs. Conclusion: ADAMTS13 activity, in combination with other laboratory param-eters, could constitute a potential prognostic biomarker of thrombotic risk in SLE. Lupus(2015) 0, 1–7.
Key words: Systemic lupus erythematosus; ADAMTS13 activity; SLEDAI
Introduction
Von Willebrand factor (VWF) is an adhesive, mul-timeric glycoprotein synthesized by endothelialcells1 and megakaryocytes,2 which plays an essen-tial role in hemostasis.3 After vascular damage,VWF mediates platelet adhesion by binding toexposed subendothelial collagen. VWF also carriesand stabilizes factor VIII in blood circulation.4
The normal hemostatic function of VWFdepends on its multimeric size. This is physiologic-ally regulated by the metalloproteinaseADAMTS13. ADAMTS13 (a disintegrin and
metalloproteinase with a thrombospondin type 1motif, member 13) is a protease synthesized byhuman stellate hepatic cells and vascular endothe-lial cells, which cleaves specifically ultralarge VWFmultimers at the VWF-A2 domain, generatingshorter globular multimers in the normal circula-tion.5,6 A lack of proteolitic activity results in thepresence of unsual hyperadhesive large VWFstrings on the endothelial cell surface, which aremore likely to bind to platelets than normal globu-lar VWF, leading to platelet aggregation andthrombus formation in the microvasculature.7,8
ADAMTS13 severe deficiency (<5% ofADAMTS13 activity) is considered to bethe cause of thrombotic thrombocytopenicpurpura (TTP), a syndrome characterized bythrombocytopenia, hemolytic anemia and throm-botic events in microvasculature, which results inorgan damage, of which renal impairment and
Correspondence to: Maribel Diaz-Ricart, Department of
Hemotherapy-Hemostasis, Hospital Clınic, 170 Villarroel Street,
08036 Barcelona, Spain.
Email: [email protected]
Received 13 May 2014; accepted 3 March 2015
! The Author(s), 2015. Reprints and permissions: http://www.sagepub.co.uk/journalsPermissions.nav 10.1177/0961203315579091
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neurological symptoms are the most common clin-ical features.9,10 ADAMTS13 activity deficiency iscaused by mutations in the ADAMTS13 gene(Upshaw–Schulman syndrome)11 or with the devel-opment of inactivating autoantibodies against theprotease (acquired TTP).12
In addition, there are studies demonstrating thatADAMTS13 activity could also be reduced in otherpathological conditions such as sepsis,13 cirrhosis,14
malignancy,15 autoimmune disorders, multisyste-mic inflammatory states16 and in other conditionssuch as organ transplantation or associated to theadministration of specific drugs.16,17 Moreover, ithas been described that a mild to moderate defi-ciency of ADAMTS13 has clinical significance,contributing to increase the risk of thrombosis indiseases that share in common the presence of sys-temic inflammation.18,19
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an auto-immune disease characterized by multisystemicchronic inflammation and the presence of immunecomplexes associated with organ damage and sys-temic clinical manifestations involving the skin,joints, kidneys, nervous system and blood, amongother elements.19,20 SLE patients have an increasedrisk of cardiovascular events, resulting from bothatherosclerosis21 and thromboembolic events.20
Thrombosis is one of the life-threatening complica-tions in SLE, with an approximate prevalence of10% in the SLE population.22,23 These thromboticevents in SLE have similar clinical features to thosefound in TTP, and could be ascribed to endothelialdamage caused by the inflammatory condition pre-sent in SLE.24,25
This study was designed to evaluate the potentialrelation between low to moderate levels ofADAMTS13, endothelial damage and the throm-botic risk present in patients with SLE.
Patients and methods
Experimental design
A total of 50 consecutive SLE patients from thesystemic autoimmune outpatient clinic wereincluded in this study. Healthy individuals withoutautoimmune disease, thrombotic risk or a historyof thrombosis were selected as controls. The twogroups were matched for age (range 16–58 yearsin patients, range 20–50 years in controls) andgender (4% men and 96% women in patients,10% men and 90% women in controls).
SLE clinical manifestations were evaluatedaccording to the American Rheumatism
Association glossary committee, and activity ofthe disease and SLE-associated organ damagewere scored using the systemic lupus erythematosusdisease activity index (SLEDAI) and systemic lupusinternational collaborating clinics (SLICC),respectively.26 Other laboratory parameters relatedto SLE were also registered (Table 1). Sixty per centof the SLE patients were on treatment with pred-nisone, and 25% were on treatment with immuno-suppressants (cyclophosphamide, azathioprine andmethotrexate). Other medications used were non-steroidal anti-inflammatory agents, hydroxychloro-quine and antiplatelet agents. Four out of 50 SLEpatients included had thrombotic episodes: ische-mic stroke (one), deep venous thrombosis (one)and deep venous thrombosis and pulmonaryembolism (two). Three of these patients receivedoral anticoagulation.
Informed consent was obtained from all patientsand donors for blood utilization. The study wasapproved by the ethical committee of the hospitalclinic and was carried out according to the prin-ciples of the Declaration of Helsinki.
To carry out the present study, ADAMTS13activity, VWF and VCAM-1 levels were measuredin plasma samples from SLE patients and the
Table 1 Clinical characteristics of the patients with SLEincluded
Age 32 (16–58)
Sex (female (%)/male (%) 96%/4%
Antiphospholipid antibodies (%) 28%
Lupus anticoagulant (LA) 16%
Anticardiolipin antibodies (aCL) 20%
Anticardiolipin antibodies IgG/IgM/IgG–IgM 8%/8%/4%
Anti-b2-glycoprotein-1 antibodies (anti-b2GPI) 12%
Anti-b2GPI IgG/IgM/IgG-IgM 4%/6%/2%
SLE clinical manifestations (%)
Arthritis 98%
Skin involvement 78%
Glomerulonephritis 54%
Class V/IV/III/II 8%/36%/6%/4%
Neprhotic syndrome 40%
Renal failure 8%
Hematological involvement 42%
Hemolytic anemia/thrombocytopenia 22%/34%
Serositis 28%
Neurological involvement 16%
Antiphospholipid syndrome 16%
SLEDAI mean� SD (range) 6.64� 4 (2–21)
SLICC mean� SD (range) 2.66� 1 (1–6)
Controls were matched for age (range 20–50 years) and gender (90%
women and 10% men).
SLE: systemic lupus erythematosus; SLEDAI: systemic lupus erythe-
matosus activity index; SLICC: systemic lupus international collabor-
ating clinics.
ADAMTS13 activity and thrombotic risk in SLES Martin-Rodriguez et al.
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controls. Results were correlated with clinical par-ameters of the disease in patients with SLE.
Sample collection and processing
Nine parts of venous blood from SLE patients werecollected into one part of 3.8% sodium citrate.Platelet-poor plasma (PPP) was obtained by centri-fugation at 2500 rpm for 20 minutes and PPP sam-ples were aliquoted and immediately stored at�80�C until testing. Plasma samples from 50healthy donors were used as controls.
Tests using plasma samples were performed inrandom order and analysis of results was per-formed on a blinded basis.
ADAMTS13 activity assay
Fluorescence resonance energy transfer (FRET)methodology was performed using a synthetic 73amino acid VWF peptide as fluorescence-quench-ing substrate.27 Plasma samples were diluted 1:25 in5mM Tris HCl, 25mM calcium chloride (pH 6),0.005% Tween-20, 100mM4-(2-aminoethyl)-ben-zenesulfonyl fluoride, hydrochloride PEFABLOCSC (Roche, Mannheim Germany) dilution buffer.
One hundred microlitres of calibration test andcontrol samples were added into a 96-well whiteplate (Sterilin Ltd., Newport, UK) and incubatedat 37�C for 10 minutes. After this, 100 ml of theFRET-VWF 73 substrate solution were added toeach well and fluorescence was measured by a fluor-escence microplate reader (Fluoroskan Ascent FL;Thermolab Systems, Waltham, MA, USA)(�ex¼ 340 nm, �em¼ 450 nm at 37�C) every 5 min-utes up to 1 hour. The normal range forADAMTS13 activity was calculated based onmeasurements on 50 different healthy donors,being 101� 8%.
Measurement of VWF antigen and VCAM-1 levels
Measurement of VWF antigen levels was per-formed by an enzyme-linked immunoabsorbentassay (ELISA), using a commercial sandwichELISA (DG-EIA vWF; Grifols, Barcelona,Spain). Sample concentration was optimizedbecause WVF antigen exceeded the highest pointof the standard curve. Plasma levels of solubleVCAM-1 were measured by using the humanVCAM-1 ELISA kit (Millipore Corporation,Billerica, MA, USA) according to the manufac-turer’s instructions. Absorbance was immediatelyread at 450 nm by MultiSkan Ascent (ThermoElectron Corporation, Finland). Normal rangesare 50–160% for VWF (according to the
manufacturer’s protocol) and 400–650 ng/ml forVCAM-1 (according to the laboratory standards).
Evaluation of the VWF multimer structure byagarose gels
Analysis of VWF multimers was carried out bysodium dodecyl sulphate-agarose discontinuousgel electrophoresis followed by protein transfer tonitrocellulose membranes by western blotting.Blots were probed using horseradish peroxidase(HRP) conjugated rabbit anti-VWF; visualisationof VWF multimers was achieved using a commer-cially available enhanced chemiluminescence kit fordetecting HRP labelled antibodies on westernblots.28
Anti-ADAMTS13 antibodies assay
The TECHNOZYM ADAMTS13 INH ELISA kit(Technoclone, Vienna, Austria) was used for thedetection of human IgG autoantibodies againstADAMTS13 in those patients whose ADAMTS13activity was lower than 60%. The ELISA test wasperformed according to the manufacturer’s proto-cols. Measurement was performed by ELISA readerMultiSkan Ascent (Thermo Electron Corporation,Finland) at 450 nm (IgG ADAMTS13 antibodiespositive if above 15U/mL).
Statistical analysis
Quantitative results were expressed asmean� standard deviation and percentages.Statistical analysis was performed using theStudent’s t test and linear regression analysisfor parametric data and chi-squared (�2) fornon-parametric data. Results were considered stat-istically significant when P< 0.05. Statistically sig-nificant levels indicated in the text refer to the t test,except where indicated.
Results
ADAMTS13 activity levels
ADAMTS13 activity values were significantlyreduced in patients with SLE (66� 27% vs.101� 8% in healthy individuals, P< 0.01). InSLE patients, ADAMTS13 activity was below60% (38� 14%, n¼ 20) in 40% of the SLEpatients. ADAMTS13 activity was between 60%and 40% (50� 6, n¼ 9) in 18% of SLE patients,whereas 22% showed ADAMTS13 activity below
ADAMTS13 activity and thrombotic risk in SLES Martin-Rodriguez et al.
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40% (29� 11%, n¼ 11). No patient could be iden-tified as having a severe deficiency of ADAMTS13activity (<5%), 13% being the lowest value in thegroup of SLE patients studied (Figure 1(a)).
VWF antigen levels and multimeric structure
VWF levels were significantly elevated in all SLEpatients included in our study (325� 151% vs.81� 14% in healthy individuals, P< 0.001)(Figure 1(b)).
Although moderate, there was a statistically sig-nificant inverse correlation (Pearson correlation,r¼�0.3) between levels of VWF and activitylevels of ADAMTS13 (P< 0.05).
No abnormalities were observed in the multi-meric patterns of VWF in the patients’ plasmawhen compared with those observed in controlsamples (see Figure 1(c)).
Evaluation of endothelial activation through solubleadhesion molecule VCAM-1 analysis
Levels of soluble VCAM-1 were found to be not-ably and significantly higher in almost all theplasma samples from patients with SLE (range of564–4991 ng/ml vs. 502–694 ng/ml in healthydonors, P< 0.05). Comparing subgroups ofpatients with ADAMTS13 activity greater than
60% and less than 60%, we found that those whohad protein activity values less than 60% presentedVCAM-1 levels significantly higher than those withADAMTS13 activity levels greater than 60%(mean� SEM of 2319� 293 vs. 1561� 223 ng/ml,respectively, P< 0.05). However, no significant cor-relation was found between ADAMTS13 activitylevels and VCAM-1 levels.
Relationship between ADAMTS13 activity levelsand indicators of disease activity (SLEDAI) andorgan damage (SLICC)
The population of SLE patients included in the pre-sent study showed low to medium SLEDAI(6.64� 4) and SLICC (2.6� 1) scores. TheSLEDAI score was significantly higher in SLEpatients with ADAMTS13 activity levels less than60% (8.6� 5) than in patients with ADAMTS13activity greater than 60% levels (5.3� 3) (P< 0.01).
The presence of active disease, considered whenthe SLEDAI score was greater than 6, was signifi-cantly associated with low levels of ADAMTS13activity (P< 0.05, �2 test), from the comparativeanalysis among three groups of SLE patients estab-lished depending on ADAMTS13 activity (>60%,between 60–40% and <40%).
In relation to SLE patients with SLEDAI scoresgreater than 6 (n¼ 22), 59% hadADAMTS13 activ-ity levels less than 60% and 36% had ADAMTS13activity levels less than 40% (Table 2).
Statistical analysis showed no correlationbetween SLICC and the metalloprotease levels.
IgG anti-ADAMTS13 autoantibodies
IgG anti-ADAMTS13 autoantibodies were deter-mined by ELISA only in those plasma samplesfrom SLE patients with ADAMTS13 activitylevels below 60%. The presence of IgG againstADAMST13 was positive only in three SLEplasma samples (15%) being of 63U/ml in twosamples and 70U/ml in the other. These samplesshowed ADAMTS13 activity levels of 38%, 40%and 51%. Additional evaluation of ADAMTS13activity in mixtures of patients plasma and controlplasma in a 1:1 proportion gave values of 70%,53% and 81%, respectively. Therefore, only onesample out of 50 showed significant inhibitoryaction on ADAMTS13 activity (around 50% ofinhibition).
ADAMTS13 activity and other disease parameters
Fourteen SLE patients were positive for one, twoor three of the antiphospholipid antibodies (aPLs)
Figure 1 (a) Bar diagrams representing ADAMTS13 activitylevels (mean� SD, n¼ 50 patients, n¼ 50 healthy donors). (b)Bar diagrams representing VWF antigen levels (mean� SD,n¼ 50 patients, n¼ 50 healthy donors). (c) Multimeric patternof VWF resolved through agarose gels (1.2%). *P< 0.01versus control.
ADAMTS13 activity and thrombotic risk in SLES Martin-Rodriguez et al.
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LA, aCL and ab2GPI. Twelve of these patients(85%) exhibited reduced ADAMTS13 activity,and seven of them showed values less than 40%.
Of the eight patients diagnosed with APS SLE,seven (88%) had ADAMTS13 activity levels lessthan 60%, being less than 40% in 50% of them.
Four out of the 50 SLE patients included in thestudy had a thrombotic episode (which stands for8% of the patients with SLE). All four patients whoexperienced thrombotic events were found to pre-sent ADAMTS13 activity levels less than 60%.Interestingly, three out of four of these patientspresented ADAMTS13 activity levels less than40% (Table 2). Levels of ADAMTS13 activity inthese patients were 46%, 37%, 32% and 17%.
An additional comparison of the distribution (�2
test) of the number of SLE patients with the pres-ence of aPLs, APS SLE and thrombotic eventsamong the three groups of SLE patients (estab-lished depending on ADAMTS13 activity >60%,between 60–40% and <40%), demonstrated a stat-istically significant association between low levelsof ADAMTS13 activity and the presence of aPLs(P< 0.001), APS SLE (P< 0.01) and thromboticevents (P< 0.01).
Discussion
SLE is an autoimmune disease in which the mainpathological features are systemic inflammationtogether with elevated levels of proinflammatorycytokines, the presence of autoantibodies and thedeposition of immune complexes in target tissues.29
One of the main causes of morbidity and mortalityamong SLE patients is the development of throm-botic events,20 which are caused by microvascula-ture occlusion similar to that occurring in TTP.30
While the presence of autoantibodies neutralizingADAMTS13 are known to be the main cause ofmicrothrombosis in acquired TTP,12 the pathogenicmechanisms of thrombosis in SLE still remainunknown. The hypothesis of our present studywas that ADAMTS13 activity could be reduced inSLE and this deficiency could have an impact onthe clinical outcome of the disease.
ADAMTS13 activity in the patients included inour study was found to be mildly to moderatelydeficient, although never as severe as in TTP.These results were associated with very high levelsof plasma VWF, with a moderate inverse correl-ation. VWF is a marker of endothelial damageand these high values, together with the increasedlevels of VCAM-1, another marker of endothelialharm, could be indicating the presence of endothe-lial activation and damage in association with SLE.
Endothelial injury is a common pathologicalcondition in different diseases in which inflamma-tion is present, such as obesity,31 diabetes andchronic renal failure,32 and even in associationwith treatments such as hematopoietic stem celltransplantation.33 In these pathological entities,decreased levels of ADAMTS13 have beenreported. In autoimmune disorders, inflammationand the presence of immune complexes can producenot only endothelial activation, with the expressionof adhesion molecules that induce a pro-adhesiveand thrombogenic endothelium, but also endothe-lial dysfunction.34,35 The cause of ADAMTS13deficiency in SLE is still unclear although differenthypotheses could be proposed. Considering thatADAMTS13 is synthesized in the liver, it hasbeen suggested that a lack of synthesis of metallo-proteinase may be due to liver damage, potentiallyascribed to the SLE condition and/or to the treat-ment with immunosuppressant agents, althoughlow levels of ADAMTS13 activity were observedin both treated and untreated SLE patients.Turner et al.36 demonstrated that ADAMTS13 isalso synthesized by endothelial cells. These authorsdetected the presence of both ADAMTS13
Table 2 Clinical and laboratory parameters of the SLEpatients included and correlation with the ADAMTS13 activ-
ity levels (% with respect to the total number of SLE patients)
All
ADAMTS13activity>60%
ADAMTS13activity60–40%
ADAMTS13activity<40%
SLEDAI �6 (%)* 22 (44%) 9 (18%) 5 (10%) 8 (16%)
APS SLE** 8 (16%) 1 (2%) 4 (8%) 3 (6%)
Antiphospholipidantibodies***
14 (28%) 2(4%) 5(10%) 7(14%)
Lupusanticoagulant
8 (16%) – 4 (8%) 4 (8%)
Anticardiolipinantibodies
10 (20%)
IgG 4 (8%) 1 (2%) – 3 (6%)
IgM 4 (8%) – 2 (4%) 2 (4%)
IgG, IgM 2 (4%) 1 (2%) 1 (2%) –
Anti-b2GPI 6 (12%)
IgG 2 (4%) 1 (2%) – 1 (2%)
IgM 3 (6%) – 2 (4%) 1 (2%)
IgG, IgM 1 (2%) – 1 (2%) –
Thrombotic events* 4 (8%) – 1 (2%) 3 (6%)
Levels of statistical significance reached by using �2 test for compari-
son between levels of ADAMTS13 activity and clinical parameters in
the three groups of SLE patients established depending on
ADAMTS13 activity levels, as indicated: *P< 0.05, **P< 0.01,
***P< 0.001.
SLE: systemic lupus erythematosus; SLEDAI: systemic lupus erythe-
matosus activity index; APS: antiphospholipid syndrome.
ADAMTS13 activity and thrombotic risk in SLES Martin-Rodriguez et al.
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messenger RNA and antigen in cultured humanendothelial cells from venous and arterial locations,functionally active even under static conditions.Therefore, considering that the endothelium maybe an important source of ADAMTS13 because ofthe high number of endothelial cells along themicro-vasculature, the potential activation anddamage dueto the inflammatory state in SLE, as derived fromthe high levels of VWF and VCAM-1, could becausing ADAMTS13 activity deficiency. Moreover,reduced ADAMTS13 activity levels may result froman increased consumption due to the high amountsof its physiological substrate VWF.37
Development of autoantibodies againstADAMTS13 could be another putative mechan-ism.38 In our SLE patients, the presence ofanti-ADAMTS13 IgG was rare and there was nota strong correlation with the correspondingADAMTS13 activity levels. However, othersubclasses of antibodies, such as IgM anti-ADAMTS13, or the development of non-neutraliz-ing antibodies that induce modifications in theprotein clearance may be also be considered as pos-sible mechanisms, but no conclusion can be drawnat the moment.
Our SLE cohort included patients with both APSsecondary to SLE and different types of aPL with-out a diagnosis of APS. aPLs belong to a heteroge-neous group of antibodies against different plasmaproteins that bind phospholipids.39 The presence ofaPLs, characteristic of APS, is associated with thedevelopment of a prothrombotic state.40,41 APS wasfirst described in SLE, although it may appear as aprimary disease, but aPLs may also be found in SLEwithout APS. It is interesting to point out that mostof the patients with detectable aPLs showed levels ofADAMTS13 activity below 60%. Other in-vitro stu-dies suggest that the presence of aPLs promoteendothelial activation through the expression ofadhesion molecules, such as VCAM-1.41 Taking allthese findings together, the high levels of VWF andVCAM-1 described and the reduced levels of theVWF cleaving protease would lead to the develop-ment of a prothrombotic state increasing the throm-botic risk present in SLE patients.
In our study, ADAMTS13 activity was speciallyreduced in patients with active disease. The patho-genic role of ADAMTS13 in unexpected throm-botic events occurring in acute episodes ofchronic inflammatory diseases is the subject ofcurrent investigation. These thrombotic eventshave been associated with decreased ADAMTS13activity levels in ischemic stroke,42 in acute inflam-matory episodes in chronic kidney disease,16,32 and
in other clinical situations such as sepsis or bonemarrow transplantation.13,33,43
In our SLE cohort, four SLE patients had throm-botic complications, which constitute 8% of the SLEpatients selected. This result is in agreement with theestimated frequency of thrombotic events in the SLEpopulation, according to prospective studies.23
Interestingly, all SLE patients who developedthrombosis presented low levels of ADAMTS13.
Comparative analysis of the distribution of thenumber of SLE patients with SLE-related antibo-dies, APS SLE and thrombotic events among thethree groups of SLE patients (established depend-ing on ADAMTS13 activity >60%, between60–40% and <40%), demonstrated a statisticallysignificant association between low levels ofADAMTS13 activity and the presence of antibo-dies, APS SLE and thrombotic events.
In conclusion, our present findings show thatSLE is a pathological condition with mild to mod-erate ADAMTS13 activity deficiency and highlevels of VWF and VCAM-1, potentially relatedto endothelial damage. ADAMTS13 activity inSLE is specially reduced in patients with active dis-ease and in those with aPLs. Further studies areneeded to clarify the pathogenesis of this deficiencyand its role in the thrombotic complicationsobserved in SLE. Since the size of the study popu-lation is relatively small, we cannot state that lowerlevels of ADAMTS13 are predictive of thromboticrisk. Nevertheless, our results are powerful enoughto detect significant differences in the thromboticrisk in subgroups of SLE patients with lowerlevels of ADAMTS13. Further studies in largergroups of patients will be required to explorewhether levels of ADAMTS13 and VWF could becombined with other parameters to generate a scoreor even an algorithm that could be more predictiveof the thrombotic risk in SLE patients.
Funding
This work has been partially supported byMinisterio de Economıa y Competitividad(SAF2011-28214, Fondos FEDER), and HealthInstitute Carlos III (ISCIII): Fondo deInvestigacion Sanitaria (FIS PI13/00517) andCardiovascular Reseach Net (RIC) (RD12/0042/0016) together with the European RegionalDevelopment Funds (FEDER).
Conflict of interest statement
The authors declare no conflicts of interest.
ADAMTS13 activity and thrombotic risk in SLES Martin-Rodriguez et al.
6
Lupus
at CRAI-Universitat de Barcelona on March 30, 2015lup.sagepub.comDownloaded from
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ADAMTS13 activity and thrombotic risk in SLES Martin-Rodriguez et al.
7
Lupus
at CRAI-Universitat de Barcelona on March 30, 2015lup.sagepub.comDownloaded from
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Discusión
DISCUSIÓN
87
Existe asociación entre enfermedades inflamatorias crónicas, aterosclerosis acelerada
y un aumento en el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares. Estudios recientes
revelan que el endotelio juega un papel relevante en estas situaciones patológicas.
Los pacientes con patologías inflamatorias presentan signos de disfunción endotelial
incluso antes de la evolución de la propia enfermedad cardiovascular. Es por ello que
es de especial importancia el estudio de la disfunción endotelial en enfermedades
inflamatorias crónicas, pues el endotelio ha de ser visto como un factor integrador del
riesgo vascular donde las señales patogénicas de distintas patologías pueden llegar a
converger en una o varias vías comunes en la génesis de la aterotrombosis.
Los resultados obtenidos durante la elaboración de esta tesis doctoral han permitido
confirmar la presencia de disfunción endotelial en la uremia y conocer la participación
de receptores del sistema inmune en su aparición y desarrollo. En concreto, se
demuestra que el receptor TLR4 y el inflamasoma NALP3, ambos mecanismos de
inmunidad innata, participan en la propagación del estímulo infamatorio, activando vías
de señalización relacionadas con el factor de transcripción NFkB y culminando en la
expresión en la superficie endotelial de moléculas de adhesión ICAM-1. Además, se
produce un viraje hacia el estrés oxidativo, con el aumento de especies reactivas de
oxígeno intracelulares. Los mecanismos descritos en los estudios incluidos en esta
tesis pueden constituir una diana preventiva y/o terapéutica para las complicaciones
cardiovasculares asociadas a patologías inflamatorias crónicas (artículo enviado).
El hecho de que elementos del sistema inmune estén relacionados con la activación y
disfunción endotelial plantea la posibilidad de una asociación entre enfermedades
autoinmunes y disfunción endotelial. Resulta necesario conocer marcadores de
disfunción endotelial que permitan la detección precoz de complicaciones
cardiovasculares en patologías inflamatorias crónicas, incluso mucho antes de su
propio desarrollo. Los resultados de esta tesis indican que en el LES existe una
deficiencia moderada de la proteína ADAMTS13 junto con niveles elevados de FvW y
de VCAM-1 soluble, moléculas asociadas a un escenario proinflamatorio y
protrombrótico. Además, demuestran que esta condición es constante y significativa
en pacientes con enfermedad activa y/o que han sufrido eventos protrombóticos, por lo
que sugiere un aumento en el posible riesgo de sufrir eventos cardiovasculares de tipo
trombótico en episodios activos de la enfermedad, en los que la inflamación excesiva y
la disfunción endotelial parecen jugar un rol relevante.
DISCUSIÓN
88
1.- DISFUNCIÓN ENDOTELIAL EN LA UREMIA. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA
Y BIOQUÍMICA
El desarrollo acelerado de aterotrombosis en la IRC terminal está asociado a la
existencia de disfunción endotelial en estos pacientes. Los factores desencadenantes
son el propio estado tóxico de la uremia y, por otro lado, la activación celular derivada
de los tratamientos sustitutivos. Estos factores promueven el desarrollo de un estado
inflamatorio crónico y de estrés oxidativo, ambos característicos en estos pacientes y
que posiblemente se condicionan mutuamente.
Nuestro grupo de investigación ha sido capaz de caracterizar la disfunción endotelial
asociada a la IRC gracias a un modelo in vitro en el que células endoteliales en cultivo
son incubadas en presencia de medio urémico. La caracterización de los cambios
ocurridos en el endotelio debidos a la exposición al medio urémico ha sido posible
mediante el empleo de técnicas inmunocitoquímicas y bioquímicas de eficacia
contrastada. Un enfoque proteómico nos ha permitido identificar proteínas concretas
relacionadas con el factor de transcripción NFκB, posiblemente involucrado
directamente en el desarrollo de la disfunción endotelial en la uremia (Caballo C. et al,
2012). A pesar de la evidencia generada hasta ahora, los mecanismos exactos que
participan en la detección de los estímulos dañinos y la producción de la consiguiente
respuesta inflamatoria no están totalmente esclarecidos, por lo que resulta crucial el
estudio de los mecanismos que en respuesta a estímulos tóxicos favorecen la
activación del factor de transducción NFκB o de otros factores no explorados
vinculados a la activación de proteínas específicamente relacionadas con la
inflamación.
En este sentido, algunas de las moléculas identificadas en los estudios proteómicos
anteriores han sido reconocidas como señales de alarma o “danger associated
molecular patterns” (DAMP) (Carbo C. et al, 2008; Erlandsson HH. et al, 2004). Los
DAMPs son proteínas y moléculas no proteicas que pueden iniciar y perpetuar la
respuesta inmune en estados inflamatorios no infecciosos, actuando a través de
receptores específicos relacionados con la inflamación. Los receptores más conocidos
para DAMPs son los toll-like receptors (TLR), que son receptores de inmunidad innata,
y complejos proteicos relacionados con procesos inflamatorios, denominados
inflamosomas. Algunos DAMPS pueden actuar sobre TLRs, especialmente TLR2 y
TLR4, para inducir la respuesta inmune y amplificar la respuesta inflamatoria a través
de la activación de factor de transcripción NFκB (Sutton TA. et al, 2011).
DISCUSIÓN
89
Además, las nuevas teorías apuntan a la acción de los inflamosomas, que median la
producción de citoquinas proinflamatorias mediante la regulación de la actividad
enzimática de caspasas (Schroder K. et al, 2010). De estos complejos, el mejor
caracterizado es el NALP3, que consiste en una molécula sensora (receptor NALP3)
conectado a una proteína adaptadora (ASC) responsable de la activación de la enzima
proinflamatoria caspasa-1 (Strowig T. et al, 2012). El ensamblaje de estos
componentes activa una cadena de proteínas señalizadoras (Schroder K. et al, 2010;
Zhou R. et al, 2010), con la participación del factor de transcripción NFkB y la proteína
proinflamatoria p38 (Kasza A., 2013). Nuestra experiencia indica que estas moléculas
se encuentran activadas en HUVEC expuestas a las condiciones urémicas (Carbo C.
et al, 2008; Caballo C. et al. 2012). Curiosamente, la presencia de estrés oxidativo
parece inducir la activación del inflamosoma a través de TXNIP (Zhou R. et al, 2010).
La presente tesis aborda el estudio de los mecanismos moleculares que desde la
recepción del estímulo “tóxico” conducen al desarrollo de la disfunción. El objetivo del
primer estudio fue determinar los mecanismos de recepción del estímulo urémico, la
contribución de elementos moleculares de inmunidad innata y la propagación de la
consiguiente respuesta inflamatoria.
Para llevar a cabo el primer estudio incluido en esta tesis, células endoteliales en
cultivo fueron expuestas a medio suplementado con suero de pacientes urémicos en
tres escenarios diferentes: en tratamiento conservador (prediálisis), o bajo tratamiento
sustitutivo renal, bien mediante hemodiálisis o diálisis peritoneal. Esta diferenciación
entre grupos debería permitir evaluar la contribución del estado urémico per se y el de
los tratamientos sustitutivos. Es importante señalar que los pacientes fueron
seleccionados cuidadosamente con el fin de dilucidar el papel del estado urémico en la
disfunción endotelial, excluyendo aquellos pacientes con comorbilidades asociadas
como la diabetes.
Las células endoteliales expresan TLR4 y el medio urémico incrementa su
expresión
Los resultados del presente estudio demuestran la presencia de TLR4 en HUVEC y la
regulación al alza de este receptor en respuesta a la uremia. Este efecto fue asociado
a la activación de NFκB. La activación de la proteína Akt, relacionada con estrés
celular, no pudo correlacionarse con TLR4 en ninguna de las condiciones
experimentales. NFκB es un importante factor de transcripción que se activa por una
DISCUSIÓN
90
amplia variedad de estímulos, controla la expresión de un gran número de genes e
interviene en la patogénesis de diversas enfermedades. La activación de NFκB es
importante para provocar respuestas inmunitarias innatas, así como para el posterior
desarrollo de la respuesta inmune adaptativa (Sung B. et al, 2010). NFκB constituye
una diana atractiva pero, debido a su ubicuidad, su inhibición no selectiva podría dar
lugar a efectos secundarios complejos. Por otro lado, el TLR4 participa de forma activa
en la primera línea de defensa del organismo reconociendo patrones moleculares
asociados a daño endógeno e iniciando la respuesta inmune (Lee KM. et al, 2009). Si
bien el TLR4 fue incialmente descrito en células propias del sistema inmune, se
conocen cada vez más tipos celulares (Kawai T. et al, 2010).
Los resultados de este primer estudio indican que las células endoteliales presentan
TLR4 con actividad funcional y que dicha función no sólo corresponde a la inmunidad
innata sino que tienen un importante papel en la respuesta inflamatoria. Por tanto, la
modulación de los mecanismos receptoriales, tales como TLR, podría ser beneficiosa
para bloquear, prevenir y/o modular la respuesta inflamatoria.
Presencia del inflamasoma NALP3 en la célula endotelial. Modificaciones en
respuesta al medio urémico y relación con TLR4
Investigaciones llevadas a cabo por nuestro grupo y otros centros de investigación han
confirmado que el medio urémico contiene DAMPs, como la proteína HMGB1
(Erlansson HH. et al, 2004; Zhu P. et al, 2013), productos finales de glucosilación
avanzada (AGE) y lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas, entre otros tóxicos,
que son comúnmente acumulados en pacientes con IRC debido a un aclaramiento
renal disminuido (Piccinini AM. et al, 2010; Zhu P. et al, 2013). Estos elementos
pueden tener un papel destacado en la activación de TLR4 en la CE. Además, no
podemos descartar un posible papel de los productos derivados de la microbiota de
estos pacientes en este proceso.
Por otra parte, se ha descrito que la presencia de DAMPs en el plasma y moléculas
relacionadas con estrés oxidativo parecen estar implicados en la activación de
inflamosomas (Zhou R. et al, 2010; Tschopp J. et al, 2010).
Las células endoteliales expuestas a las condiciones en estudio producen ROS de
manera muy significativa. El inflamasoma NALP3 es un complejo de proteínas que
estimula la activación de la caspasa-1 para promover la producción y la secreción de
DISCUSIÓN
91
citoquinas proinflamatorias (Strowig T. et al, 2012; Ogura Y. et al, 2006), lo que
constituye un mecanismo de retroalimentación para perpetuar la respuesta inflamatoria.
Los resultados de esta tesis demuestran que la condición urémica per se y las terapias
renales sustitutivas producen un fenotipo inflamatorio y prooxidante a través de la
activación de la vías de señalización relacionadas con estrés oxidativo e inflamasoma
NALP3, con una mayor producción de niveles de la caspasa-1, siendo más notable en
respuesta al medio urémico de pacientes en terapia sustitutiva.
Es interesante destacar que ambos mecanismos, TLR4 y NALP3, están relacionados.
La presencia de un anticuerpo inhibidor de TLR4 produjo la disminución de la
expresión de receptores de adhesión en la superficie celular, de la producción
intracelular de ROS y de la asociación de TXNIP al inflamosoma en las HUVEC
expuestas a las condiciones urémicas exploradas.
Efecto del medio urémico y de las terapias renales sustitutivas
Según los datos publicados por la USRDS, la tasa de mortalidad de los pacientes en
diálisis ha disminuido en los últimos años, probablemente debido a la introducción de
mejoras en la utilización de catéteres y a un mejor manejo de las complicaciones. A
pesar de ello, los eventos cardiovasculares siguen siendo la principal causa de
morbimortalidad en pacientes urémicos en diálisis (USRDS Annual Report, 2011).
Los resultados de la presente tesis confirman la evidencia generada en estudios
previos, que indican que el medio urémico tiene un efecto proinflamatorio y de estrés
oxidativo sobre la CE y que este efecto es significativamente más notable cuando el
medio urémico procede de enfermos en diálisis, especialmente peritoneal (Caballo C.
et al, 2012).
La hemodiálisis induce la activación celular y la liberación de citoquinas en una
manera similar a la producida por los estados inflamatorios. Los pacientes en diálisis
peritoneal presentan a menudo hipertensión, que se considera una de las principales
causas concomitantes del daño endotelial en la patología urémica (Konings CJ. et al,
2002). En estos últimos pacientes, el desequilibrio volumétrico, las altas
concentraciones de glucosa y los productos de la degradación de la glucosa presentes
en el líquido de diálisis podrían contribuir a agravar este daño endotelial (Cheng LT. et
al, 2008). Todo ello podría explicar las diferencias observadas en los tres grupos de
pacientes.
DISCUSIÓN
92
Participación de la inmunidad innata en el desarrollo de disfunción endotelial
Los primeros resultados de esta tesis proporcionan evidencias convincentes de la
presencia y el papel de los dos elementos básicos de la respuesta inmune innata,
TLRs e inflamasoma NALP3, en la inflamación y la progresión de la disfunción
endotelial asociada a la IRC. En concreto, hemos identificado la expresión de TLR4 en
cultivos primarios de células endoteliales. Por otra parte, nuestros resultados enlazan
la activación del factor de trascripción NFκB, la producción de ROS y la expresión
NALP3 con la estimulación de TLR4 en la superficie celular, lo que sugiere que esta
vía contribuye a la disfunción endotelial asociada a la IRC.
Además, las condiciones humorales presentes en el estado urémico per se y,
especialmente, a las derivadas de los tratamientos renales sustitutivos, activan una vía
alternativa de la inflamación como es la del inflamasoma NALP3.
Por todo ello, la inhibición de la señalización de TLR4 y el bloqueo de los componentes
del inflamosoma NALP3 podrían constituir nuevas estrategias para prevenir y/o tratar
el desarrollo de disfunción endotelial pudiendo tener un impacto beneficioso en el
desarrollo de las complicaciones cardiovasculares de la IRC y otras patologías.
DISCUSIÓN
93
2.- UTILIDAD DIAGNÓSTICA Y PRONÓSTICA DE LOS BIOMARCADORES DE
DAÑO ENDOTELIAL: ESTUDIO EN PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO
SISTÉMICO.
Los estudios en modelos in vitro son útiles para reproducir y caracterizar las
condiciones de disfunción endotelial asociada a patologías inflamatorias crónicas. Pero
es necesario establecer una relación traslacional entre las aproximaciones
experimentales y los datos clínicos, por lo que resulta crucial encontrar marcadores
biológicos con valor diagnóstico y/o pronóstico que permitan prever la aparición
de las principales complicaciones cardiovasculares asociadas a la inflamación crónica.
En este contexto, la disfunción endotelial ha emergido como un importante “endpoint”
para comprender el desarrollo de eventos cardiovasculares (Frick M. et al, 2007). Su
implicación en la iniciación y progresión de la aterosclerosis y aterotrombosis hace que
pueda ser considerado como un indicador temprano de enfermedad cardiovascular
(Hadi AR. et al, 2005).
Por ello, la identificación de marcadores biológicos de disfunción endotelial permitiría
un diagnóstico precoz y, por tanto, la posibilidad de modificar los riesgos y la
intervención farmacológica antes del desarrollo en sí de la patología aterotrombótica.
Sin embargo, actualmente no existen todavía biomarcadores exclusivos que permitan
el diagnóstico de daño endotelial, por lo que es necesario el estudio de posibles
biomarcadores y de su interrelación con el estado del paciente.
Estudios llevados a cabo en muestras de pacientes con distintas patologías que
conllevan la presencia de disfunción endotelial nos ha permitido evaluar el
comportamiento de potenciales biomarcadores. Aún partiendo de situaciones clínico-
patológicas diferentes, como son la IRC (Caballo C. et al, 2012) y el transplante de
progenitores hematopoyéticos (Palomo M. et al, 2010), en ambas situaciones
observamos cambios significativos en biomarcadores relacionados con respuestas
proinflamatoria, protrombótica y de activación endotelial, como los receptores de
adhesión VCAM-1 solubles, el factor de Von Willebrand, la actividad ADAMTS13 y el
receptor I para el factor de necrosis tisular (TNF-RI).
Entre las patologías inflamatorias crónicas, las enfermedades autoinmunes han
suscitado un creciente interés, ya que no sólo cumplimentan las características
proaterogénicas y protrombóticas asociadas a la inflamación crónica, sino que incluyen
periodos activos que conllevan la exacerbación del estado inflamatorio y, por tanto, un
DISCUSIÓN
94
posible aumento de sufrir complicaciones trombóticas. A través de esta tesis hemos
abordado el estudio de estos biomarcadores en el LES como claro ejemplo de una
situación inflamatoria crónica con un alto riesgo trombótico.
El LES es una enfermedad autoinmune en la que las principales características
patológicas son la inflamación sistémica junto con niveles elevados de citoquinas
proinflamatorias, la presencia de autoanticuerpos y la deposición de complejos
inmunes en los tejidos diana (Rhaman A. et al, 2008).
El riesgo de sufrir complicaciones cardiovasculares es de hasta cinco a seis veces
superior que en la población general, e interesantemente muy superior a otras
enfermedades autoinmunes. Además, aproximadamente el 30% de los pacientes
lúpicos presentan arterosclerosis sublínica de manera prematura (El-Magadmi M. et al,
2004).
El desarrollo de eventos trombóticos, causados por la oclusión de la microvasculatura
de manera similar a la que ocurre en la púrpura trombocitopénica trombótica (PTT),
presenta una prevalencia de en torno a 10% (Erkan D., 2006; Cervera R. et al, 2003).
Mientras que en la PTT la presencia de autoanticuerpos neutralizantes anti-
ADAMTS13 es la principal causa de desarrollo de la microangiopatía (Tsai HM. et al,
2001), los mecanismos patogénicos de la trombosis en el LES todavía siguen siendo
desconocidos. La hipótesis de nuestro estudio sostiene que existe un componente
inflamatorio en el LES que conlleva la presencia de disfunción endotelial y ello puede
afectar la actividad ADAMTS13 y del FvW, pudiendo tener un impacto en el resultado
clínico de la enfermedad. Por tanto, la monitorización de marcadores de disfunción
endotelial podrían tener un papel relevante en la predicción del riesgo trombótico en
pacientes lúpicos.
Para la realización de este segundo estudio fueron seleccionados 50 pacientes
diagnosticados de LES, de los cuales se obtuvieron muestras de plasma y se
recopilaron parámetros clínicos y de laboratorio con el objetivo de evaluar la actividad
ADAMTS13, y los FvW y VCAM-1 solubles como marcadores de disfunción endotelial
y su capacidad predictiva del riesgo trombótico al combinarlo con los parámetros
recogidos.
DISCUSIÓN
95
Alteraciones en los niveles plasmáticos de ADAMTS13 y FvW en pacientes con
lupus eritematoso sistémico
Los resultados mostraron una actividad ADAMTS13 ligera a moderadamente
deficiente en los pacientes lúpicos incluidos en el estudio, aunque nunca tan reducida
como en la PTT. Esta disminución en la actividad de la metaloproteinasa se asoció con
niveles significativamente muy altos de FvW en el plasma de todos los pacientes
lúpicos, encontrándose una correlación inversa moderada entre ambos marcadores.
Por otra parte, los niveles de VCAM-1 soluble fueron más elevados en todas las
muestras de plasma de pacientes lúpicos con actividad ADAMTS13 <60%, aunque no
se pudo determinar una correlación entre estas determinaciones.
La constancia en el resultado de altos niveles de FvW junto con el aumento de los
niveles de VCAM-1, ambos considerados marcadores de activación y daño endotelial,
demuestra la existencia de disfunción endotelial en LES, algo que podría contribuir al
desarrollo de las complicaciones trombóticas asociadas esta patología.
La determinación de actividad ADAMTS13 ha permitido en los últimos años el
diagnóstico diferencial de las microangiopatías graves, donde niveles de actividad
ADAMTS13 menores de 6 ó 10%, dependiendo del laboratorio, se consideran
deficiencias graves y, por tanto, orientan el diagnóstico hacia una PTT. Recientemente,
debido a las observaciones clínicas y de laboratorio, ha comenzado a proponerse que
niveles relativamente reducidos de actividad ADAMTS13 pueden conllevar a una
situación propicia para la aparición de eventos trombóticos (Mannucci PM. et al, 2001;
Franchini M. et al, 2007). Existe un gran debate en torno al significado clínico de los
valores reducidos de actividad proteolítica de ADAMTS13, siendo difícil el establecer
un punto de corte que determine un riesgo trombótico inminente debido a la amplia
variablidad de resultados obtenidos tanto en condiciones fisiológicas (Mannucci PM. et
al, 2001) como patológicas (Kremer Hovinga JA. et al, 2007; Matsuyama T. et al, 2007;
Blot E. et al, 2002). Para intentar dar con una solución unánime, la literatura recoge la
importancia de establecer comparaciones entre pacientes, de una condición patológica
concreta, y sujetos sanos. Así mismo, se han ido estableciendo puntos de corte más
aceptados, como 60% ó 40% con respecto a la actividad total, niveles de actividad a
partir de los cuales existe una predisposición más acentuada a sufrir complicaciones
de tipo trombótico asociadas a enfermedades inflamatorias.
En este segundo estudio se observó que los valores de actividad ADAMTS13 en los
pacientes con LES estaban notablemente disminuidos, incluso hasta 13%, aunque
DISCUSIÓN
96
nunca por debajo del límite fijado para el diagnóstico de PTT. Es interesante destacar
que en 1 de cada 5 pacientes, la actividad ADAMTS13 estaba por debajo del 40%,
situación de evidente alteración funcional de la metaloproteinasa ADAMTS13. La
causa de la deficiencia de ADAMTS13 en el LES todavía no está clara, aunque
podemos barajar diferentes hipótesis. Teniendo en cuenta que la proteína ADAMTS13
se sintetiza principalmente en el hígado, se ha sugerido que la deficiencia pueda ser
causa de una falta de síntesis debido a daños en el hígado por la condición lúpica per
se y/o al tratamiento con agentes inmunosupresores (Mannucci P. et al, 2003). Sin
embargo, no sólo el hígado es responsable de la síntesis de ADAMTS13. En 2006,
Tuner y cols. demostraron que la metaloproteinasa también puede ser sintetizada por
las células endoteliales (Turner N. et al, 2006).
Así pues, considerando que el endotelio puede ser una importante fuente de
ADAMTS13 gracias al alto número de células endoteliales a lo largo de la vasculatura,
la activación y el daño potencial debido al estado inflamatorio en el LES, como se
deriva de los altos niveles de FvW y VCAM-1, podría ser una posible causa de la
deficiencia de la actividad de ADAMTS13 (Rhew EY. et al, 2006; Attia FM. et al, 2011).
Además, la reducción de los niveles de actividad ADAMTS13 puede ser resultado de
un aumento del consumo debido a las altas cantidades de su sustrato fisiológico, el
FvW.
Por otra parte, de manera similar a la PTT, el desarrollo de autoanticuerpos contra
ADAMTS13 podría ser otro mecanismo. En este estudio la presencia de IgG anti-
ADAMTS13 era prácticamente ausente y no había correlación con los niveles de
actividad de ADAMTS13 correspondientes (Rieger M. et al, 2005). Sin embargo, otras
subclases de anticuerpos, tales como IgM antiADAMTS13, o el desarrollo de
anticuerpos no neutralizantes que inducen modificaciones en el aclaramiento de
proteínas pueden ser también considerados como posibles mecanismos, aunque no
es posible extraer una conclusión en este momento a este respecto (Mannucci PM. et
al, 2003).
DISCUSIÓN
97
Disminución de la actividad ADAMTS13 y presencia de anticuerpos
antifosfolípidos
En el contexto del LES, es común que pueda desarrollarse otra patología autoinmune
denominada síndrome antifosfolipídico (SAF). El SAF se caracteriza por un estado de
hipercoagulabilidad debido a la presencia de anticuerpos antifosfolípidos (en inglés
antiphospholipid antiboides, aPLs), un grupo heterogéneo de anticuerpos contra
diferentes proteínas plasmáticas que se unen a fosfolípidos de membrana, entre ellos
el anticoagulante lúpico y la anticardiolipina. Este estado de hipercoagulabilidad resulta
en un alto riesgo de sufrir complicaciones trombóticas de tipo severo, que no sólo
agravan el estado general preexistente debido al lupus, sino que constituyen un
peligro potencial añadido para la vida del paciente. El SAF es diagnosticado cuando
se producen uno o varios eventos trombóticos y/o complicaciones obstétricas junto con
la determinación positiva de aPLs en el laboratorio. Sin embargo, el estado de
hipercoagulabilidad también puede ser debido a la propia presencia de aPLs sin haber
desarrollado en sí un SAF (de Groot PG. et al, 2012).
Una vez confirmada la disminución en los niveles de actividad ADAMTS13 en
pacientes lúpicos, exploramos su relación con la presencia de aPLs y/o de SAF
secundario en esta población. Los resultados obtenidos mostraron que en la mayoría
de los pacientes lúpicos con niveles de aPLs detectables, así como en pacientes
diagnosticados con SAF secundario, la actividad ADAMTS13 disminuía notablemente,
encontrándose además una asociación estadísticamente significativa entre ambos.
Considerando que existen estudios in vitro que sugieren que la presencia de aPLs
promueven la activación endotelial a través de la expresión de moléculas de adhesión,
tales como VCAM-1 (Willis R. et al, 2012) y tomando todos los hallazgos de nuestro
estudio en conjunto, podemos concluir que la disfunción endotelial junto con factores
autoinmunes asociados a la propia patología lúpica pueden contribuir al desarrollo de
un estado protrombótico en el LES.
DISCUSIÓN
98
Asociación entre niveles disminuidos de actividad ADAMTS13, grado de
actividad del lupus eritematoso sistémico y riesgo trombótico
Por último, los hallazgos más determinantes de este estudio se encontraron al
relacionar los niveles de actividad ADAMTS13, el grado de actividad del LES y el
desarrollo de complicaciones trombóticas. Por una parte, encontramos que la actividad
ADAMTS13 estaba especialmente reducida en pacientes con enfermedad activa,
determinada mediante el índice global de actividad SLEDAI. Los periodos de
reactivación del LES conllevan asociados un brote explosivo y descontrolado de la
enfermedad, con un importante componente inflamatorio, siendo en este periodo más
probable la aparición de daño orgánico y complicaciones diversas. (Cervera R. et al,
2013).
Estos resultados son novedosos, concuerdan con los pocos estudios relacionados
recogidos en la literatura y sugieren que en periodos activos de LES se puede producir
una alteración funcional de la metaloproteinasa ADAMTS13 (Klonizakis P. et al, 2013).
Junto con el estado proinflamatorio sistémico y la activación y disfunción endoteliales,
pueden dar lugar a la aparición de complicaciones trombóticas. Además, abre la
posibilidad de extrapolar los métodos utilizados en este estudio a otras patologías
inflamatorias crónicas. Actualmente, el papel de ADAMTS13 en eventos trombóticos
asociados a episodios agudos de enfermedades inflamatorias crónicas es objeto de
investigación.
En nuestra cohorte, cuatro pacientes con LES habían sufrido complicaciones
trombóticas, lo que constituye un 8% del total. Este porcentaje concuerda con la
frecuencia estimada de eventos trombóticos en los pacientes afectos de LES (Erkan D.
et al, 2006; Cervera R. et al, 2003). Curiosamente, en todos los pacientes lúpicos con
episodios trombóticos los niveles de ADAMTS13 que se detectaron fueron bajos,
estableciéndose una asociación estadísticamente significativa.
En conclusión, este segundo estudio demuestra que el LES es una condición
patológica asociada a daño endotelial, como así lo indican los cambios en los niveles
plasmáticos observados en la actividad de ADAMTS13, FvW y VCAM-1. Además,
evidencia que en el LES existe una relación entre una actividad ADAMTS13
disminuida, el grado de activación de la enfermedad, factores autoinmunes asociados
y el desarrollo de eventos trombóticos.
DISCUSIÓN
99
En este sentido, es necesario realizar más estudios para aclarar la patogenia de esta
deficiencia y su papel en las complicaciones trombóticas observadas en el LES. Dado
que el tamaño de la población de estudio es relativamente pequeño, no podemos
afirmar que los niveles más bajos de ADAMTS13 sean con seguridad predictivos de
riesgo trombótico. No obstante, los resultados son lo suficientemente consistentes y
significativos para detectar que las determinaciones propuestas presentan un potencial
valor como biomarcadores de riesgo trombótico y constituyen una línea interesante
para investigaciones futuras. Se requieren estudios de mayor tamaño para confirmar
si los niveles de ADAMTS13 y FvW podrían ser útiles en combinación con otros
parámetros para generar una puntuación o incluso un algoritmo predictivo del riesgo
trombótico en pacientes con LES y, en extensión, en pacientes con inflamación crónica.
DISCUSIÓN
100
3.- CONSIDERACIONES FINALES
Las investigaciones realizadas durante esta tesis doctoral nos han llevado a la
caracterización de las alteraciones fisiológicas y bioquímicas de la disfunción
endotelial en distintas situaciones patológicas.
Por un lado, la utilización de un modelo in vitro de disfunción endotelial nos ha
permitido profundizar en el efecto sobre el endotelio de la presencia y exposición
continua de moléculas tóxicas, elementos proinflamatorios y productos de la oxidación.
Resultados derivados del primer estudio determinan un papel importante de
mecanismos de inmunidad innata y aquellos relacionados con la inflamación, en
concreto el receptor TLR4 y el inflamasoma NALP3, la generación de especies
reactivas de oxígeno (ROS), y las vías de señalización relacionadas con el factor de
transcripción NFκB en el establecimiento de fenotipo un proinflamatorio y prooxidante
del endotelio que permite desarrollar una lesión endotelial progresiva, mantenida e
irreversible.
Por otra parte, los estudios ex vivo realizados en pacientes con LES demuestran que
en este tipo de patologías de origen autoinmune de curso en brotes y caracterizadas
por una sucesión de eventos inflamatorios en un estado de inflamación crónica de
base, evidencian la instauración de un estado protrombótico que se intensifica en
episodios activos de la enfermedad, pudiendo estar relacionado con un mayor riesgo
de sufrir complicaciones cardiovasculares.
Por tanto, podemos concluir que la disfunción endotelial es un factor
patofisiológico común en distintas patologías y que aunque su patogenia pueda
ser diferente en cada patología concreta, los mecanismos moleculares parecen ser
en gran parte coincidentes.
Abordar el conocimiento de los mecanismos moleculares utilizando modelos celulares
permite extraer información valiosa que puede ser extendida y comprobada en otras
enfermedades inflamatorias, con el objetivo de identificar posibles dianas terapéuticas
aplicables a todas aquellas enfermedades inflamatorias con complicaciones
cardiovasculares, capaces de llegar a comprometer la vida del paciente.
DISCUSIÓN
101
El hecho de que la disfunción endotelial sea un evento previo al desarrollo de
complicaciones trombóticas hace que la identificación de posibles marcadores
biológicos específicos de disfunción endotelial comunes y aplicables a diversas
patologías inflamatorias aporte un potencial valor pronóstico de enfermedad
cardiovascular.
Esta tesis doctoral defiende que el abordaje de la disfunción endotelial desde
diferentes perspectivas junto con la traslación de los estudios realizados en el
laboratorio y su conjunción con parámetros clínicos es necesario para un diagnóstico
precoz de la enfermedad cardiovascular asociada a patologías crónicas así como para
establecer estrategias preventivas y terapéuticas con el objetivo de prevenir y/o
disminuir considerablemente el impacto que las complicaciones cardiovasculares
tienen en la morbimortalidad delos pacientes con patologías con componente
inflamatorio, independientemente de su patogenia.
103
Conclusiones
CONCLUSIONES
105
CONCLUSIONES
1. Dos elementos esenciales de la de inmunidad innata, el receptor toll-like 4
(TLR4 de las siglas en inglés) y el complejo proteico NALP3, juegan un
importante papel en el desarrollo de inflamación y disfunción endoteliales
asociadas a la insuficiencia renal crónica.
2. El receptor TLR4 se encuentra constitutivamente expresado en cultivos
primarios de células endoteliales.
3. El incremento en la expresión del receptor TLR4 en la superficie endotelial por
el microambiente urémico está asociado a la activación del factor de
transcripción NFκB, el ensamblaje de los elementos que constituyen el
inflamasoma NALP3 y la producción de ROS, considerados mecanismos
proinflamatorios.
4. La activación y perpetuación de la respuesta proinflamatoria vía TLR4 y NALP3
del endotelio a consecuencia de la uremia se ven intensificadas en asociación
con el tratamiento renal sustitutivo.
5. La inhibición de la vía de señalización dependiente de TLR4, y/o de
componentes del inflamasoma NALP3, previene el daño endotelial en
respuesta a la uremia.
6. Existe daño endotelial en el lupus eritematoso sistémico, caracterizado por una
deficiencia funcional moderada de la metaloproteinasa ADAMTS13, junto con
un aumento de moléculas proinflamatorias FvW y VCAM-1.
7. La deficiencia funcional de ADAMTS13 es mucho más evidente en aquellos
pacientes lúpicos con enfermedad activa, y en aquellos que presentan
anticuerpos antifosfolipídicos y/o síndrome antifosfolípido asociados.
8. Todos los pacientes con lupus eritematoso sistémico que sufrieron eventos
trombóticos presentaban una deficiencia funcional moderada de ADAMTS13 y
altos niveles plasmáticos de FvW y VCAM-1.
CONCLUSIONES
106
9. Las moléculas relacionadas con activación y daño endoteliales, en concreto, la
actividad ADAMTS13, y los niveles plasmáticos de FvW y VCAM-1, pueden
constituir biomarcadores predictivos de riesgo trombótico en LES,
monitorizadas en combinación con otros parámetros clínicos.
10. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral indican que la disfunción
endotelial es un factor común en diferentes enfermedades inflamatorias. El
conocimiento de los mecanismos implicados permitirá mejorar el diagnóstico
precoz de la disfunción endotelial, la predicción y monitorización del riesgo
trombótico asociado. Además, facilitará el desarrollo de estrategias preventivas
y terapéuticas de las complicaciones cardiovasculares asociadas,
independientemente de la etiopatogenia de la enfermedad.
107
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