Incremento en la expresión del ARNm del receptor c-Met en...

Incremento en la expresión del ARNmdel receptor c-Met en el cáncer gástrico.

Hideki Amemiya1, Alix Peña2, Miguel Chiurillo3, Jaime Moscoso1, Alejandro Useche4

y Raúl Baffi5.

1Departamento de Ciencias Morfológicas, Sección de Anatomía Macroscópica,Decanato de Ciencias de la Salud, Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”.

2Clínica Razetti.3Departamento de Ciencias Funcionales, Sección de Bioquímica,Decanato de Ciencias de la Salud, Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”.

4Departamento de Cirugía General, Hospital Central Universitario “Antonio María Pineda”.5Sociedad Anticancerosa del Estado Lara.Barquisimeto, Venezuela.

Palabras clave: cáncer gástrico, ARNm, receptor c-Met, RT-PCR, inmunohistoquí-mica.

Resumen. El cáncer gástrico es una de las patologías malignas más fre-cuentes en el mundo. En las últimas décadas la atención se ha centrado enposibles alteraciones de factores genéticos que incluyen la activación de pro-to-oncogenes y/o la inactivación de genes supresores tumorales. El productodel C-MET proto-oncogen y su ligando, el factor de crecimiento del hepatoci-to (HGF), han sido implicados en la proliferación y migración celular en elcáncer gástrico. En este estudio se analizó a nivel molecular la amplificacióndel ARNm del receptor c-Met a partir del tejido tumoral gástrico de pacientesa quienes se les practicó gastrectomías, utilizando el método del ácido guani-dina-tiocianato-fenol-cloroformo, y el método semicuantitativo de la Reacciónen Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Reversa (RT-PCR), encontrán-dose que los elevados niveles del ARNm del receptor c-Met en las muestras tu-morales de los pacientes están relacionados con mayor invasión en la profun-didad de la pared gástrica (r = 0,762, p<0,01), incremento en la metástasis alos ganglios linfáticos (r = 0,766, p<0,01), alta frecuencia en tumores pocosdiferenciados o indiferenciados (r = 0,912, p<0,001), aumento en el estadia-je del cáncer gástrico (r = 0,838, p<0,001), y en la sobreexpresión por el mé-todo inmunohistoquímico (IHQ) de la estreptavidina-biotina marcada de sureceptor a nivel proteico (r = 0,858, p<0,001). La amplificación del ARNmy/o la sobreexpresión a nivel proteico del receptor c-Met, pudieran ser utiliza-dos como factores pronósticos en el cáncer gástrico.

Invest Clin 54(3): 284 - 298, 2013

Autor de correspondencia: Hideki Amemiya. Departamento de Ciencias Morfológicas, Sección de Anatomía Ma-croscópica, Decanato de Ciencias de la Salud, Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”. Avenida Liber-tador con Avenida Andrés Bello, al lado del Hospital Central Universitario “Antonio María Pineda”.Barquisimeto 3001, Venezuela. Teléfono: 58-251-259-1849. Correo electrónico: [email protected]

Increased expression of the c-Met receptor mRNA in gastriccancer.Invest Clin: 2013; 54(3): 284 - 298

Keywords: Gastric cancer, c-Met receptor, RT-PCR, immunohistochemistry.

Abstract. Gastric cancer is one of the most common malignancies in theworld. In the last decades, the attention has been focused in possible alter-ations of genetic factors that include proto-oncogene activation and/or thetumor suppressor gene inactivation. The product of the proto-oncogenec-MET and its ligand, hepatocyte growth factor (HGF), have been implicatedin cell proliferation and migration in gastric cancer. In this study we analyzedat the molecular level, the amplification of c-Met receptor mRNA from gastrictumor tissue of patients who underwent gastrectomy, using the acidguanidinium-thiocyanate-phenol-chloroform method and the semiquantitativeReverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) method. It wasfound that high levels of c-Met receptor mRNA in tumor samples from pa-tients are associated with greater depth of invasion in the gastric wall (r =0.762, p<0.01), increase in metastases to lymph nodes (r = 0.766, p<0.01),high frequency of poorly differentiated or undifferentiated tumors (r = 0.912,p<0.001), increase in the gastric cancer staging (r = 0.838, p<0.001), andthe overexpression, by the immunohistochemistry method (IHC) of the la-beled streptavidin-biotin, of the c-Met receptor at the protein level (r =0.858, p<0.001). The amplification of mRNA and/or protein leveloverexpression of the c-Met receptor could be used as prognostic factors ingastric cancer.

Recibido: 11-03-2013. Aceptado: 18-07-2013

INTRODUCCIÓN

El carcinoma gástrico continúa siendouna de las neoplasias más frecuentes del serhumano. En Venezuela, el estado Táchira esel que ocupa el primer lugar con una tasade mortalidad por cáncer gástrico de 15,91por 100.000 habitantes, seguido de Mériday Trujillo con 15,22 y 11,02 por 100.000 ha-bitantes respectivamente. El estado Laraocupa el noveno lugar en la mortalidad porcáncer gástrico con 8,15 por 100.000 habi-tantes, presentando una tasa de mortalidadmás alta que la mortalidad general por cán-cer gástrico en Venezuela el cual es de 6,73por 100.000 habitantes (1). Además para

Barquisimeto, el cáncer gástrico representaun problema de salud pública ya que ocupael primer lugar en las defunciones por cán-cer (2).

Las neoplasias malignas frecuentemen-te resultan por una serie de alteraciones ge-néticas que incluyen la activación de pro-to-oncogenes y/o la inactivación de los ge-nes supresores tumorales (3). El c-Met pro-to-oncongen regula la proliferación o mi-gración celular (4, 5), y codifica el receptorc-Met con actividad de tirosina kinasa (6).La molécula del receptor es un heterodíme-ro de 190 kDa, que consta de 2 cadenasunidas a un puente disulfuro: la subunidad�, de 50 kDa, está expuesta en la superficie

Vol. 54(3): 284 - 298, 2013

ARNm del c-Met en el cáncer gástrico 285

extracelular y la subunidad �, de 145 kDa,atraviesa la membrana celular (6), ésta últi-ma incluye los sitios de fosforilación de latirosina (7).

El ligando para el receptor c-Met es elfactor de crecimiento del hepatocito(HGF), el cual fue inicialmente identificadocomo un potente mitógeno para los cultivosprimarios de hepatocitos a partir del suerode ratas con hepatectomías parciales (8).HGF fue aislado de varias fuentes, incluyen-do las plaquetas de rata (9), suero de pa-cientes humanos con falla hepática (10) ysuero de conejo (11). HGF es consideradoel mayor mediador en la regeneración hepá-tica in vivo (12). HGF es conocido por esti-mular el crecimiento de otros tejidos epite-liales, tales como epitelio tubular renal,queratinocitos (13), células endoteliales ymelanocitos (14).

El receptor c-Met ha sido encontradocon sobreexpresión en los canceres gástrico(15), colorrectal (16), pulmonar (17), tiroi-deo (18), renales (19), ovárico (20) y demamas (21). Además se ha reportado acer-ca del pobre pronóstico de los pacientescon cáncer gástrico productor de alfa-feto-proteínas (22) y se ha encontrado una altafrecuencia en la expresión del receptorc-Met en este tipo de cáncer gástrico (23).Recientemente se ha publicado un estudioen donde se observó una alta expresión delreceptor c-Met a nivel proteico en pacientesvenezolanos con estadios avanzados (III yIV) con respecto a pacientes en estadiosprecoces (I y II) del cáncer gástrico, encon-trando además sobreexpresión del receptorc-Met en las variables histológicas con bajogrado de diferenciación, mayor invasión tu-moral, metástasis hepática y se reportó unasobrevida menor de los pacientes con ma-yor expresión del receptor comparados conel grupo de menor expresión (24).

Motivados por las investigaciones pre-vias y desconociendo la existencia de publi-caciones en español, en las que se evalúe a

nivel molecular el ARNm del receptor c-Meten el cáncer gástrico, se ha propuesto reali-zar el presente estudio a objeto de determi-nar por RT-PCR la amplificación del recep-tor c-Met en pacientes con cáncer gástricodiagnosticados en la ciudad de Barquisime-to, estado Lara, Venezuela.

PACIENTES Y MÉTODOS

PacientesSe realizó un estudio poblacional, lon-

gitudinal y transversal, en el que se incluye-ron en este estudio 12 pacientes a quienesse les practicó gastrectomía total o subtotalpor presentar diagnóstico de cáncer gástri-co en la Clínica Razetti de Barquisimeto,Estado Lara, Venezuela, en el período com-prendido entre Marzo 2008 hasta Marzo2012.

El aspecto bioético del trabajo fue dis-cutido y aprobado por la comisión de Bioé-tica de la Clínica Razetti y a cada pacientese les explicó sobre los procedimientos arealizar en los especímenes tomados de lasgastrectomías por cáncer gástrico, y se lessolicitó sus firmas para la hoja del consenti-miento informado.

Extracción del ARN totalSe recolectaron muestras tanto de teji-

do tumoral con cáncer gástrico y tejido gás-trico sano de los pacientes que fueron inter-venidos en la Clínica Razetti de Barquisime-to, siendo congelados inmediatamente connitrógeno líquido, posteriormente fueronalmacenados en un refrigerador de –80°Chasta la extracción del ARN total.

Para la extracción del ARN total se uti-lizó el método del ácido guanidina-tiociana-to-fenol-cloroformo (Trizol Reagent, Invi-trogen) con modificaciones menores comopreviamente se describe (25, 26). Breve-mente, cada muestra de tejido fue pulveri-zado dentro del nitrógeno líquido, y se leagregó la solución denaturizante contenien-

Investigación Clínica 54(3): 2013

286 Amemiya y col.

do 4M de guanidina-tiocianato. Secuencial-mente, se le agregó 2M de acetato sódico,fenol saturado en agua y clorofor-mo/isoamyl alcohol. El ARN total se separópor centrifugación y fue precipitado conisopropanol. El precipitado del RNA se di-solvió en la solución denaturizante y fue re-precipitado con isopropanol, se lavó con70% de etanol y finalmente se disolvió enagua tratada con dietilpirocarbonato(DEPC).

OligonucleótidosSe utilizaron las secuencias del recep-

tor c-Met (número de acceso NM 000245,GenBank), �-actina (número de acceso XM004814, GenBank) y los iniciadores quefueron diseñados por el autor en estudiosprevios (25, 26) con el Primer3 software de-sarrollado por el Instituto Whitehead, Inves-tigaciones Biomédicas (Cambridge, Massa-chussets). Los iniciadores oligonucleótidosson los siguientes: receptor c-Met: (senti-do): AAG CTG CCA GTG AAG TGG AT; (an-tisentido): AAA CCA TTG GAC AAA GTGTGG (tamaño del producto de 491 pares debases de PCR) y �-actina: (sentido): CTACAA TGA GCT GCG TGT GC; (antisentido):CGG TGA GGA TCT TCA TGA GG (tamañodel producto de 314 pares de bases dePCR).

Método semicuantitativo de la reacciónde la cadena de polimerasacon transcriptasa reversa (RT-PCR)

Un microgramo del ARN total fueagregado a la mezcla de reactivos usando elAccess RT-PCR System (Promega, Madison,WI, USA) el cual contiene 0,1 µ/µL de latranscriptasa reversa del Virus de la Mielo-blastosis Aviaria (AMV), 0,1 µ/µL del ADNPolimerasa del Thermus flavus (Tfl), 10 µLAMV/Tfl bufer, 1 mM MgSO4, 0,2 mMdNTP, 0,1 µM para cada iniciador y aguatratada con DEPC para completar un volu-men total de 50 µL.

Tanto para el receptor c-Met y �-acti-na, la reacción de la transcriptasa reversafue llevado a cabo en 1 ciclo de 45 min a45° y de 2 min a 94°C para la inactivacióndel AMV transcriptasa reversa. Para deter-minar la mejor cantidad de ciclos para elmétodo semicuantitativo del PCR, se esco-gió un ciclo en la línea ascendente de laamplificación del producto del PCR poranálisis densitométrico de las bandas entre10 a 40 ciclos, y se utilizaron las siguientescondiciones cíclicas: para el receptor c-Met,20 ciclos de 30 seg a 94°C para la desnatu-ralización, 1 minuto a 60° para el acopla-miento y 2 min a 68°C para la elongación ypara la �-actina, el protocolo fue similar aldescrito anteriormente pero con 15 ciclos(Fig. 1). Se utilizó el termociclador (GeneAmp, PCR System 9700, Applied Biosy-stem).

Para evaluar la cantidad del productodel PCR, 10 µL del producto amplificado sele realizó electroforesis en gel de agarosa(Scientific Trade Corp. Miami, USA) al 1,2%y 1,5% equilibrado en buffer 40 mMTris-acetato, 2mM EDTA (TAE) para c-Met y�-actina respectivamente. Bromuro de eti-dio (0,5 µg/mL) fue agregado al gel de aga-rosa-TAE y al buffer-TAE para electroforesispara visualizar el fragmento amplificado deADN y fueron visualizados bajo luz ultravio-leta con el equipo Kodak Gel Logic 2000Imaging System (Rochester, NY, 14650).Las fotografías fueron analizadas calculan-do la intensidad de las bandas utilizando elsoftware Kodak Molecular Imaging SoftwareVersion 4.0 (Rochester, NY, 14650). Lascantidades relativas del receptor c-Met fue-ron estandarizados al gen control, la �-acti-na, del mismo paciente.

InmunohistoquímicaEl análisis inmunohistoquímico (IHQ)

fue realizado por el método de la estreptavi-dina-biotina marcada (LSAB+), usando elkit LSAB+ (DAKO Corporation, CA, USA)

Vol. 54(3): 284 - 298, 2013


sobre bloques de tejidos en parafina fijadascon formalina al 10%. Secciones seriadas de2-µm fueron desparafinados en xilene yrehidratados a través de concentraciones al-cohólicas decrecientes. La actividad de laperoxidasa endógena fue bloqueada por in-cubación en peróxido de hidrógeno al 0,1%por 15 minutos. El anticuerpo primario in-cluyó un anticuerpo policlonal anti-Met deconejo contra el carboxilo terminal delc-Met humano (Santa Cruz Biotechnology,CA, USA) a dilución de 1 en 50, y fue detec-tado incubando el anticuerpo secundario yla estreptavidina-peroxidasa por 30 min atemperatura ambiente, seguida de tres en-juagues con PBS cada uno. Diaminobenzidi-na fue usado por 5 min para visualizar la de-posición de la peroxidasa en los sitios anti-génicos. Por último, las secciones fueron te-ñidas con hematoxilina.

ClasificaciónLa inmunorreacción observada en el

citoplasma y la membrana celular de las cé-lulas tumorales para el receptor c-Met fue-ron tomadas como positivos para clasificarel método IHQ como sigue: negativo (–): no

hay inmunorreacción en las células neoplá-sicas; una cruz (+): de 1 a 24% de las célu-las neoplásicas exhibieron inmunorreac-ción; dos cruces (++): de 25 a 49%; trescruces (+++): de 50 a 74%; cuatro cruces(++++): de 75% o más de las células neo-plásicas presentaron inmunorreacción.

Se utilizó para la clasificación del cán-cer gástrico por estadios, profundidad e in-vasión a los ganglios linfáticos, los paráme-tros de la 7ma. Edición de la AmericanJoint Committee of Cancer (AJCC) (27) ypara la clasificación histológica según la1era. Edición en inglés de la Japanese Re-search Society for Gastric Cancer (JRSGC)(28).

Análisis estadísticoPara determinar el análisis estadístico,

se utilizó el paquete estadístico SPSS 15 ylos niveles del ARNm para evaluar 2 gruposfueron analizados con el t student. Los re-sultados de la IHQ se compararon mediantelas pruebas de Fisher y Chi Cuadrado. Paradeterminar el grado de asociación entre elnivel del ARNm y a nivel proteico del recep-tor c-Met, se utilizó el coeficiente de corre-


288 Amemiya y col.

Fig. 1. Amplificación según el número de ciclos de los niveles del ARNm del receptor c-Met y �-actinapor la Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Reversa (RT-PCR). M=Marcador.

lación de Pearson. Se consideró estadística-mente significativo un valor de p<0,05.

RESULTADOS

Características clinicopatológicasde los pacientes

Del total de 12 pacientes incluidos enéste estudio, 2 pacientes fueron del génerofemenino (17%) y 10 pacientes del masculi-no (83%). La edad de los pacientes osciló de28 a 75 años (X ± DE: 57,42 ± 13,26 años).

En cuanto al grado de diferenciacióndel tejido tumoral, en el 50 % de los casospresentaron adenocarcinomas moderada-mente diferenciados, en el 25 % los poco di-ferenciados, y para las células en anillo desello, papilar y el bien diferenciado corres-pondió a 1 paciente respectivamente.

Según la profundidad de la invasión tu-moral en la pared gástrica, fue más frecuen-te hasta la serosa (T4a) con 6 casos (50%),seguidos de la infiltración neoplásica quesobrepasa la serosa (T4b) con 3 pacientes(25%), y un caso cada uno en los nivelesT1b (submucosa), T2 (muscularis mucosa)y T3 (subserosa). Con estos resultados, el91,7% de los pacientes (n=11) presentaroncáncer gástrico avanzado.

Se observó infiltración tumoral en va-rios órganos en una paciente (peritoneo pa-rietal, peritoneo visceral de asas delgadas,páncreas y epiplón mayor), en otro pacienteen 2 órganos (páncreas y colon) y en 2 ca-sos presentaron infiltración a un órgano(epiplón mayor y páncreas respectivamen-te). Y en el resto de los pacientes (n=8,66,7 %), no presentaron evidencias de infil-tración a órganos vecinos o metástasis.

En relación al número de ganglios lin-fáticos afectados, se observó que predominóel N2 (metástasis de 3 a 6 ganglios linfáti-cos) con 4 casos (33,3 %), seguidos de N3a(metástasis de 7 a 15 ganglios linfáticos) yN3b (mayor de 16 ganglios linfáticos invadi-dos) ambos con 3 pacientes (25% cada

uno), y un caso cada uno para N0 (sin afec-tación en los ganglios linfáticos) y N1 (inva-sión de 1 a 2 ganglios linfáticos).

De acuerdo a la última edición delTNM (27) para el estadiaje del cáncer gás-trico se clasificó en: IA: 1 paciente; IB: 0pacientes; IIA: 1 paciente; IIB: 0 pacientes;IIIA: 1 paciente; IIIB: 3 pacientes; IIIC: 4pacientes y IV: 2 pacientes.

Amplificación del ARNm del receptorc-Met en especímenes de cáncer gástrico

Se analizaron los niveles del ARNm delreceptor c-Met en los especímenes congela-dos del carcinoma gástrico como de tejidonormal del estómago de 12 pacientes por elmétodo semicuantitativo de la RT-PCR.

El ARNm del receptor c-Met se observóen todas las muestras tanto tumoralescomo de tejidos gástricos normales de los12 pacientes (Fig. 2).

Al analizar los tejidos tumorales de lospacientes, se encontró altos niveles delARNm del receptor c-Met en el grupo de pa-cientes con invasión tumoral en profundi-dad T4 (27), con respecto a las categoríasT3, T2 y T1. Además, se observó que a ma-yor amplificación en el ARNm del receptorc-Met, fue mayor la invasión tumoral en laprofundidad de la pared gástrica (r =0,762, p<0,01) (Fig. 3). Con respecto a lainvasión hacia los ganglios linfáticos segúnla clasificación de la AJCC (27), el grupoN3 presentó altos niveles del ARNm del re-ceptor c-Met comparados con los grupos N1y N0, evidenciándose una relación positivaentre la amplificación del ARNm con el gra-do de infiltración a los ganglios linfáticos(r = 0,766, p<0,01) (Fig. 4). En cuanto altipo histológico del cáncer gástrico segúnla JRSGC (28), se observó correlación consignificancia estadística en donde los tumo-res con bajo grado de diferenciación pre-sentaron elevados niveles del ARNm del re-ceptor c-Met (r = 0,912, p<0,001) (Fig. 5).Al evaluar los niveles del ARNm con el esta-

Vol. 54(3): 284 - 298, 2013



290 Amemiya y col.

A

B

Fig. 2. (A) Niveles del ARNm del receptor c-Met en tejidos con tumor primario en casos representati-vos determinados por RT-PCR. (B). Niveles del ARNm de la �-actina utilizada como control in-terno. M= Marcador; T= Tumor gástrico; N= Tejido gástrico sano del mismo paciente.

r = 0,762 (p<0,01)

Fig. 3. Correlación entre la amplificación delARNm del receptor c-Met por el métododel RT-PCR en los tejidos tumorales conla invasión en la profundidad de la paredgástrica de acuerdo a los parámetros dela 7ma. edición de la American JointCommittee of Cancer (AJCC) (27).

r = 0,766 (p<0,01)

Fig. 4. Correlación entre la amplificación delARNm del receptor c-Met por el métododel RT-PCR en los tejidos tumorales conla invasión a los ganglios linfáticos deacuerdo a los parámetros de la 7ma. edi-ción de la AJCC (27).

dio del cáncer gástrico, se encontró amplifi-cado el ARNm del receptor c-Met en los es-tadios III y IV con respecto a los estadios I yII, con una relación directamente proporcio-nal entre el estadio del tumor con respectoal ARNm (r = 0,838, p<0,001) (Fig. 6).

En el cálculo del coeficiente de regre-sión, se observó que por cada unidad densi-tométrica de la amplificación del ARNm delreceptor c-Met, aumentan las siguientes va-riables: Invasión tumoral en la profundidadde la pared gástrica en 0,93; infiltración alos ganglios linfáticos en 0,87; histopatolo-gía hacia patrones menos diferenciados en0,757 y el avance en el estadio del cáncercon 0,814 respectivamente.

Se apreció una elevada amplificacióndel ARNm del receptor c-Met en las especí-menes tumorales comparados con los de te-jido normal en los pacientes con estadioavanzado del cáncer gástrico (p<0,001)mientras que no hubo diferencias significa-tivas en los niveles del ARNm del receptorc-Met en las muestras tumorales y normalesde los pacientes con estadio precoz(p=0,144).

Inmunorreacción del receptor c-Meten especímenes de cáncer gástrico

En la evaluación del receptor c-Met anivel proteínico, se observó una fuerte ex-presión de tipo granular predominantemen-te en el citoplasma de las células tumorales(Fig. 7). En la Tabla I se detalla las caracte-rísticas clinicopatológicas de los pacientesy la expresión del receptor c-Met por IHQ.

El análisis de la correlación de Pearsonmostró una relación positiva significativaentre los niveles del ARNm a nivel genéticocon respecto a la expresión a nivel proteicodel receptor c-Met en los especímenes depacientes con cáncer gástrico (r = 0,858,p<0,001) (Fig. 8). Finalmente, el coeficien-te de regresión demostró un aumento en laIHQ de 0,957 por cada unidad densitomé-trica de la amplificación del ARNm del re-ceptor c-Met.

DISCUSIÓN

Hay un incremento en las investigacio-nes a nivel de la biología molecular en elcarcinoma gástrico. Pero no existe en la li-

Vol. 54(3): 284 - 298, 2013


r = 0,912 (p<0,001)

Fig. 5. Correlación entre la amplificación delARNm del receptor c-Met por el métododel RT-PCR en los tejidos tumorales conla clasificación histológica del cáncergástrico de acuerdo a los parámetros dela Japanese Research Society for GastricCancer (JRSGC) (28).

r = 0,838 (p<0,001)

Fig. 6. Correlación entre la amplificación delARNm del receptor c-Met por el métododel RT-PCR en los tejidos tumorales conel estadio del cáncer gástrico de acuer-do a los parámetros de la 7ma. Ediciónde la AJCC (27).

teratura en español reportes sobre la rela-ción de la amplificación a nivel moleculardel ARNm del receptor c-Met con el cáncergástrico. Por tales motivos, surge este estu-dio en la región Centro-Occidental de Vene-zuela, para así comparar los resultados conlos publicados en los reportes internaciona-les.

En el presente trabajo, se encontróelevados niveles del ARNm del receptorc-Met en las muestras tumorales de cáncergástrico en los pacientes con estadios avan-

zados (III y IV), con bajo grado de diferen-ciación tumoral, con mayor infiltración tu-moral en la pared gástrica (T4), y con ma-yor invasión a ganglios linfáticos (N3), enconcordancia con reportes previos, en don-de Kuniyasu y colaboradores demostraronque hay una amplificación genética delc-Met en los pacientes en estadios avanza-dos, en especial a los carcinomas gástricostipo escirroso (que corresponde a un carci-noma con infiltración difusa o Borrmanntipo IV) (29), así como Wang y colaborado-


292 Amemiya y col.

A

B

Fig. 7. (A) Inmunorreacción del receptor c-Met en un caso representativo grado ++++. Se apreciafuerte expresión con un patrón granular a nivel de citoplasma de todas las células neoplásicas.(B) Inmunorreacción del receptor c-Met en un caso representativo grado +, observado en al-gunas células neoplásicas.

res, analizaron la expresión del ARNm delreceptor c-Met por RT-PCR en tejidos tumo-rales gástricos, encontrando sobreexpresa-do el ARNm del receptor con una relaciónsignificativa mientras mayor es la invasióntumoral en la profundidad (p=0,007), lametástasis a ganglios linfáticos (p<0,01), yel estadio TNM (p=0,001) (30). Otros in-vestigadores encontraron una amplificacióngenética del receptor c-Met de 2 hasta 50veces en los especímenes tumorales conrespecto al tejido sano (16). Se ha involu-crado en el incremento de los niveles delARNm del receptor c-Met, a las citokinas ta-les como IL-1�, IL-6, Factor de Necrosis Tu-moral (FNT)-�, TGF�1 y las hormonas este-roideas como la progesterona y el tamoxife-

Vol. 54(3): 284 - 298, 2013


TABLA ICARACTERISTICAS CLINICOPATOLÓGICAS DE PACIENTES CON CÁNCER GÁSTRICO

Y LA INMUNOEXPRESIÓN DEL RECEPTOR C-MET

ParámetrosNº de pacientes según el grado de expresión del receptor c-Met

+n=1

++n=2

+++n=2

++++n=7

Profundidada

T1 1 0 0 0

T2 0 1 0 0

T3 0 1 0 0

T4 0 0 2 7

Invasión aganglioslinfáticosa

N0 1 0 0 0

N1 0 1 0 0

N2 0 1 1 2

N3 0 0 1 5

Clasificaciónhistológicab

Bien 1 0 0 0

Papilar 0 1 0 0

Moderado 0 1 2 3

Pobre 0 0 0 3

Anillo de sello 0 0 0 1

Estadio delcáncer gástricoa

I 1 0 0 0

II 0 1 0 0

III 0 1 2 5

IV 0 0 0 2a Según los parámetros de la 7ma. Edición de la American Joint Committee of Cancer (AJCC) (27). b Según losparámetros de la Japanese Research Society for Gastric Cancer (JRSGC) (28).

r = 0,858 (p<0,001)

Inm

un

oh

isto

qu

ímic

a

Fig. 8. Correlación entre la amplificación a ni-vel genético del ARNm del receptorc-Met por el método del RT-PCR con laexpresión a nivel proteico del receptorc-Met por el método de IHQ en los teji-dos tumorales.

no, en una variedad de líneas celulares decarcinomas humanos (31).

El 91,7% de los pacientes en este estu-dio presentaron cáncer gástrico avanzado, yde ellos, el 75% se encontraba en T4, quie-nes presentaron elevados niveles en el ARNmdel receptor c-Met en comparación con loscasos catalogados como T1, T2 y T3. Tsuga-wa y colaboradores (32) reportaron una inci-dencia alta de diseminación peritoneal enlos pacientes con amplificación genética delc-Met. En ésta investigación, se evidencióque hubo diseminación en peritoneo parietalanterior y posterior, así como también enperitoneo visceral de asas delgadas en lamisma paciente, quien presentó la más altaamplificación del ARNm del receptor. En lospacientes con invasión linfática N2 y N3, seapreció una amplificación del ARNm delc-Met en el 83,3% de los casos, al relacionar-los con los grupos N1 y N0, en concordanciacon estudios previos (33).

Además del análisis de la amplificacióndel ARNm del c-Met por medio del RT-PCR,se evaluó a nivel protéico de dicho receptorpor medio del método de IHQ, encontrandoque los pacientes con alta expresión del re-ceptor c-Met, presentaron mayor invasióntumoral en la profundidad de la pared gás-trica, infiltración a órganos vecinos, asícomo también hacia los ganglios linfáticos(N2 y N3), observándose mayor expresión(++++) en los tumores menos diferencia-dos y en los casos en estadios avanzados delcáncer gástrico (III y IV).

Nakajima y colaboradores reportaronque tanto la amplificación genética y la so-breexpresión de la proteína del receptorc-Met en el cáncer gástrico, están relacio-nados con el grado de invasión en la profun-didad de la pared gástrica, a los ganglioslinfáticos y al pobre pronóstico de los pa-cientes (33). Se ha demostrado además,que los pacientes con amplificación genéti-ca del receptor c-Met, presentaron un pe-ríodo libre de enfermedad más corto

(p=0,0216) y una sobrevida general másbaja (p=0,0134) comparado con el grupode pacientes sin amplificación genética(34). En un estudio previo, pero a nivel dela proteína del receptor c-Met, se observóque los pacientes que mostraron alta expre-sión en la inmunorreactividad del receptorc-Met, presentaban una supervivencia muypobre (24). En la presente investigación,hubo una correlación entre las expresionesdel ARNm con el de la proteína del receptorc-Met, demostrándose que mientras mayorera la amplificación genética en el ARNm,se apreciaba mayor inmunorreacción en laproteína del receptor, en línea con reportesprevios (35). Sin embargo, otros autores,observaron que en tejidos como riñón, tiroi-des, placenta y páncreas, presentaron nive-les elevados del ARNm del c-Met, pero no secorrelacionaban debido a la inmunorreacti-vidad apenas detectable en la proteína delreceptor c-Met por IHQ (36). Una explica-ción pudiera ser una vida media extremada-mente corta del ARNm del receptor c-Meten el mecanismo postranscripcional repor-tado en líneas celulares de carcinoma hu-mano derivados del ovario, mama, endome-trio, y que pudiera estar regulado de mane-ra diferente para cada tejido (31).

Tajima y colaboradores, utilizando elHGF recombinante humano con I125, des-cribieron una correlación entre la amplifi-cación del ARNm del c-Met con la afinidaddel receptor a su ligando en varias líneascelulares (36). Los niveles séricos del HGFfueron reportados elevados en los pacientescon cáncer gástrico, asociados a mayor in-vasión tumoral en la pared gástrica e infil-tración de células cancerosas en los capila-res venosos dentro del tumor (37). En unainvestigación aparte, el 61,5 % de los pa-cientes portadores de cáncer gástrico, seles detectaron la amplificación del ARNmdel receptor c-Met en las células tumoralescirculantes en la sangre periférica utilizan-do la técnica del RT-PCR, y fueron asocia-


294 Amemiya y col.

dos a invasión tumoral y metástasis a gan-glios linfáticos (38).

En estudios previos, se ha encontradoun alto grado de expresión proteica y ampli-ficación genética del receptor c-Met en elgrupo de pacientes con cáncer gástrico pri-mario con metástasis hepática comparadocon el grupo sin metástasis hepática (26).En una investigación similar, se observó unnivel elevado del ARNm del receptor c-Metusando el método RT-PCR en los tejidoscon cáncer colorrectal primario con respec-to al tejido normal, encontrando ademásuna sobreamplificación del ARNm del re-ceptor c-Met en el tejido hepático metastá-sico (39). De esta manera, la amplificacióndel ARNm del receptor c-Met, es uno de losmecanismos para la activación de la carci-nogénesis, demostrando su rol en la progre-sión de las células tumorales hacia fenoti-pos más agresivos en el carcinoma gástrico(26, 29, 32). Así mismo, en el presente tra-bajo se demostró que los elevados nivelesdel ARNm del receptor c-Met está correla-cionado a mayor invasión tumoral en la pro-fundidad de la pared gástrica, incrementoen la metástasis a los ganglios linfáticos,alta frecuencia en tumores pocos diferen-ciados o indiferenciados, aumento en el es-tadiaje del cáncer gástrico, y en la sobreex-presión por IHQ de su receptor a nivel pro-teico en los pacientes con carcinomas gás-tricos.

Por todo lo discutido anteriormente, laamplificación del ARNm y/o la sobreexpre-sión a nivel proteico del receptor c-Met, pu-dieran ser utilizados como factores pronós-ticos y como potencial blanco terapéuticotanto a nivel genético como a nivel de laproteína del receptor c-Met en el cáncergástrico.

AGRADECIMIENTOS

El nitrógeno líquido utilizado paracongelar los especímenes fue obtenido por

la colaboración de la planta productora dedicho elemento ubicado dentro del Decana-to de Ciencias Veterinarias de la Universi-dad Centroccidental “Lisandro Alvarado”(UCLA) y luego fueron almacenados en unrefrigerador de –80°C localizado en el Labo-ratorio de Microbiología del Decanato deCiencias de la Salud de la UCLA que gentil-mente nos facilitaron hasta la extraccióndel ARN total. Se decidió realizar las tomasde las muestras del tejido gástrico en la Clí-nica Razetti debido al apoyo recibido porparte de la Unidad FECUNDAR para el de-pósito transitorio de las muestras dentrolos envases especializados que contiene ni-trógeno líquido hasta su traslado al refrige-rador de –80°C.

A la profesora María Eugenia Camargo,adscrita al Departamento de Ciencias Fun-cionales, Sección de Bioquímica, Laborato-rio de Genética Molecular “Dr. Yunis Tur-bay” de la UCLA, por su importante colabo-ración en la extracción del ARN total, y enel análisis de la intensidad de las bandas delARNm.

Al Dr. Douglas García, adscrito al De-partamento de Medicina Preventiva y So-cial, Sección de Epidemiología y Bioestadís-tica de la UCLA, por sus valiosos consejosen la revisión del manuscrito.

Este trabajo fue financiado por el Con-sejo de Desarrollo Científico, Humanístico yTecnológico (C.D.C.H.T.) de la UCLA.

REFERENCIAS

1. Amemiya H, Menolascino F, Peña A. Fac-tores anatomopatológicos y sobrevida depacientes intervenidos de gastrectomíaspor cáncer gástrico. Boletín Médico dePostgrado 2008; 24: 11-19.

2. Anuarios de Epidemiología y EstadísticaVital, MSAS. 1996.

3. Stemmermann G, Heffelfinger SC,Noffsinger A, Hui YZ, Miller MA,Fenoglio-Preiser CM. The molecular biol-ogy of esophageal and gastric cancer and

Vol. 54(3): 284 - 298, 2013


their precursors: Oncogenes, tumor sup-pressor genes, and growth factors. HumPathol 1994; 25: 968-981.

4. Matsumoto K, Nakamura T. Hepatocytegrowth factor (HGF) as a tissue organizerfor organogenesis and regeneration. Bio-chem Biophys Res Commun 1997; 239:639-644.

5. Halaban R, Rubin JS, Funasaka Y, CobbM, Boulton T, Faletto D, Rosen E, ChanA, Yoko K, White W, Cook C, MoellmannG. Met and hepatocyte growth factor/scat-ter factor signal transduction in normalmelanocytes and melanoma cells. Onco-gene 1992; 7: 2195-2206.

6. Giordano S, Ponzetto C, Di Renzo MF,Cooper CS, Comoglio PM. Tyrosine kinasereceptor indistinguishable from the c-Metprotein. Nature 1989; 339: 155-156.

7. Gonzatti-Haces M, Seth A, Park M, Cope-land T, Oroszlan S, Vande Woude GF.Characterization of the TPR-MET onco-gene p65 and the MET protooncogenep140 protein-tyrosine kinases. Proc NatlAcad Sci USA 1988; 85: 21-25.

8. Nakamura T, Nawa K, Ichihara A. Partialpurification and characterization ofhepatocyte growth factor from serum ofhepatectomized rats. Biochem Biophys ResCommun 1984; 122: 1450-1459.

9. Nakamura T, Teramoto H, Ichihara A. Pu-rification and characterization of a growthfactor from rat platelets for matureparenchymal hepatocytes in primary cul-tures. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 86:6489-6493.

10. Gohda E, Tsubouchi H, Nakayama H,Hirono S, Sakiyama O, Takahashi K,Miyazaki H, Hashimoto S, Daikuhara Y.Purification and partial characterization ofhepatocyte growth factor from plasma of apatient with fulminant hepatic failure. JClin Invest 1988; 81: 414-419.

11. Zarnegar R, Michalopoulos G. Purifica-tion and biological characterization of hu-man hepatopoietin A, a polypeptidegrowth factor for hepatocytes. Cancer Res1989; 49: 3314-3320.

12. Michalopoulos G. Liver regeneration: mo-lecular mechanisms of growth control.FASEB J 1990; 4: 176-187.

13. Kan M, Zhang GH, Zarnegar R,Michalopoulos G, Myoken Y, McKeehanWL, Stevens JI. Hepatocyte growth fac-tor/hepatopoietin A stimulates the growthof rat kidney proximal tubule epithelialcells (RPTE), rat nonparenchymal livercells, human melanoma cells, mousekeratinocytes and stimulates anchorage-in-dependent growth of SV40-transformedRPTE. Biochem Biophys Res Commun1991; 174: 331-337.

14. Rubin J, Chan AM, Bottaro DP, BurgessWH, Taylor WG, Cech AC, HirschfieldDW, Wong J, Miki T, Finch PW. Abroad-spectrum human lung fibroblast-de-rived mitogen is a variant of hepatocytegrowth factor. Proc Natl Acad Sci USA1991; 88: 415-419.

15. Kaji M, Yonemura Y, Harada S, Liu X,Terada I, Yamamoto H. Participation ofc-met in the progresión of human gastriccancers: anti c-met oligonucleotides in-hibit proliferation or invasiveness of gas-tric cancer cells. Cancer Gene Ther 1996;3: 393-404.

16. Di Renzo MF, Oliveros M, Giacomini A,Porte H, Chastre E, Mirossay L,Nordlinger B, Bretti S, Bottardi S,Giordano S, Plebani M, Gespach C,Comoglio PM. Overexpression and amplifi-cation of the met/HGF receptor gene dur-ing the progression of colorectal cancer.Clin Cancer Res 1995; 1:147-154.

17. Harvey P, Warn A, Newman P, Perry LJ,Ball RY, Warn RM. Immunoreactivity forhepatocyte growth factor/scatter factorand its receptor, met, in human lung carci-nomas and malignant mesotheliomas. JPathol 1996; 180:389-394.

18. Di Renzo MF, Olivero M, Serini G,Orlandi F, Pilotti S, Belfiore A,Costantino A, Vigneri R, Angeli A,Pierotti MA. Overexpression of the c-MET/HGF receptor in human thyroid carcino-mas derived from the follicular epithelium.J Endocrinol Invest 1995; 18: 134-139.

19. Natali PG, Prat M, Nicotra MR, Bigotti A,Olivero M, Comoglio PM, Di Renzo MF.Overexpression of the met/HGF receptorin renal cell carcinomas. Int J Cancer1996; 69: 212-217.


296 Amemiya y col.

20. Di Renzo MF, Oliveros M, Crepaldi T,Gaglia P, Zola P, Sismondi P, ComoglioPM. Overexpression of the Met/HGF recep-tor in ovarian cancer. Int J Cancer 1994;8: 658-662.

21. Jin L, Fuchs A, Schnitt SJ, Yao Y, JosephA, Lamszus K, Park M, Goldberg ID,Rosen EM. Expression of scatter factorand c-met receptor in benign and malig-nant breast tissue. Cancer 1997; 79: 749-760.

22. Kono K, Amemiya H, Sekikawa T, IizukaH, Takahashi A, Fujii H, Matsumoto Y.Clinicopathologic features of gastric can-cers producing alpha-fetoprotein. Dig Surg2002; 19: 359-365.

23. Amemiya H, Kono K, Mori Y, TakahashiA, Ichihara F, Iizuka H, Sekikawa T,Matsumoto Y. High frequency of c-Met ex-pression in gastric cancers producing al-pha-fetoprotein. Oncology 2000; 59: 145-151.

24. Amemiya H, Menolascino F, Peña A.Papel de la expresión del receptor c-Met enla progresión del cáncer gástrico. InvestClin 2010; 51: 369-380.

25. Amemiya H, Kono K, Takahashi A, KameiS, Sugai H, Ichihara F, Fujii H,Matsumoto Y. c-Met expression in gastriccancer cell line producing alpha-feto-protein. Surg Today 2004; 34: 115-122.

26. Amemiya H, Kono K, Itakura J, Tang RF,Takahashi A, An FQ, Kamei S, Iizuka H,Fujii H, Matsumoto Y. c-Met expression ingastric cancer with liver metastasis. Oncol-ogy 2002; 63: 286-296.

27. American Joint Committee of Cancer(AJCC). AJCC Cancer Staging Manual. 7th

ed. New York: Springer-Verlag; 2010, p117-126.

28. Japanese Research Society for GastricCancer (JRSGC). Japanese Classificationof Gastric Carcinoma. 1st English ed. To-kyo: Kanehara & CO., LTD.; 1995, p 37-43.

29. Kuniyasu H, Yasui W, Kitadai Y, YokozakiH, Ito H, Tahara E. Frequent amplifica-tion of the c-met gene in scirrhous typestomach cancer. Biochem Biophys ResCommun 1992; 189: 227-232.

30. Wang JY, Hsieh JS, Chen CC, Tzou WS,Cheng TL, Chen FM, Huang TJ, HuangYS, Huang SY, Yang T, Lin SR. Alter-ations of APS, c-Met, and p53 genes in tu-mor tissue and serum of patients with gas-tric cancers. J Surg Res 2004; 120: 242-248.

31. Moghul A, Lin L, Beedle A, Kanbour-Shakir A, DeFrances MC, Liu Y, ZarnegarR. Modulation of c-MET proto-oncogene(HGF receptor) mRNA abundance bycytokines and hormones: Evidence forrapid decay of the 8 kb c-MET transcript.Oncogene 1994; 9: 2045-2052.

32. Tsugawa K, Yonemura Y, Hirono Y,Fushida S, Kaji M, Miwa K, Miyazaki I,Yamamoto H. Amplification of the c-met,c-erbB2 and epidermal growth factor re-ceptor gene in human gastric cancers:Correlation to clinical features. Oncology1998; 55: 475-481.

33. Nakajima M, Sawada H, Yamada Y,Watanabe A, Tatsumi M, Yamashita J,Matsuda M, Sakaguchi T, Hirao T,Nakano H. The prognostic significance ofamplification and overexpression of c-metand c-erb B-2 in human gastric carcino-mas. Cancer 1999; 85: 1894-1902.

34. Lee J, Seo JW, Jun HJ, Ki CS, Park SH,Park YS, Lim HY, Choi MG, Bae JM,Sohn TS, Noh JH, Kim S, Jang HL, KimJY, Kim KM, Kang WK, Park JO. Impactof Met amplification on gastric cancer:Possible roles as a novel prognostic markerand a potential therapeutic target. OncolRep 2011; 25: 1517-1524.

35. Prat M, Narsimhan RP, Crepaldi T,Nicotra R, Natali PG, Comoglio PM. Thereceptor encoded by the human c-Metoncogene is expressed in hepatoytes, epi-thelial cells and solid tumors. Int J Cancer1991; 49:323-328.

36. Tajima H, Matsumoto K, Nakamura T.Regulation of cell growth and motility byhepatocyte growth factor and receptor ex-pression in various cell species. Exp CellRes 1992; 202: 423-431.

37. Taniguchi T, Kitamura M, Arai K, IwasakiY, Yamamoto Y, Igari A, Toil M. Increase

Vol. 54(3): 284 - 298, 2013


in the circulating level of hepatocytegrowth factor in gastric cancer patients.Br J Cancer 1997; 75: 673-677.

38. Uen YH, Lin SR, Wu CH, Hsieh JS, LuCY, Yu FJ, Huang TJ, Wang JY. Clinicalsignificance of MUC1 and c-Met RT-PCRdetection of circulating tumor cells in pa-

tients with gastric carcinoma. Clin ChimActa 2006; 367: 55-61.

39. Fujita S, Sugano K. Expression of c-metproto-oncogene in primary colorectal can-cer and liver metastases. Jpn J Clin Oncol1997; 27: 378-383.


298 Amemiya y col.

Incremento en la expresión del ARNm del receptor c-Met en...

Documents

Transcript of Incremento en la expresión del ARNm del receptor c-Met en...