INDICE GENERAL -...

iii

INDICE GENERAL

LISTA DE CUADROS ...................................................................................... vii

LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... viii

AGRADECIMIENTOS ....................................................................................... xi

DEDICATORIAS .............................................................................................. xiv

DATOS BIOGRÁFICOS .................................................................................. xvi

RESUMEN GENERAL ................................................................................... xvii

ABSTRACT ................................................................................................... xviii

1 INTRODUCCIÓN GENERAL ....................................................................... 1

2 REVISIÓN DE LITERATURA GENERAL .................................................... 5

2.1 Origen y distribución del aguacate ......................................................... 5

2.2 Taxonomía del aguacate ....................................................................... 7

2.3 El aguacate criollo mexicano ................................................................. 8

2.4 El aguacate cv. ‘Hass’.......................................................................... 10

2.5 Importancia mundial y nacional del aguacate ...................................... 11

2.6 Composición nutricional del aguacate ................................................. 12

2.6.1 Lípidos ........................................................................................... 16

2.6.2 Ácidos Grasos ............................................................................... 17

2.6.3 Compuestos de importancia biológica ........................................... 18

2.7 Enfermedades del aguacate ................................................................ 20

2.7.1 La roña en aguacate ..................................................................... 21

2.8 Marcadores moleculares ...................................................................... 27

2.8.1 PCR-RFLPs .................................................................................. 30

2.9 Literatura citada ................................................................................... 31

iv

3 DIVERSIDAD GENÉTICA Y MORFOLÓGICA DE HONGOS ASOCIADOS

A LA ROÑA EN ACUACATES CRIOLLOS MEXICANOS .............................. 41

3.1 Resumen ............................................................................................. 41

3.2 Abstract ................................................................................................ 42

3.3 Introducción ......................................................................................... 43

3.4 Materiales y métodos ........................................................................... 44

3.4.1 Recolección de muestras .............................................................. 44

3.4.2 Aislamiento del patógeno .............................................................. 44

3.4.3 Caracterización morfológica .......................................................... 45

3.4.4 Identificación molecular ................................................................. 45

3.5 Resultados y discusión ........................................................................ 48

3.5.1 Caracterización morfológica ......................................................... 48

3.5.2 Identificación molecular ................................................................. 50

3.6 Conclusiones ....................................................................................... 55


4 VARIABILIDAD GENÉTICA DE HONGOS ASOCIADOS A LA ROÑA EN

AGUACATES CRIOLLOS MEXICANOS MEDIANTE MARCADORES

MOLECULARES RFLPS.................................................................................. 59

4.1 Resumen ............................................................................................. 59

4.2 Abstract ................................................................................................ 60

4.3 Introducción ......................................................................................... 61



4.4.2 Análisis molecular ......................................................................... 63


4.5.1 RFLPs de la región de ITS y EF-1................................................. 64

v

4.5.2 Identificación de cepas por similitud de polimorfismos .................. 70

4.6 Conclusiones ....................................................................................... 72


5 FISIOLOGÍA POSTCOSECHA Y CAMBIOS FISICOS Y QUÍMICOS EN

AGUACATES ‘HASS’ INOCULADOS CON DIVERSOS HONGOS ............... 76

5.1 Resumen ............................................................................................. 76

5.2 Abstract ................................................................................................ 77

5.3 Introducción ......................................................................................... 78



5.4.2 Pruebas de patogenicidad ............................................................. 79

5.4.3 Variables físicas ............................................................................ 80

5.4.4 Variables fisiológicas ..................................................................... 82

5.4.5 Variables químicas ........................................................................ 82


5.5.1 Prueba de patogenicidad .............................................................. 84

5.5.2 Variables físicas ............................................................................ 85

5.5.3 Variables fisiológicas ..................................................................... 90

5.5.4 Variables químicas ........................................................................ 93

5.6 Conclusiones ....................................................................................... 96


6 PRIMER REPORTE DE Neofusicoccum parvum CAUSANTE DE

MUERTE REGRESIVA EN AGUACATES ‘HASS’ (Persea americana cv.

‘Hass’)...…………………………………………………………………………..….101

6.1 Resumen ........................................................................................... 101

6.2 Abstract .............................................................................................. 103

6.3 Literatura citada ................................................................................. 106

7 TOLERANCIA A HONGOS FITOPATÓGENOS INOCULADOS EN

TEJIDOS VEGETALES DE AGUACATE CRIOLLO Y ‘HASS’ EN CAMPO . 107

7.1 Resumen ........................................................................................... 107

vi

7.2 Abstract .............................................................................................. 108

7.3 Introducción ....................................................................................... 109

7.4 Materiales y Métodos ......................................................................... 110

7.4.1 Aislamiento de patógenos ........................................................... 110

7.4.2 Identificación de los aislamientos ................................................ 110

7.4.3 Pruebas de patogenicidad ........................................................... 111

7.5 Resultados y discusión ...................................................................... 111

7.5.1 Identificación de los aislamientos ................................................ 111

7.5.2 Pruebas de patogenicidad ........................................................... 113

7.6 Conclusiones ..................................................................................... 116

7.7 Literatura citada ................................................................................. 118

8 CONCLUSIONES GENERALES ............................................................. 120

9 APÉNDICES ............................................................................................ 121

9.1 Protocolos de extracción de DNA ...................................................... 121

9.2 Protocolo Reacción en Cadena de la Polimerasa para gen ITS, SUB

PEQ, TEF. ................................................................................................... 122

9.3 Digestión con enzimas de restricción de fragmentos de longitud

polimórfica ................................................................................................... 123

9.4 Preparación de geles de agarosa y Poliacrilamida ............................ 123

vii

LISTA DE CUADROS

Cuadro 1. Composición de la porción comestible del aguacate ‘Hass’ .......... 14

Cuadro 2. Clasificación taxonómica de E. perseae. Fuente: Rossman y W.C.

Allen, 2016. ..................................................................................................... 22

Cuadro 3. Lugar de colecta y características de los frutos de las diferentes

accesiones de aguacate criollo. ...................................................................... 47

Cuadro 4. Identidad molecular de hongos aislados de frutos de aguacate,

mediante amplificación del gen ITS ................................................................ 52


mediante amplificación del gen EF-1 .............................................................. 53

Cuadro 6. Identificación de cepas no secuenciadas basada en secuencias de

ADN y por similitud de agrupamiento en RFLPs. ............................................ 70

Cuadro 7. Distribución de tratamientos de los hongos inoculados en aguacate

‘Hass’ .............................................................................................................. 80

Cuadro 8(a,b) Pérdida de peso, Tono, Pureza, Luminosidad (L) y Firmeza de

los frutos de aguacate ‘‘Hass’’ inoculados con patógenos. Tratamientos con los

distintos hongos (T1-T10); Tratamiento sin inocular (Testigo) ........................ 87

Cuadro 9. Promedios y desviaciones estándares para actividad antioxidante

(DPPH), fenoles totales, y antocianinas en cáscara y pulpa de aguacates

‘Hass’ inoculados y almacenados durante diez días a temperatura 25 ± 2 °C.

Tratamientos con diferentes hongos (T1-T10), tratamiento sin inocular

(Testigo) .......................................................................................................... 94

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Distribución del aguacate después de la conquista en el mundo

hasta antes de 1915. Fuente: Sanchez et al., 1998 .......................................... 6

Figura 2. Cultivo perteneciente a Sphaceloma perseae en medio PDA con 25

días de crecimiento a 20 °C. Fuente: Everett et al. 2011 ................................ 23

Figura 3. Conidióforo y conidios de S. perseae. Fuente: Jenkins, 1934 ....... 24

Figura 4. Síndrome de roña en aguacates: a) Criollo b) cv. ‘Hass’. Fuente:

Elaboración propia. ......................................................................................... 24

Figura 5. Lesiones de roña en tallo, hoja y fruto de aguacate. Fuente: Jenkins,

1934 ................................................................................................................ 25

Figura 6. Corte histopatológico de hoja de aguacate con síntomas de roña.

Fuene: Jenkins, 1934...................................................................................... 26

Figura 7. Representación esquemática del método de RFLP . Fuente:

Pereira, 2008 .................................................................................................. 31

Figura 8. Características morfológicas de los aislamientos obtenidos de

síntomas de roña en aguacate criollo. A-F. Morfología de la colonia después

de 10 días de crecimiento en medio PDA. a-f. Conidios después de 10 días en

PDA. A-a. Mucor sp. B-b Alternaria sp. C-c. Phoma sp. D-d. Collecotrichum sp.

E-e. Pestalotipsis sp. F-f. Arthrinium sp. ......................................................... 50

Figura 9. Árbol filogenético a partir de secuencias obtenidas de la región ITS

de los aislamientos de aguacate criollo, realizado con MEGA 6 con 500

repeticiones de bootstraping en NTSYS ......................................................... 53

Figura 10. PCR-RFLPs obtenidos de la digestión enzimática del amplificado

del gen ITS con el uso de las enzimas de restricción Hha1, Hhae III, Hinf I. .. 66

Figura 11. PCR-RFLPs obtenidos de la digestión enzimática del amplificado

del gen EF-1 con el uso de las enzimas de restricción a) Hae III y b) Alu I .... 67

ix

Figura 12. Dendrograma generado a partir de la digestión del fragmento

amplificado del gen ITS con el uso de las enzimas: Hae III, HhaI y Hinf I.

Construcción basada en el método de agrupamiento UPGMA utilizando el

coeficiente de Dice (1945) / Nei-Li (1979). El soporte de la topología con un

bootstrap de 1000 repeticiones. Valores de distancia genética se muestra

sobre las ramas .............................................................................................. 68

Figura 13. Dendrograma generado a partir de la digestión del fragmento

amplificado del gen EF-1 con el uso de las enzimas: Hae III y Alu I.

Construcción basada en el método de agrupamiento UPGMA utilizando el

coeficiente de Dice (1945) / Nei-Li (1979). El soporte de la topología con un

bootstrap de 1000 repeticiones. Valores de distancia genética se muestra

sobre las ramas .............................................................................................. 69

Figura 14. Evaluación de daño externo en aguacates ‘Hass’ inoculados con

diversos patógenos durante 10 días de almacenamiento a 22 °C. Tratamientos

con diferentes hongos (T1-T10); tratamiento sin inocular (Testigo). ............... 86

Figura 15. Patrón de respiración de frutos de aguacate ‘Hass’ inoculados y

almacenados a temperatura ambiente (22 °C) durante 10 días. Tratamientos

con diferentes hongos (T1-T10); tratamiento sin inocular (Testigo). ............... 92

Figura 16. Producción de etileno en frutos de aguacate ‘Hass’ inoculados y

almacenados a temperatura ambiente (22 °C) durante 10 días. Tratamientos

con diferentes hongos (T1-T10), tratamiento sin inocular (Testigo). ............... 93

Figura 17. A) Aislamiento de Neofussicocum parvum en medio de cultivo

PDA, observado después de 12 días. B) Conidios hialinos de Neofussicocum

parvum. C) Síntomas inducidos por inoculación artificial de Neofussicocum

parvum en ramas, después de 30 días. ........................................................ 104

Figura 18. Análisis filogenético concatenado de Neofussicocum parvum para

el fragmento del gen ITS y EF, utilizando el método UPGMA y generado por

MEGA-X Este análisis involucró 7 secuencias de nucleótidos. Las distancias

evolutivas se calcularon utilizando el Máximo. ............................................. 105

x

Figura 19. Análisis filogenético de Neofussicocum parvum del fragmento del

gen ITS, utilizando el método UPGMA y generado por MEGA-X. Este análisis

involucró 9 secuencias de nucleótidos. Las distancias evolutivas se calcularon

utilizando el método de probabilidad máxima compuesta. El porcentaje de

árboles replicados en los que los taxones asociados agrupados en la prueba

de arranque (1000 repeticiones) se muestran junto a las ramas. ................. 105

Figura 20. Análisis filogenético de Neofussicocum parvum del fragmento del

gen EF, utilizando el método UPGMA y generado por MEGA-X. Este análisis

involucró 7 secuencias de nucleótidos. Las distancias evolutivas se calcularon

utilizando el método de probabilidad máxima compuesta. El porcentaje de

árboles replicados en los que los taxones asociados agrupados en la prueba

de arranque (1000 repeticiones) se muestran junto a las ramas .................. 106

Figura 21. Conidios de los aislamientos a-f, a los 10 días de crecimiento en

medio PDA, bajo exposición de luz continúa. a) Colletotrichum spp. b) Phoma

spp. c) Cladosporium spp. d) Alternaria spp. (1) e) Alternaria spp. (2) f)

Alternaria spp. (3). ........................................................................................ 114

Figura 22. Síntomas de necrosis y marchitez en ramas, tallos y hojas de

aguacate cv. 'Hass' (A-F) y criollos (a-f), después de 30 días de la inoculación.

A-a) Colletotrichum spp.; B-b) Phoma spp.; C-c) Cladosporium spp.; D-d)

Alternaria spp. (1); E-e) Alternaria spp. (2); F-f) Alternaria spp. (3). ............. 117

xi

AGRADECIMIENTOS

A Dios por permitirme llegar hasta esta etapa de mi vida, por darme la fortaleza

para seguir adelante en los buenos y en los malos momentos.

A mi Álma Mater, la Universidad Autónoma Chapingo por la oportunidad de

realizar mis estudios de Preparatoria, Licenciatura y Doctorado, por acogerme

durante más de 11 años y permitirme crecer como profesional y como persona.

Espero algún día retribuir aunque sea un poco de lo mucho que nos ha dado a

mí y miles de alumnos que llevamos a Chapingo en el corazón.

Al Programa de Posgrado en Ciencia y Tecnología Agroalimentaria, en especial

al Doctorado en Ciencias Agroalimentarias de la Universidad Autónoma

Chapingo, por la oportunidad de pertenecer a la primera generación de este

programa y por todos los conocimientos adquiridos durante mi estancia.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el apoyo

económico brindado durante la realización de este proyecto.

Al Dr. Joel Corrales García un especial agradecimiento por depositar su

confianza en mí y en mi trabajo, por la paciencia otorgada y por compartir sus

conocimientos durante estos más de cuatro años, que me han ayudado a crecer

como profesional y sobre todo como persona. Gracias por brindarme su apoyo y

amistad en todo este tiempo.

A mis asesores:

A la Dra. Ernestina Valadez Moctezuma por abrir las puertas de su laboratorio y

permitirme trabajar durante mi estancia, por impulsarme a seguir adelante y

xii

contagiarme su amor por la ciencia, por siempre ver el lado positivo de las

cosas, porque es un gran ejemplo para mí como profesional y como persona,

Gracias.

A la Dra. Ma. Del Rosario García Mateos por su apoyo incondicional durante mi

estancia en el Posgrado, por sus conocimentos compartidos y por su apoyo

moral en todo momento, por impulsarme siempre a ser mejor persona y

profesional.

Al Dr. Daniel Nieto Angel, por aceptarme e incluirme en su equipo de trabajo

para la realización de mi estancia Doctoral, gracias por todo su apoyo y

asesoría en la realización de mi proyecto y por contagiarme su entusiamo y

amor por la postcosecha.

A la Dra. Alejandra Almaráz Sanchez y la MC. Victoria Ayala Escobar, por

compartir sus conocimientos y por conducirme exitosamente en el trabajo de mi

estancia Doctoral, gracias también por su gran amistad.

Al Ing. Daniel Lino y los productores de aguacate de la región de Atlixco y

Hueyapan, Puebla, por porporcionar la materia prima para este estudio y por

permitirme realizar parte de mi investigación en sus huertos.

A todos los trabajadores que laboran a diario para brindarnos un mejor servicio,

en especial a la Sra. Esperanza, por su paciencia y apoyo incondicional siempre

que lo necesitamos. A Arely, Melchor y Evita por apoyarnos en todos los

trámites administrativos durante estos más de cuatro años. Especialmente a la

Sra. Dolores, por ser un gran apoyo durante mi estancia en el laboratorio de

Biología Molecular. A la Lic. Biol. Mariana, por su dedicacación, entusiasmo y

entrega al participar en la primera parte de este proyecto.

A mis compañeras y amigas de generación Bety, Irene y Lupita, porque juntas

comenzamos este difícil pero satisfactorio proyecto de vida y porque juntas

xiii

logramos culminar estos cuatro años. A mis compeañeros de otras

generaciones del DCA: Flor, Daysi, Vere, Daniel por compartir este camino y

por hacer cada uno de mis días más placenteros. Especialmente a mi amigo

Sergio, por todas las aventuras vividas tanto dentro como fuera del laboratorio y

por llegar a entablar esa gran amistad.

A los que no mencioné en este documento, pero de alguna manera estuvieron

presentes durante mi transcurso en el Doctorado, Muchas Gracias.

xiv

DEDICATORIAS

A mis hijos Daniela y Diego, porque son mi motor de vida día con día, porque

por Ellos siempre quiero ser una mejor persona, porque, aunque aún son muy

pequeños, siempre han sabido entender el trabajo que implica estudiar un

posgrado y ser padres a la vez. Gracias por recibirme siempre con un abrazo

cuando no podía estar con ustedes todo el día. Los amo hasta el infinito y más

allá.

A mi esposo Daniel, porque decidió seguirme en este mismo camino, por

compartir nuestro amor a la ciencia, porque ni la distancia de un océano

completo pudo impedir que estuviéramos juntos. Porque a pesar de todo

siempre me has apoyado, tanto en lo personal como en lo profesional, gracias

por tu enorme paciencia y amor, por apoyarme con los niños y por seguir

siempre a mi lado, en las buenas y en las malas, Te amo.

A mis padres Guillermo y Marisol a quienes respeto y admiro mucho, gracias

por todo su apoyo durante toda mi vida, en especial en los momentos más

difíciles, tanto a mí, como a mi pequeña familia. Gracias por ser un ejemplo de

superación constante para mí, porque ustedes has sido los mejores maestros

de vida. Gracias por apoyarme con mis hijos cuando más lo necesitaba. Gracias

por comprender también a veces mi mal carácter y mi estrés. Por todo eso y

mucho más, estoy infinitamente agradecida con Ustedes, los amo.

A mi hermana, Itzel, porque a pesar de la distancia, siempre me has apoyado

en todo lo que he decidio. Gracias por estar al pendiente y por tu apoyo y

disposición para cuidar a mis hijos cuando tuve que salir al extranjero. Te

amamos.

xv

Gracias a toda mi familia (primos, tíos, abuelos) por animarme a seguir adelante

y por brindarme ánimos cuando más lo necesito. En especial, A mi Tía Rosy, a

quien considero una segunda mamá, porque siempre ha estado al pendiente de

mí y de mis hijos. Gracias por todo tu apoyo y por preocuparte por nuestro

bienestar.

A mis suegros, Francisco y Natalia, y a mis cuñados, porque jamás nos han

dejado solos a pesar de la distancia, y porque también son un gran ejemplo a

seguir. Gracias por todo su apoyo.

A todas las personas que la vida ha cruzado en este camino y que alguna u otra

manera han dejado huella en mi vida, muchas gracias.

xvi

DATOS BIOGRÁFICOS

Datos personales

Nombre: Diana Becerra Morales Fecha de nacimiento: 3 de enero de 1989 Lugar de nacimiento: Ciudad de México

Desarrollo académico

Licenciatura: Ingeniería Agroindustrial, Universidad Autónoma Chapingo Maestría: Maestría en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Universidad Autónoma de Querétaro

Experiencia profesional

Ha participado en la publicación de siete notas en la revista Tecnoagro durante el periodo del 2010-2011. Trabajó como profesora de Química y Bilogía en Bachillerato Técnico, Celaya, Guanajuato, en el periodo 2011-2012. Fue colaboradora en el Proyecto “Evaluación de fuentes nutrimentales para el cultivo en batch de biofertilizantes microbianos para la empresa Ager Alimentaria S.A. de C.V.” Participó como ponente en el XVI Congreso Internacional de los alimentos y XXXI Reunión Nacional de Microbiología, 2014. También participó como ponente en el II Congreso Internacional y XVI Congreso Nacional de Ciencias Agronómicas, 2014. Tiene un artículo científico publicado en la Revista Ciencias de la Salud, en el año 2016. .

xvii

RESUMEN GENERAL

Síndrome de roña en frutos de aguacate ‘Hass’ y Criollos: hongos asociados, cambios fisiológicos y fisicoquímicos en los frutos1

Resumen

El aguacate (Persea americana Mill.) es uno de los cultivos más importantes en México, ya que es el principal productor y exportador a nivel mundial. La roña es considerada como una de las enfermedades fúngicas de mayor importancia económica para este cultivo. Se manifiesta con lesiones de apariencia corchosa y sólo se presentan en el pericarpio de los frutos sin afectar a la pulpa. Se reportó en 1934 a Sphaceloma perseae como agente causal de esta enfermedad, sin embargo, hasta la fecha no existe información científica que corrobore este hecho, poniendo en duda al patógeno responsable. Por lo que el objetivo principal de esta investigación fue la identificación de los patógenos asociados a la roña en aguacates ‘Hass’ y criollo. Se utilizó una combinación de técnicas de identificación basada en marcadores moleculares (PCR-RFLPs) y se realizaron pruebas de patogenicidad in vivo para poder determinar al patógeno causal de la roña. Las características físicas y químicas de los aguacates y los cambios fisiológicos de los frutos infectados fueron evaluadas. Se obtuvieron 31 aislamientos fúngicos provenientes de aguacates con roña de dos regiones geográficas distintas de México. Mediante el análisis morfológico y molecular se identificaron especies de Alternaria sp. Colletotrichum sp., Phoma sp., Pestalotiopsis sp., Artrhinium sp., y Penicillium sp. asociadas a síntomas de roña. Se observaron alteraciones en la tasa de respiración y producción de etileno, y se incrementó el contenido de fenoles en los frutos de aguacate como respuesta al ataque de estos patógenos. Se observó mayor susceptibilidad del ‘Hass’ ante la infección de patógenos fúngicos comparado con el aguacate criollo mexicano, esto pude atribuirse al alto contenido de antocianinas en la cáscara de los criollos. Pruebas de patogenicidad en campo fueron negativas al síntoma de roña. Ninguno de los hongos identificados fue S. perseae.

Palabras clave: aguacate, antocianinas, hongos asociados, fenoles, roña.

1 Tesis de Doctorado en Ciencias Agroalimentarias, Programa de Posgrado en Ciencia y

Tecnología Agroalimentaria, Universidad Autónoma Chapingo. Autor: Diana Becerra Morales Director de Tesis: J.Joel E. Corrales García

xviii

ABSTRACT

Scabs syndrome in ‘Hass’ and Mexican native avocado: associated fungi, physiological and physicochemical changes in these fruits2

Abstract

The avocado (Persea americana Mill.) is one of the most important crops in Mexico, since it is the main producer and exporter worldwide. The scab is considered one of the fungal diseases of major economic importance for this crop. It manifests itself with lesions of corky appearance and only appears in the pericarp of the fruits, without affecting the pulp. In 1934, the Sphaceloma perseae was reported as the causal agent of scab on avocado; however, to date, there has not been other reports that corroborate the fact that S. perseae causes scab on avocado fruits, questioning the responsible pathogen. Therefore, the aim of this work was the identification of the pathogens associated with scab in ‘Hass’ and Mexican native avocados. A combination of identification techniques based on molecular markers (PCR-RFLPs) was used and in vivo pathogenicity tests were carried out in order to determine the causal pathogen of the scab. The physical and chemical characteristics of the fruits and the physiological changes of the infected fruits were evaluated. Thirty-one fungal isolates were obtained from avocados with symptoms of a scab from two sites of Mexico. The morphological and molecular analysis allowed to identify the species of Alternaria sp., Colletotrichum sp., Phoma sp., Pestalotiopsis sp., Arthrium sp., and Penicillium sp. associated with scabies symptoms. Alterations in the rate of respiration and ethylene production were observed, and the content of phenols in the avocado fruits was increased as response to the attack of these pathogens. The ‘Hass’ showed major susceptibility to the infection of fungi in comparison with the Mexican native avocado, this fact be attributed to the high content of anthocyanins in the peel of Mexican avocado. Tests of pathogenicity in the field were negative to the symptom of scabs. None of the fungi identified was S. perseae. Keywords: avocado, anthocyanins, fungi associated, phenols, scab

2Tesis de Doctorado en Ciencias Agroalimentarias, Programa de Posgrado en Ciencia y


1

1 INTRODUCCIÓN GENERAL

El aguacate (Persea americana Mill.) es uno de los cultivos más importantes a

nivel mundial, debido a la importancia económica que genera hacia los

productores y comercializadores de estos frutos. México, es el principal país

productor a nivel mundial con 1.8 millones de toneladas cosechadas en 220,334

ha (USDA, 2017) y aporta el 46 % del valor total de las exportaciones

(SENASICA, 2017). El consumo de estos frutos en más de 34 paíes del mundo

ha propiciado un aumento en las exportaciones mexicanas, principalmente

hacia EU y Japón (SENASICA, 2017).

Del aguacate se distinguen tres razas botánicas: la raza mexicana (P.

americana var. Drymifolia), la raza guatemalteca (P. americana var.

Guatemalensis) y la raza antillana (P. americana var. Americana). Las

diferencias entre ellas radican principalmente en el tamaño y forma del fruto,

textura, grosor y color de la cáscara, tamaño de la semilla y maduración del

fruto, y potencial nutracéutico (Bergh, 1992; Bergh et al., 1973; Corrales et al.,

2019; Ibar, 1986; SAGARPA, 2011). El cultivar más reconocido, producido y

consumido a nivel mundial es el ‘Hass’. En México, éste cultivar se injerta en un

patrón de la raza mexicana conocido como aguacate criollo (Persea americana

var. Drymifolia.), variedad agreste que se caracteriza por su alta resistencia a

plagas y a enfermedades (Sánchez et al., 1999; Rincón et al., 2011).

El aguacate criollo mexicano se distribuye en la mayor parte del territorio

nacional y ha sido consumido desde épocas prehispánicas; mucha gente lo

consume con todo y piel porque ésta es delgada y aromática, y las hojas de

esté árbol tienen ligero sabor a anis, usadas comúnmente en platillos regionales

(Corrales et al., 2019; Sánchez, 1999). Se han identificado compuestos

fitoquímicos lipofílicos e hidrofílicos en la pulpa de aguacates ‘Hass’ y criollo,

2

tales como ácidos graos, carotenoides, compuestos fenólicos, fitoesteroles, y

antocianinas en la cáscara que proporcionan un efecto beneficioso a la salud

cuando se aumenta su consumo (Vinha et al., 2013; Cox et al, 2004; Corrales et

al., 2019). El contenido de estos compuestos es afectado por diversos factores

como la variedad, la posición del fruto en el árbol, ubicación dentro del fruto,

grado de madurez, prácticas culturales, condiciones ambientales y manejo

postcosecha (Campos et al., 2011). Sin embargo, hasta la fecha no se ha

estudiado el cambio de estos compuestos en aguacate ‘Hass’ y criollo cuando

existe daño por patógenos.

La roña o corchosis del aguacate es considerada como una de las

enfermedades fúngicas de mayor importancia económica para este cultivo, ya

que produce pérdidas de poscosecha de hasta 53 % (Vidales, 1996). Es

considerada como una infección superficial porque los daños sólo se presentan

en el pericarpio de los frutos, sin afectar a la pulpa; aunque también se pueden

presentar lesiones en la parte superior e inferior de hojas jóvenes que afectan la

nervadura central (Everett et al., 2011; Gallegos, 1983).

Esta enfermedad fue asociada al hongo Sphaceloma perseae Jenk (Elsinoe

persea, fase sexual) reportado por Jenkins (1934). Posterior a esta fecha se

han realizado trabajos de identificación y caracterización de los posibles

agentes casuales de la roña en aguacate ‘Hass’ y Fuerte (Stevens & Piper,

1960; McMillan, 1976; Hartill, 1991; Salgado, 1993; Djeugap, et al., 2015). Sin

embargo, ninguno de los autores mencionados con anterioridad ha vuelto a

asociar a Sphaceloma perseae como agente causal de este síndrome.

Hasta la fecha, no existe información científica publicada que corrobore la

identificación molecular de Sphaceloma perseae como agente causal de la

roña, lo que pone en duda al patógeno responsable, como lo señala Alfaro et

al., (2015). Por este motivo, el objetivo principal de esta investigación fue la

identificación y caracterización molecular de los patógenos asociados a la roña

en aguacates ‘Hass’ y criollo, así como evaluar los cambios físicos, químicos y

fisiológicos los frutos con este síndrome. Para lograr lo anterior, el trabajó se

3

desarrolló en seis etapas distinas, descritas a partir del Capítulo 3 de la

presente tesis Doctoral.

En el Capítulo 3 se realizó el aislamiento de hongos asociados al síndrome de

roña en aguacates Criollos de tres regiones distintas de México. Por medio de

caracterización morfológica, caracterización e identificación molecular a través

de la región ITS y del gen EF-1. Se identificaron los géneros de Alternaria,

Colletotricum, Phoma, Pestalotipsis y Artrinium. Ninguno de los hongos aislados

fue Sphaceloma perseae.

En el Capítulo 4, se evaluó la diversidad genética de los hongos aislados

mediante el uso de RFLPs. Los distintos perfiles polimórficos permitieron la

agrupación de los hongos conforme a la similitud del peso molecular de bandas

de ADN, en dónde cada grupo fue asociado a un género distinto de hongos con

base en la identificación molecular. Esta técnica resultó de gran utilidad para la

discriminación de muestras repetidas.

En el Capítulo 5 se evaluó el comportamiento físico, químico y fisiológico de

aguacates ‘Hass’ inoculados con los diversos hongos aislados y referidos en el

Capítulo 3. Se observó aumento en la tasa de respiración y producción de

etileno; además, el contenido de fenoles y actividad antioxidante aumentó en

los aguacates inoculados con respecto al testigo sin inocular. Esto indica que

algunos metabolitos secundarios como los fenoles, se expresan ante el ataque

de estos patógenos.

Como resultado de las pruebas de patogenicidad realizadas en campo y

referidas en el Capítulo 6, se reporta por primera vez la muerte regresiva

causada por Neofusicoccum parvum en aguacates ‘Hass’ en Atlixco, México.

Finalmente, en el Capítulo 7 se evaluó la tolerancia de árboles de aguacate

‘Hass’ y criollos ante la infección de diversos patógenos fúngicos. El aguacate

‘Hass’ fue susceptible a la infección por especies de Alternaria, Coletotrichum,

4

Phoma y Cladosporium, mientras que accesiones de aguacate criollo sólo

fueron suceptibles a una especie de Alternaría.

.

5

2 REVISIÓN DE LITERATURA GENERAL

2.1 Origen y distribución del aguacate

El origen del aguacate tuvo lugar en las partes altas del centro y este de

México, y partes altas de Guatemala. Esta misma región está incluida en lo que

se conoce como Mesoamérica, y también es considerada como el área donde

se llevó a cabo la domesticación del mismo. La evidencia más antigua del

consumo de esta fruta data de 10,000 años a.c. y fue encontrada en una cueva

localizada en Coxcatlán, Puebla (Sanchez et al., 1998; Williams, 1976).

Mucho antes de la llegada de los españoles a América, el aguacate ya formaba

parte de la dieta de los aztecas y de otros pueblos americanos. El aguacate

impresionó a los españoles y en sus crónicas aparecen variadas descripciones

sobre la forma del árbol, sus nombres nativos, su sabor y algunas de sus

propiedades medicinales (Villanueva & Verti, 2007).

El aguacate criollo mexicano (Persea americana var. Drymifolia), es la variedad

más antigua utilizada como alimento. Se encontraron semillas de aguacates en

depósitos de cuevas (El Riego, Purrón y Coxcotlán) en el valle de Tehuacán,

Puebla, en México. El cotiledón más antiguo del depósito de cuevas de

Coxcotlán está fechado en al menos 7.000 a.c. (Storey et al., 1986; Williams,

1976). En México, la ciudad de Atlixco, Puebla fue una de las poblaciones

reconocidas por la gran diversidad y calidad de sus aguacates, de esta

población se obtuvo el cultivar Fuerte, que fue la base de la industria

aguacatera de California, USA (Villanueva & Verti, 2007).

Las variedades cultivadas se derivaron de las formas silvestres que todavía

existen en México y en América Central. Se reconocen tres razas de aguacate;

Mexicana, Guatemalteca y Antillana. La clasificación botánica de estas tres

6

razas ha sido variada, algunos indican a la raza Mexicana como una especie

por separado; Persea drymifolia (Kopp, 1966), otros autores como Williams

(1977) clasificó a la raza Guatemalteca como Persea nubigena var.

Guatemalensis. Sin embargo, actualmente se consideran a las tres razas dentro

de la especie Persea americana Mill. (Scora & Bergh, 1990). Después de la

conquista los españoles llevaron el aguacate a España en 1600 y

posteriormente comenzó su distribución a nivel mundial.

Figura 1. Distribución del aguacate después de la conquista en el mundo hasta

antes de 1915. Fuente: Sanchez et al., 1998

Hasta 1963, se tenía registro de alrededor de 47 tipos de aguacates criollos,

todos ellos con nombres regionales. En este mismo año se establecieron los

primeros viveros comerciales con la variedad ‘Hass’ y a partir de 1964, se inicia

el establecimiento de los primeros huertos comerciales con esta variedad,

sustituyendo en el mercado nacional a las variedades Fuerte y Criollas (Scora &

Bergh, 1990; Zamora, 1997).

Las múltiples hibridaciones ocurridas en diferentes ambientes ecológicos de

México y Centroamérica dieron origen al aguacate comestible. Así, en las

regiones americanas en donde el aguacate se cultiva desde tiempos

precolombinos, la producción proviene de fuentes distintas de árboles nativos o

7

criollos y cultivares selectos reproducidos asexualmente, en los cuales el sabor

y los valores nutritivos varían según el tipo ecológico (Acosta et al., 2013).

2.2 Taxonomía del aguacate

El aguacate es una planta leñosa de elevado porte, presenta hojas coriáceas y

semillas dicotiledóneas. Pertenece al orden Ranales y familia Lauraceae.

Comprende poco más de 50 géneros y unas 2,200 especies. La familia

Lauraceae consiste principalmente en tres especies de árboles, algunas de las

cuales son económicamente importantes, incluyendo el aguacate (Persea

americana), la hoja de laurel (Laurus nobilis), la canela (Cinnamomum

zeylanicum) y el alcanfor (Cinnamomum camphora) (Scora & Bergh, 1990)

El aguacate es la única especie de fruta comercialmente importante dentro de

la familia (Davey & Pua, 2007). De esta familia se deriva el género Persea, el

cual tiene dos subgéneros: Persea que contiene pocas especies estrechamente

relacionadas entre sí y Eriodaphne bastante numeroso, variable y claramente

diferenciado del primero principalmente por la pubescencia de la cara interior de

los sépalos de la flor (Bergh et al., 1986; Barrientos et al., 2000; Store et al.,

1986).

Este cultivo se divide en tres variedades o razas botánicas: la raza mexicana (P.

americana var. Drymifolia), la raza guatemalteca (P. americana var.

Guatemalensis) y la raza antillana (P. americana var. Americana). Las

diferencias entre ellas radican principalmente en el tamaño y forma del fruto,

textura y color de la cáscara, tamaño de la semilla y maduración del fruto

(Bergh, 1992; Bergh et al., 1973).

Los árboles de aguacate son de hoja perenne con un sistema de raíces

secundarias poco profundas, las raíces de anclaje pueden penetrar a 3−4 m

(Whiley, 1992). Las flores nacen en ramitas terminales como panículas de

cimas. El fruto del aguacate es una baya grande, carnosa, piriforme o globosa

con una sola semilla. La especie tiene un largo período juvenil y es muy

8

heterogénea debido a la baja incidencia de autopolinización. Los cultivares de

aguacate se clasifican como tipos A o B, debido a su patrón de floración. Cada

flor se abre dos veces en un período de 2 días, y todas las flores abiertas son

funcionalmente femeninas o masculinas. Los cultivares tipo A tienen flores

funcionalmente femeninas en la mañana, mientras que las flores de los

cultivares tipo B son funcionalmente femeninas en la tarde (Davey & Pua,

2007).

La mayoría de las variedades comerciales de aguacate son híbridos

interraciales desarrollados a partir del intercambio de materiales entre las

diferentes razas. De esta manera, los más importantes cultivares de climas

subtropicales, como el 'Hass', 'Bacon' y 'Fuerte', son producto de las cruzas

entre las razas Mexicana y Guatemalteca y tienen diferente grado de

hibridación (Acosta, 2013).

2.3 El aguacate criollo mexicano

El taxón (Persea americana var. Drymifolia) representa a las especies

cultivadas de aguacate conocidos como raza mexicana o criollos y es originaria

de los valles de México (Bergh et al., 1986; Campos et al., 2008). El eje

neovolcánico constituido por los estados de Nayarit, Jalisco, Colima,

Michoacán, Estado de México, Morelos y Puebla, es el área de mayor

diversidad de aguacates de raza mexicana y muy probablemente el centro de

origen de la misma (Campos et al., 2008; Sánchez et al., 1999).

Estas variedades se caracterizan por presentar un ciclo de inicio de cosecha

intermedio y tardío, lo cual limita que su producción se concentre en un periodo

relativamente corto. De acuerdo con los productores de la región, los frutos de

dichas variedades reúnen las características que el mercado demanda (Acosta

et al., 2013). La raza Mexicana incluye variedades nativas con nombres locales

y se usan como pie de injerto para el cultivar 'Hass', que es el más distribuido

en el mundo (Acosta, 2013; Rincón et al., 2011).

9

Los árboles criollos se caracterizan por su resistencia al frío. El principal uso de

los frutos es alimenticio, algunos lo degustan con todo y su piel por su sabor

aromatizante (Rincón et al., 2011; Villanueva & Verti, 2007). De la semilla se

extrae aceite de alta calidad, su madera es apreciada en la elaboración de

artesanías. Una característica muy distintiva son sus hojas fuertemente

aromáticas (olor a anís) en casi todos los individuos, que comúnmente son

usadas en la medicina tradicional y para condimentar diversos platillos

tradicionales (Gutiérrez et al. ,2015).

Sus árboles alcanzan los 15 m de altura, de ramas ligeramente pubescentes;

sus hojas son de color verde oscuro pero los brotes jóvenes son verdes claros o

rojizos; su corteza y madera presentan un característico olor a anís que la

diferencía con otras razas. Los frutos se presentan en 3 a 6 por racimo terminal,

miden aproximadamente entre 4 a 12 cm de longitud, de forma ovoide o

ligeramente piriformes, de cáscara delgada, lisa y suave, de color verde oscuro,

amarillo, café, negro o púrpura con un ligero sabor a anís. Es común que

presenten fibra en la pulpa, aunque ésta no se encuentra en la mayoría de

especies cultivadas; de semilla grande, larga y ovada, puede estar adherida o

suelta y sus cotiledones son lisos o ligeramente rugosos. Por lo general, crecen

a altitudes superiores a los 2.000 m. (Barrientos et al., 2002; Campos et al.,

2008; Guitierrez et al., 2009).

El aguacate criollo no es un cultivo establecido, como lo es el aguacate ‘Hass’.

Se encuentra en bosques mesófilos de montaña y de Lauraceas, cuya

superficie original ha disminuido por la apertura de nuevas áreas a la agricultura

y la ganadería, sobrepastoreo, incendios forestales, avance de las áreas

urbanas y la explotación maderera (Sánchez,1999). Así, una parte considerable

de la enorme riqueza fitogenética de Persea spp. está amenazada por la

destrucción de estos ecosistemas y por la sustitución de cultivos tradicionales

por cultivares mejorados (Torres et al., 2009). Actualmente se cultiva tanto en

huertos como en jardines, estas formas de producción son centros importantes

10

de experimentación, introducción de plantas, mejoramiento empírico y refugios

de una diversidad genética única que contiene genes que no se han estudiado.

La variedad criolla también es fuente de genes de resistencia a plagas y

enfermedades para las variedades comerciales de aguacate (Guitierrez et al.,

2009; Sánchez et al., 1999). Algunos estudios en P. americana var. Drymifolia

muestran la actividad de algunos compuestos químicos contra varios de sus

herbívoros y patógenos, especialmente los terpenoides y fenilpropanoides de

las hojas (Rincón et al., 2011) aunque otros compuestos activos también se han

encontrado en otros tejidos de la planta (Prabha et al., 1980).

2.4 El aguacate cv. ‘Hass’

La variedad más cultivada en el siglo pasado en climas subtropicales es Persea

americana cv. ‘Hass’. Esta variedad es una fruta de raza guatemalteca (P.

americana var. Guatemalensis) mezclada con la raza mexicana (P. americana

var. Drymifolia) y fue creado por Rudolph Hass (1935) en California. P.

americana cv. ‘Hass’ es una especie con alta variabilidad, consistiendo de

varios taxones, variedades botánicas y subespecies que incluyen las tres razas

antes mencionadas (Bergh, 1992).

El fruto es redondeado en forma de pera (140-400 g) con una semilla de

tamaño medio. La pulpa es de color amarillo con un sabor a nuez característico.

La piel gruesa rugosa es la principal peculiaridad de este cultivar y representa

una buena protección frente a plagas y enfermedades. Los tejidos de la cáscara

cambian de color de verde a morado oscuro con el progreso de la maduración.

Además la idoneidad de la fruta para el envío y para el almacenamiento a largo

plazo hace que ‘Hass’ sea una variedad perfecta para el comercio internacional

(Newett et al., 2002).

El aguacate ‘Hass’ produce uno o dos flujos vegetativos y sólo un flujo floral

durante el año. En California, EE. UU y Nayarit, México, se presentan dos flujos

vegetativos y un flujo de floración al año. El crecimiento de raíces ocurre todo el

11

año (Cossio et al., 2008). La diversidad de climas (cálidos, semicálidos o

templados) donde se cultiva 'Hass' en Michoacán propicia que los árboles

produzcan hasta tres flujos vegetativos y cuatro periodos de floración durante el

año (Salazar et al., 2005). Los productores de la región señalan que la emisión

de brotes vegetativos en 'Hass' suele observarse durante 7 a 10 meses y la

floración hasta nueve meses. Este comportamiento fenológico origina la

presencia simultánea de fruto de diferentes edades en el árbol, que es

cosechado durante la mayor parte del año en los distintos climas de la región

(Rocha et al., 2011).

Una característica genética del aguacate ‘Hass’ es que el fruto puede

permanecer adherido al árbol durante más de tres meses después de haber

alcanzado su madurez fisiológica. Entonces, la decisión del productor sobre

cuándo cosechar considera factores ambientales, disponibilidad de mano de

obra y sobre todo el precio en el mercado (Wang et al., 2010).

2.5 Importancia mundial y nacional del aguacate

El aguacate (Persea americana Mill.) es uno de los cultivos más importantes en

México, ya que es el principal productor a nivel mundial con 1.8 millones de

toneladas cosechadas en 220,334 ha (USDA, 2017). Aporta 46 % del valor total

de las exportaciones (SENASICA, 2017). De acuerdo con la Organización para

la Agricultura y la Alimentación (FAO, 2017), el 13 % de los aguacates

producidos en México se comercializan internacionalmente. Actualmente se

satisface el 100% de los requerimientos nacionales con la producción interna,

es decir, no es necesario importar fruto para satisfacer el consumo nacional. Sin

embargo, las importaciones mundiales han aumentado casi en un 200 %

durante la última década, lo que ha generado un aumento en las exportaciones

mexicanas, principalmente hacia EU y Japón (SENASICA, 2017).

Los principales países que cultivan aguacate en orden de importancia son:

México, Chile, Indonesia, Estados Unidos, Colombia, Brasil y República

Dominicana (FAO, 2017; Secretaría de Economía, 2016). En 2017, los

12

principales países importadores de aguacate fueron: EUA (47.1 %), Francia

(12.8 %), Japón (6.1 %) y Canadá (4.9 %), los cuales concentran 70.8 % de la

importación total. Por otro lado, entre los principales países exportadores de

aguacate se encuentra México, el cual participa con 51.4 % del mercado, le

siguen en menor medida Israel (11.6 %), Perú (9.4 %) y Sudáfrica (8.0 %)

(FAO, 2017).

La producción de aguacate en México está concentrada en el estado de

Michoacán, que es la entidad federativa con la mayor producción. La

producción aguacatera del estado de Michoacán ha oscilado entre 80 y 85% del

total nacional. Michoacán es el principal productor de aguacate a nivel nacional,

los estados que lo siguen en mayor producción son: Estado de México, Jalisco,

Nayarit y Morelos, que en conjunto generan 95 % de la producción nacional

(SIAP, 2016; SENASICA, 2016). En México se tiene un consumo per cápita de

aproximadamente 10 kg, lo que posiciona a nuestro país en el primer lugar a

nivel mundial (Secretaría de Economía, 2016).

La franja aguacatera de Michoacán encuentra la región productora de aguacate

más grande del mundo que con una superficie superior a 103 mil hectáreas,

distribuidas en 45 municipios, 5 tipos de climas, 11 tipos de suelo con

pendientes de 5-50 % y altitudes que varían de 1 000 a más de 2 600 m (SIAP,

2016). En esta región predominan los suelos andosoles, con profundidades que

varían de 0.8 m a más de 3 m y tienen gran capacidad para retener humedad

de las lluvias durante la época de sequía. Sin embargo, en las zonas de baja

altitud con climas cálido o semicálido y suelos diferentes a los andosoles, el

riego de auxilio es necesario (Tapia et al., 2007). La importancia económica de

este cultivo reside en la generación de empleos y sus vínculos indirectos con

otras actividades.

2.6 Composición nutricional del aguacate

El aguacate es un fruto climatérico, considerado tropical, con características

sensoriales excelsas, por ser un fruto de alto contenido lipídico, con ácidos

13

grasos insaturados de relevancia nutraceútica, le brinda potencial para su

consumo en fresco o transformado (USDA, 2011).

El aguacate es un fruto rico en nutrientes, la composición está en función del

cultivar, el grado de madurez y las condiciones de cultivo. Los principales

constituyentes de la fruta de aguacate son agua (70-80 %), grasa (15- 18 %),

hidratos de carbono (4-5 %), proteína (1-2 %), fibra (1 %) y ceniza (1 %)

(Donetti, 2012; Moreno et al., 2003). Los carotenoides (70 % lutina) y clorofila

son responsables de la amarillo verdoso a amarillo brillante de la mesocarpio

(Platt et al., 1981).

Los aguacates contienen 2 y 4 g de fibra dietética por 30 g ó media fruta,

respectivamente (USDA, 2011). Por lo tanto, el consumo moderado de

aguacate puede ayudar a lograr una ingesta adecuada de 14 g de fibra dietética

por 1000 kcal, ya que aproximadamente un tercio de este nivel de fibra puede

alcanzarse consumiendo la mitad de un aguacate.

Los aguacates son una buena fuente de vitamina K, fibra dietética, vitamina B6,

vitamina C, ácido fólico y cobre, también son una buena fuente de potasio. El

aguacate también es una buena fuente de aceite, su contenido de aceite varía

según las variedades y el período de extracción del mismo (Orhevba & Jinadu,

2011; Ranade & Thiagarajan, 2015). Además de esto, muchos metabolitos

secundarios también se han aislado de diferentes partes de la planta de

aguacate.

14

Cuadro 1. Composición de la porción comestible del aguacate ‘Hass’

Nutriente / Fitoquímico Contenido en

100 g Una fruta

136 g Nutriente / Fitoquímico

Contenido en 100 g

Una fruta 136 g

Agua (g) 72.3 98.4 Vitamina B-6 (mg) 0.29 0.39

Energía (kcal) 167 227 Folato, alimentos (μg) 89 121

Energía (kcal) (fibra insoluble ajustada)

148 201 Colina, total (mg) 14.2 19.3

Proteína (g) 1.96 2,67 Betaína (mg) 0.7 1

Lípidos totales (grasa) (g)

15.4 21 Vitamina B-12 (μg) 0 0

Cenizas (g) 1.66 2,26 Vitamina A (μg RAE) 7 10

Carbohidratos (g) 8.64 11.8 Caroteno, beta (μg) 63 86

Fibra total dietética (g) 6.8 9.2 Caroteno, alfa (μg) 24 33

Azúcares, total (g) 0.3 0.41 Cryptoxanthin, beta (μg) 27 37

Almidon (g) 0.11 0.15 Luteína + zeaxantina (μg) 271 369

Minerales Vitamina E (alfa-tocoferol), mg

1.97 2.68

Calcio (mg) 13 18 Tocoferol, beta (mg) 0.04 0.05

Hierro (mg) 0.61 0.83 Tocoferol, gamma (mg) 0.32 0.44

Magnesio (mg) 29 39 Tocoferol, delta (mg) 0.02 0.03

Fósforo (mg) 54 73 Vitamina K 1 (filoquinona) (μg)

21 28.6

Potasio (mg) 507 690 Lípidos

Sodio (mg) 8 11 Ácidos grasos, total saturado (g)

2,13 2,90

Zinc (mg) 0.68 0.92 16: 0 (g) 2.08 2,82

Cobre (mg) 0.17 0.23 Ácidos grasos, total monoinsaturados (g)

9.8 13.3

15

Manganeso (mg) 0.15 0,20 18: 1 (g) 9.07 12.3

Selenio (ug) 0.4 0.5 Ácidos grasos, poliinsaturados totales (g)

1.82 2,47

Vitaminas y Fitoquímicos

18: 2 (g) 1.67 2,28

Vitamina C (mg) 8.8 12 18: 3 (g) 0.13 0.17

Tiamina (mg) 0.08 0.1 Colesterol (mg) 0 0

Riboflavina (mg) 0.14 0.19 Estigmasterol (mg) 2 3

Niacina (mg) 1.91 2,60 Campesterol (mg) 5 7

Ácido pantoténico (mg) 1.46 2 Beta-sitosterol (mg) 76 103

Fuente: USDA (2011), tomada de Dreher y Davenport, 2012.

16

2.6.1 Lípidos

El contenido mínimo de aceite necesario para la comercialización de la fruta de

aguacate es 8 %. Después de la maduración, los frutos de aguacate pueden

obtener valores superiores a 20 % de contendio de aceite. Estos cambios

ocurren entre la recolección y la maduración completa, cuando el contenido de

aceite aumenta y se produce un cambio en la composición del mismo. Las

concentraciones de ácidos grasos insaturados aumentan y las de los ácidos

grasos saturados disminuyen (Ozdemir & Topuz, 2004).

El aceite en aguacate se compone predominantemente de lípidos neutros, que

se forman principalmente de triglicéridos, fosfolípidos, glicolípidos y ácidos

grasos libres. La mayor parte de la fracción lipídica se sintetiza en la fruta

durante la fase de crecimiento y la etapa de maduración de la fruta mientras

todavía está unido al árbol (Cowan et al., 2016; Platt et al., 1981).

Los lípidos se concentran principalmente en el mesocarpio o pulpa, que está

formada por células parenquimatosas con idioblastos (que contienen aceite)

que varía de 3 a 30 % de su peso fresco. La pulpa también es rica en ácido

oleico, palmítico, linoléico y palmitoléico, así como ácido esteárico en

cantidades traza (Gaydou et al., 1987). Se ha reportado aumento en el

contenido de ácido oleico y compuestos fenólicos como el ácido protocatéquico,

ácido caféico, epicatequina y la rutina durante la maduración (Ozdemir et al.,

2004). A medida que aumenta el aceite en el mesocarpio, el contenido de agua

disminuye en la misma cantidad, por lo que el porcentaje total de aceite y agua

permanece constante durante la vida de la fruta.

El contenido de estos metabolitos es afectado por diversos factores como la

variedad, la posición del fruto en el árbol, ubicación dentro del fruto, grado de

madurez, prácticas culturales, condiciones ambientales y manejo postcosecha

(Campos et al., 2011). El contenido de aceite es alto y aumenta con el retraso

de la cosecha en los aguacates cultivados en climas subtropicales frescos,

17

llegando de 25 a 30 % en los frutos de los cultivares ‘Hass’ y Fuerte (Kaiser &

Wolstenholme, 1994).

2.6.2 Ácidos Grasos

Los ácidos grasos constituyen los principales componentes de los lípidos y son

necesarios en la nutrición humana como fuente de energía y para cumplir con

funciones de carácter metabólico y/o estructural (Lehninger, 2009). El precursor

más importante para la biosíntesis de ácidos grasos es el acetil-CoA. La

mayoría de los aceites vegetales son ricos en ciertos tipos de ácidos grasos

insaturados, como el oleato y el linoleato. Esto se debe a que las plantas tienen

los mecanismos necesarios para introducir dobles enlaces en posiciones

específicas de las cadenas de acilo producidas por las reacciones de síntesis

de ácidos grasos (Ozdemir & Topuz, 2003).

La composición de ácidos grasos es el rasgo característico para determinar la

calidad y los posibles usos de un aceite dado (Gaydou et al. 1987). Las

cadenas hidrocarbonadas C18: 1, C18: 2, C16: 0 y C16: 1 son los principales

ácidos grasos presentes. El aceite de aguacate consiste en 71 % de ácidos

grasos monoinsaturados (MUFA), 13 % de ácidos grasos poliinsaturados

(PUFA) y 16 % de ácidos grasos saturados (SFA), que ayudan a promover

perfiles saludables de lípidos en la sangre y mejorar la biodisponibilidad de

vitaminas solubles en grasa (Dreher & Dravenport, 2012).

Los ácidos grasos polinsaturados poseen un efecto protector en el ser humano

por disminuir la viscosidad de la sangre, reduciendo así el riesgo de sufrir

enfermedades cardiovasculares. Estos metabolitos se han vinculado con los

efectos antiarrítmicos, antitrombóticos, antiescleróticos, antidepresivos y

pueden mejorar el perfil lipídico en pacientes con hipercolesterolemia moderada

(Biruete et al., 2009; López et al., 1996).

El aceite de aguacate contiene al ácido oleico como principal componente, el

cual favorece el incremento en la concentración de las lipoproteínas de alta

18

densidad o colesterol “bueno” (HDL) y evita la oxidación de las lipoproteínas de

baja densidad o colesterol “malo” (LDL) en la sangre humana. Por el elevado

contenido de ácidos grasos monoinsaturados y la densidad de nutrientes en el

aguacate, este fruto debe ser considerado como parte de una estrategia

dietética para proteger contra el desarrollo de la cardiopatía coronaria (Cowan &

Wolstenholme, 2016; Kritchevsky et al., 2003; Pérez et al., 2005).

2.6.3 Compuestos de importancia biológica

En variedades comerciales de aguacate, tales como 'Hass', compuestos

fitoquímicos han sido identificados en la pulpa, tales como carotenoides,

compuestos fenólicos, fitoesteroles, y antocianinas en la cáscara. Los

compuestos fitoquímicos del aguacate son importantes por su capacidad para

capturar radicales libres que causan estrés oxidativo en las estructuras

celulares y, por lo tanto, proporcionan un efecto beneficioso en la prevención de

enfermedades cardiovasculares, circulatorias, cancerosas y neurológicas

(Corrales et al., 2019; Cox et al., 2004; Vinha et al., 2013).

Los aguacates son uno de los pocos alimentos que contienen niveles

significativos de vitaminas C y E. La vitamina C desempeña un papel importante

en el reciclaje de la vitamina E para mantener la protección antioxidante

circulatoria, como una posible reducción de la tasa de oxidación del colesterol

LDL. La vitamina C podría tener mayores efectos protectores contra la

Enfermedad Cardiovascular en poblaciones específicas como fumadores,

personas obesas y personas con sobrepeso; personas con colesterol elevado,

hipertensión y diabéticos tipo 2; y personas mayores de 55 años (Honarbakhsh

& Schachter, 2009). La fruta de aguacate contiene 2.6 mg y 6 mg de vitamina C

por 30 g y media fruta, respectivamente (USDA, 2011).

Los aguacates contienen 0.59-1.34 mg de vitamina E (α-tocoferol) en 30 g

aguacate, respectivamente (USDA, 2011). Un estudio clínico aleatorizado

sugirió que una combinación de vitamina C y E puede retardar la progresión

aterosclerótica en personas hipercolesterolémicas (Dreher & Dravenport, 2012).

19

Los cambios en el color son representativos de las etapas fisiológicas de frutas

y hortalizas y su medición en postcosecha pueden ser un indicador de la

calidad. En el aguacate, los carotenoides y clorofilas son los principales

responsables del color verde-amarillo del mesocarpio (pulpa) y del aceite

extraído (Asthon et al., 2006; Cox et al., 2004).

Los carotenoides pertenecen a la clase de terpenoides presentes en los

cloroplastos y tienen una función protectora de los pigmentos fotosintéticos de

la luz solar excesiva. El mesocarpio del aguacate es particularmente rico en

carotenoides de los cuales, la luteína representa 70 % (Slater et al., 1975). Los

principales carotenoides que se encuentran en la pulpa madura de ‘Hass’ son

los siguientes: luteína, zeaxantina, α-criptoxantina, β-caroteno y α-caroteno (Lu

et al., 2009). El metabolismo de carotenoides es modulado por la fisiología de

frutas: la maduración tiende a acelerar la degradación de los carotenoides

(Ashton et al., 2006).

Los compuestos fenólicos son los antioxidantes más abundantes en la dieta y

están presentes en todos los tejidos vegetales (Scalbert et al., 2002). Estos

fitoquímicos, se sintetizan durante el metabolismo secundario de las plantas

cuando son expuestas a la radiación ultravioleta, daños fisiológicos por

patógenos o algún otro tipo de estrés (biótico o abiótico) (Das et al., 2012;

Yedidia et al., 2008). Estructuralmente, los fenoles contienen un anillo aromático

con uno o más grupos hidroxilos sustituyentes que pueden variar desde

moléculas simples hasta grandes compuestos polimerizados. Según su

estructura, se clasifican en: ácidos fenólicos, flavonoides, estilbenos, lignanos y

taninos (hidrolizables y condensados) (Balasundram et al., 2006; Palafox et al.,

2011).

Los aguacates contienen un nivel moderado de compuestos fenólicos que

aportan aproximadamente 140 mg de equivalentes de ácido gálico (GAE) por

media fruta. El aguacate también tiene una capacidad antioxidante total de 600

μmol de Trolox Equilvalent (TE) por 30 g (Wu et al., 2004). Los aguacates

tienen la mayor capacidad antioxidante lipófila de la fruta, lo que puede ser un

20

factor para ayudar a reducir la peroxidación de lípidos en suero y promover la

salud vascular (Wu et al., 2007).

Los flavonoides, son el mayor grupo de compuestos fenólicos de las plantas.

Las variaciones en su estructura dan como resultado las principales clases de

flavonoides, es decir, flavonoles, flavonas, flavanonas, flavanoles, isoflavonas, y

antocianidinas (Bravo, 1998)

Las antocianinas son una clase de flavonoides sobre la base de una estructura

heterocíclica con 15 unidades carbonos unidos a azúcares. Se almacenan en

vacuolas celulares con pH bajo (3-3.5) (Hosseinian & Beta, 2008). Cox et al.,

(2004) mencionan que la temperatura de maduración tiene un efecto de

correlación positiva con la concentración de antocianinas (cianidina 3-O-

glucósido) encontradas en la cáscara del aguacate ‘Hass’.

2.7 Enfermedades del aguacate

A pesar del largo período de exposición del fruto de exposición a patógenos

potenciales desde su crecimiento, desarrollo hasta la madurez, los aguacates

no siempre presentan síntomas de enfermedad antes de la cosecha. Durante el

periodo postcosecha es que generalmente aparecen las pudriciones de la fruta

(Hartill et al., 1991). Es probable que la mayoría de las infecciones ocurran

antes de la cosecha, pero permanezcan latentes hasta que los cambios

fisiológicos y bioquímicos, que se inician cuando se extrae una fruta del árbol,

causen una reducción en la concentración de inhibidores fúngicos presentes en

la fruta (Prusky et al., 1983).

El aguacate presenta enfermedades severas que en casos extremos provocan

la muerte del árbol y en general, una disminución en la producción, que varía

del 10 al 40 % (Sánchez et al., 1999). Las enfermedades de mayor importancia

económica son: la antracnosis del fruto (Colletotrichum gloeosporioides Penz);

la roña del fruto (Sphaceloma persea Jenkins); el anillamiento del fruto causado

por el complejo de bacterias (Pseudomonas sp., Xanthomonas sp., Clavibacter

21

Corynebacterium sp.) y hongos (Alternaria sp., Diplodia sp., Dothiorella sp., y

Pestalotia sp.); la tristeza o pudrición de la raíz (Phytophthora cinnamomi); el

cáncer de tronco y ramas (Fusarium epishaeria Snyder y Hansen, P.

boehmeriae Sawada y Nectria galligena Cayley); y algunas otras enfermedades

fúngicas causadas por Diplodia natalensis, Rhizopus nigricans, Alternaria sp.,

Verticillum sp., F. roseum, C. gloeosporioides Penz y S. persea Jenkins (Ahmed

& Barmore, 1980; Darvas & Kotze, 1987; Hartill, 1991; Jenkins, 1934; Prusky et

al., 1983; Yahia & Woolf, 2011; Zentmyer, 1984).

De las tres razas de aguacate utilizadas como portainjertos, la Mexicana (P.

americana var. Drymifolia) ha mostrado tener una mayor tolerancia e incluso

resistencia moderada a P. cinnamomi (Coffey, 1987; Zentmyer & Lewis, 1976) y

esta es la razón por la cual se utilizan portainjertos de esta raza para injertar los

cultivares comerciales como el ‘Hass’.

2.7.1 La roña en aguacate

Una de las enfermedades de mayor importancia económica es la roña o costra

del aguacate, asociada al hongo Sphaceloma perseae Jenk (Jenkins, 1934),

que ocasiona una infección superficial en la fruta, las hojas y ramas jóvenes del

aguacate, y produce pérdidas de poscosecha de hasta 53 % (Vidales, 1996).

La roña del aguacate se reportó por primera vez en un vivero en Florida en

1918 (Stevens, 1922). El hongo Sphaceloma persea Jenkins fue reportado

como agente causal de la roña en aguacate desde 1934 (Jenkins A).

Posteriormente el mismo síndrome fue observado en África (Guinea,

Marruecos, Sudáfrica, Zambia, Zimbabwe), Asia (Filipinas, Taiwán), América

Central y las Antillas (Antillas, Costa Rica, Cuba, República Dominicana,

Guadalupe, Guatemala, Haití, Honduras, Jamaica, Nicaragua, Panamá, Puerto

Rico, Salvador) y en América del Sur (Argentina, Brasil, Guyana, Perú,

Venezuela) (Anónimo, 1986). En 1991, se registró por primera vez en Nueva

Zelanda (Hartill, 1991). El registro en Nueva Zelanda se basó en la

identificación de un hongo aislado de cicatrices en el aguacate. Se depositó un

22

cultivo liofilizado en la Colección internacional de microorganismos de plantas

(ICMP, mantenido por Landcare Research, Auckland, Nueva Zelanda). El

síntoma también fue fotografiado y publicado por Hartill (1991).

Everett et al., (2011) realizaron identificación molecular de los hongos

asociados con los síntomas de roña en aguacates de nueva Zelanda. Los

resultados indicaron que el registro original del hongo causante de dicha

enfermedad no era S. persea sino Phaeosphaeria sp.

Posteriormente, en el año 2015 se propuso una actualización clasificatoria,

colocando a Sphaceloma dentro del género Elsinoë (fase sexual de S.

perseae= Elsinoë perseae), debido a que éste último hongo es más

comúnmente encontrado como agente causal de la enfermedad de la roña en

diversos frutos (Crous et al., 2013; Li et al., 2011) En la actualidad ambos son

considerados sinónimos (Rossman et al., 2015).

Cuadro 2. Clasificación taxonómica de E. perseae. Fuente: Rossman y W.C. Allen, 2016.

Reino Fungi

División Ascomycota

Subdivisión Pezizomycotina

Clase Dothideomycetes

Subclase Dothideomycetidae

Orden Myriangiales

Familia Elsinoaceae

Género Elsinoë

Especie E. perseae

Elsinoë perseae se caracteriza morfológicamente por formar conidios hialinos,

con forma ovoide a oblongooelipsoide, a veces bigutulados, de

aproximadamente 5-8 × 3-4 μm (Jenkins, 1934). El crecimiento fúngico en PDA

es lento y produce colonias convuladas. Los cultivos son oscuros en la parte

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4681266/?report=reader#R24



23

inferior de las placas, y las colonias son de color beige claro (Everett, 2011;

Palmateer, 2006).

Los síntomas se manifiestan como lesiones de color café, de aspecto corchoso,

de forma inicial redonda o irregular, que al unirse pueden cubrir parte del fruto o

el fruto completo, dándole un aspecto parecido al mamey. En las hojas se

presentan como pequeñas manchas individuales de color café oscuro de menos

de tres milímetros de diámetro, ocasionando distorsión de las nervaduras

(Everett et al., 2011). En el fruto los daños son exclusivos del pericarpio y no de

la pulpa, aunque las lesiones pueden ser la entrada de otros organismos que

afectan a su valor comercial.

Figura 2. Cultivo perteneciente a S. perseae en medio PDA con 25 días de crecimiento a 20 °C. Fuente: Everett et al. 2011

24

Figura 3. Conidióforo y conidios de S. perseae. Fuente: Jenkins, 1934

Figura 4. Síndrome de roña en aguacates: a) Criollo b) ‘Hass’. Fuente: Elaboración propia.

25

Figura 5. Lesiones de roña en tallo, hoja y fruto de aguacate. Fuente: Jenkins,

1934

26

Figura 6. Corte histopatológico de hoja de aguacate con síntomas de roña. Fuene: Jenkins, 1934

La observación de frutos de aguacate en México mostraron que las lesiones

podían tener un diámetro de hasta 10 mm, inicialmente de forma redondeada

con un margen irregular que al unirse forman un área extendida irregular que

logra cubrir toda la superficie de la fruta (Palmateer, 2006). En las hojas, las

lesiones a menudo son rojas, y el centro a veces se cae dando lugar a agujeros

(Pernezny & Marlatt 2007). Las lesiones en las hojas se forman con mayor

27

frecuencia en la parte superior del dosel del árbol (Pernezny & Marlatt, 2007), y

la superficie superior de las hojas fue más susceptible que la superficie inferior.

La identificación de hongos se ha realizado con base a la descripción

morfológica utilizando las claves taxonómicas. La diversidad genética en los

hongos puede evaluarse con la observación de otras características

morfológicas, tales como el nivel de organización celular (unicelular, pluricelular

o dimórfico), características del talo (filamentoso o no), características del

micelio (tamaño micro o macroscópico; forma amorfa o definida; septos

ausentes o presentes; situación aérea o profunda; aspecto algodonoso,

aterciopelado, terroso, húmedo, seco; coloreado o sin color; consistencia

blanda, papirácea, carnosa, etc) (Hyde, 2010).

Algunos caracteres son bastante estables, pero la gran mayoría son variables

debido a que son influenciados por el ambiente, además de que es difícil

encontrar suficientes marcadores morfológicos para realizar un estudio de

variabilidad confiable y difícilmente su identificación llega a nivel de especie. Por

lo tanto, la certeza de las clasificaciones es ambigua y poco confiable (González

& Simpson, 1997).

Las nuevas herramientas moleculares permiten la identificación de genes

implicados en un conjunto de caracteres, incluyendo los caracteres adaptativos,

así como los polimorfismos que causan la variación genética funcional. El modo

más rápido y rentable de medir la diversidad genética es mediante el análisis de

polimorfismos utilizando marcadores genéticos moleculares que pueden

proporcionar información indirecta sobre genes funcionales para caracteres

importantes (Piercey & Egger, 2001),

2.8 Marcadores moleculares

Para estudiar la variación genética de los hongos, se han desarrollado diversas

técnicas de biología molecular (Piercey & Egger, 2001), entre estas técnicas se

encuentra la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Cadene

Reaction, PCR), basada fundamentalmente en la réplica o duplicación de

28

regiones particulares de ADN. Sin embargo, como tal no es una herramienta de

análisis, pero es necesaria para determinar las características del ADN

amplificado. En la forma más simple, la presencia/ausencia de un producto

obtenido puede ser el resultado final, como en diagnóstico en el que los

iniciadores o primers utilizados generalmente se alinean con el ADN de cierto

organismo. Por otra parte, el tamaño y número de productos puede ser el

resultado final, con el uso de pimers universales que generan huellas de ADN

(Mullis et al., 1986). Sin embargo, con mayor frecuencia el análisis de la región

amplificada se lleva a cabo mediante el uso de enzimas de restricción o

directamente con la secuenciación.

Tanto para estudios de variabilidad genética como para análisis de regiones

conservadas, se han evaluado diferentes marcadores moleculares. Las

regiones que codifican para el ARN ribosómico (ADN mitocondrial, ADN

nuclear), tienen mayor interés en estudios de taxonomía y filogenia de hongos,

mientras que las zonas no codificantes del ARN nuclear, son más utilizadas en

investigaciones de identificación y tipificación de estas especies (Iturralde,

2005). Los genes 18S, 5.8S y 28S del ARNr nuclear, se separa por dos

regiones Espaciadoras Internas que se Transcriben ITS1 e ITS2. (Por sus siglas

en inglés Internal Transcribed Spacer). Las regiones ITS son consideradas

como una secuencia universal de códigos de barras para especies fúngicas

(Iturralde, 2005).

La secuencia del ADN ribosomal que incluye las regiones ITS1, 5.8S e ITS2 ha

sido usada con frecuencia en taxonomía y filogenia. Esta región ha sido

identificada como la región Barcode de hongos (Schoch et al., 2012) ya que

además de presentar un buen Barcode gap (alto grado de variación

interespecífica y baja variación intraespecífica), es de fácil amplificación por su

gran número de repeticiones.

El ADN Barcoding es una herramienta actualmente disponible para los

taxónomos, que tiene como objetivo, proveer un método eficiente para la

identificación de organismos a nivel de especie. Se basa en la premisa de que

29

una secuencia corta estandarizada de ADN puede distinguir individuos de una

especie, porque las variaciones genéticas entre especies son mayores que

dentro de las especies (el llamado Barcode gap) (Hajibabaei et al., 2007). En la

práctica, la secuencia de ADN puede ser generada de una pequeña muestra de

tejido de un organismo no identificado, esta secuencia es comparada con una

librería de secuencias de referencia provenientes de especies conocidas. Una

coincidencia entre la secuencia del organismo desconocido y la secuencia de

referencia puede proveer una rápida y reproducible identificación (Kress et al.,

2007).

Schoch et al. (2012) evaluaron la utilidad de diferentes secuencias, entre ellas

la Subunidad Pequeña del Ribosoma (SSU), la subunidad grande del ribosoma

(LSU) e ITS, llegando a la conclusión de que ésta última debería ser propuesta

como marcador universal para hongos. Sin embargo, estos resultados

contrastan con los de Santamaría (2009) quien determinó el uso de SSU y LSU

inadecuados para la identificación, y con los de Seifert et al., (2007) en los que

18S, 28S e ITS no pudieron diferenciar tantas especies como el gen Cox1.

Los genes que codifican proteínas también se han utilizado ampliamente para

construir filogenias moleculares para ayudar en la identificación y clasificación

de taxones, esto debido a que permiten un fácil reconocimiento de homología y

convergencia, en la mayoría de los casos se producen en una sola copia en los

hongos, son menos variables en su longitud ya que se acumulan menos

mutaciones en sus exones (Berbee & Taylor 2001; Einax et al., 2003), además

cuentan con regiones intrónicas, que a veces evolucionan a un ritmo más rápido

en comparación con ITS y se emplean en análisis filogenéticos debido a su

mejor resolución en niveles taxonómicos superiores en comparación con los

genes rRNA (Schoch et al., 2012) .

El gen del factor de elongación de la traducción alfa (EF-1α), codifica una parte

esencial de la maquinaria de traducción proteica (Geiser et al., 2004). EF-1α es

un componente del proceso de síntesis de proteínas en eucariotas y

arqueobacterias. Es catalogada como una proteína G, que en conjunto con

30

GTP, se une al aa-tRNA y lo lleva al sitio A del complejo preformado: ribosoma-

mRNA-peptidil-tRNA para la síntesis de la cadena proteica (Irinyi et al., 2006).

Actualmente EF-1 es considerado como el gen esencial en análisis multigénicos

en una amplia variedad de hongos (Geiser et al., 2004; O’Donnell et al., 2004)

debido a que codifica para una proteína ubicua altamente conservada con

propiedades idóneas para la inferencia de relaciones filogenéticas (Roger et al.,

1999), tiene presencia universal en organismos eucariontes y procariontes, y

cuenta con única copia del gen dentro del genoma. Además, se ha demostrado

que es un gen útil para resolver relaciones filogenéticas a nivel de especie, así

como en divergencias más profundas donde las sustituciones de aminoácidos

proporcionan una resolución filogenética (Druzhinina & Kubicek, 2005).

Los marcadores moleculares han sido eficientes en el estudio de la diversidad

genética de fitopatógenos y en la identificación de formas especiales. Algunas

técnicas utilizadas para determinar la diversidad genética son RAPD (Random

Amplified Polymorphyc DNA), RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism) (Bentley, 1998), AFLP (Amplified Fragment Length

Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeats) y actualmente la

secuenciación de porciones o genes completos (Kristensen et al., 2005; Wulff et

al., 2010).

2.8.1 PCR-RFLPs

El análisis con RFLP se usa ampliamente para la detección de variación de

secuencias de ADN entre especies. Consiste en la generación de perfiles de

bandas específicas de especie a través de PCR y la subsecuente digestión del

amplicón de ADN con una o más enzimas de restricción (Botstein et al., 1980).

Estas enzimas de restricción rompen la molécula de DNA en sitios de

reconocimiento de 4-6 pares de bases (pb) específicos, originando un conjunto

de fragmentos con diferentes longitudes que podrían separarse de acuerdo a

tamaño molecular mediante electroforesis (Figura 7). El perfil RFLP distintivo de

cada especie es el resultado de la distribución genómica única de los sitios de

31

reconocimiento (generados o eliminados por sustituciones de una sola base) y

la distancia entre ellos (que varía debido a reordenamientos genómicos

grandes, como translocaciones, elementos transponibles o tándem y

duplicaciones (Pereira, 2008).

Con el advenimiento de la técnica de reacción de PCR (Mullis, 1987) el análisis

de RFLP, conocido como PCR-RFLPs, se ha utilizado rutinariamente para la

detección de especies cuando se compara con los fragmentos digeridos de

DNA de organismos previamente identificados.

Figura 7. Representación esquemática del método de RFLP . Fuente: Pereira, 2008

2.9 Literatura citada

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41

3 DIVERSIDAD GENÉTICA Y MORFOLÓGICA DE HONGOS ASOCIADOS A LA ROÑA EN ACUACATES CRIOLLOS

MEXICANOS3 3.1 Resumen

El taxón (Persea americana var. Drymifolia) representa a las especies de

aguacate conocidos como raza mexicana y es originaria de los valles de

México. Una característica muy distintiva de estos frutos es su cáscara lisa y

muy delgada. La roña o corchosis es una de las enfermedades fúngicas de

mayor importancia para este cultivo. Los síntomas se caracterizan como

lesiones de aspecto corchoso en la superficie del fruto, sin dañar la pulpa.

Hasta la fecha se tiene incertidumbre acerca de cúal es el agente causal del

síndrome de roña en aguacates, por lo que el objetivo de este trabajo fue aislar

e identificar hongos asociados a síntomas de roña en aguacates criollos

mexicanos. Los aislamientos fueron identificados morfológica y molecularmente

mediante el uso de marcadores moleculares, amplificando los genes ITS y EF-1

mediante PCR. Se obtuvieron 32 aislamientos fúngicos y se formaron ocho

grupos basándose en características morfológicas similares, los cuales fueron

identificados dentro de los géneros Mucor, Alternaria, Colletotrichum, Phoma y

Pestalotiopsis. El análisis de las secuencias ITS permitió la identificación de las

especies Mucor racemosus, Alternaria tenuissima, Alternaria burnsii,

Pestalotiopsis sp, Phoma sp., Colletotrichum gloeosporioides y Arthrinium sp.

Para el análisis de las secuencias EF-1, se dentificaron las especies de Mucor

circinelloides, Lasiodiplodia iranensis, Neopestalotiopsis sp., Phoma

medicaginis, Colletotrichum sp, y Arthrinium phragmites. El análisis filogenético

basado en las secuencias ITS mostró una agrupación errónea de una cepa de

Alternaria sp. en el grupo de Colletotrichum sp., indicando que este gen no da

especifidad para diferenciar estas especies. Sin embargo, al secuenciar esta

especie de Alternaria con el gen EF-1 el resultado es Lasiodiplodia iranensis,

por lo que el apoyo de la identificación de caracteres morfológicos resulta

complementario para poder diferenciar estas especies.

Palabras clave: aguacate criollo, gen EF-1, gen ITS, roña.



42

3.2 Abstract

Genetic and morphological diversity of fungi associated with the scab in

Mexican landrace avocados4

The taxon (Persea americana var. Drymifolia) represents the avocado species known as the Mexican landrace and is native to the valleys of Mexico. A very distinctive characteristic of these fruits is their smooth and very thin skin. The scab is one of the most important fungal diseases for this crop. The symptoms are characterized as corky lesions on the surface of the fruit, without damaging the pulp. To date there is uncertainty about what is the causal agent of the syndrome of scab in avocados, so the objective of this work was to isolate and identify fungi associated with symptoms of scab in Mexican landrace avocados. The isolates were identified morphologically and molecularly by the use of molecular markers, amplifying the ITS and EF-1 genes by PCR. 32 fungal isolates were obtained and eight groups were formed based on similar morphological characteristics, which were identified within the genera Mucor, Alternaria, Colletotrichum, Phoma and Pestalotiopsis. The analysis of the ITS sequences allowed the identification of the species Mucor racemosus, Alternaria tenuissima, Alternaria burnsii, Pestalotiopsis sp, Phoma sp., Colletotrichum gloeosporioides and Arthrinium sp. For the analysis of the EF-1 sequences, the species of Mucor circinelloides, Lasiodiplodia iranensis, Neopestalotiopsis sp., Phoma medicaginis, Colletotrichum sp, and Arthrinium phragmites were identified. The phylogenetic analysis based on the ITS sequences showed an erroneous grouping of a strain of Alternaria sp. in the group of Colletotrichum sp., indicating that this gene does not give specificity to differentiate these species. However, when sequencing this species of Alternaria with the EF-1 gene, the result is Lasiodiplodia iranensis, so the support of the identification of morphological characters is complementary to be able to differentiate these species.

Key words: Mexican landrace avocado, EF-1 gene, ITS gene, scab

4 Thesis of Doctorado en Ciencias Agroalimentarias, Programa de Posgrado en Ciencia y

Tecnología Agroalimentaria, Universidad Autónoma Chapingo. Author: Diana Becerra Morales Director de Tesis: J.Joel E. Corrales García

43

3.3 Introducción

El taxón (Persea americana var. Drymifolia) representa a las especies

cultivadas de aguacate conocidos como raza mexicana o criollos y es originaria

de los valles de México (Bergh et al., 1986; Campos et al., 2008). Una

característica muy distintiva de estos frutos es su cáscara lisa y muy delgada;

sus hojas son fuertemente aromáticas (olor a anís) en casi todos los individuos,

y comúnmente son usadas en la medicina tradicional y para condimentar

diversos platillos tradicionales (Gutiérrez et al., 2015). La variedad criolla

también es fuente de genes de resistencia a plagas y enfermedades para las

variedades comerciales de aguacate (Guitierrez et al., 2009; Sánchez et al.,

1999).

La roña o corchosis es una de los síndromes de mayor importancia para el

cultivo del aguacate, que ocasiona pérdidas de hasta el 53 % (Vidales, 1996).

Los síntomas se caracterizan como una infección superficial en la fruta, con

lesiones de aspecto corchoso y de color café de forma inicial irregular, que al

unirse pueden cubrir parte de la superficie del fruto sin dañar la pulpa. Aunque

los síntomas en las hojas y ramas jóvenes del aguacate no son tan notorios, se

pueden presentar como manchas color café oscuro o distorsión de nervaduras

(Everett et al., 2011; Vidales, 1996).

La roña del aguacate se reportó por primera vez en un vivero en Florida en

1918 (Stevens, 1922). Posteriormente se identificó a Sphaceloma perseae

Jenks (Jenkins, 1934) como agente causal de dicha enfermedad en algunos

huertos de California y México. A partir de esta fecha se ha reportado trabajos

sobre la incidencia de roña en aguacates ‘Hass’ y Fuerte (Hartill, 1991;

McMillan, 1976; Salgado, 1993; Stevens & Piper, 1960), haciendo referencia al

agente causal reportado por Jenkins (1934). En el año 1991, se registró un

trabajo de identificación morfológica de un hongo aislado de lesiones de roña en

la superficie de frutos de aguacate de Nueva Zelanda (Hartill, 1991). No fue

hasta el año 2011 que Everett et al., (2011) realizaron identificación molecular

de los hongos asociados con los síntomas de roña en aguacates de Nueva

44

Zelanda. Sin embargo, los resultados indicaron que el agente causal dicha

enfermedad en Nueva Zelanda no era S. persea sino Phaeosphaeria sp. Hasta

la fecha, no existen reportes del aislamiento y la identificación molecular de

Sphaceloma perseae, lo que pone en duda al patógeno responsable, como lo

señala Alfaro et al., (2015).

Debido a la creciente importancia del síndrome de roña en las principales áreas

productoras de aguacate de México, se ha implementado el uso de métodos de

identificación y caracterización de hongos basados en el uso de marcadores

moleculares (Acosta et al., 2009; Gutiérrez et al., 2009). La región Espaciadora

Transcrita Interna (ITS) y el el Factor de Elongación de la Traducción (EF-1) se

han amplificado con fines de identificación filogenética. Además, se han tomado

en consideración criterios morfológicos para establecer las posiciones

taxonómicas correctas de las especies. Por ello, el objetivo de este estudio es

caracterizar e identificar los hongos asociados a la roña en aguacates criollos

con aparentes síntomas de daños por roña en el pericarpio.

3.4 Materiales y métodos

3.4.1 Recolección de muestras

Se colectaron cinco frutos en etapa de madurez fisiológica y con síntomas

característicos de roña en el pericarpio de seis accesiones de aguacate criollo,

en los poblados de Axocopan y Veracruz, en el municipio de Atlixco, Puebla

(Cuadro 3). Posteriormente se trasladaron al laboratorio bajo condiciones de

refrigeración.

3.4.2 Aislamiento del patógeno

Los frutos se lavaron con agua destilada y se desinfestaron con una solución de

hipoclorito de sodio 2.5% durante 5 min. Después se enjuagaron 3 veces con

agua estéril y se secaron con papel absorbente estéril. Se realizaron cortes de

tejido de 1 cm de corteza con síntomas de roña y se depositaron en platos con

medio Agar-Papa-Dextrosa (PDA, DIFCO®); se incubaron a 25 ± 2 ºC por 5

45

días bajo exposición de luz blanca continua. La obtención de cultivos

monospóricos se realizó mediante la técnica de punta de hifa en cajas Petri con

medio Agar-Agar.

3.4.3 Caracterización morfológica

El medio de cultivo agar-papa-dextrosa (PDA) se utilizó para la caracterización

morfológica de los aislamientos. Se colocó un trozo de 3 mm de micelio en cada

caja con medio de cultivo, proveniente de un aislamiento monospórico. Las

cajas se colocaron en una cámara de incubación marca Thermo Scientific a una

temperatura de 22 °C, por un periodo de 8 días. Posteriormente, se procedió a

describir la forma de la colonia, color, tipo y forma de crecimiento del micelio. La

presencia de conidios, el tamaño, la forma y el color de conidios, formación de

ascas, ascosporas, picnidios o alguna otra estructura característica, con la

ayuda de un microscopio marca Olympus modelo BX41BF (Tokio, Japón) y

usando las categorías de Hawksworth et al., (1995).

3.4.4 Identificación molecular

Para la extracción de ADN se utilizó el método CTAB con algunas

modificaciones (Murray & Thompson 1985; Weising et al., 2005). Con la ayuda

de una espátula se colectó el micelio de cada caja Petri y se transfirió a tubos

Eppedorf de 2 mL donde fue macerado con nitrógeno líquido. Se agregó 1mL

de Buffer de lisis (NaCl 5M, Tris HCl 1M, EDTA 0,5M y CTAB 2 %) y se incubó

a temperatura de 65 °C durante 60 min en un termobaño con agitación

constante. El pellet se purificó por medio de lavados con chloroformo-alcohol

isoamílico (24:1) y el DNA se precipitó con etanol 70 % frío. El ADN puro se

disolvió en buffer TE (Tris-Cl pH 7.5 y EDTA pH 8) y se guardó a -20 °C. La

calidad e integridad de DNA se determinó en geles de agarosa 1 %. La

concentración de DNA se determinó con un espectrofotómetro Nanodrop ND-

1000 (NanoDrop Tecnologies, Wilmington, DE, EUA).

46

La amplificación del ADN se realizó con el marcador molecular para el espacio

transcrito Interno (ITS) con los cebadores ITS 5HP [5'

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG – 3'] y NL4 [5'–

GGTCCGTGTTTCAAGACGG– 3'] y para factor de elongación 1α (EF-1α) con

los cebadores EF1 [5’-ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3’] y EF2 [5’-

GGA(G/A)GTACCAGT(G/C) ATCATGTT-3’] (O’Donnell & Cigelnik, 1997;

O'Donnell et al., 1998). Estos amplifican un fragmento de 1200 pb para ITS y

650 pares de bases para EF. Las condiciones del perfil térmico fueron para ITS

predesnaturalización a 94 ºC durante 5 min, posteriormente 35 ciclos

(desnaturalización a 94 ºC por 30 s, alineamiento a 57 ºC por 30 s y extensión a

72 ºC por 45 s) y finalmente, una extensión de 72 ºC por 10 min. Para EF1

predesnaturalización a 95 ºC durante 4 min, posteriormente, 35 ciclos

(desnaturalización a 95 ºC por 1 min, alineamiento a 52 ºC por 1 min y

extensión a 72 ºC por 2 min) y finalmente, una extensión de 72 ºC por 10 min en

un termociclador automático (GeneAmp PCR System 9700 Applied

Biosystems). Los productos de PCR se analizaron en gel de agarosa 1.2 % por

electroforesis con amortiguador de corrida TAE 1X, con voltaje 90 voltios.

Las secuencias bidireccionales se alinearon con el programa BioEdit (Hall

1999). Se realizó un BLAST para determinar la especie por medio de la página

web del National Center of Biotechnology Information (NCBI). Para comparar la

similitud de los aislamientos se realizó un análisis filogenético con el Programa

Mega X (Tamura et al., 2013) y se utilizó accesiones provenientes del NCBI.

47

Cuadro 3. Lugar de colecta y características de los frutos de las diferentes accesiones de aguacate criollo.

Accesión Lugar de colecta Altitud

(m) Latitud Longitud Características fisiológicas

A Axocopan, Atlixco,

Puebla 1865.38 18°53.981’N 98° 27.554’W

Frutos pequeños, forma de canica, madura en verde

B Axocopan, Atlixco,

Puebla 1866.6 18° 53.982’N

98° 27.585’ W

Frutos medianos, ovalados, madura en negro

C Axocopan, Atlixco,

Puebla 1871.78 18° 53.989’N

98° 27.536’ W

Frutos ovalados, medianos, madura en negro

D Axocopan, Atlixco,

Puebla 1866.29 18° 53.986’N 98° 27.542’W

Frutos en forma de pera, medianos,madura en negro

M1 Veracruz,

Atlixco, Puebla 1751.3 18°52'08.6"N 98°26'17.6"W

Frutos grandes, alargados, madura en verde

M2 Veracruz,

Atlixco, Puebla 1755.82 18°52'09.2"N 98°26'19.0"W

Frutos grandes, esféricos, madura en verde

48

3.5 Resultados y discusión

3.5.1 Caracterización morfológica

Se recuperaron un total de 32 aislamientos fúngicos de frutos de aguacate

criollo con síntomas de roña en el pericarpio. Las comparaciones sobre los

fenotipos junto con las características de crecimiento del micelio de las colonias

en cajas Petri con PDA, permitieron la formación de siete grupos (Figura 8).

Cinco de ellos fueron caracterizados a nivel de género, usando las claves

taxonómicas de Barnett y Hunter (1998), y las descripciones compiladas por

Alexopoulos (1996), Cepero et al., (2012), y Herrera y Ulloa (2013). Los

aislamientos restantes fueron catalogados según el criterio de Lacap, Hyde, y

Liew, (2003) como Mycelia sterilia, debido a la ausencia de estructuras

reproductivas en el medio de cultivo.

De acuerdo a las características macro y microscópicas, los aislados fúngicos

del Grupo A presentaron micelio de color crema grisáceo a amarillo con textura

tipo algodonosa laxa, al reverso color amarillo, crecimiento aéreo compuesto de

esporangióforos. El micelio está conformado por hifas gruesas y cenocíticas, los

esporangios son terminales multiesporados, de coloración café, globosos sin

apófisis, los esporangióforos son erectos, hialinos, ramificados sin rizoides,

teniendo similitud con Mucor sp.

El grupo B presentó aislamientos con micelio de color gris y café oliváceo con

textura aterciopelada o lanosa, al reverso son de color café oscuro a negro,

crecimiento superficial, no presenta exudación; micelio conformado por hifas

septadas de color café-marrón, conidióforos son de color marrón, ramificados,

conidios de color marrón con septos transversales y longitudinales, forma

elipsoide, arreglados en cadenas acrópetas catenuladas, similares Alternaria

sp.

Los aislados fúngicos del Grupo C presentaron tonalidades café oscuro en el

centro a pardo conforme continua su crecimiento, con textura aterciopelada,

49

correosa y húmeda; al reverso son de color café oscuro a negro; el micelio está

conformado por hifas septadas de color café-marrón, las clamidosporas se

desarrollan de forma aislada en el ápice de la hifa, son de coloración marrón

con septos transversales y longitudinales, forma globosa, arregladas de forma

individual, similares al género Peryonellaea.

Los aislados fúngicos del Grupo D presentaron color blanco a grisáceo con

textura algodonosa densa, masas conidiales de color naranja brillante cerca del

punto de inoculación, al reverso son de color amarillo crema, crecimiento aéreo;

micelio hialino, conidios hialinos, cilíndricos con extremos redondeados y rectos,

similares a Colletotrichum sp.

Los aislados fúngicos del Grupo E fueron identificados como Pestalotiopsis sp.

Presentaron colonias de coloración blanquecina con textura algodonosa, al

reverso color blanco a beige; esporodoquios negros, crecimiento superficial e

irregular; conidios de forma fusiforme, con 4 septos; la célula basal con

apéndice simple; la célula apical cónica y presenta de 1 a 4 apéndices simple;

las células intermedias de color amarillo a marrón. Los aislados fúngicos del

Grupo F y G no pudieron identificarse puesto que no presentaron estructuras

reproductivas. Sólo se pudo apreciar micelio con hifas septadas hialinas.

La identificación de patógenos fúngicos es una tarea difícil, si sólo se basa en

las características morfológicas de los aislamientos. La diversidad de especies

de hongos aisladas de aguacate es similar a la reportada en otras áreas de

cultivo de aguacates en todo el mundo (Hartill & Everett 2002; Eskalen 2011;

McDonald, Menge & Ploetz, 2003). Sin embargo, con base en la identificación

morfológica, ninguno de los hongos identificados fue Sphaceloma perseae. Por

esta razón, la utilización de técnicas de idntificación molecular resulta útil

cuando existe incertidumbre en la diferenciación de especies.

50

Figura 8. Características morfológicas de los aislamientos obtenidos de síntomas de roña en aguacate criollo. A-F. Morfología de la colonia después de 10 días de crecimiento en medio PDA. a-f. Conidios después de 10 días en PDA. A-a. Mucor sp. B-b Alternaria sp. C-c. Phoma sp. D-d. Collecotrichum sp. E-e. Pestalotipsis sp. F-f. Arthrinium sp.

3.5.2 Identificación molecular

Los pares de primers ITS5HP- NL4 y EF1-729F- EF2 amplificaron la mayoría de

las muestras, con fragmentos de aproximadamente 1200 y 500 pb,

respectivamente. Las especies que no amplificaron, no se enviaron a

secuenciación. Como resultado se obtuvieron 17 secuencias para ITS y 6

secuencias para EF-1. Posteriormente se realizó el análisis BLAST (Cuadro 4 y

5) para la identificación por género y especie de la secuencia con mayor

porcentaje de similitud y cobertura (Huang et al., 2009), recomendablemente

con valores >95 % de identidad (Raja & Oberlies, 2017). La información

A a

B

C

D

E

F

b

c

d

e

f

51

obtenida de dicho análisis fue concordante con la mayoría de los aislamientos

identificados por medio de caracterización morfológica realizada con

anetrioridad.

De acuerdo con en análisis de comparación de secuencias en el GenBank, los

aislamientos del grupo A mostraron una similitud del 97 % con Mucor

racemosus; los aislamientos del grupo B mostraron similutud del 99 % con

Alternaria tenuissima; sin embargo, las cepas C3, C7, D1 y F1, también se

identificaron como A. tenuissima. Las cepas C2 y E1 tuvieron el 99 % de

similitud con Pestalotipsis sp. y el aislamiento C5 obtuvo 99 % de similitud con

Phoma sp. Por último, también se identificó a la cepa G1 como Arthrinium sp.

Con base en la identificación de las secuencias, la frecuencia de aislamiento de

especies de hongos de aguacates asociados a síndrome de roña fue la

siguiente: Alternaria sp. de 52 %, seguida de Colletotrichum gloeosporioides

con 17 %, Pestalotiopsis sp. 11 % y Phoma sp., Mucor racemosus y Arthrinium

sp. fue de 5 %.

Para tener mayor confiabilidad y soporte en la identificación de los aislados

fúngicos se realizaron análisis filogenéticos con base en el fragmento

amplificado de las secuencias del gen ITS y EF-1 utilizando el algoritmo de

Máxima Verosimilitud. Para el árbol filogenético de ITS (Figura 9) se pueden

identificar dos grandes clados: el primero conformado por la cepa A2 pertenece

a Mucor racemosus. Para el segundo se pueden identificar a grandes rasgos

dos subgrupos: uno formado por las cepas B1, F1, C7, B6, B3, B2, C3, C1,

identificados dentro del género Alternaria y C5, clasificado como Phoma sp. El

otro sub grupo está formado por las C2, E1, G1, D7, D5, D4 y D1, clasificacdas

como C. gloeosporioides.

Hay muchas especies que no podrían ser diferenciadas basados en métodos

moleculares, sobre todo, las especies con esporas pequeñas de Alternaria sp.

El análisis de secuencias de ITS del DNA nuclear ha revelado variación entre

las especies de Alternaria de esporas pequeñas. Sin embargo, no logra resolver

52

estos taxones como filogenéticamente distintos (Paul et al., 2015; Pryor &

Michailides, 2002; Simmons, 2007). Esto puede dar explicación a la variabilidad

de algunas cepas de Alternaria tenuissima que pertenecen a dos grupos

filogenéticos distintos.

Alternaria sp. es un hongo común en la naturaleza, sobrevive y se desarrolla

sobre los residuos de los cultivos y senescencia de hojas y malezas. Puede

desarrollarse sobre fruta dañada por las quemaduras solares o pájaros, y en el

caso particular del aguacate, los trips pueden ser un vector para la infección de

este hongo (Van et al., 1988). Especies de Alternaria sp. tienen una amplia

gama de huéspedes como patógenos de plantas, ocupando el décimo lugar en

términos del número total de asociaciones de plantas hospedantes (Farr et al.,

1989). Algunas especies son conocidos como patógenos destructivos, pero la

gran mayoría son saprófitos.

Cuadro 4. Identidad molecular de hongos aislados de frutos de aguacate, mediante amplificación del gen ITS

Aislamiento Nombre Identidad

%

A2 Mucor racemosus 97

B1 Alternaria tenuissima 99




C1 Alternaria burnsii 99

C2 Pestalotiopsis sp. 99

C3 Alternaria tenuissima 98

C5 Phoma sp. 99

C7 Alternaria tenuissima 99

D1 Alternaria tenuissima 99

D4 Colletotrichum gloeosporioides 99



E1 Pestalotiopsis sp. 99

F1 Alternaria tenuissima 99

G1 Arthrinium sp. 98

http://link.springer.com/article/10.1007/s11557-016-1219-3#CR20

53

Figura 9. Árbol filogenético a partir de secuencias obtenidas de la región ITS de los aislamientos de aguacate criollo, realizado con MEGA 6 con 500 repeticiones de bootstraping en NTSYS


mediante amplificación del gen EF-1

Aislamiento Nombre Identidad

A2 Mucor circinelloides 98 %

B6 Lasiodiplodia iranensis 100 %

C6 Phoma medicaginis 95 %

D8 Colletotrichum sp. 99 %

E2 Neopestalotiopsis sp. 100 %

G1 Arthrinium phragmites. 89 %

54

Colletotrichum gloeosporioides es un patógeno que produce la descomposición

del fruto y daño en partes vegetativas de diferentes hospederos y es

económicamente importante debido a que causa pérdidas postcosecha

(Freeman & Shabi, 1996; Sanders & Korsten, 2003). Las enfermedades

causadas por C. gloeosporioides incluyen la antracnosis, la podredumbre

obscura de los frutos y flores, la podredumbre de las raíces, la mancha foliar, en

una amplia gama de cultivos como el aguacate, almendra, melocotón (Freeman

et al., 1998; Silva & Ávila, 2011). Algunos de los frutos colectados, después de

siete días de almacenamiento comenzaron a presentar síntomas de

antracnosis, por lo que se puede suponer que al momento de la colecta ya

existía la infección por C. gloeosporioides, aunque las lesiones no fueran

visibles.

Especies Pestalotiopsis y Phoma sp. se ha reportado como patógenos en

algunas variedades de aguacate y otras frutas tropicales incluyendo mango,

manzana, banano y uva; sin embargo, no se sabe con exactitud los daños que

puedan producir estos hongos en el fruto de aguacate (Djeugap et al., 2015;

Zhang et al., 2003).

Algunos autores (Everett et al., 2011; Fan et al., 2017; Hyun et al., 2009; Swart

et al., 2001) han empleado el gen ITS para la identificación de especies de

hongos. Sin embargo, Cannon et al. (2012) y Shetty, KG. et al. (2016)

mencionan que la secuenciación de la región ITS para la identificación de

Colletotrichum spp. no da resultados confiables y muy posiblemente la

agrupación por especies sea incorrecta.

Niguno de los hongos identificados con anterioridad han sido reportados como

causantes de los síntomas de roña en aguacate. Es posible que esporas de

otros cultivos infectados y utilizados como cobertura del suelo en los huertos

aledaños a las plantaciones de aguacate contaminaran los aguacates

muestreados (Everett et al., 2011). Estos síntomas de roña en los frutos

también son muy similares en apariencia a los causados por daños físicos

como el roce del viento como lo describeToit et al., (1979) y Hartill (1991).

55

3.6 Conclusiones

Los hongos asociados a la roña en aguacate fueron identificados mediante los

genes ITS y EF-1 dentro de los géneros Mucor sp., Alternaria sp., Pestalotiopsis

sp., Phoma sp., Colletotrichum sp., Pestalotiopsis sp. Y Arthrinium sp. Ninguno

de los asilamientos asociados a la roña de los aguacates criollos colectados,

fue indentificado como S. perseae, lo que abre la posibilidad de que sean otros

los patógenos responsables de dicha enfermedad.


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59

4 VARIABILIDAD GENÉTICA DE HONGOS ASOCIADOS A LA ROÑA EN

AGUACATES CRIOLLOS MEXICANOS MEDIANTE MARCADORES

MOLECULARES RFLPS5

4.1 Resumen

La corchosis del aguacate se manifiesta como lesiones de color café, de aspecto seco, de forma inicial redonda o irregular que al unirse pueden cubrir parte del fruto o el fruto completo, ocasionando un aspecto parecido a la cáscara del mamey, modificando su calidad visual. La superficie irregular y hundida propicia a que otros patógenos se hospeden, dificultado la capacidad de identificar al agente causal. El objetivo de este trabajo fue evaluar la diversidad fúngica asociada al síndrome de corchosis en aguacate criollo mexicano mediante el análisis RFLPs (fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica) de los amplicones correspondientes a los Espaciadores Transcritos Internos (ITS) y Factor de Elongación de la Traducción (EF-1). Se colectaron aguacates criollos mexicanos con síntomas de roña en el pericarpio provenientes del municipio de Atlixco, México. Se recuperaron un total de 32 aislamientos fúngicos de la superficie de estos frutos, se realizó la extracción de DNA y la amplificación de los fragmentos de ITS. El corte de los fragmentos ITS con enzimas de restricción (Hae III, Hha I y Hinf I), permitió observar polimorfismo entre los distintos tipos de hongos, generando fragmentos de diferentes pesos moleculares, con los cuales se agruparon los aislamientos por similitud de bandas. El dendrograma agrupó a los aislamientos en ocho grupos. Los hongos identificados pertenecen a los géneros de Alternaria sp., Pestalotipsis sp., Phoma sp., Colletotrichum sp., Artrhinium sp. Algunos de los hongos encontrados son patógenos importantes que ocasionan daños postcosecha de frutos; sin embargo, ninguno de ellos ha sido reportado como el agente causal de la corchosis en aguacate. No se identificó a S. perseae.

Palabras clave: aguacate criollo, RFLPs, ITS, EF-1



60

4.2 Abstract

Molecular markers RFLPs for the analysis of genetic variability of fungi associated to sacbs in avocado6

The avocado scab is manifested as brown, dry-looking lesions, initially round or irregular in shape, which may cover part of the fruit or the whole fruit, giving it a similar appearance to the mammee skin, affecting its visual quality. The irregular and sunken surface propitiates that other pathogens stay, hindering the ability to identify the causal agent. The objective of this work was to evaluate the fungal diversity associated with scab of Mexican Landrace avocados by means of the RFLPs analysis (fragments of Polymorphic Length Restriction) of the amplicons corresponding to the Internal Transcribed Spacers (ITS) and the Translation Elongation Factor (EF-1). Mexican landrade avocados with symptoms of scab in the pericarp were collected from the municipality of Atlixco, Mexico. A total of 32 fungal isolates were recovered from the pericarp of these fruits, DNA extraction and the amplification of the ITS fragments was performed. The cutting of the ITS fragments with restriction enzymes (Hae III, Hha I and Hinf I), allowed to observe polymorphism between the different types of fungi, generating fragments of different molecular weights, with which the isolates were grouped by band similarity. The dendrogram grouped the isolates into eight groups. The fungi identified belong to the genera of Alternaria sp., Pestalotipsis sp., Phoma sp., Colletotrichum sp. and Artrhinium sp. The diversity of the isolations was very broad. Some of the fungi found are important pathogens that cause postharvest fruit damage; however, none of them has been reported as the causal agent of corkscrew in avocado.S. perseae was not identified.

Key words: avocado, RFLPs, ITS, EF-1



61

4.3 Introducción

Entre los factores fitopatológicos que más limitan la exportación, se encuentran

la antracnosis y roña (Lázaro, 1985; Téliz, 1999; USDA, 1997). La roña del

aguacate, asociada al hongo Sphaceloma persea jenk (Jenkins, 1934), es una

de las enfermedades de mayor importancia para este cultivo en México, ya que

puede producir pérdidas de gran importancia económica. Se manifiesta como

lesiones de color café, de aspecto seco, de forma inicial redonda o irregular que

al unirse pueden cubrir parte del fruto o el fruto completo, dándole un aspecto

parecido a la cáscara del mamey, afectando su calidad visual. La superficie

irregular y hundida propicia a que otros patógenos se hospeden, dificultado la

capacidad de identificar al agente causal (Gutiérrez et al. 2015; Sánchez et al.,

1999)

La detección de diversas especies de hongos en muestras de plantas y suelos

se ha basado hasta ahora en técnicas de aislamiento convencionales seguidas

de la identificación del hongo en función de la morfología y la especialización

del huésped (Sutton, 1992). Las condiciones ambientales, medio de cultivo y

factores de estrés bióticos y abióticos dificultan su identificación de manera

tradicional. La PCR es un método de diagnóstico ampliamente utilizado para la

detección de hongos patógenos de plantas (Miller, 1996).

El análisis con RFLP se usa ampliamente para la detección de la variación de

secuencias de DNA entre especies. Es una técnica robusta porque genera

fragmentos específicos (o subfragmentados) de ADN a partir de pequeñas

cantidades del amplicón de ADN a través de la digestión del ADN con una o

más enzimas de restricción (Botstein et al., 1980; Piterkova, 2009). Estas

enzimas de restricción rompen el amplicón de ADN en sitios de reconocimiento

de 4-6 pares de bases (pb) específicos, originando un conjunto de fragmentos

con diferentes longitudes que podrían separarse de acuerdo a tamaño

molecular mediante electroforesis.

62

El perfil RFLP distintivo de cada especie es el resultado de la distribución

genómica única de los sitios de reconocimiento (generados o eliminados por

sustituciones de una sola base) y la distancia entre ellos (que varía debido a

reordenamientos genómicos grandes, como translocaciones, elementos

transponibles o tándem y duplicaciones (Pereira, 2008).

El objetivo de este trabajo fue evaluar la diversidad fúngica asociada a

corchosis de aguacate criollo mexicano del municipio de Atlixco, Puebla,

mediante amplificación directa de espaciadores transcritos internos (ITS), el

Factor de Elongación de la Tradución (EF-1) y el análisis de los fragmentos de

restricción de longitud polimórfica (RFLP). La diversidad de la población se

evaluó mediante el análisis comparativo de la región ITS y por medio de RFLP-

PCR se detectaron las diferencias reconocidas por las enzimas de restricción

entre los fragmentos homólogos de los subgrupos o subconjuntos de hongos.

La identificación de las cepas resultantes se realizará mediante secuenciación.


Se colectaron cinco frutos en etapa de madurez fisiológica y con síntomas

característicos de roña en el pericarpio, de seis accesiones de aguacate criollo,

en las poblaciones de Axocopan y Veracruz, pertenecientes al municipio de

Atlixco, Puebla. Posteriormente se trasladaron al laboratorio para el análisis

respectivo, y se almacenaron a temperatura de 22 °C.


Los frutos se lavaron con agua destilada y se desinfestaron con una solución de

hipoclorito de sodio al 2.5 % por 5 min. Después se enjuagaron tres veces con

agua estéril y se secaron con papel absorbente estéril. Se realizaron cortes de

tejido de 1 cm de corteza con síntomas de roña y se depositaron en Placas

Petri con medio Agar-Papa-Dextrosa (PDA, DIFCO®); se incubaron a 25 ± 2 ºC

por 5 días bajo exposición de luz blanca continua. La obtención de cultivos

monospóricos se realizó mediante la técnica de punta de hifa en Platos Petri

con medio Agar-Agar.

63

4.4.2 Análisis molecular

Para la extracción de ADN se utilizó el método CTAB con algunas

modificaciones (Murray & Thompson 1985; Weising et al., 2005). Con la ayuda

de una espátula se colectó el micelio de cada Petri y se transfirió a tubos

Eppedorf de 2 mL donde fue macerado con nitrógeno líquido. Se agregó 1 mL

de Buffer de lisis (NaCl 5M, Tris HCl 1M, EDTA 0,5M y CTAB 2 %) y se incubó

a temperatura de 65 °C durante 60 min en un termobaño con agitación

constante. El pellet se purificó por medio de lavados con chloroformo-alcohol

isoamílico (24:1) y el DNA se precipitó con etanol 70 % frío. El ADN puro se

disolvió en buffer TE (Tris-Cl pH 7.5 y EDTA pH 8) y se guardó a -20 °C. La

calidad e integridad de DNA se determinó en geles de agarosa 1 %. La

concentración de DNA se determinó con un espectrofotómetro Nanodrop ND-

1000 (NanoDrop Tecnologies, Wilmington, DE, EUA).

La amplificación del ADN se realizó con el marcador molecular para el espacio

transcrito Interno (ITS) con los cebadores ITS 5HP [5'

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG – 3'] y NL4 [5'–

GGTCCGTGTTTCAAGACGG– 3'] y para factor de elongación 1α (EF-1α) con

los cebadores EF1 [5’-ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3’] y EF2 [5’-

GGA(G/A)GTACCAGT(G/C) ATCATGTT-3’] (O’Donnell K. y Cigelnik E. 1997;

O'Donnell K et al. 1998). Estos amplifican un fragmento de 1200 pb para ITS y

650 pares de bases para EF. Las condiciones del perfil térmico fueron para ITS

predesnaturalización a 94 ºC durante 5 min, posteriormente 35 ciclos

(desnaturalización a 94 ºC por 30 s, alineamiento a 57 ºC por 30 s y extensión a

72 ºC por 45 s) y después una extensión de 72 ºC por 10 min. Para EF1

predesnaturalización a 95 ºC durante 4 min, posteriormente, 35 ciclos

(desnaturalización a 95 ºC por 1 min, alineamiento a 52 ºC por 1 min y

extensión a 72 ºC por 2 min) y finalmente, una extensión de 72 ºC por 10 min en

un termociclador automático (GeneAmp PCR System 9700 Applied

Biosystems). Los productos de PCR se analizaron en gel de agarosa 1.2 % por

electroforesis con amortiguador de corrida TAE 1X, con voltaje 90 voltios.

64

RFLPs de la región ITS Y EF-1

Para seleccionar las muestras a secuenciar, se utilizó la técnica de RFLPs. Los

fragmentos de los hongos obtenidos con el par de iniciadores IT5/NL4, se

digirieron con las enzimas HaeIII (Fementas®), Hha I (Fementas®) y HinfL

(Fementas®) conforme las especificaciones del proveedor.

El producto de digestión se visualizó en geles de acrilamida 8 % teñido con

nitrato de plata. En este paso se agruparon los hongos por similitud con base en

los tamaños de los fragmentos digeridos y se seleccionaron aquellos que fueran

diferentes entre sí para la secuenciación.

Análisis de fragmentos RFLPs

Los fragmentos obtenidos del marcador PCR-RFLP se analizaron de acuerdo

con el método informado por Nuñez y Valadez (2010). Las bandas digeridas se

codificaron en una matriz binaria, a partir de la cual se construyó una matriz de

similitud con el programa NTSyS pc. 2.0 y el coeficiente de similitud Dice. Se

realizó un análisis filogenético utilizando el método UPGMA a partir de la matriz

binaria generada en la codificación de las bandas.


4.5.1 RFLPs de la región de ITS y EF-1

El corte con enzimas de restricción (Hha I, Hae III, y Hinf I) a partir de los

fragmentos ITS y las enzimas (HaeIII y Alu I) para fragmentos de EF-1,

permitió observar polimorfismo entre las distintas muestras de hongos,

generando fragmentos de diferentes pesos moleculares, lo que permitió

agrupar los aislamientos por similitud de bandas.

El análisis de RFLP, se ha utilizado rutinariamente para la detección de

especies (Grolla & Czub, 2004; Silverstein et al., 1996; Wolf et al., 1999; Zehner

et al., 1998) cuando se comparan fragmentos digeridos de ADN de organismos

previamente identificados.

65

Los perfiles polimórficos generados fueron diferentes para cada población,

abarcando de dos a cuatro fragmentos. El análisis de polimorfismos de ITS y

EF-1 generado por la digestión de las enzimas mostró la formación de 6 grupos

diferentes (Figura 10 y 11) concordantes con el número de géneros y las

muestras fúngicas descritas previamente con base a la caracterización

morfológica.

No hubo diferencias de agrupación de los perfiles polimórficos generados por

cada enzima de restricción, por lo que de esta manera fue posible seleccionar

sólo representantes de cada grupo para la secuenciación e identificación

molecular.

El primer grupo formado fueron las Cepas A1 y A2; el segundo grupo lo

conforman las cepas B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, C1, C3, C7, C8 Y F1; el

tercer grupo esta formado por la scepas C2 Y E1; cuarto grupo formado por

C4, C5 y C6; quinto grupo formado por las cepas D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7,

D9 y por último, el sexto grupo por las cepas G1 y G2.

El análisis UPGMA a partir de la digestión del fragmento amplificado del gen

ITS con la información de las tres enzimas de restricción permitió agrupar a

los hongos en dos grupos principales (Figura 12). El grupo a, se dividió en dos

subgrupos, clasificando en uno de ellos a los aislamientos A1 y A2, y a los G1 y

G2 en otro. Con base en la morfología, estos aislamientos fueron los únicos

que presentaron micelio aéreo. El segundo clado se dividió en cuatro

subgrupos.

El análisis UPGMA a partir de la digestión del fragmento amplificado del gen

EF-1 con la información de las dos enzimas permitió agrupar a los aislamientos

en 6 clados diferentes (Figura 13). La agrupación realizada con este gen

parece concordar más con la agrupación realizada por medio de las

características morfológicas de los aislamientos. Por esta razón se eligió una

muestra representante de cada uno de los clados (A2, B6, C6, D8, E2 y G1)

para realizar la secuenciación.

66

Figura 10. PCR-RFLPs obtenidos de la digestión enzimática del amplificado del gen ITS con el uso de las enzimas de restricción Hha1, Hhae III, Hinf I.

67

a)

b)

Figura 11. PCR-RFLPs obtenidos de la digestión enzimática del amplificado del gen EF-1 con el uso de las enzimas de restricción a) Hae III y b) Alu I

68

b

a

Figura 12. Dendrograma generado a partir de la digestión del fragmento amplificado del gen ITS con el uso de las enzimas: Hae III, HhaI y Hinf I. Construcción basada en el método de agrupamiento UPGMA utilizando el coeficiente de Dice (1945) / Nei-Li (1979). El soporte de la topología con un bootstrap de 1000 repeticiones. Valores de distancia genética se muestra sobre las ramas

69

Figura 13. Dendrograma generado a partir de la digestión del fragmento amplificado del gen EF-1 con el uso de las enzimas: Hae III y Alu I. Construcción basada en el método de agrupamiento UPGMA utilizando el coeficiente de Dice (1945) / Nei-Li (1979). El soporte de la topología con un bootstrap de 1000 repeticiones. Valores de distancia genética se muestra sobre las ramas

*

70

4.5.2 Identificación de cepas por similitud de polimorfismos

Considerando el estudio de diversidad basado en la distancia genética entre

cada cepa fúngica por medio de PCR-RFLPs, se infiere que los organismos

presentes en el mismo clado formado en el dendograma, pertenecen a la

misma especie.

Cuadro 6. Identificación de cepas no secuenciadas basada en secuencias de ADN y por similitud de agrupamiento en RFLPs.

Cepa Seciencia ITS Secuencia EF-1

A1 Mucor racemosus

A2 Mucor racemosus

G1 Arthrinium sp. 1

G2 Arthrinium sp

B1 Alternaria tenuissima






C1 Alternaria burnsii strain

C3 Alternaria tenuissima





F1 Alternaria tenuissima

C2 Pestalotiopsis sp.

E1 Pestalotiopsis sp.

D1 Alternaria tenuissima

D2 Colletotrichum

gloeosporioides

71

D3 Colletotrichum

gloeosporioides

D4 Colletotrichum gloeosporioides

D6 Colletotrichum

gloeosporioides


D9 Colletotrichum

gloeosporioides


D8 Colletotrichum

gloeosporioides

C4 Phoma sp

C5 Phoma sp.

C6 Phoma sp

Se ha demostrado que los productos de amplificación de ITS que tienen

patrones de RFLP idénticos con diferentes enzimas de restricción tienen

secuencias de ADN muy estrechamente relacionadas (Neuvéglise et al., 1994).

Esto se confirmó en el presente estudio para los seis grupos ITS- RFLP a partir

de tres enzimas de restricción y para los seis grupos EF-1- RFLPs a partir de

dos enzimas de restricción.

De acuerdo a la secuenciación de la región ITS y el gen EF-1 de dichas cepas,

se identificaron los siguientes grupos de hogos y su frecuencia de aislamiento:

Alternaria sp. (52 %), Colletotrichum gloeosporioides (17 %), Pestalotiopsis sp.

(11%), Phoma sp. (5 %), Mucor racemosus (5 %), y Arthrinium sp. (5 %). Estos

resultados concuerdan con el número de grupos generados por los PCR-

RFLPs, lo que nos indica que ésta técnica se puede usar sin la necesidad de

una secuenciación sistemática para la discriminación de muestras

pertenecientes al mismo género.

72

Una de las desventajas que se le atribuyen a los RFLPs es la falta de claridad

en los perfiles polimórficos generados a partir de los geles de acrilamida, debido

a que cada fragmento puede representar una región diferente, pero con el

mismo peso molecular (Crous, Hawksworth & Wingfield, 2015). Curran y

Webster (1989) señalan que las diferencias en los perfiles polimórficos no

pueden ser usadas como criterio único para delimitar una especie. Por esta

razón, esta técnica es un complemento para la identificaión de los aislamientos

a nivel de especie.

Los análisis de PCR-RFLPs demostraron que ninguna de estas secuencias fue

similar a las S. perseae ó E. perseae o con especies relacionadas,

pertenecientes al mismo género como: E. fawcettii, E. australis, E. canavaliae y

E. phaseoli y E. ampelina (Jenkins 1925; Shear 1929; Jenkins 1931; Bruner y

Jenkins 1933; Bitancourt y Jenkins 1936; Boedijn 1961; Tan et al., 1996)

agentes causales de la enfermedad de la roña en diversos frutos.

4.6 Conclusiones

La diversidad fúngica asociada al síndrome de roña en aguacates criollos

mexicanos es muy amplia. Los análisis de PCR-RFLPs permitieron la formación

de seis grupos de hongos y mediante la secuenciación se confirmó a cada

grupo como una especie diferente. Ninguna de estas secuencias fue similar a S.

perseae.


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76

5 FISIOLOGÍA POSTCOSECHA Y CAMBIOS FISICOS Y QUÍMICOS EN

AGUACATES ‘HASS’ INOCULADOS CON DIVERSOS HONGOS 7

5.1 Resumen

El principal factor de pérdidas postcosecha en el aguacate ‘Hass’ es el daño por patógenos fúngicos, que producen diversas alteraciones fisiológicas y alteran la calidad y vida de anaquel de los frutos. En el presente trabajo se evaluó el comportamiento postcosecha y los cambios fisicoquímicos en aguacates ‘Hass’ inoculados con diversas especies de hongos, durante 10 días de almacenamiento a temperatura ambiente (22 °C). Los patógenos que presentaron mayor severidad de infección en este experimento fueron Colletotrichum gloeosporoides, Alternaria sp., y Pestalotiopsis sp., causando necrosis en la zona de la infección. Todos los frutos inoculados presentaron decremento en la firmeza comparado con el Testigo (sin inocular). La mayor tasa de respiración (394.98 mL CO2 Kg-1 h-1) y producción de etileno (661.79 mL Kg h-1) se presentó en los frutos inoculados con Colletotrichum gloeosporoides, a los seis días de almacenamiento. Se pudo observar una aceleración en la tasa de respiración al tercer día de almacenamiento, para los frutos inoculados con Penicillium crustosum. El efecto de la inoculación con Colletotrichum gloeosporoides (T7) disminuyó significativamente (P ≤ 0.05) la actividad Antioxidante en la cáscara de aguacate ‘Hass’ con respecto al testigo. Para el análisis de la pulpa, frutos inoculados con Phoma sp. y Colletotrichum gloeosporoides, tuvieron la mayor actividad antioxidante, comparada con el testigo. Los hongos Mucor racemosus, Phoma sp., Nemania sp. y Artrhinum sp. no provocaron cambios significativos en las variables evaluadas, en comparación con los frutos inoculados con Colletotrichum gloeosporoides., Penicillium crustosum, Pestalotiopsis sp. y Alternaria sp.

Palabras claves: aguacate ‘Hass’, tasa de respiración, actividad antioxidante,

fenoles



77

5.2 Abstract

Postharvest physiology and physical and chemical changes in ‘Hass’

avocados inoculated with different fungi8

The major factor of postharvest losses in the ‘Hass’ avocado is the damage caused by fungal pathogens, which produce changes in the quality and physiological alterations of the fruits. In the present work, physiology postharvest and physicochemical changes were evaluated in ‘Hass’ avocados inoculated with different fungi species, during 10 days of storage at room temperature (22 °C). The pathogens that presented the highest severity infection in this experiment were Colletotrichum gloeosporoides, Alternaria sp. and Pestalotiopsis sp. causing necrosis in the area of infection. All inoculated fruits showed a decrease in firmness compared to the control (without inoculation). The highest respiration rate (394.98 mL CO2 mL Kg h-1) and ethylene production (661.79 mL mL Kg h-1was in the fruits inoculated with Colletotrichum gloeosporoides, after six days of storage. The highest respiration rate was observed on the third day of storage for the fruits inoculated with Penicillium crustosum. The effect of the inoculation with Colletotrichum gloeosporoides (T7) significantly decreased (P ≤ 0.05) the antioxidant activity in the ‘Hass’ avocado peel with respect to the control. For the analysis of the pulp, fruits inoculated with Phoma sp. and Colletotrichum gloeosporoides had the highest antioxidant activity compared with the control. The fungi Mucor racemosus, Phoma sp., Nemania sp. and Artrhinum sp. did not cause significant changes in the evaluated variables, in comparison with the fruits inoculated with Colletotrichum gloeosporoides, P. crustosum, Pestalotiopsis sp. and Alternaria sp.

Key words: ‘Hass’ avocado, respiration rate, antioxidant activity, phenols



78

5.3 Introducción


nivel mundial, sobre todo para México, por los beneficios socioeconómicos que

derrama hacia sus productores (Dreher & Davenport, 2013). Los principales

países productores son México, Chile, Indonesia, Estados Unidos, Colombia,

Brasil y República Dominicana. México es el principal país exportador con 51.4

% del total mundial, seguido de Israel (11.6 %), Perú (9.4 %) y Sudáfrica (8.0 %)

(FAO, 2012; Secretaría de Economía, 2011). Persea americana Mill cv. ‘Hass’

es la fruta de aguacate más popular entre los consumidores de todo el mundo

debido a su rico sabor, alta calidad general y atributos relacionados con la salud

(Pedreschi et al., 2015).

El aguacate está afectado por varias enfermedades, tanto en la etapa pre como

en la poscosecha. FAO (2014) informó que las pérdidas postcosecha de frutos

de aguacate fueron entre 15-50 % del total de la producción. El principal factor

al que pueden atribuirse es el daño por patógenos fúngicos. La antracnosis,

(Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides; Glomerella cingulata), que causa

lesiones necróticas en la pulpa y cáscara (Humble & Reneby, 2015) es la

enfermedad poscosecha más severa del aguacate (Djami et. al., 2012) y puede

producir pérdidas de hasta 80 % de los frutos almacenados postcosecha

(Darvas & Kotze 1987).

La roña, asociada a Sphaceloma perseae causa lesiones en forma de

lenticelas, que dan al fruto una apariencia de tipo corchosa, disminuyendo su

calidad visual, pero sin afectar la pulpa (Everett et al., 2011; Jenkins,1934).

Algunos otros patógenos fúngicos como Alternaria sp., Fusarium sp., Diplodia

sp., Dothiorella sp., Botryosphaeria parva, B. dothidea y Phomopsis sp., (Hartill,

1991) causan pudriciones en tallo y en pulpa. Especies de Cercospora

ocasionan la mancha negra en el aguacate, también puede causar grandes

pérdidas postcosecha en los frutos y su incidencia en México es localizada

(Teliz, 2000; Pérez, 2008).

79

El aguacate es un fruto climatérico que madura unos días después de la

cosecha debido a una serie de eventos como el aumento de la actividad

respiratoria, la mayor producción de etileno, el contenido de lípidos modificado y

la textura alterada, que implica la degradación de las células mesocarpianas

(Miles et al., 2013; Seymour & Tucker, 1993) provocando que los frutos sean

más susceptibles a la infección de patógenos. Por lo tanto, el objetivo de este

trabajo fue evaluar el comportamiento postcosecha y los cambios fisicoquímicos

en aguacate ‘Hass’ inoculado con diversos hongos fitopatógenos, aislados de

tejido con síntomas de roña.



Aguacates del cv. 'Hass' con síntomas de roña y mancha negra se colectaron

en el municipio de Atlixco, Puebla, en febrero, junio y octubre de 2017. El

aislamiento y la purificación de los hongos se realizó de acuerdo con la

metodología propuesta por Agrios (2005). Se recolectaron seis frutos con roña y

seis con síntomas de mancha negra en 10 árboles de aguacate ‘Hass’. Se

cortaron pequeñas secciones de tejido de corteza (0.5 cm), se desinfectaron

con hipoclorito de sodio al 1.5 % durante dos minutos, se enjuagaron dos veces

con agua destilada estéril y se secaron sobre papel absorbente. Luego, los

tejidos de la corteza se colocaron en placas de Petri con agar papa dextrosa

(PDA) y se incubaron durante 15 días a 25 ° C. Los cultivos puros se obtuvieron

a partir de puntas hifales de la colonia. La identificación de los hongos se llevó a

cabo utilizando las claves taxonómicas de Barnett y Hunter (1998). Un hongo

representativo de cada especie fue considerado como un tratamiento

independiente (Tabla 1).

5.4.2 Pruebas de patogenicidad

Frutos sanos de aguacate ‘Hass’ se lavaron y se desinfectaron en una solución

de hipoclorito de sodio al 2.5 % durante 5 min. Se enjuagaron tres veces con

agua destilada y se secaron con papel estéril. Los frutos de aguacate fueron

80

inoculados por contacto directo. Se realizaron tres perforaciones (3 mm) entre el

pericarpio y el mesocarpio de la fruta, con la ayuda de una aguja de disección.

Se cortó un disco de diámetro (3 mm) que contenía micelio y se colocó sobre la

herida en la fruta, permaneciendo en contacto con la superficie de la fruta con el

micelio. Cada hongo obtenido fue considerado como un tratamiento, la unidad

experimental fue una fruta con seis repeticiones. Inmediatamente después de la

inoculación, los frutos se colocaron en una cámara húmeda a 25 ºC ± 2 durante

diez días. Como control se utilizaron frutas perforadas inoculadas con agua

estéril.

Cuadro 7. Distribución de tratamientos de los hongos inoculados en aguacate ‘Hass’.

Tratamiento Nombre

T1 Mucor racemosus

T2 Alternaria tenuissima

T3 Nemania sp.

T4 Pestalotiopsis sp.

T5 Pestalotiopsis sp.

T6 Phoma sp.

T7 Colletotrichum gloeosporioides

T8 Arthrinium sp.

T9 Sordariomycetes sp.

T10 Penicillium crustosum

TESTIGO Agua destilada

5.4.3 Variables físicas

Pérdida de peso

Para registrar los valores de peso (g) se utilizó una balanza digital (OHAUS

Modelo Traveler TA1501). Se tomaron datos del peso total del fruto durante los

diez días del experimento. La pérdida de peso se calculó por diferencia de

peso, respecto al peso inicial y expresado en porcentaje en base al peso fresco

81

según el método estándar de AOAC (1994). El cálculo se realizó con la

Ecuación (6):

(6) % 𝑃𝑃 =𝑃𝑖−𝑃𝑓

𝑃𝑖∙ 100

Dónde:

PP = Pérdida de peso (%). Pi = Peso inicial del fruto (kg). Pf = Peso final del

fruto (kg). Los resultados se expresaron en (%) respecto al peso inicial.

Color

El color se midió en la parte central del mesocarpio y en la parte ecuatorial de la

cáscara de la fruta con un colorímetro MiniScan XE Plus (HunterLab, serie

5348, EE. UU.). Los resultados se expresan en L * (brillo), a * (rojo +, verde-) y

b * (amarillo +, azul-). El tono (ángulo de tono) se calculó con los valores de a *

y b * de acuerdo con McGuire (1992):

Hue = arco tan (b * / a *)

El índice de saturación de color (Chroma) se calculó con los valores de a * y b *

de acuerdo con las siguientes fórmulas propuestas por McGuire (1992):

Chroma = (a*2 + b*2)1/2

Firmeza

La textura (firmeza) se determinó con un texturómetro TA-TX2i (Stable Micro

Systems, Gran Bretaña) y sonda de esférica en una rutina de medida de fuerza

de compresión. La velocidad de ensayo fue 2 mm s-1 y la distancia de

penetración 3 mm. Se realizó sobre tres frutos con en la zona alrededor de la

lesión (Sedano et al., 2011). Los resultados se expresaron en Newtons (N).

82

5.4.4 Variables fisiológicas

Tasa de respiración y producción de etileno.

Se evaluó la tasa de respiración y producción de etileno durante todos los días

del experimento. Se colocó cada fruta en un recipiente de plástico, cerrado

herméticamente por 1 h, se extrajo 1 mL de muestra gaseosa y se inyectó el

gas en un cromatógrafo de gases Agilent 7890B, con columna capilar 19094P-

QO4 (30 m largo, 0.530 mm de diámetro y 40 μm de espesor) con detector FID

y un detector TCD. Se usó como gas de arrastre nitrógeno con un flujo de 32.3

mL·min-1. Los flujos del gas portador N2, del aire y del H2 fueron,

respectivamente, 25, 499 y 45 mL·min -1. El inyector y el detector se

mantuvieron a 120 y 180 °C.

La cuantificación de etileno y dióxido de carbono se realizó mediante la

comparación de la muestra y alturas de los picos estándar para cada

componente. Las concentraciones de las muestras se calcularon con el apoyo

de una curva patrón previamente establecida. La respiración de la fruta se

determinó diariamente, hasta el término del experimento. Los resultados se

expresaron en mL de CO2·kg-1 h-1 y mL de Etileno·kg-1 h- (Magaña et al., 2006).

5.4.5 Variables químicas

Obtención de los extractos

Esta determinación se hizo a partir del extracto metanólico reportado por

Álvarez et al. (2010) con modificaciones. Se añadió 1 g de pulpa con 10 ml de

metanol al 80% (v:v) y se sonicó durante 20 minutos en un aparato de

ultrasonidos (Cole-Parmer, modelo 08892-21, EE. UU.). Se dejó reposar en

condiciones oscuras a temperatura ambiente durante 22 h. La muestra se filtró

y se obtuvo el extracto metanólico.

83

Fenoles totales

Se realizó la metodología según el método propuesto por Waterman y Mole

(1994) con modificaciones. Se tomaron 200 µL del extracto metanólico,

preparado previamente, se agregaron 1300 µL de H2O destilada, se agregaron

200 µL del reactivo Folin-Ciocalteu (1/10 v/v) se agito, posteriormente se

agregaron 300 µL de una solución de Na2CO3 al 20 %, la mezcla se incubó a

temperatura ambiente y en oscuridad durante media hora (se usó como blanco

la misma mezcla sin muestra). Se tomaron lecturas en un espectrofotómetro

Genesys 10s (Thermoscientific, Florida, USA) a una longitud de onda de 765

nm. Se repitió el mismo procedimiento para extractos metanólicos de pulpa. Se

elaboró una curva patrón de ácido gálico para expresar el contenido de fenoles

totales en función de este ácido. El contenido total de fenólicos en el extracto se

expresó en mg equivalentes de ácido gálico por 100 g de peso fresco (mg EAG

100 g -1 p.f.)

Actividad antioxidante

La actividad antioxidante de la cáscara y el mesocarpio se evaluó mediante el

método de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo; Sigma-Aldrich), siguiendo la

metodología descrita por Brand et al., (1995). En un tubo de ensayo se

añadieron 2.9 mL de una solución de DPPH 0.1 mM y 0.1 mL del extracto, se

mezclaron con la ayuda de un agitador vortex y se incubó a oscuridad y

temperatura ambiente hasta su medición. Las lecturas se tomaron a los 30 y 60

min a una longitud de onda de 516 nm en un espectrofotómetro marca Thermo

(modelo Genesys 10-S, USA). Como blanco se utilizó metanol 80 %.

La inhibición o reducción del radical libre DPPH se midió en porcentaje por

medio de la ecuación

1) %𝐷𝑃𝑃𝐻𝐷𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎𝑑𝑜 = [1 −𝐴𝑚−𝐴𝑏

𝐴𝑐−𝐴𝑏] × 100

84

donde: Am, Ab y Ac representan las absorbancias de las diferentes

concentraciones de la muestra, blanco y control leídas a 515 nm después de 60

minutos de reacción con el DPPH. La capacidad antioxidante se expresa µmol

Eq. De Trolox/100g de muestra.

Análisis estadístico.

Se utilizó un diseño completamente al azar, cada especie de hongo se

consideró como un tratamiento. La unidad experimental fue un fruto y se

realizaron tres repeticiones por tratamiento. Se consideró como testigo a frutos

sin inocular. El análisis de varianza y las pruebas de comparación de medias

(Tukey, 0.05) se realizaron con el programa estadístico SAS (SAS Institute,

2002).


5.5.1 Prueba de patogenicidad

Se observaron cambios en la superficie de los aguacates inoculados con los

diferentes hongos, durante el transcurso del experimento (Figura 14). Estos

cambios principalmente se presentaron alrededor de las zonas de punción e

inoculación, como hundimiento, pardeamiento, resequedad e incluso necrosis.

No se observó crecimiento externo de micelio o conidios en ningún tratamiento.

Para el caso del testigo, sólo se observó deshidratación alrededor de la zona de

punción.

Después de diez días de almacenamiento, las frutas se abrieron para observar

el daño interno causado por los diversos patógenos. Se observaron áreas de

color negro en el mesocarpo, alrededor de la herida de inoculación. Los

tratamientos T1, T2, T4, T5, T6, T7, T9 y T10 presentaron necrosis en las áreas

de infección.

Los patógenos de mayor severidad de infección en este experimento fueron C.

gloeosporoides, Alternaria sp., y Pestalotiopsis sp. Estos son patógenos que se

85

presentan antes de la cosecha del aguacate y atacan a los frutos durante su

desarrollo (Freeman, 1996; Hartill, 1999). La presencia de micelio en zonas muy

profundas dentro del fruto se le atribuye a C. gloeosporoides, causante de la

antracnosis. Este tipo de infección se presenta en campo, desde el momento de

la floración y amarre del fruto, donde los conidios permanecen inactivos hasta

que los frutos maduran, causando el desarrollo de síntomas, como pudriciones,

y pérdidas por deterioro durante el almacenamiento y comercialización (Prusky

& Plumbley, 1992), por lo que posiblemente algunos de los frutos ya estaban

enfermos desde antes de su cosecha.

5.5.2 Variables físicas

Pérdida de peso

El peso de los frutos disminuyó significativamente (P <0.05) desde la cosecha

hasta su maduración. Aunque no existieron diferencias significativas entre los

tratamientos, el T8 tuvo el porcentaje más alto en pérdida de peso y el T9 fue el

que menor porcentaje obtuvo.

86

Figura 14. Evaluación de daño externo en aguacates ‘Hass’ inoculados con diversos patógenos durante 10 días de almacenamiento a 22 °C. Tratamientos con diferentes hongos (T1-T10); tratamiento sin inocular (Testigo).

87

Cuadro 8a. Pérdida de peso, Tono, Pureza, Luminosidad (L) y Firmeza de los frutos de aguacate ‘Hass’ inoculados con patógenos. Tratamientos con los distintos hongos (T1-T10); Tratamiento sin inocular (Testigo)

Z Medias seguidas con la misma letra en cada fila no son diferentes (Tukey= P ≤ 0.05). y Media ± desviación estándar

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Pérdida de peso (%)

12.15az ± 2.20y 14.06a ± 2.87 13.54a ± 2.39 15.84a ± 4.02 13.26a± 2.35 14.80a± 2.94

Día 1

Tono 175.99a± 6.11 179.23ª ± 1.95 177.95a ± 1.23 174.08± 5.52 173.19a±7.62 175.63a±8.29

Pureza 0.66a ± 0.84 0.22a ± 0.05 0.384a ± 0.20 0.962a ± 0.85 0.954a ± 0.62 1.119a±1.63

L 18.39a ± 0.61 18.47a ± 0.71 18.95a ± 1.83 18.03a ± 1.16 19.13a ± 2.16 19.01a ± 1.23

Firmeza (N) 64.98a ± 5.7 68.03a ± 6.42 68.75a ± 7.96 63.76a ± 1.61 73.38a ± 3.59 65.83a±15.81

Día 10

Tono 55.67a ± 5.18 51.41ab± 3.92 55.06a ± 8.20 26.41def±0.02 47.42ab±9.22 21.54ef± 4.43

Pureza 1.16a ± 0.30 1.404a ± 0.37 1.114a ± 0.66 0.974a ± 0.57 1.266a ± 0.07 0.622a ± 0.15

L 13.48a ± 0.45 13.54a ± 0.43 13.13a ± 0.840 13.70a ± 0.27 13.75a ± 0.09 13.28a ± 0.54

Firmeza (N) 4.48cd ± 0.12 5.30bc ± 0.16 4.25de ± 0.23 5.53b ± 0.18 4.53bcd±0.37 4.58bcd±0.23

88

Cuadro 8b. Pérdida de peso, Tono, Pureza, Luminosidad (L) y Firmeza de los frutos de aguacate ‘Hass’ inoculados con patógenos. Tratamientos con los distintos hongos (T1-T10); Tratamiento sin inocular (Testigo)

Z Medias seguidas con la misma letra en cada fila no son diferentes (Tukey= P ≤ 0.05) y Media ± desviación estándar

T7 T8 T9 T10 Testigo

Pérdida de peso (%)

15.64az ± 6.88y 18.79a ± 5.35 11.06a ± 0.64 12.05a ± 2.47 14.49a ± 1.56

Día 1

Tono 180.33a ± 1.83 178.14a ± 0.79 176.99a ± 2.35 178.54a ± 1.10 168.64a ± 4.66

Pureza 0.204a ± 0.060 0.288a ± 0.145 0.527a ± 0.414 0.274a ± 0.211 1.559a ± 0.495

L 17.75a ± 0.973 19.68a ± 0.603 18.06a ± 2.30 19.15a ± 1.071 18.96a ± 0.271

Firmeza (N) 69.71a ± 4.82 68.42a ± 3.73 68.02a ± 6.26 59.57a ± 5.15 70.99a ± 2.82

Día 10

Tono 14.33f ± 3.45 29.48cde ± 3.45 38.52bcd ± 4.85 53.76a ± 0.87 41.80abc± 3.95

Pureza 0.427a ± 0.217 1.302a ± 0.408 0.881a ± 0.453 1.188a ± 0.528 1.062a ± 0.597

L 12.89a ± 0.296 13.66a ± 0.153 12.80a ± 0.261 13.52a ± 0.672 13.66a ± 0.040

Firmeza (N) 4.71bcd ± 0.46 4.43cd ± 0.54 4.21de ± 0.33 3.30e ± 0.06 6.82a ± 0.63

89

Erickson et al., (1964), señaló que la fruta madura mostró una frecuencia

respiratoria máxima a las 80 h después de la cosecha, mientras que el fruto

verde alcanzó el pico 5 d después de ser cosechado. Medina et al., (2017) y

Osuna et al., (2010), mencionan que las pérdidas de peso en aguacate ‘Hass’

oscilan entre 8 y 12 % desde la cosecha hasta la madurez de consumo.

La pérdida de peso en postcosecha se atribuye principalmente a transpiración

causada por un déficit de presión de vapor del producto con relación a su

entorno, el cual, por la baja humedad relativa se incrementó en la condición de

aire natural y mayor temperatura (Herrera et al., 2013). Los porcentajes

obtenidos superan estos valores, debido a que la infección por patógenos

acelera los procesos metabólicos del fruto, propiciando una mayor transpiración

del mismo.

Medición de Color

Los resultados obtenidos no mostraron diferencias significativas entre los

tratamientos para los valores de Hue, Chroma y L. Los valores de Hue (Cuadro

9 y 10) mostraron un decremento para todos las Tratamientos, lo que nos indica

un cambio de color de verde a morado-negro, en el periodo de almacenamiento

de 10 días. La misma tendencia se observó para los valores de Luminosidad en

todos los tratamientos. Los valores de Luminosidad y Chroma fueron bajos en

general, lo que significó que estos colores son percibidos por el ojo humano

como colores oscuros y con poca cromaticidad, de acuerdo con los parámetros

establecidos por McGuire (1992). Los frutos que tuvieron el mayor cambio de

color fueron los de T7, esto podrá ser atribuido a que el hongo C.

gloeosporoides aceleró la degradación de compuestos como las clorofilas. La

disminución en Hue y L se debe a la degradación de la clorofila y se ha

relacionado con la síntesis de cianidina 3-O-glucósido que proporciona colores

oscuros en la piel de los aguacates ‘Hass’ (Cox et al. 2004).

El color de la piel de aguacate es un indicador importante de la etapa de

maduración de la industria y los consumidores (Cox et al. 2004). La variedad

90

'Hass' es característica de un cambio de color de la cáscara de verde a púrpura

y finalmente a negro (Cox et al 2004; Arzate et al., 2011). Ashton et al., (2006)

encontraron resultados comparables al observar una disminución en la clorofila

de la piel durante la maduración.

Firmeza

La firmeza de la pulpa es uno de los indicadores más importantes para

determinar si un aguacate ‘Hass’ está listo para el consumo (Osuna et al.,

2010). En todos los tratamientos hubo reducción notable de la firmeza con el

transcurso del tiempo. Al día uno, no se presentaron diferencias significativas (P

≤ 0.05) entre los tratamientos, esto se relaciona con el grado de madurez del

fruto (recién cosechados); sin embargo, al día 10, el Testigo tuvo el mayor valor

de firmeza (6.28 N) con respecto a los demás tratamientos (Cuadros 8 y 9). Los

resultados concuerdan con lo reportado por Espinosa et al., (2014), quienes

obtuvieron valores de firmeza en el primer día de almacenamiento de 55 N.

Los resultados obtenidos en esta investigación coinciden con los de Proctor

(1991), quienes señalan que una de las causas de la pérdida de firmeza es la

alteración enzimática de la laminilla media y pared celular de los frutos,

constituidas principalmente por sustancias pécticas, celulosa y hemicelulosa y

que se degradan conforme aumenta el grado de madurez o algún agente

patógeno libere enzimas que degraden estos compuestos.

5.5.3 Variables fisiológicas

Tasa de respiración

La mayor tasa de respiración (394.98 mL CO2 kg -1 h -1) fue de los frutos del T7

inoculados con C. gloeosporioides a los seis días de almacenamiento. Se pudo

observar el mismo patrón de respiración para los tratamientos T1, T2, T5, T6,

T8 y Testigo (224.03, 287.50, 244.18, 245.51, 293.23 y 261.33 mL CO2 Kg -1 h -

1, respectivamente) (Figura 15), dónde el punto de máximo climaterio se

presentó en el día seis; sin embargo, la tasa de respiración es menor a la del T7

91

en este mismo día. En los frutos infectados, tienen un patrón similar de

respiración al de los frutos no infectada, pero la infección con patógenos puede

causar una aceleración en el aumento de la respiración climatérica (Schiffmann

et al., 1985).

Para los T3 y T4, el punto máximo de climaterio se observó a los 5 días de

almacenamiento. En el caso del T10, se observó un comportamiento atípico en

la curva, puesto que al tercer día de almacenamiento presentó la máxima tasa

de respiración (234.75 mL CO2 kg -1 h -1). Prusky et al., (1984), reportaron

concentraciones de 80-90 mL CO2 kg-1 h-1 en aguacates inculados

con Colletotrichum gloeosporioides. Algunos hongos, como Botrytis sp.,

Penicillium sp. y Diplodia sp. desarrollan más rápido la infección en el huésped,

mientras que otros hongos, como Alternaria y Pestalotia sp., se desarrollan muy

lentamente. Esto explica la aceleración del climaterio para el T7 (Penicillium

crustosum) con respecto al Testigo.

Con los resultados obtenidos, podemos decir que la fisiología postcosecha de

los productos hortofrutícolas, no sólo debe ser asociada a los procesos de

maduración de la fruta, también debe ser considerado el daño por patógenos y

la tasa de desarrollo de un hongo en hospedero específico. Un aumento en los

procesos fisiológicos, indirectamente afecta el rápido desarrollo de hongos: en

la fruta madura el hongo se desarrolla más rápido.

92

Figura1. Patrón de respiración de frutos de aguacate 'Hass' inoculados y almacnados a temperatura

ambiente (22°C) durante 10 días.

Días de almacenamiento

0 2 4 6 8 10

ml C

O2

Kg

-1h

-1

0

200

400

600

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

T9

T10

Testigo

Figura 15. Patrón de respiración de frutos de aguacate ‘Hass’ inoculados y almacenados a temperatura ambiente (22 °C) durante 10 días. Tratamientos con diferentes hongos (T1-T10); tratamiento sin inocular (Testigo).

Producción de etileno

La producción de etileno en la fruta comienza después de la cosecha y aumenta

con la maduración. La mayor producción de etileno fue 661.79 mL Etileno kg/h,

para el T7 al sexto día de almacenamiento (Figura 16). Al igual que la

producción de CO2, el pico máximo de producción fue al día seis para los frutos

de T1, T5 y T10. Para los frutos de T2, T3, T4, T6 y T8, la mayor producción de

etileno fue al quinto día de almacenamiento. Para el testigo, se presentó un

comportamiento atípico, sin embargo, la mayor producción se dio al noveno día

de almacenamiento.

Achilea et al., (1940) informaron un aumento en la evolución del etileno en los

cítricos infectados por P. digitatum. Fukuda et al., (1993) reportaron que hongos

como P. digitatum producen por sí mismos grandes cantidades de etileno, sin

necesariamente asociarse a un fruto. Schiffmann y Cohen E. (1985)

93

encontraron que la inoculación con Phytophthora citrophthora causó una

aproximadamente un aumento de diez veces en la tasa de respiración de los

limones. Zauberman y Schiffmann, (1977), encontraron un aumento en la

respiración y la emanación de etileno de los limones inoculado con Geotrichum

candidum, Diplodia natalensis y Fusarium moniliforme. Figura 2. Producción de etileno en aguacates 'Hass' durante 10 días de almacenamiento a tempreatura ambiente (22°c)

Días de almacenamiento

0 2 4 6 8 10

ml C

2H

4 K

g-1

h-1

0

200

400

600

800 T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

T9

T10

Testigo

Figura 16. Producción de etileno en frutos de aguacate ‘Hass’ inoculados y almacenados a temperatura ambiente (22 °C) durante 10 días. Tratamientos con diferentes hongos (T1-T10), tratamiento sin inocular (Testigo).

5.5.4 Variables químicas

Actividad antioxidante

Las actividades antioxidantes de los extractos metanólicos para la cáscara y la

pulpa del aguacate ‘Hass’ fueron muy similares entre sí, evaluados al décimo

día de almacenamiento (Cuadro 10). La mayoría de los estudios realizados

sobre la actividad antioxidante en el aguacate se concentran principalmente en

la evaluación de compuestos hidrófilos, como el ácido ascórbico y compuestos

fenólicos (Villa et al., 2011).

94

Cuadro 9. Promedios y desviaciones estándares para actividad antioxidante (DPPH), fenoles totales, y antocianinas en cáscara y pulpa de aguacates ‘Hass’ inoculados y almacenados durante diez días a temperatura 25 ± 2 °C. Tratamientos con diferentes hongos (T1-T10), tratamiento sin inocular (Testigo)

z Peso fresco y Medias seguidas con la misma letra en cada columna no son diferentes (Tukey= P ≤ 0.05).

DPPH

(mM equivalents Trolox 100 g-1 pf.z) Fenoles totales

(mg ácido gálico 100 g-1 p.f.)

Cáscara Pulpa Cáscara Pulpa

T1 110.57ay±1.59 122.64ab±6.28 215.41bcd ±13.81 364.4a ±29.1

T2 113.93a±2.67 124.55a±1.76 239.3abcd ±19.9 311.8ab±30.8

T3 106.37a±14.17 120.90ab±9.79 148.92d±8.77 172.44c±11.54

T4 112.48a±8.51 120.98ab±8.48 231.71abcd±16.69 248.6bc±45.4

T5 95.49ab±15.45 105.12ab±14.04 262.7abc±18.0 387.59a±6.41

T6 93.89ab±3.72 130.1 a±1.66 184.07cd±12.38 223.1c±29.5

T7 62.39a±1.93 129.41a±1.20 200.13bcd±3.19 255.3bc±26.3

T8 112.05a±6.62 122.02ab±5.64 203.8bcd±21.2 212.5c±21.4

T9 110.71a±5.58 99.9ab±23.29 289.5ab±43.4 390.6a±48.8

T10 109.94a±7.75 116.1ab±16.01 317.6a±90.1 381.6a±17.7

Testigo 123.4b±40.2 91.5b±9.89 201.28bcd±10.97 364.0a ±30.3

95

Los valores obtenidos en este estudio fueron más altos que los reportados por

Rodríguez et al., (2011), quienes reportaron un valor de 71.92 ± (28.93) mM ET

g-1 pf. para la cáscara y 0.32 ± (0.079) para la pulpa de aguacates ‘Hass’.

Existen estudios que documentan la actividad antioxidante en el mesocarpio de

aguacate de diferentes cultivares. Wang et al., (2010) informaron la actividad

antioxidante (0.07 - 0.13 mM ET 100 g-1 pf.) obtenida por el método DPPH para

los cultivares ‘Slimcado’, ‘Simmonds’, ‘Loretta’, ‘Choquette’, ‘Booth 7’, ‘Booth 8’,

‘Tonnage’ y ‘Hass’, respectivamente. Kuskoski et al., (2005) reportaron una

actividad antioxidante de 0.27 - 1.20 mM ET 100 g-1 pf. La mayoría de los

estudios realizados sobre la actividad antioxidante en el aguacate se

concentran principalmente en la evaluación de compuestos hidrófilos, como el

ácido ascórbico y compuestos fenólicos (Villa et al., 2011).

Los resultados obtenidos en el presente estudio muestran una mayor

acumulación de compuestos fenólicos en pulpa que en la cáscara de los

aguacates infectados. El T10 tuvo el mayor contenido de fenoles en la cáscara

y el Testigo el menor contenido. Para la pulpa, los Tratamientos T1, T5, T9, T10

y Testigo obtuvieron el mayor contenido de fenoles. El incremento de

compuestos fenólicos es un mecanismo de respuesta ante la presencia de

micelio (Cruz et al.,2006). Algunos compuestos fenólicos (ácidos cinámicos,

flavonoides, isoflavonoides, deoxiantocianinas, estilbenos, cumarinas,

cromonas) actúan de forma pasiva alrededor de las células dañadas,

reforzando la pared celular e inhibiendo el crecimiento de hifas (Scalbert, 1991;

Schlosser, 1994).

Esta respuesta de acumulación de fenoles antifúngicos generalmente ocurre en

mayor cantidad en el momento de la infección (De Ascensao & Dubery, 2003),

como se puede observar en los tratamientos. El alto contenido de fenoles en el

control se puede atribuir a que la fruta también tuvo una respuesta de defensa a

la punción generada.

96

5.6 Conclusiones

La inoculación de frutos de aguacate con C. gloeosporoides., P. crustosum,

Pestalotiopsis sp. y Alternaria sp., promovió cambio de color de pulpa de verde

a negro, así como pérdida de la firmeza de frutos y aumento en la tasa de

respiración y producción de etileno. Los cambios fisicoquímicos en aguacates

por efecto de C. gloeosporoides., P. crustosum, Pestalotiopsis sp. y Alternaria

sp., son de mayor impacto que los generados por M. racemosus, Phoma sp.,

Nemania sp. y Artrhinum sp. La actividad antioxidante en la cáscara de los

frutos disminuye por efecto del ataque de los hongos, mientras que el análisis

de actividad antioxidante de la pulpa, mostró un comportamiento inverso.


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101

6 PRIMER REPORTE DE Neofusicoccum parvum CAUSANTE DE MUERTE REGRESIVA EN AGUACATES ‘HASS’ (Persea

americana cv. ‘Hass’)9

6.1 Resumen

El aguacate (Persea americana cv. ‘Hass’) es una fruta subtropical, originaria de América Central de gran importancia en el mundo. Económicamente, se considera el cultivo más importante de México, al clasificar al país como el mayor productor, consumidor y exportador del mercado mundial (Salazar-García, S. et al. 2017, Galindo-Tovar, M. et al., 2007). Durante Febrero y Marzo de 2018, la incidencia de muerte en las ramas de aguacate ‘Hass’ fue del 20% en varias áreas de producción ubicadas en Atlixco, Puebla. Los síntomas de la enfermedad se manifiestan con el marchitamiento de las hojas, permaneciendo adheridas a la rama, donde se encuentra el cancro. La corteza interna presenta un color entre marrón rojizo y marrón, en lugar del color beige, lo que indica una necrosis del tejido que se extiende hacia el interior del xilema, causando la muerte de las ramas. Para determinar el agente causal de esta enfermedad, se recolectaron 10 ramas secundarias de aguacate ‘Hass’ con síntomas de muerte regresiva. Se cortaron pequeñas secciones de tejido de corteza (0.5 cm), se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1,5% durante dos minutos y se enjuagaron dos veces con agua destilada estéril y se secaron sobre papel absorbente. Luego, se colocaron en placas de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA), y se incubaron durante 15 días, a 25ºC. Se obtuvieron cinco cultivos por puntas hifales de la colonia. Los aislamientos puros desarrollaron colonias con un micelio grisáceo, que se oscureció una semana después de la incubación. Se produjeron picnidios y conidios bajo exposición continua a la luz. Se observó la formación de estromatos con conidiomas picnidiales y picnidios globosos; los conidios fueron hialinos, unicelulares, no separados, elipsoidales, presentando un ápice obtuso y una base subtruncada, midiendo una longitud y anchura promedio de 17.2 (15-19) x 5.8 (4-7) μm (n = 100). Para confirmar la identificación, se extrajo el ADN genómico del aislado, el espaciador transcrito interno (ITS) y la región del factor de alargamiento de la traducción (EF) fueron amplificadas mediante PCR (White et al. 1999; O´Donell, 2005) y se secuenciaron utilizando cebadores (ITS5HP y NL4) y (EF1-728F y EF2). El análisis de BLAST de 896 pb para las secuencias de ITS y 617 pb para las secuencias de EF, mostró una identidad del 98% con Neofusicoccum parvum

9 Nota Científica Aceptada con revisones en la revista Plant Disease Autor: Diana Becerra Morales Director de tesis: J. Joel E. Corrales García

102

en comparación con el GenBank (números de acceso KJ657701.1 y KJ657700.1 para ITS) y una identidad del 100% en comparación con JQ512103.1 y KY024669.1 para EF. Se depositó en el Gen-Bank Accession una de las secuencias representativas obtenidas para ITS (No. MH493050.1) y EF (No. MH493051.1). Las pruebas de patogenicidad se realizaron en el campo en cinco árboles de aguacate con cinco aislamientos. Se asperjó una concentración de 105 conidios/ml sobre ramitas, hojas y flores de diez ramas apicales sanas de cada árbol de aguacate 'Hass'. Cada rama se mantuvo durante 48 horas en una bolsa de plástico como cámara humidificada a 25 ± 2 ° C, después de este tiempo se retiró la bolsa, permaneciendo a 26 ° C hasta que se observaron los primeros síntomas. Se usó agua destilada estéril asperjada sobre ramas sanas como control. Después de 30 días se observó marchitez en ramas y hojas, permaneciendo adheridas a la rama; los síntomas no se desarrollaron en las plantas de control. El aislamiento de los tallos inoculados con lesiones resultó patógeno, confirmando así los postulados de Koch. Especies de Botryosphaeriaceae, incluidas Neofusicoccum parvum, fueron identificadas en California causando cancros de las ramas y muerte en los árboles de aguacate (McDonald V. y Eskalen A, 2011). Durante la primavera de 2010, se identificó a N. parvum como el hongo asociado con los síntomas de la mancha negra en la superficie de frutos de palta en los huertos de Michoacán, México (Molina-Gallosso et al., 2012). Sin embargo, por lo que sabemos, este es el primer informe de la enfermedad de muerte regresiva en las ramas de aguacate ‘Hass’, en nuestro país. Este patógeno representa un problema fitosanitario para los árboles de aguacate ‘Hass’, ya que la enfermedad puede propagarse a partir de material vegetal infectado de un sitio a otro.

103

6.2 Abstract

First report of Neofusicoccum parvum causal agent of dieback on ‘Hass’ Avocado branches (Persea americana cv ‘Hass’) in Atlixco, México10

Avocado (Persea Americana cv. ‘Hass’) is a subtropical fruit, native to Central America of great importance in the world. Economically, it is considered the most important crop in Mexico, classifying the country as the largest producer, consumer, and exporter, on the global market (Salazar-García, S. et al. 2017, Galindo-Tovar, M. et al., 2007). During February and March on 2018, the incidence of dieback on ‘Hass’ Avocado branches was 20%, has been observed in several production areas located in Atlixco, Puebla. Symptoms of the disease manifest with the wilting of the leaves, remaining attached to the branch, where the canker. The Inner bark presents color red-brown to brown, instead of the beige color, indicating necrosis of the tissue that extends into the inner of the xylem, causing dieback of branches. To determine the causal agent of this disease, 10 secondary branches of avocado ‘Hass’ with dieback symptoms were collected. Small sections of bark tissue (0.5 cm) were cut, were disinfest with 1.5% sodium hypochlorite during two minutes and rinsed two times with steril distilled water and dry on absorbent paper. Then, placed on Petri dishes with potato dextrose agar (PDA), and incubated for 15 days, at 25ºC. Five cultures were obtained by hyphal tips from the colony. The pure isolates developed colonies with a grayish mycelium, which darkened one week after incubation. Pycnidia and conidia were produced under continuous exposure to light. The formation of stromata with pycnidial conidiomata, and globose pycnidia was observed; the conidia were hyaline, unicellular, nonseptate, ellipsoid, presenting an obtuse apex and subtruncate base, measuring an average length and width of 17.2 (15-19) x 5.8 (4-7) μm (n=100). To confirm the identification, genomic DNA five isolate was extracted, the internal transcribed spacer (ITS) and the translation elongation factor (EF) region was amplified by PCR (White et al. 1999; O´Donell, 2005).BLAST analysis of the 896 bp for ITS sequences and 617 pb for EF sequences, showed 98% identity to Neofusicoccum parvum compared with GenBank (Accession Nos. KJ657701.1 and KJ657700.1 for ITS) and 100% identity compared with JQ512103.1 and KY024669.1 for EF. One of the representatives sequences obtained was deposited as Gen-Bank Accession for ITS (No. MH493050.1) and EF (No. MH493051.1.) Pathogenicity tests were performed in field on five avocado trees with five isolates. A concentration of 105 conidia / ml was sprinkled on twigs, leaves and flowers of ten healthy apical branches of each 'Hass' Avocado tree. Each branch was kept for 48 hours in a plastic bag as a humidified chamber at 25 ± 2 ° C, after this time the bag was retired, staying at 26 ° C until firts symptoms were observed. Sprinkled sterile distilled water on healty branches was used as the control. After 30 days was

10 Nota Científica Aceptada con revisones en la revista Plant Disease Autor: Diana Becerra Morales Director de tesis: J. Joel E. Corrales García

104

observed Dieback in the branch and wilting leaves, remaining attached to the branch; symptoms was not developed in the control plants. Re-isolation from the inoculated stems with lesions were result pathogenic thus confirming Koch postulates. Species of Botryosphaeriaceae, included Neofusicoccum parvum, were identified in California causing branch cankers and dieback on avocado trees (McDonald V. and Eskalen A, 2011). During the spring of 2010, identify to N. parvum of the fungus associated with black spot symptoms on the Surface avocado fruit in orchards of Michoacán, México (Molina-Gallosso et al., 2012). However, to our knowledge, this is the first report of the dieback disease in ‘Hass’ Avocado branches, in our country. This pathogen represents a phytosanitary problem for ‘Hass’ avocado trees, because the disease can be spread by of infected plant material from one site to another.

Figura 17. A) Aislamiento de Neofussicocum parvum en medio de cultivo PDA, observado después de 12 días. B) Conidios hialinos de Neofussicocum parvum. C) Síntomas inducidos por inoculación artificial de Neofussicocum parvum en ramas, después de 30 días.

105

Figura 18. Análisis filogenético concatenado de Neofussicocum parvum para el fragmento del gen ITS y EF, utilizando el método UPGMA y generado por MEGA-X Este análisis involucró 7 secuencias de nucleótidos. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el Máximo.

Figura 19. Análisis filogenético de Neofussicocum parvum del fragmento del gen ITS, utilizando el método UPGMA y generado por MEGA-X. Este análisis involucró 9 secuencias de nucleótidos. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de probabilidad máxima compuesta. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados agrupados en la prueba de arranque (1000 repeticiones) se muestran junto a las ramas.

106

Figura 20. Análisis filogenético de Neofussicocum parvum del fragmento del gen EF, utilizando el método UPGMA y generado por MEGA-X. Este análisis involucró 7 secuencias de nucleótidos. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de probabilidad máxima compuesta. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados agrupados en la prueba de arranque (1000 repeticiones) se muestran junto a las ramas


(1) P. W. Crous et al. Stud. Mycol. 55:235, 2006 (2) J. J. Alva et al. Plant Disease 93:426, 2009 (3) G. I. Arjona & H. C. J. López. Plant Disease, 100:12, 2529, 2016 (4) W.F. T. Hartill et al. NZJ Crop Hortic. Sci. 30: 249. 2002.

107

7 TOLERANCIA A HONGOS FITOPATÓGENOS INOCULADOS EN TEJIDOS VEGETALES DE AGUACATE CRIOLLO Y

‘HASS’ EN CAMPO11

7.1 Resumen

El cultivo del aguacate se ve afectado por enfermedades fúngicas que ocasionan pérdidas económicas al afectar la calidad del fruto, entre las cuales destaca la roña. Inspecciones fitosanitarias en huertos de aguacate en zonas de Atlixco, México, revelan una variabilidad de síndromes de roña en aguacates de tipo ‘Hass’ y criillos, probablemente por la presencia de microorganismos que están ocasionando distintas síntomatologías. El objetivo fue identificar el agente causal del síndrome de roña mediante criterios morfológicos y moleculares y pruebas de patogenicidad en campo. Se aislaron e identificaron especies de Colletotrichum spp., Alternaria spp., Phoma spp., Cladosporium spp. La identificación morfológica por medio del gen ITS no pudo diferenciar a las especies de Alternaria. El uso del gen EF-1 permitió la diferenciación de Alternaria alternata y Alternaria tenuissima. Las pruebas de patogenicidad en campo fueron positivas para todas las especies de hongos inoculados en aguacates ‘Hass’; sin embargo, aguacates de tipo criollo mostaron tolerancia a la infección de estos mismos hongos. Ninguna prueba de patogenicidad en aguacates ‘Hass’ y criollo mostraron síntomas similares al síndrome de roña.

Palabras clave: aguacate ‘Hass’, guacate criollo, tolerancia, pruebas de

patogenicidad, roña.


Tecnología Agroalimentaria, Universidad Autónoma Chapingo. aDirector de Tesis: J.Joel E. Corrales García

bAutor de correspondencia: Diana Becerra Morales

108

7.2 Abstract

Tolerance to phytopathogenic fungus, inoculated in vegetable tissues of ‘Hass’ and Mexican landrace avocados in yield.12

The avocado crop is affected by fungal diseases that cause economic losses and affecting the quality of the fruit, among which the scab. Phytosanitary inspections in avocado orchards in areas of Atlixco, Mexico, reveal the variability of scab syndromes in ‘Hass’ and criollo avocados, maybe for the precensce of other microorganisms are causing different symptoms. The objective was to identify the causative agent of scab syndrome by means of morphological and molecular criteria and pathogenicity tests in yield. Species of Colletotrichum spp., Alternaria spp., Phoma spp., Cladosporium spp. were isolated and identified. The morphological identification by means of the ITS gene could not differentiate the Alternaria species. The use of the EF-1 gene allowed the differentiation of Alternaria alternata and Alternaria tenuissima. Field pathogenicity tests were positive for all fungal species inoculated in ‘Hass’ avocados; nevertheless, Mexican landrace avocados showed tolerance to the infection of these same fungi. Pathogenicity test in ‘Hass’ and Mexican landrace avocados did not show symptoms similar to scab syndrome

Key words: ‘Hass’ avocado, Mexican landrace avocado, tolerance, pathogenicity tests, scab.


Tecnología Agroalimentaria, Universidad Autónoma Chapingo. aDirector de Tesis: J.Joel E. Corrales García

bAutor de correspondencia: Diana Becerra Morales

109

7.3 Introducción


nivel mundial, sobre todo para México, por los beneficios socioeconómicos que

derrama hacia sus productores. El taxón Persea americana var. Drymifolia se

distribuye en la mayor parte del territorio mexicano y ha sido consumido

ancestralmente en las regiones que se produce (Sánchez, 1999). Las plantas

de estos aguacates se usan principalmente como portainjerto de variedades

comerciales, debido a su poder de adaptación y resistencia a plagas y

enfermedades (Rincón et al., 2011).

En México, las principales enfermedades fúngicas del aguacate se pueden

presentar pre y postcosecha. La antracnosis, (Colletotrichum acutatum, C.

gloeosporioides; Glomerella cingulata), que casusa lesiones necróticas en la

pulpa y cáscara (Humble & Reneby, 2015) es la enfermedad poscosecha más

severa del aguacate (Djami et al., 2012) y puede producir pérdidas de hasta 80

% de los frutos almacenados postcosecha (Darvas & Kotze, 1987). Algunos

otros patógenos fúngicos como Alternaria sp. Fusarium sp. y Diplodia sp.,

Dothiorella, Botryosphaeria parva, B. dothidea y Phomopsis (Hartill, 1991)

ocasionan pudriciones en tallo y en pulpa. Especies de Cercospora sp. o

mancha negra también puede causar grandes pérdidas postcosecha en frutos

de aguacate, su incidencia en México es localizada (Teliz, 2000; Pérez, 2008).

El aguacate criollo es también una fuente de genes resistentes a plagas y

enfermedades para las variedades comerciales de este frutal (Sánchez, 1999).

Algunos estudios en P. americana var. Drymifolia muestran la actividad de

algunos metabolitos contra varios de sus herbívoros y patógenos,

especialmente los terpenoides y fenilpropanoides de las hojas (Rincón et al.,

2011) aunque otros compuestos activos también se han encontrado en otros

tejidos de la planta (Prabha et al., 1980). El objetivo de este trabajo fue evaluar

la suceptibilidad en campo de tejidos vegetales de aguacate ‘Hass’ y criollo ante

la infección de diversos hongos fitopatógenos.

110

7.4 Materiales y Métodos

7.4.1 Aislamiento de patógenos

Se colectaron muestras de frutos de aguacate criollo con síntomas

característicos de roña, en los poblados de en los poblados de Axocopan y

Veracruz, municipio de Atlixco, Puebla en el mes de febrero del año 2018. Se

cortaron trozos de 3 mm de ancho de tejido sintomático, se lavaron con agua

corriente y posteriormente se desinfestaron en hipoclorito de sodio al 1.5 %

durante 2 minutos; se enjuagaron tres a cuatro veces con agua estéril; se

secaron en papel estéril y se sembraron en cajas Petri con medio de cultivo

papa-dextrosa-agar (PDA) para aislar hongos imperfectos. Se incubaron a 28°C

por 5 a 8 días. Para obtener cultivos puros se aplicó la técnica de punta de hifa

en medio PDA.

7.4.2 Identificación de los aislamientos

Las colonias puras fueron observadas bajo el microscopio, la caracterización

morfológica se realizó mediante las claves de Barnett y Hunter (1998). Se utilizó

el método de CTAB 2 % con algunas modificaciones para la extracción del DNA

(Weising et al., 2005). La calidad e integridad de DNA se determinó en geles de

agarosa al (0.8 %). La concentración de DNA se determinó con un

espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Tecnologies, Wilmington, DE,

EUA).

Se amplificó mediante PCR los genes de la región espaciadora del transcripto

interno (ITS) y los genes del factor de elongación de la traducción (TEF), con

los cebadores (ITS5HP y NL4) y (EF1-728F y EF2), respectivamente, para

confirmar la identificación de los aislados. Las secuencias se depositaron en el

GenBank. Se realizó un análisis BLAST para determinar la identidad de los

aislamientos (Crous et al. 2006).

111


Las pruebas de patogenicidad se realizaron en el campo. Se seleccionaron 10

ramas apicales, hojas, tallo y flores de 10 árboles de aguacate ‘Hass’ y 10 de

aguacate criollo. Se asperjó una concentración de 105 conidia mL-1 en cada uno

de los tejidos vegetales y se mantuvieron en una cámara de humedad por 48 h,

a 25 ° C (temperatura promedio). Se usó agua destilada estéril como control.

Después de 30 d de inoculación, se colectaron muestras de los tejidos

inoculados y se reaislaron los patógenos, para corroborar los postulados de

Koch.

Para evaluar la suceptibilidad de los árboles, se utilizó una escala hedónica de

presencia o ausencia de daño en las hojas, ramas, flores y frutos inoculados

con los distintos fitopatógenos. Se tomó como punto de referencia las

fotografías tomadas inicialmente antes de la inoculación de las ramas.


7.5.1 Identificación de los aislamientos

Se obtuvieron seis grupos de aislamientos fúngicos a partir de la superficie de

los frutos con síntomas de roña. Se realizó caracterización morfológica con el

apoyo de claves taxonómicas y por medio de ellas se pudieron identificar a las

especies de Colletotrichum spp., Alternaria spp., Phoma spp., Cladosporium

spp.

Colletotrichum gloeosporioides es un patógeno fúngico importante de la fruta de

aguacate y mango. Causa antracnosis y podredumbre del tallo en estos

cultivos, pero también se ha identificado como el agente patógeno causante de

la mancha de pimienta en la mancha de aguacate y lagrimeo. Aunque los

estudios de inoculación artificial pueden demostrar el potencial de los

aislamientos para infectar a otros huéspedes, generalmente no son suficientes

para establecer definitivamente la especificidad del huésped (Giblin et al.,

2010). C. gloeosporioides se caracteriza por tener micelio aéreo algodonoso,

112

naranja pálido; reversa naranja oscuro, longitu de conidios de 12.0–17.0 μm

Media = 14.2 ± 0.2 μm, ancho de 3.5–6.5 μm Media = 5.2 ± 0.1 μm, forma de

conidio cilíndrico, obtuso en el ápice.

La incidencia de Alternaria sp. obtenida de muestras de aguacate fue 60 %. A.

alternata se distingue por la formación de cadenas conidiales de seis a 14

conidios de longitud y el desarrollo de numerosas cadenas secundarias. La

ramificación de la cadena se produce de manera simpodial a través de la

elongación de conidióforos secundarios de las células conidiales terminales

distales y la posterior formación de conidio. Los conidios son pequeños (20–

50μm de largo), ovaladas, divididas por paredes transversales y verticales, con

un desarrollo mínimo de extensiones apicales. Las hifas y los conidióforos son

marrón claro y septados.

Especies de Alternaria y Cladosporium también se aislaron de la pudrición del

vástago, lo que confirma los hallazgos de Horne (1934). Algunos autores (Aira

et al., 2013; Rodríguez et al., 2005;) mencionan que el género Alternaria es uno

de los más abundantes en el aire en diferentes condiciones bioclimáticas. Esta

especie aún no se ha reportado como agente causal de mancha negra en hojas

y necrosamiento en flores y frutos.

Los conidios de P. medicaginis son aseptados 4.5–9 x 2–3 mm. las colonias

cultivadas bajo un fotoperíodo de 12 h de luz, forma zonas alternas de micelio y

picnidios que conducen a anillos concéntricos alrededor del tapón micelial

original.

La región del gen ITS de los aislamientos se secuenció para su identificación.

Basándose en los resultados de búsqueda NCBI-BLAST de las secuencias de

ITS, los aisalmientos pertenecían a C. gloeosporioides con100% de identidad,

a Cladosporium cladosporium con 100 % de identidad, Alternaria alternata 99 %

de identidad, Alternaria tenuissima con 99 % de identidad y Phoma medicagins

con 98% de identidad. Se realizaron análisis filogenéticos adicionales de

113

acuerdo con el conjunto descrito de marcadores genéticos para los

respectivos complejos de especies

Se informó que el uso de las regiones 5.8s de la región ribosomal de ADN, junto

con la región ITS1 y ITS2 fueron capaces de diferenciar entre algunas especies

de A. alternata (Kai et al., 2001). Sin embargo, en este estudio, el análisis no

mostró diferencias filogenéticas entre las especies de Alternaria. Al usar la

secuencia del EF-1, s pudieron diferenciar las especies de A. alternata y A.

tenuissima. Por lo mencionado anteriormente, claramente existe controversia

sobre el uso de la secuencia de las regiones ITS, lo que sugiere la necesidad

de encontrar otra región genómica de ADN para diferenciar entre diferentes

cepas de Alternaria.


Se realizaron las pruebas de patogenicidad en ramas, hojas tallos y flores

apicales en árboles de aguacates cv. ‘Hass’ y criollos mexicanos. En la

evaluación inicial, ninguna de las partes vegetativas presentó daños visbles

antes de la inoculación de los patógenos. Después de 30 días de la inoculación,

se observaron daños notables en el tallo, ramas, hojas y flores inoculadas,

mientras que el tratamiento testigo (inoculado con agua estéril) no presentó

daños. Algunos de los hongos fueron más patogénicos que otros, de acuerdo a

la evaluación visual en comparación con el tratamiento testigo. Para validar los

postulados de Koch, los patógenos se volvieron a aislar de los tejidos del

huésped infectados. Los frutos de control no desarrollaron síntomas.

De los hongos inoculados en aguacate ‘Hass’, sólo una especie de Alternaria no

fue patogénica, es decir, no produjo ningún daño visible al final de la

evaluación. Las demás cepas produjeron necrosis y marchitez de los tejidos

vegetales, y en algunos casos se observaron manchas. Para el aguacate criollo,

la respuesta fue inversa. De todas las cepas inoculadas, sólo una especie de

Alternaria, produjo marchitez y necrosis de los tejidos vegetales, mientras que

los demás tratamientos no produjeron ningún tipo de alteración.

114

a b

c d

e f

Las infecciones de aguacate ocurren en el huerto, donde los conidios del

patógeno germinan, forman apresorios, pero permanecen inactivos hasta la

maduración de la fruta después de la cosecha. Es plausible suponer que la

fuente de conidios que afecta a la fruta puede provenir de hojas o ramas

(secas o frescas) que se dispersan en los frutos y las frutas formadas durante

este período (Prusky & Kotze, 1994). La humedad elevada puede contribuir al

Figura 21. Conidios de los aislamientos a-f, a los 10 días de crecimiento en medio PDA, bajo exposición de luz continúa. a) Colletotrichum sp. b) Phoma spp. c) Cladosporium sp. d) Alternaria sp. (1) e) Alternaria sp. (2) f) Alternaria sp. (3).

115

porcentaje relativamente alto de hojas verdes y frescas infectadas y permitir

la supervivencia del inóculo del patógeno en forma de aperssoria germinada

quiescente en estos tejidos durante la estación seca de verano que prevalece

en las condiciones de cultivo (Sharma et al., 2017)

Los patógenos de la pudrición del tallo están presentes en ramas vivas y

muertas, ramitas, hojas y pedicelos vivos o a veces, en el suelo. El inóculo

puede ser diseminado por salpicaduras de lluvia, viento, o sacudiendo ramas

cuando se cosechan frutos (Hartill & Everett, 2002) Aunque algunas infecciones

se originan a partir de la colonización endofítica que permanece latente hasta

después de la cosecha, la mayoría de las infecciones probablemente ocurren

en la cosecha cuando las esporas que contaminan la superficie del tallo se

distribuyen con herramientas de corte (Everett K. R., et al. 2003). Después de la

infección, la fruta se coloniza gradualmente. Algunos patógenos, como

Colletotrichum y Botryosphaeria, causan infecciones latentes que ae activan

cuando se producen cambios fisiológicos y bioquímicosque. Las pudriciones en

los tallos son generalmente un problema relativamente menor de los aguacates;

sin embargo, es de suma importancia realizar un estudio más exhaustivo sobre

aquellos patógenos de reciente importancia (Everett, 1999; Johnson & Kotzé,

1994).

La tolerancia al ataque de los patógenos se puede deber a que los árboles de

aguacate criollo representan una fuente de genes de resistencia a plagas y

enfermedades comparado con las variedades comerciales de aguacate

(Sánchez et al., 1999; Guitierrez et al., 2009), además que los árboles de

aguacate criollo se caracterizan por su resistencia al frío (Villanueva & Verti,

2007; Rincón et al., 2011).

Algunos estudios muestran la actividad antagonista de algunos compuestos

químicos contra varios de sus herbívoros y patógenos, especialmente los

terpenoides y fenilpropanoides de las hojas (Rincón et al., 2011) aunque otros

compuestos activos también se han encontrado en otros tejidos de la planta

116

(Prabha et al., 1980). Sin embargo, a la fecha existen pocos estudios que

evaluén la actividad biológica de extractos vegetales de aguacate criollo.

Los resultados de esta investigación enfatizan el impacto potencial de las

enfermedades de necrosis y marchitez del tallo, hojas, flores y frutos de

aguacate y la importancia del manejo integrado de las enfermedades en los

huertos. Las aplicaciones de fungicidas de precosecha y poscosecha para el

control de la podredumbre del tallo se han utilizado con cierto éxito en otras

partes del mundo, pero en México los tratamientos se suelen aplicar cuando la

enfermedad ya ha afectado el cultivo (Darvas et al. 1990).

Un aspecto crítico para minimizar la podredumbre del tallo es el saneamiento

del huerto y las prácticas culturales óptimas, como podar y cosechar solo en

condiciones secas, deshacerse de la madera muerta y fruta vieja de los árboles

de aguacate, proporcionar suficiente riego y corregir el estrés nutricional (Yahia,

E.M.2012).

7.6 Conclusiones

Las pruebas de patogenicidad en campo no produjeron ningún síntoma de la

roña en aguacates ‘Hass’ y criollos; sin embargo, se observó necrosis y

marchitez de tallo, hojas, flores y frutos por efecto de Colletotrichum sp.,

Alternaria sp., Phoma sp. y Cladosporium sp. en aguacates ‘Hass’. Árboles de

aguacate criollo mostaron mayor tolerancia al ataque de estos patógenos,

donde solouna especie de Alterania sp. resultó patogénica. Ninguna de las

especies aisladas produjo síntomas de roña en los frutos de aguacate.

.

117

A

B

C F

E

D a

b

c

d

e

f Figura 22. Síntomas de necrosis y marchitez en ramas, tallos y hojas de aguacate cv. 'Hass' (A-F) y criollos (a-f), después de 30 días de la inoculación. A-a) Colletotrichum spp.; B-b) Phoma spp.; C-c) Cladosporium spp.; D-d) Alternaria spp. (1); E-e) Alternaria spp. (2); F-f) Alternaria spp. (3).

118


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120

8 CONCLUSIONES GENERALES

Los hongos asociados a la roña en aguacate fueron identificados mediante

caracterización morfólogica y PCR-RFLPs, permitiendo la formación de seis

grupos. Se confirmó a cada grupo como una especie diferente mediante la

secuenciación de la región ITS y el gen EF-1, identificando a los géneros

Mucor sp., Alternaria sp., Pestalotiopsis sp., Phoma sp., Colletotrichum sp., y

Arthrinium sp.

Pruebas de patogenicidad en frutos de aguacate ‘Hass’ con C. gloeosporoides.,

P. crustosum, Pestalotiopsis sp. y Alternaria sp., provocaron pérdida de la

firmeza de frutos, aumento en la tasa de respiración y producción de etileno

durante un periodo de 10 días en alamacenamiento. La actividad antioxidante y

el contenido de fenoles en la pulpa de los frutos inoculados mostraron

incremento en los compuestos con respecto al testigo sin inocular.

Pruebas de patogenicidad en campo no produjeron ningún síntoma de roña en

aguacates ‘Hass’ y criollos; sin embargo, se observó síntomas de marchitez y

necrosis de tallo, hojas, flores y frutos por efecto de Colletotrichum sp.,

Alternaria sp., Phoma sp. y Cladosporium sp. en aguacates ‘Hass’. Árboles de

aguacate criollo mostaron mayor tolerancia al ataque de estos patógenos,

Dentro de los hallazgos realizados en esta investigación se aisló y caracterizóa

Neofusicoccum parvum como causante de muerte regresiva en aguacates

‘Hass’.

Ninguna de las especies de hongos aislados de aguacates ‘Hass’ y criollos

produjo síntomas de roña en los frutos de aguacate. No se aisló al hongo

Sphaceloma perseae de frutos de aguacate con síndrome de roña, lo que pone

en duda si el agente causal de este síndrome es un patógeno fúgico.

121

9 APÉNDICES

9.1 Protocolos de extracción de DNA

La extracción de DNA se llevó a cabo a través del método de CTAB 2%

(Weising et al., 2005) con modificaciones.

1. De los aislados purificados que se obtuvieron de hongos sembrados en las

cajas Petri, se colectó el micelio crecido y se depositó en tubos Eppendorf

de 2mL para posteriormente agregar a cada uno de ellos 500μL de

nitrógeno líquido y macerar el micelio con el pistilo (previamente

desinfectado con alcohol al 96%).

2. Posteriormente se agregó 1mL de CTAB 2% + 0.2 % β-Mercaptoetanol, se

mezcló por inversión y se incubó a baño maría por 90 min a 65°C en

agitación constante.

3. A cada tubo se le agregó 500μL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y se

mezclaron por inversión durante 10 min a temperatura ambiente. Los tubos

se centrifugaron a 3500 rpm durante 10 min.

4. El sobrenadante formado se transfirió a un tubo nuevo de 2 mL evitando el

rompimiento de la interfase y se agregó ½ del volumen total de isopropanol

frio. Posteriormente se incubó -20°C por 18 h.

5. Se centrifugaron los tubos con DNA precipitado a 13200 rpm por 30 min y

como se desechó el sobrenadante. El pellet formado se lavó con 1 mL de

etanol al 70% y se centrifugó a 13 200 rpm por 8 min. El sobrenadante se

decantó cuidadosamente para no perder el pellet previamente formado.

6. Los tubos permanecieron invertidos sobre papel absorbente hasta que el

pellet secó. Posteriormente a cada tubo se le adicionó entre 50-100 µL de

buffer TE y se mantuvo a -20°C.

122

9.2 Protocolo Reacción en Cadena de la Polimerasa para gen ITS, SUB

PEQ, TEF.

El gen tef1 se amplificó a través de la técnica de PCR con el uso de los primers

EF1-728F: CAT CGA GAA GTT CGA GAA GG (Carbone & Kohn 1999) y EF-2:

GGA RGT ACC AGT SAT CAT GTT (O´Donnell et al., 1998), sintetizados por

Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT). La reacción de PCR se estandarizó

para en un volumen final de 25 μL por muestra, conteniendo 8.2 μL de agua

HPLC, 1X GoTaq® Buffer, 200 μM dNTPs, 5 mM MgCl2, 4 μM de cada primer,

1.5 U/μL GoTaq® DNA Polymerase (Promega), y 40ng/μL de ADN. El volumen

final utilizado por cada reactivo se señala en el Anexo (Tabla 3).

A continuación, se presenta el programa de amplificación efectuado en el

termociclador automático modelo Maxygene (Axygene).

Figura 11. Condiciones estandarizadas de termociclaje para la amplificación del

gen tef1 a través de la técnica de PCR.

El producto de amplificación se visualizó por electroforesis horizontal en geles

de agarosa al 1% con buffer TAE 1X, corrido a 90 volts durante 1 hr. Para

revelar las bandas, se tiñó el gel de agarosa con bromuro de etidio durante 15

min. Las imágenes del fueron fotodocumentadas empleando el programa

Quanty One (BioRad). El tamaño de las bandas se calculó tomando como

referencia los marcadores de peso molecular o ladders de 1 kb (Invitrogen),

123

colocados en los 2 pozos exteriores. Los productos amplificados se

conservaron a 4°C para sus posteriores análisis.

9.3 Digestión con enzimas de restricción de fragmentos de longitud

polimórfica

Los productos amplificados del gen tef1 de cada muestra se sometieron a un

análisis de PCR-RFPLs. Cada uno de ellos se digirieron con las enzimas

restricción HaeIII () y AluI () de manera independiente. Se preparó la mezcla de

digestión con un volumen final de 20 µL en la que se agregó 3 µL del fragmento

de DNA amplificado de cada muestra, 0.2 µL de BSA, 2 µL de Buffer 10X, 0.2

µL Enzima 10U/ µL, 14.6 de agua HPLC.

Los componentes de la reacción se depositaron en tubos Eppendorf de 50 µL

de volumen y se mezclaron cuidadosamente de acuerdo a las sugerencias del

fabricante, se dio un pulso de centrifuga a cada tubo con la reacción

previamente descrita y se incubo en a 37°C por 16 h.

9.4 Preparación de geles de agarosa y Poliacrilamida

La calidad e integridad del DNA se diagnosticó en geles de agarosa al 1%,

mientras que la concentración de DNA se determinó con el espectrofotómetro A

260 nm en Nanodrop ND-1000 V3.5.2 (Coleman Technologies Inc. for

Nanodrop Technologies).

Los productos de digestión se visualizaron por electroforesis vertical en geles

de acrilamida al 8% que consisten en acrilamida-bisacrilamida (29:1), TBE 5X,

agua destilada estéril, TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-

diamine (Thermo Fisher Scientific)) y APS al 10% (SIGMA) (Anexo. Tabla 4).

La electroforesis se realizó con buffer de corrida TBE 1X a 245 volts por 1.5 h.

Una vez terminada la electroforesis, los geles se desmontaron y fueron

colocados en bandejas para sumergirlos durante 15 min en la solución fijadora

(Etanol al 10%+Ácido Acético al 1%), y posteriormente enjuagarlos con agua

124

estéril. Como siguiente se cubrieron los geles con la solución de tinción (Nitrato

de plata al 0.2%) y fueron puestos durante 15 min en agitación. Como siguiente

se retiró dicha solución para el segundo enjuague con agua estéril. Finalmente

se añadió la solución reveladora (Hidróxido de sodio al 3%) y 500 µL de

formaldehido, y de esta forma mantener los geles en agitación hasta el revelado

de las bandas. El tamaño de los fragmentos digeridos se calculó tomando como

referencia los marcadores de peso molecular o ladder de 100 pb y 1 kb

(Invitrogen), colocados cada uno en los 2 pozos exteriores. Los productos

digeridos se conservaron a 4°C para sus posteriores análisis.

Para determinar el grado de polimorfismos, los patrones de los fragmentos se

calcularon con respecto al peso molecular de cada banda y analizaron a través

de la generación una matriz binaria, asignando el valor de 0 o 1 a la ausencia y

presencia de las bandas, respectivamente y para un determinado peso

molecular.

Posteriormente con el uso del programa bioinformático FreeTree (Pavlíeek et

al., 1999) se construyó un dendrograma con el método de agrupamiento

UPGMA, basado en el índice se distancia genética (similitud) usando el

coeficiente de Dice (1945) / Nei-Li (1979). El soporte de la topología interna se

realizó mediante análisis de bootstrap con 1000 repeticiones (Felsenstein,

1985). El dendrograma generado se visualizó y editó usando el software

FigTree 1.4.2 (Rambaut, 2014).

Posteriormente con base a las distancias genéticas obtenidas en el

dendrograma, se formaron grupos y se seleccionó a un integrante de cada uno,

con el fin de disminuir el número de muestras a secuenciar.

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