INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Implicaciones Ambientales y Clínicas

de las biopelículas Formadas por

Helicobacter pylori

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO

PRESENTA:

MIGUEL ÁNGEL LOYOLA CRUZ

BAJO LA DIRECCIÓN DE:

DRA. ROSA MARÍA RIBAS JAIMES

MÉXICO, D.F. 2016

LUGAR DE REALIZACIÓN

El presente trabajo se realizó bajo la dirección de la Dra. Rosa María Ribas Jaimes, en el Laboratorio de Producción y Control de Biológicos, del Departamento Microbiología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, del Instituto Politécnico Nacional.

DEDICATORIAS

Esta tesis está dedicada principalmente a Dios y a mis padres. A Dios porque ha

estado conmigo a cada paso que doy, cuidándome y dándome fortaleza para continuar,

a mis padres Isabel y Marcos, quienes a lo largo de mi vida han velado por mi

bienestar y educación siendo mi apoyo en todo momento, dedicada a mis amigos

Cristian, Alan, Claudia Berenice, y a mi novia Claudia, ellos depositaron su entera

confianza en cada reto que se me presentaba sin dudar ni un solo momento de mí,

dándome su mano cada vez que lo necesité, quiero agradecer a mi ángel que ha

cuidado a mi familia todos estos años, mi querida abuelita, gracias por siempre estar

velando por nosotros.

Aunque ya no estás en el mundo terrenal, sé que me ves y estas orgulloso, gracias por

los consejos que me diste, gracias por compartir tu estancia terrenal conmigo, no dudo

que nos volveremos a encontrar, gracias Vic.

AGRADECIMIENTOS

Estoy sumamente agradecido con mi directora de tesis la Doctora Rosa María Ribas

Jaimes por todo el apoyo que me brindó, por abrirme la puerta de su laboratorio, por

darme la mano y un abrazo cuando más lo necesité.

Quiero agradecer a Claudia García Ibarra por estar siempre en estos 5 años,

apoyándome en los buenos y en los malos momentos, gracias por las risas y por todo

tu apoyo incondicional, no lo hubiera logrado sin ti.

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ÍNDICE

Índice I Índice de Tablas ii Índice de Figuras ii Resumen iii I Introducción 1.1 Historia de Helicobacter pylori 1 1.2 Género Helicobacter 3 1.3 Características microbiológicas 3 1.3.1 Condiciones de cultivo y morfología colonial 3 1.3.2 Morfología microscópica 3 1.3.3 Pruebas bioquímicas 4 1.4 Factores de virulencia 5 1.5 Patogénesis 11 1.6 Principales enfermedades relacionadas a Helicobacter pylori 12 1.7 Epidemiología 14 1.8 Diagnóstico 15 1.9 Tratamiento 17 II Justificación 19 III Objetivo general 20 IV Biopelícula 4.1 Generalidades de biopelícula 21 4.2 Etapas de formación de una biopelícula 21 4.3 Regulación del proceso de formación de una biopelícula 22 4.4 Factores que afectan la formación de biopelícula 24 4.5 Métodos de estudio 28 4.6 Importancia en salud pública 28 V Biopelícula de Helicobacter pylori 5.1 Reservorio y transmisión 29 5.2 Formación in vitro de biopelícula por Helicobacter pylori 30 5.3 Formación in vivo de biopelícula por Helicobacter pylori 32 5.4 Quorum-sensing de Helycobacter pylori 33 5.5 Efecto de la biopelìcula en la susceptibilidad a antimicrobianos 34 5.6 Agentes anti-biopelícula 35 VI Conclusiones 37 VII Referencias 38

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ii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Pruebas bioquímicas para la identificación de Helicobacter pylori 5 Tabla 2 Variables en la Adherencia y crecimiento de las biopelículas. 24

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Micrografía electrónica de Helicobacter pylori 4 Figura 2 Prevalencia de Helicobacter pylori en el mundo 15 Figura 3 Etapas de formación de una biopelícula 21

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RESUMEN

Helicobacter pylori es una bacteria Gram negativa que coloniza el epitelio gástrico y es uno de los agentes infecciosos más comunes. Se estima que en el mundo, el 50% de la población está infectada con este microorganismo, llegando a alcanzar más del 90% de incidencia en países subdesarrollados. La infección por H. pylori puede persistir de por vida y se ha implicado como agente etiológico de gastritis crónica activa, úlcera péptica, adenocarcinoma gástrico y a linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas (MALT). Aunado a lo anterior, la Organización Mundial de la Salud en 1994 lo incluyó en el Grupo I de carcinógenos para los seres humanos. El objetivo de este trabajo fue establecer la importancia, génesis e impacto de la formación de biopelículas por H. pylori en el medio ambiente y en el ámbito clínico, Se realizó una búsqueda en bancos de información biológica y científica relacionada con la implicaciones ambientales y clínicas de las biopelículas formadas por H. pylori, tales como: PubMed (National Library of Medicine, NIH, USA), páginas Web de los CDC y OMS y otra información científica de relevancia y alto impacto. Las publicaciones consultadas para este trabajo fueron hasta octubre de 2015.

Las biopelículas bacterianas son comunidades de microorganismos adheridos a una superficie y son ubicuas en la naturaleza. H. pylori forma biopelículas en superficies bióticas y abióticas. Se ha comprobado que H. pylori se encuentra en los sistemas de distribución de agua, ríos, pozos y el mar, formando biopelículas con otras especies bacterianas, lo que hace pensar que el agua pudiera ser uno de los principales reservorios de esta bacteria y una importante fuente de infección para el ser humano. En el estómago, H. pylori forma biopelículas en la mucosa gástrica, lo que explica en parte la falla terapéutica. Por medio de estudios in vitro se ha demostrado que estas biopelículas aumentan la resistencia a antibióticos y que en éstas se generan más mutaciones relacionadas con resistencia a antibióticos que en las células planctónicas.

El presente estudio integra y analiza los estudios e información científica sobre la formación de biopelículas por H. pylori, en particular las que están presentes en el medio ambiente y en el ámbito clínico, estableciendo sus implicaciones y relevancia, lo cual nos permite proponer medidas de control para enfrentar esta problemática.

1

I. INTRODUCCIÓN

1.1 Historia de Helicobacter pylori

Las primeras descripciones de bacterias en el epitelio gástrico se remontan a finales

del siglo XIX, habiendo sido descritas en estómagos de perros y gatos. Salomon buscó

bacterias en muestras de estómagos humanos donde también las observó (Salomon, 1896). Jaworski fue el primero que sugirió que la enfermedad gástrica podía deberse a

un patógeno (Konturek, 2003). Doenges realizó el primer estudio sistemático en busca

de las bacterias helicoidales en estómagos humanos (Doenges, 1938). Un año más

tarde, Freedberg y Berron consiguieron relacionar estos microorganismos con las

úlceras gástricas, observando este tipo de bacterias helicoidales en un porcentaje

similar de muestras que poseían patología gástrica (Freedberg y Barron, 1940). En el

año 1954 Palmer realizó un meticuloso estudió en más de 1100 biopsias gástricas y no

encontró evidencia de bacterias espirales en ninguna de ellas (Palmer, 1954), Gracias

a esto, la idea de que el estómago era un órgano estéril y que las bacterias vistas en

biopsias eran fruto de la contaminación microbiana, refutaron la idea de que estas

patologías eran causadas por un agente patógeno.

Pasaron más de 20 años para que se volviera a sugerir la posibilidad de que la

infiltración leucocitaria en la enfermedad ulcerosa se debía a una bacteria. Steer en

1975, al estudiar muestras de pacientes con úlcera gástrica, observaron con

microscopía electrónica la existencia de microorganismos espirales en la mucosa

gástrica asociados a respuesta inflamatoria (Steer, 1975), posterior a este año los

investigadores Marshall, Warren y Goodwin comenzaron sus experimentos. Un hecho

relevante fue que por primera vez y tras varios intentos fallidos lograron cultivar a la

bacteria helicoidal de biopsias de antro gástrico siguiendo la metodología descrita por

Skirrow para el aislamiento de Campylobacter spp (Skirrow, 1977); se logró esto

mediante una incubación por siete días y no por 48 horas como lo había propuesto

Skirrow.

Las múltiples infecciones bacterianas se comenzaron a describir en el siglo XX, el

descubrimiento de Helicobacter como bacteria de gran importancia en medicina, se dio

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en los años ochenta, cuando los investigadores Marshall y Warren iniciaron un estudio

prospectivo en pacientes que acudían a consulta para ser sometidos a endoscopia oral.

En ese trabajo, realizado en el Royal Perth Hospital de Australia, lograron visualizar

bacterias en la superficie de la mucosa gástrica en el 98 % de las gastritis crónicas y

en el 80 % de los pacientes con úlcera gástrica, utilizando la tinción de plata de

Warthin-Starry (Warren y Marshall, 1983). Uno de los hechos históricos fue que

Marshall para demostrar la patogenicidad de la bacteria, se autoinfectó ingiriendo una

cepa cultivada y obtenida de un paciente de 66 años con diagnóstico de dispepsia no

ulcerosa. A las dos semanas presentó la misma sintomatología manifestada por crisis

de dolor epigástrico, náuseas y vómitos, se le realizó una endoscopia y en las biopsias

de su propia mucosa gástrica se identificaron los bacilos. En una de sus publicaciones

se describe que curó espontáneamente (Marshall y col., 1985).

En un principio Marshall sugirió que podrían pertenecer al género Spirillum

proponiendo posteriormente el nombre formal de Campylobacter pyloridis siendo

revisado en 1987 para adaptarse a las formas gramaticales latinas correctas y

apareciendo en las publicaciones científicas como Campylobacter pylori (Marshall, 1987). Ese mismo año Marshall demostró que dicho microorganismo cumple los

postulados de Koch ya que ingirió al microorganismo, induciéndose una gastritis, hecho

Repetido por Morris y Nicholson (Morris y Nicholson, 1987). Posteriormente estudios

de secuenciación de la región 16S del RNA ribosómico demostraron que la especie

denominada Campylobacter pylori era distinta a las otras especies de Campylobacter

previamente descritas. En 1989 se adoptó la nueva denominación de Helicobacter,

denominándose Helicobacter pylori (Goodwin, 1989).

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1.2 Género Helicobacter

El género Helicobacter pertenece a la clase Epsilobacteria del

orden Campylobacterales, de la división Proteobacteria (Cavalier-Smith, 2002). El

género fue propuesto por primera vez en 1989 e incluyó a las especies Helicobacter

pylori y Helicobacter mustelae. Una subsecuente revisión incluyó dentro del género a

Helicobacter cinaedi y Helicobacter fennelliae (Amieva y El-Omar, 2008).

1.3 Características microbiológicas.

1.3.1 Condiciones de cultivo y morfología colonial

La temperatura óptima de crecimiento para Helicobacter pylori es a 37 ºC, aunque

puede desarrollarse en un intervalo de 35 a 39 ºC en microaerofilia, para el cultivo se

necesitan medios suplementados con suero o sangre entre el 5% y 10%. Las especies

de Helicobacter son quimioorganotrofas y tienen un metabolismo respiratorio

(Mégraud, 1995). La morfología colonial de H. pylori son colonias pequeñas,

grisáceas y brillantes de aproximadamente 1 mm de diámetro (Van der Hulst y col., 1996).

1.3.2 Morfología microscópica

H. pylori es un bacilo Gram negativo, que se encuentra en la mucosa gástrica del

estómago humano. Tiene una morfología espiral; sin embargo, en cultivos viejos puede

perder esa forma y cambiar a forma cocoide, Presenta un tamaño de 0.5 a 1.0 µm de

ancho y de 3 µm de largo. Presenta de 2 a 6 flagelos monopolares, como se observa

en la Figura 1 (Amieva, 2008).

4

Figura 1. Micrografía electrónica. Helicobacter pylori. Aislado a partir de una biopsia de antro gástrico

de un paciente con gastritis crónica. Tinción negativa con ácido fosfotúngstico, mostrando una bacteria

curva, con extremos romos y en uno de los cuales se observan tres flagelos (Rivas y Hernandez, 2000).

1.3.3 Pruebas bioquímicas

H. pylori utiliza la glucosa mediante un metabolismo oxidativo. No hidroliza gelatina,

almidón, caseína o tirosina. Las pruebas bioquímicas, rojo de metilo y Voges-

Proskauer, son negativas, la actividad de oxidasa, ureasa y catalasa es positiva

(Tabla1). Esta bacteria presenta una gran variabilidad antigénica, debido a que existen

muchos genes que codifican proteínas de membrana (Mégraud, 1995).

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Tabla 1. Pruebas Bioquímicas para la identificación de Helicobacter pylori

Prueba Resultado

Oxidasa + Catalasa + Ureasa +

Fosfatasa alcalina + Hidrólisis del hipurato -

Reducción nitratos - Producción H2S -

Crecimiento microaerofilico

25ºC

37ºC

42ºC

-

+

-

Crecimiento aerofílico a 37ºC -

Suceptibilidad del ácido nalidíxico Resistente Suceptibilidad a la cefalotina Sensible

(Garza y col., 1995)

1.4 Factores de virulencia

La infección por H. pylori origina gastritis crónica; sin embargo, las complicaciones

principales son úlcera péptica, adenocarcinoma y linfoma gástrico que se desarrollan

solo en un porcentaje mínimo de personas infectadas, predominantemente en

hospederos adultos. Uno de los retos de la investigación de H. pylori es la identificación

de los factores de virulencia predictivos de la progresión de la infección. Se han

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propuesto varios de ellos, aunque estos se han asociado con un mayor riesgo de

enfermedad ulcerosa péptica, adenocarcinoma gástrico o linfoma tipo MALT, ninguno

de ellos implica por sí mismo el desarrollo de una enfermedad en concreto. Esta

asociación aumenta cuantos más factores de virulencia acumula una bacteria (Wen y Moss, 2009).

Los factores de virulencia son estructuras o moléculas que contribuyen para generar

estrategias para la supervivencia de un microrganismo en su hospedero. H. pylori

origina una fuerte respuesta inmune, humoral y celular en la mucosa gástrica; con lo

cual se producen daños por la respuesta inmune celular en el epitelio gástrico. Una

vez que se inicia la colonización, H. pylori libera moléculas que estimulan la respuesta

inmunológica donde participan principalmente neutrófilos, siguiente a esto se produce

una amplificación de la respuesta inflamatoria por la acción de linfocitos, neutrófilos,

macrófagos, células mastoides y por la cantidad de mediadores químicos secretados.

La ulcera péptica, el adenocarcinoma y el linfoma gástrico son complicaciones de esta

inflamación crónica (Allen, 2008).

H. pylori posee factores de virulencia que ayudan a la colonización del epitelio gástrico

principalmente:

UREASA: la ureasa es la enzima más importante producida por H. pylori y su actividad

depende del pH alrededor de la bacteria. Es una metaloenzima que produce la

hidrólisis de la urea presente en el estómago formándose amonio y dióxido de carbono.

El amonio producido aumenta el pH, elevándolo hasta 6 o 7 en el entorno del

microrganismo, de este modo la bacteria se protege en el recorrido hacia el epitelio

gástrico, donde el pH es prácticamente neutro. La ureasa se regula puesto que un

aumento excesivo de la alcalinidad debida al ion amonio mataría a la bacteria. La

regulación se produce mediante un transportador dependiente de pH. UreI el cual

permite la entrada de urea pero una vez que el pH alcanza el valor de 6-7, se inactiva.

El amonio liberado va a producir una serie de daños que afectan a la microcirculación y

a las células epiteliales superficiales, origina una necrosis del tejido profundo; colabora

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en el desarrollo de gastritis atrófica crónica humana y facilita el incremento de

infecciones virales y la carcinogénesis (Bauerfeind y col, 1997).

SISTEMAS ANTIOXIDANTES: H. pylori es una bacteria microaerofílica, durante el

proceso de colonización H. pylori origina una fuerte respuesta inflamatoria mediada por

neutrófilos y macrófagos, que generan una cantidad de metabolitos reactivos del

oxígeno, H. pylori cuenta con mecanismos para la detoxificación de estos metabolitos,

así como para la reparación de los daños sufridos que favorecen su supervivencia en el

tejido inflamado (Long y col, 2009).

Entre los sistemas enzimáticos de detoxificación de los metabolitos reactivos del

oxígeno están la enzima superóxido dismutasa, que cataliza la transformación del

superóxido en peróxido de hidrogeno; la catalasa o peroxidasa, que cataliza la

descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno; las peroxirredoxinas,

que catalizan la reducción de peróxido de hidrógeno, peroxinitrito y otros

hidroperóxidos orgánicos a sus correspondientes alcoholes y la flavo proteína MdaB,

una NADPH quinona reductasa, que H. pylori expresa cuando debe compensar la

pérdida de los principales componentes antioxidantes.

La proteína NAP (neutrophil-activating protein), es codificada por el gen napA, tiene la

función de captar los iones ferrosos libres intracelulares que pueden dañar el DNA de

H. pylori y la protege del estrés oxidativo. Puede actuar como adhesina cuando se

secreta o se expresa en la superficie bacteriana pues tiene afinidad por las ceramidas

presentes en las membranas plasmáticas celulares y por el grupo antigénico sanguíneo

de Lewis (Long y col, 2009).

FLAGELOS: la movilidad de estas bacterias es fundamental para colonizar la mucosa

gástrica, H. pylori posee alrededor de 2 a 6 flagelos monopolares, una característica

inusual que es distinta del resto de proteínas flagelares, las cuales son homo

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poliméricas es que cada flagelo está compuesto por dos flagelinas, FlaA y FlaB. FlaB

se localiza en la base del flagelo, mientras que la más abundante FlaA, se encuentra

en el exterior, otra característica importante es que la morfología espiral o helicoidal

facilita la movilidad bacteriana en la mucosa gástrica.

CITOTOXINA VacA (vacuolating citotoxin): la proteína VacA es una toxina codificada

por el gen vacA, que induce vacuolización en las células epiteliales, la muerte celular y

la destrucción de la integridad epitelial. Posee una estructura hexamérica y se

ensambla en la bicapa lipídica celular del hospedador formando un canal selectivo de

aniones. Produce un gradiente de pH que atrae sustancias alcalinas al interior haciendo

que se capte agua por ósmosis, lo que origina una vacuolización alrededor del núcleo y

más tarde el estallido y muerte celular. En el citosol interfiere con el tráfico vesicular de

los lisosomas. Es producida por aproximadamente el 50% de las cepas de H. pylori. La

infección por cepas que producen la toxina es más frecuente en pacientes con úlcera

peptídica y cáncer gástrico que en pacientes que sólo padecen gastritis (Yamazadi y col., 2005).

CITOTOXINA CagA (cytotoxin-associated gene A): la presencia del gen cagA se asocia

más con síntomas graves, como la gastritis severa, la atrofia de la mucosa, alto riesgo

de úlcera y cáncer gástrico (Chromvarin 2008). Las cepas procedentes de pacientes

con úlcera, son CagA positivas en un porcentaje mayor que las cepas procedentes de

pacientes con gastritis (Erzin y col., 2006; Chiarini y col., 2009).

El gen forma parte de la isla de patogenicidad Cag (cagPAI). Las islas de patogenicidad

son segmentos de DNA que contienen más de un gen de virulencia. Tienen un papel

fundamental en la contribución a la virulencia de las bacterias patógenas que los

contienen y en el desarrollo de la enfermedad. Como muchos genes de virulencia los

genes de la cagPAI no se expresan constitutivamente, sino que responden a señales

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ambientales. están reguladas por complejos mecanismos que pueden activarse o no

dependiendo de condiciones microambientales como el nivel de oxígeno, la

osmolaridad, la fase de crecimiento bacteriano, el pH, presencia o no de ácidos grasos

volátiles de cadena corta, entre otras (Blaser y col., 1995).

La cagPAI de H. pylori codifica un sistema de secreción de proteínas tipo IV que

inyecta CagA y peptidoglicanos en las células epiteliales del hospedador. La

translocación de CagA depende de la presencia de un canal de urea protón

dependiente de UreI. Ante un descenso de pH, CagA se mueve del centro a la porción

periférica del citoplasma. La proteína inyectada interactúa con un número elevado de

moléculas de la célula hospedadora. La diana molecular de CagA más estudiada es

una fosfatasa SHP-2 (protein tyrosine phospatase). En el gen se han encontrado

mutaciones y polimorfismos que están relacionadas con la carcinogénesis gástrica

(Panayotopoulou y col., 2006).

ADHESINAS: H. pylori se une a las células blanco del huésped de forma específica

mediante adhesinas. Entre los receptores se encuentran los glicerofosfolípidos,

sulfátidos, componentes de la matriz extracelular y secuencias repetidas de N-acetil-

lactosamina o de glicoconjugados (Beswick y cols, 2006).

Se asume que dos mucinas gástricas (Muc5ac Y Muc1), componentes del moco, son

importantes en la protección contra la adhesión y progresión de la infección de H.

pylori. Las interacciones de la bacteria ocurren entre los carbohidratos antigénicos de

las mucinas y las adhesinas específicas de la superficie bacteriana (Radziejewska, 2012). Existen varias proteínas de la familia Hop que están involucradas en la

adherencia al epitelio gástrico, por ejemplo, BabA y SabA se unen a los antígenos

Lewis B-fucosilado y sialil Lewis X, respectivamente. Otras proteínas Hop como

HopV,HopW y HopX se ha reportado que funcionan como porinas (Loh y cols, 2008).

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HpaA (Helicobacter pylori adhesin A): Es una de las principales proteínas de la

membrana externa de H. pylori y, al igual que muchas de ellas actúan como adhesina.

Media la unión a glicoconjugados con el ácido siálido (N-acetil-neuraminil-lactosa)

presentes en la superficie de las células epiteliales gástricas y en la de los neutrófilos.

Está codificada por el gen hpaA. Es un antígeno de membrana que es reconocido por

los anticuerpos humanos por lo que puede ser usado en los ensayos serológicos y para

las vacunas. Se ha visto que es reconocida por las células presentadoras de antígeno

humanas estimulando la proliferación de los linfocitos T y B (Nvström y Svennerholm, 2007).

BabA (blood antigen binding adhesion): los antígenos de Lewis son antígenos

fucosilados de grupo sanguíneo (Wirth y col., 1999). Son expresados por los eritrocitos

y por células epiteliales humanas. H. pylori se une con la adhesina BabA a las células

epiteliales gástricas a través de los antígenos de Lewis (Wirth y col., 2006).

SabA (sialic acid binding adhesion): se une a los receptores con el ácido siálico de los

neutrófilos y origina la activación de su respuesta oxidativa (Unemo y col., 2005).

OipA (outer membrane inflammatory protein): todas las cepas poseen el gen que

codifica para esta adhesina, pero sólo algunas la expresan. Su expresión está asociada

a una mayor producción de IL-8, aunque no se sabe cuál es su contribución real a la

inflamación gástrica puesto que suele estar asociada a las cepas cagA positivo

(Yamaoka, 2008).

LIPOPOLISACÁRIDO (LPS): el LPS de H. pylori como el de otras especies

bacterianas, presenta una estructura de tres dominios principales: la capa polisacárida

externa o cadena específica O, el núcleo oligosacárido y el lípido A. La estructura

química del LPS de H. pylori, en concreto la cadena específica O, puede mimetizar los

antígenos de grupo sanguíneo de Lewis. Cuando esto sucede, se dice que son cepas

que expresan los antígenos de Lewis. La expresión está asociada a patologías más

severas. Algunos estudios muestran que cepas de H. pylori CagA+ los expresan más

frecuentemente .El lipopolisacárido de H. pylori es bastante inerte comparado con el de

otras bacterias Gram negativas, y puede explicar la capacidad que tiene el

11

microorganismo para evitar provocar una respuesta inmunológica eficaz del huésped.

No estimula la producción de IL-8 en cultivos celulares epiteliales sino sólo y

ligeramente en monocitos. Al inducir una baja respuesta inmunológica, la infección por

H. pylori puede persistir durante más tiempo que aquéllas causadas por bacterias más

agresivas, produciendo una infección crónica. El LPS de H. pylori puede afectar a la

integridad de la mucosa mediante la modulación de la actividad del pepsinógeno I en el

estómago. La pepsina producto del pepsinógeno es enzima proteolítica, posee una alta

capacidad mucolítica y puede ayudar a inducir ulceración duodenal. Se ha comprobado

que los niveles de pepsinógeno gástrico se correlacionan con los niveles de

pepsinógeno I sérico (componente endocrino del pepsinógeno secretado por las células

principales). Además los niveles de pepsinógeno I caen tras la erradicación de H. pylori

(Salaun y Saunders, 2006).

BIOPELICULA: Las biopelículas están presentes en todas partes y afectan todos los

aspectos de nuestra vida. A nivel clínico, se asocian con neumonía nosocomial,

infecciones del tracto urinario, infecciones supurativas, infecciones del sistema nervioso

central, sepsis bacteriana etc. (Brelles Mariño, 2012; Binkowskawa et al. 2013), se

ha demostrado que H. pylori forma biopelícula in vivo e in vitro, con lo cual se relaciona

con la resistencia al tratamiento y con la fuente de infección hacia el ser humano.

1.5 Patogénesis

H. pylori coloniza la mucosa gástrica, debido a sus factores de virulencia que le

permiten entrar dentro de la mucosa, y atacar a las células epiteliales, evadir la

respuesta inmune y como resultado de esto origina la colonización del epitelio gástrico.

La supervivencia del H. pylori en la mucosa gástrica se lleva a cabo gracias a estos

factores de patogenicidad los cuales son: las adhesinas, que permiten la adhesión a las

células blanco, éstas impiden que la bacteria pueda ser arrastrada por el peristaltismo,

la actividad ciliar o el recambio epitelial; enzimas bacterianas, como la ureasa, que

transforma la urea en amonio, produciendo un microclima alcalino que lo protege de la

acidez gástrica en el recorrido hacia la mucosa, lipasas y proteasas que propician la

desintegración del moco gástrico y la pérdida de la hidrofobicidad de la mucosa

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disminuyendo la capacidad de las células mucosas para secretar moco, catalasa y

superóxido dismutasa como línea de defensa ante polimorfonucleares activados

(Samitier y col., 2000).

H. pylori causa una continua inflamación de la mucosa gástrica. La respuesta

inflamatoria inicialmente consiste en la infiltración de neutrófilos, seguidos por linfocitos

T y B, células plasmáticas, y macrófagos. También participan moléculas del complejo

mayor de histocompatibilidad que inducen la apoptosis de las células epiteliales. Los

genes de esta bacteria inducen la formación de IL-8 y otras quimiocinas que atraen a

los neutrófilos, también está involucrado el factor de necrosis tumoral α y la IL-1 β y el

interferón γ, incrementan la liberación de gastrina y de este modo inducen la

producción de la secreción ácida, y además el factor de necrosis tumoral produce una

disminución del número de células antrales. La infección aguda causa hipoclorhidria

transitoria y se diagnostica raramente. La gastritis crónica se desarrollará en todas las

personas persistentemente colonizadas, pero 80% a 90% nunca tendrán síntomas. El

curso clínico posterior es altamente variable y depende de factores bacterianos y del

huésped. Los pacientes con una secreción ácida elevada son más propensos de tener

gastritis antral preferentemente, que los predispone a las úlceras duodenales. Los

pacientes con una secreción ácida disminuida, generalmente desarrollan gastritis en el

cuerpo del estómago, que los predispone a la úlcera gástrica y puede iniciar una

secuencia de eventos que, en casos raros, conducen al carcinoma gástrico. La

infección de H. pylori induce la formación del tejido linfoide mucosa-asociado en la

mucosa gástrica. La relación causal entre esta infección y la úlcera gástrica o duodenal

ha sido demostrada por la influencia favorable de la erradicación del H. pylori en la

evolución de la enfermedad ulcerosa (Suerbaum, 2002).

1.6 Principales enfermedades relacionadas con Helicobacter pylori

Una vez que H. pylori coloniza la mucosa gástrica humana produce una gastritis

superficial que puede permanecer así durante el resto de la vida o bien, al cabo de

cierto tiempo se puede desarrollar úlcera péptica o una gastritis atrófica que podría ser

el primer paso para la evolución a cáncer gástrico (Marshall y col., 1984).

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GASTRITIS: la gastritis que se origina después de la infección por H. pylori puede

desarrollarse sin manifestaciones o bien originar la expresión clínica propia de gastritis

aguda (dolor epigástrico, náuseas y vómitos). La gastritis crónica se caracteriza por

infiltración inflamatoria crónica, constituida por linfocitos y células plasmáticas, con

presencia de folículos linfoides y un grado variable de actividad. La gastritis crónica por

H. pylori es un proceso dinámico que evoluciona hacia la atrofia que afecta al antro y se

extiende en dirección al cuerpo (Suerbaum y Michetti, 2002).

ÚLCERA PÉPTICA: la asociación de H. pylori con la úlcera duodenal es clara, ya que

de un 90 a 95% de los pacientes que presentan el microorganismo, se curan en su

gran mayoría al erradicar la bacteria. Con respecto a la úlcera gástrica, también existe

una clara relación, aunque sólo un 70% de este tipo de úlceras está asociada a la

presencia de H. pylori, el resto se asocian al consumo de antiinflamatorios no

esteroideos. La úlcera gástrica o duodenal relacionada con la infección por H. pylori es

muy poco frecuente en la edad pediátrica contrario a lo que ocurre en el adulto

(Figueiredo y col., 2005).

CÁNCER GÁSTRICO: la infección por H. pylori origina una gastritis superficial, de

forma crónica puede dar lugar a una atrofia gástrica, la cual es una condición

precancerosa. En 1994 la Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer de la

Organización Mundial de la Salud incluyó a H. pylori como agente biológico

carcinogénico para el hombre (categoría 1) basándose en evidencias epidemiológicas

que le asocian con cáncer gástrico (Trajkow y col., 2007).

LINFOMA GÁSTRICO TIPO MALT: el 90% de los pacientes con linfoma MALT son

positivos para H. pylori. Este tipo de linfoma se localiza preferentemente en el antro del

estómago, dado que es la zona donde existe más tejido linfoide. Además, varios

estudios apoyan la asociación de H. pylori con esta enfermedad puesto que tras la

erradicación de la bacteria se ha observado la regresión del linfoma de bajo grado

(Toshiro y col., 2004).

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1.7 Epidemiologia

Cuando H. pylori infecta a su hospedero coloniza de manera crónica el epitelio

gástrico (Olivares y Gisbert, 2006). Actualmente se conoce que esta bacteria es la

responsable de la infección bacteriana crónica gastrointestinal más común en todo el

mundo, la prevalencia mundial está estimada por arriba del 50% (Palacios-Espinoza y col., 2011), los países en vías de desarrollo presentan un 80% de prevalencia,

asociándose esta infección con el nivel económico y sociocultural de su población

(Rivas y Hernández., 2000).

En 2009 se realizó un estudio serológico de prevalencia de H. pylori en México, en

más de 11,000 pacientes de 1 a 90 años provenientes de todos los estados de la

república, se realizaron las pruebas serológicas, para detectar los anticuerpos IgM

contra H. pylori mediante la técnica de ELISA, el 20% de los resultados fueron positivos

para los niños menores a 1 año, en niños de 10 años se presentó el 50% y en

individuos mayores de 25 años el 80%. También se evaluó la mortalidad, se observó

que era alta debido al cáncer gástrico en el centro, norte y sur de la República

Mexicana.Aunque la prevalencia de H. pylori es alta, solo se reporta que entre 10% y

20% de los casos desarrollan sintomatología, el17% úlcera gástrica, 4% presentan

complicaciones de ùlcera y solo el 1% desarrolla cáncer gástrico (Serrano y col., 2009).

El ser humano es el huésped definitivo de H. pylori, la infección se adquiere los

primeros años de vida y se relaciona con la localización geográfica (Kusters y col., 2006). La evolución de la infección es variable, la mayoría de los individuos infectados

permanecen asintomáticos y solo del 10% al 20% progresa a gastritis atrófica

(Fuentes-Panana y col., 2009).

En países desarrollados la prevalencia (figura 2) de H. pylori es variable puede ir desde

1.2% a 12.2% en población general, es baja en niños, adolescentes y alta en adultos,

personas de edad avanzada. (Rajindrajith y col., 2009).

15

Figura 2. Prevalencia de Helicobacter pylori en el mundo. Porcentajes de prevalencia de H. pylori en

el mundo. (Azevedo y col., 2007).

En México, las ulceras, la gastritis y la duodenitis son de notificación obligatoria, en el

boletín de epidemiología del 2015 se reportaron 1,428.661 casos; 508,625 en hombres

y 920,036 en mujeres. En el anuario de epidemiologia del 2014 se reportaron

1,497,802; 968,166 en la población femenina y 529,636 en la población masculina, las

edades reportadas fueron de los 0 hasta los 65 años presentándose casos en todas las

edades, pero teniendo un mayor número de casos de los 25 a los 50 años, cabe

resaltar que no se describe la etiología.

1.8 Diagnóstico

Las técnicas empleadas para el diagnóstico de H. pylori se pueden dividir en 2 grupos:

técnicas invasivas (biopsias gástricas a partir de la cual se realizan, tinciones

histológicas, pruebas de ureasa en cultivo y la reacción en cadena de la polimerasa) y

técnicas no invasivas (la prueba del aliento, serología y detección de antígenos en

heces) (Gatta y col., 2003). Las técnicas invasivas son muy útiles porque permiten

detectar directamente la bacteria y, por tanto, son altamente específicas, pero su

sensibilidad está muchas veces comprometida por la heterogénea distribución de la

16

bacteria en el estómago (Bayerdorffer y col.,1989). Lo que conlleva a obtener falsos

negativos. Por otra parte, las técnicas no invasivas poseen buena sensibilidad, pero es

la especificidad la que resulta en ocasiones comprometida, en algunas de ellas se

obtienen falsos positivos.

Técnicas no invasivas:

1. Serología: la resolución espontánea de la infección por H. pylori parece ser un

evento muy poco frecuente. Mediante ELISA se detectan IgG o IgA dirigidas contra

varios antígenos específicos del H. pylori. La sensibilidad y especificidad superan el

90% y la erradicación de H. pylori se asocia a una lenta pero progresiva caída en los

títulos, de modo que la mayoría de las pruebas serán negativas seis meses o un año

después de una erradicación efectiva. La reinfección se asocia a una nueva elevación

de los títulos. Helico Blot 2.1 Kit, es un test serológico cualitativo usado para detectar

anticuerpos de tipo IgG para antígenos específicos del H. pylori (Lu y col., 2006; Ford y col., 2005).

2. Pruebas de aliento (Breath Test): utilizando C 13 no radiactivo o C 14, que puede ser

leído en un contador de centelleo, se detecta la descomposición, por la ureasa de H.

pylori, de la urea marcada ingerida por el paciente. La sensibilidad y la especificidad

son comparables a la serología, con la ventaja de poder confirmar la erradicación

cuatro semanas después de terminada la terapia, sin necesidad de repetir la

endoscopía (Lu y col., 2006; Ford y col., 2005).

Técnicas invasivas:

1. Prueba de ureasa en biopsia antral: constituye el método más rápido y práctico

para detectar a H. pylori en pacientes sometidos a endoscopía. La ureasa

producida por H. pylori convierte la urea a amonio y CO2, lo que modifica el pH

17

del medio y provoca el cambio de color que define la reacción como positiva. Su

sensibilidad y especificidad son comparables a las de los métodos anteriores. Un

problema adicional lo constituye la posibilidad de falsos positivos debido a

pinzas de biopsia o endoscopios contaminados.

2. Histopatología: constituye el estándar de oro para definir la presencia o ausencia

de H. pylori, tiñendo la muestra con Giemsa. Debe tomarse la muestra en

mucosa antral, evitando la región prepilórica y la parte más baja de la curva

menor. Es de utilidad en el diagnóstico inicial.

3. Cultivo: actualmente no tiene un papel importante en el diagnóstico, debido a su

lentitud y a que en muchos laboratorios su sensibilidad es menor que la de la

histología, aunque es útil en pacientes en los que el tratamiento no ha logrado

erradicación, para evaluar la sensibilidad a los-antimicrobianos-y-orientar-la-

terapia-posterior.

4. PCR (polymerase chain reaction): por su sensibilidad y especificidad podría

transformarse en el método estándar futuro, aunque la ubicuidad de H. pylori

puede generar problemas por falsos positivos. La posibilidad de estudiar

diversos tipos de muestras, incluyendo tejido fijado en parafina, le abre

importantes perspectivas en estudios retrospectivos y prospectivos (Lu y col., 2006; Ford y col., 2005).

1.9 Tratamiento

En pacientes con úlcera péptica asociada a H. pylori positivo, el microorganismo se

debe erradicar para ayudar en la curación y también para reducir el riesgo de

recurrencia de la úlcera duodenal o gástrica (Fendrick y col., 2005). El tratamiento se compone de:

• Una dosis estándar de un inhibidor de la bomba de protones, cada 12 h.

• Claritromicina, 500mg cada 12 h, vía oral.

18

• Amoxicilina 1 g cada 12 h vía oral (o metronidazol 500 mg cada 12 h, en caso de

alergia a la penicilina) (Malfertheiner y col., 2007).

El tratamiento de segunda línea para la erradicación del H. pylori puede basarse en

terapias que contienen bismuto:

Terapia cuádruple por 7 a 14 días: Inhibidor de bomba de protones (cada 12 h),

Bismuto (120 mg cada 6 h), Metronidazol (250 mg cada 6 h), Tetraciclina (500 mg cada

6 h) (Calvet y col., 2000).

19

II. JUSTIFICACIÒN

Las biopelículas son agregados microbianos compuestas por una o diferentes géneros de microoganismos , están compuestas de agua y una sustancia llamada matriz extracelular, que ayuda a delimitar el interior de la biopelícula del exterior, ayuda a la obtención de nutrientes y a la protección a factores que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos que la conforman. Son una de las formas que tienen las bacterias para sobrevivir en diferentes ambientes. Están presentes en superficies inertes o tejidos vivos y son uno de los factores que provocan que los microorganismos causen enfermedades, ya que la formación de éstas permite la supervivencia de ellos en ambientes difíciles, su propagación para la formación de nuevas biopelículas, así como su protección hacia diversos factores, Los microorganismos del género Helicobacter pueden formar biopelículas tanto in vitro como in vivo y su hallazgo en sistemas de distribución de agua hace pensar que el agua pudiera ser un reservorio natural. Aunado a esto, la evidencia de la formación in vivo de biopelículas asociadas a H. pylori demuestra la relevancia de su estudio para conocer mejor la historia natural de la enfermedad, la patogénesis de la enfermedad y la repercusión de la formación de biopelículas en los programas de desinfección, análisis de brotes y en el tratamiento contra este patógeno.

20

III. OBJETIVO GENERAL

Realizar una revisión bibliográfica acerca del impacto y la importancia que tienen las biopelìculas de Helicobacter pylori, estableciendo la importancia, génesis e impacto de la formación de las mismas en el medio ambiente y en el ámbito clínico.

21

IV.BIOPELÍCULAS

4.1 Generalidades de biopelículas

Las biopelículas son comunidades microbianas que constituyen la forma más exitosa

de colonización de los diferentes microorganismos, están presentes en casi todo

ambiente y son una de los principales factores que provocan que los microorganismos

causen enfermedades, pueden estar adheridas a superficies inertes o a tejidos. Las

biopelículas están compuestas de agua, microorganismos y un exopolisacárido o matriz

extracelular (Hall-Stoodley y col., 2004).

4.2 Etapas de formación de una biopelícula

La formación de una biopelícula procede de varias etapas: a) adsorción reversible, b)

adsorción irreversible, c) formación de microcolonia d) maduración y e) disgregación

(figura3).

Figura 3. Etapas de la formación de una biopelícula. Se muestran las diferentes etapas que preceden

la formación de una biopelícula estas etapas son las siguientes: adsorción reversible, adsorción

irreversible, formación de la microcolonia, maduración, disgregación. (Rivera y col., 2010)

a) b) c) d) e)

22

Durante la fase de acondicionamiento de la formación de biopelículas, los

microorganismos libres se adsorben a una superficie de manera reversible, esta

interacción se da por fuerzas electrostáticas, una vez que este proceso se lleve a cabo

, lo siguiente es la adhesión en la cual están implicadas diversas estructuras tales

como: fimbrias, flagelos, pili sexual, en el caso de Gram negativas el lipopolisacárido y

en las Gram positivas que posean ácidos micólicos, una vez que se logra esta

adhesión mediada por las estructuras antes mencionadas, es de forma

irreversible (Bos y col.,1999). La expresión de estas estructuras microbianas puede

cambiar dependiendo del ambiente en que se encuentren. Las propiedades físico-

químicas de la superficie pueden ejercer gran influencia en el grado y extensión de la

adhesión, los microorganismos se adhieren más rápidamente a superficies hidrófobas,

no polarizadas como el teflón y plásticos, en comparación con materiales hidrofílicos

como el vidrio o el metal. Después de esta etapa, las células se dividen y colonizan la

superficie, cuando la concentración local de señales químicas producidas por el

metabolismo microbiano alcanza un umbral, se sugiere que la población microbiana ha

alcanzado una densidad mínima, esto trae como consecuencia el inicio de cambios

fenotípicos en la comunidad microbiana. Al proceso en el que una célula microbiana

percibe la proximidad de otras células y genera señales químicas que corresponden

con metabolitos secundarios, se le conoce como quorum sensing; este hecho trae

como respuesta la autoinducción en la síntesis de la matriz extracelular o

exopolisacárido y se logra así la maduración de la biopelícula. Finalmente, después de

la maduración, ocurre la dispersión por células aisladas o en conglomerados que

colonizan nuevas superficies y se inicia un nuevo ciclo de formación de biopelícula

(Ladd y Costerton, 1990).

4.3 Regulación del proceso de formación de una biopelícula

Numerosas evidencias experimentales sugieren que el proceso de formación de una

biopelícula está regulado por una compleja cascada de reguladores. Estudios

realizados con Pseudomonas aeruginosa han demostrado que la formación de una

biopelícula está regulada por un proceso de quorum sensing o autoinducción. El

sistema de quorum sensing es un mecanismo de regulación dependiente de la

23

acumulación en el medio ambiente de una molécula señal, autoinductor, que permite a

la bacteria sentir la densidad de la población existente. En bacterias Gram negativas el

principal autoinductor es la acil-homoserina lactona, mientras que en bacterias Gram

positivas los autoinductores suelen ser de naturaleza peptídica. Cuando en el medio

extracelular se acumula una suficiente cantidad del autoinductor, éste activa un

receptor específico que altera la expresión de genes afectando a distintos fenotipos

(Donlan, 2002). En Staphylococcus aureus se ha descrito un péptido denominado RIP,

que interactúa con el sistema de quorum sensing inhibiendo el proceso de formación de

la biopelícula (Lasa y col., 2009). Además del quorum sensing, otros reguladores

globales como CsrA en Escherichia coli y CytR en Vibrio cholerae, son determinantes

importantes para el desarrollo de la biopelícula de estas bacterias (Donlan, 2002). En

S. aureus se ha demostrado que un regulador global de virulencia denominado SarA es

esencial para el desarrollo de la biopelícula. Así, existen reguladores de virulencia que

son a su vez reguladores de la formación de la biopelícula sirviendo de conexión entre

ambos procesos (Lasa y col., 2009). Además de la regulación a nivel transcripcional,

existen numerosos indicios de la existencia de una regulación postranscripcional del

proceso de formación de la biopelícula. En V. cholerae, Yersinia pestis, Pseudomonas

fluorescens y Gluconacetobacter xylinum, también se han descrito proteínas con

dominio GGDEF implicadas en la formación de biopelícula, indicando que esta

molécula es un transmisor secundario de señal común al proceso de regulación de la

producción de exopolisacáridos en las bacterias (Lasa y col., 2009). Finalmente,

parece lógico que la formación de biopelícula se produzca en respuesta a las

condiciones ambientales y por tanto que existan sistemas de que transmitan la señal

ambiental al interior de la bacteria para adecuar la expresión de genes a la nueva

situación ambiental (Lasa y col., 2009).

Davey y O'Toole (2000) y Wimpenny y col (2000) describieron biopelículas que van

desde monocapas de células dispersas individuales, a los parches de células que se

intercalan a lo largo de 3 capas dimensionales

24

4.4 Factores que afectan la formación de biopelícula.

Existen varios factores que afectan al desarrollo de las biopelículas como son

(González, 2005) (Fuster i Vallsy col, 2006):

• Las propiedades de las superficies de contacto.

• El tiempo de contacto.

• Las características de la superficie bacteriana.

• La disponibilidad de nutrientes.

• La composición de la comunidad microbiana.

• La disponibilidad de agua.

Existen variables importantes que intervienen en el proceso de adherencia y

crecimiento de las biopelículas (Tabla 2).

. Tabla2. Variables en la Adherencia y crecimiento de las biopelículas.

Propiedades de la superficie

Propiedades del fluido

Propiedades de la bacteria

• Textura

• Hidrofobicidad

• Material

• Velocidad del flujo

• pH

• temperatura

• cationes presencia de

agentes antimicrobianos

• Hidrofobicidad de la superficie celular

• Fimbrias

• Flagelos

• Sustancias extracelulares poliméricas

1. Propiedades de las superficies de contacto El tipo de sustrato influye en las

características de la unión. Las bacterias tienden a unirse a las superficies hidrófilas

uniformemente en una capa, mientras que en el caso de las superficies hidrófobas

tienden a unirse en grupos (Fuster i Valls, 2006). En algunos trabajos se ha

demostrado que las bacterias quedan retenidas en las imperfecciones de las

superficies; además, las superficies rugosas son más difíciles de limpiar y acumulan

suciedad permitiendo que las bacterias vuelvan a multiplicarse (González, 2005). El

acero inoxidable se usa frecuentemente como material para la cocina y en las

25

instalaciones industriales porque es resistente a los golpes, a la corrosión, dura

mucho tiempo y es de sencilla fabricación, además de ser estable, inerte y de fácil

limpieza. A escala microscópica se observa, sin embargo, que el acero presenta

diminutas oquedades que permiten una mayor retención de bacterias por el

incremento del número de puntos de adhesión Boyd y colaboradores (2001)

demostraron que los niveles de higiene en las superficies de contacto podían verse

disminuidos con el uso y provocar que la superficie se deteriorase. Los defectos de

las superficies pueden actuar como puntos de retención de microorganismos y

materia orgánica. Las superficies rugosas acumulan suciedad y son de más difícil

limpieza que las lisas. En consecuencia, los defectos de las superficies proporcionan

protección a la suciedad y los microorganismos, lo que hace que las bacterias

supervivientes puedan volver a multiplicarse y formar una biopelícula (Fuster i Valls, 2006). Estudios realizados en botellas de agua mineral muestran que las superficies

lisas de las botellas de PET (polyethylene terephtalate) apenas eran colonizadas por

bacilos mientras que las superficies más rugosas e hidrofílicas del HPDE (High

Density Polyethylene) de los tapones eran pobladas por grupos de cocos

(Chmielewsky y Frank, 2003). Con respecto a las propiedades del líquido que fluye

sobre la superficie en la que se va a formar la biopelícula, cabe destacar que,

sorprendentemente, las bacterias forman biopelículas preferentemente en entornos

de alta turbulencia. Las células planctónicas pueden adherirse a superficies e iniciar

la formación de biopelícula en presencia de fuerzas de cizalladura que superan un

número de Reynolds 1 de 5.000. Los estudios de adherencia bacteriana han

demostrado que las biopelículas que se forman en entornos de baja turbulencia,

tienen una baja resistencia a la tracción y se rompen con facilidad, mientras que

aquellas formadas en entornos de flujo turbulento son más fuertes y resistentes a la

rotura mecánica (Donlan y Costerton, 2002). 2. Tiempo de contacto: Un mayor tiempo en contacto (exposición) entre las células

y la superficie permite que se establezca un mayor número de uniones haciendo la

adhesión irreversible, y por tanto, factores, como las condiciones ambientales, tipo

de microorganismo, sustrato y presión en el caso de superficies de trabajo o

26

utensilios, pueden también influir de manera importante en la mayor posibilidad de

formación de una biopelículas (Pérez-Rodríguez y col., 2008). 3. Características de la superficie celular: Las características de la superficie celular

como los flagelos, pili, proteínas de adhesión y cápsulas ejercen también su

influencia. Los pili actúan como un velcro para anclar las bacterias a algunas

superficies y también como quimiorreceptores, dirigiendo a la bacteria hacia a

algunos sitios específicos. La pérdida de estos apéndices cambia las propiedades de

superficie de la bacteria, lo que puede provocar una menor capacidad de adhesión.

También se conoce que las esporas se adhieren mejor a la superficie que las células

vegetativas debido al grado de hidrofobicidad de su superficie (González, 2005).

4. Disponibilidad de nutrientes: La disponibilidad de nutrientes ejerce una influencia

mayor sobre la estructura y composición de una biopelícula. Estudios realizados

sobre la biopelícula de Listeria spp. han puesto de manifiesto que niveles bajos de

fosfatos estimulan el desarrollo de ésta, aunque el efecto se reducía después de

varios días (kim y col.,1995). Asimismo su desarrollo depende también del tipo de

azúcar utilizado, en este estudio se modificó la fuente de carbono del medio siendo

la trehalosa y manosa las que proporcionan mayor formación de biopelícula

respecto a la glucosa después de 12 dias de incubación.

5. Composición y diversidad microbiana: Las biopelículas compuestas por

multiespecies son más gruesas y estables frente al estrés ambiental que las

compuestas por monoespecies. En una superficie, el grosor medio de las

biopelículas formadas por Klebsiella pneumoniae y P. aeruginosa monoespecie son

de 15 y 30 µm respectivamente, mientras que una formada por ambas especies

bacterianas es de un grosor de 40 µm (Kumar y Anand, 1998). Esto se atribuye a la

secreción combinada de las distintas sustancias poliméricas extracelulares

resultantes de los diferentes microorganismos (Chmielewsky y Frank, 2003). La mayoría de los estudios están focalizados hacia biopelículas en aguas y sistemas

de agua residuales. En una planta de procesado existen lugares como los desagües

27

del suelo que son proclives a la formación de biopelículas multiespecie debido a su

alta diversidad bacteriana y otras, como una placa de calor, propicias a la formación

de biopelículas monoespecies (Chmielewsky y Frank, 2003). Se ha observado la

asociación de varias especies patógenas, incluyendo Legionella pneumophila, S.

aureus, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp., E. coli O157:H7, V. cholerae y

H. pylori, en la formación de biopelículas multiespecie. A pesar de que todas ellas

son capaces de adherirse a una superficie y comenzar el crecimiento, la mayoría no

tiene capacidad por si sola de completar el desarrollo de la biopelícula. Cada vez se

tiene más la percepción de que las biopelículas son comunidades biológicas

heterogéneas que se adaptan a la evolución de las condiciones ambientales y a la

composición de la comunidad (Donlan, 2002).

6. Disponibilidad de agua La disponibilidad de agua es un factor crucial para la

formación de la biopelícula. Una humedad relativa en torno al 90-100% posibilita el

desarrollo de ésta, por ello la mayoría de las biopelículas se encuentran en

ambientes acuosos como pueden ser los sistemas de conducción o tuberías (Pérez-Rodríguez y col., 2008). Sin embargo, también se ha encontrado que valores en

torno al 70-80% pueden ser suficientes para permitir el desarrollo de una biopelícula

(Keskinen y col., 2008) indicando que ambientes con humedad relativa alta (por

ejemplo: aerosoles) pueden incrementar significativamente el riesgo de su aparición.

La temperatura es un factor también determinante y a la vez, relacionado con la

humedad relativa, ya que se ha observado que valores en el rango 20-30 ºC

incrementan la probabilidad de formación de una biopelícula, mientras que valores

por encima de este rango inciden negativamente sobre ese proceso (Else y col., 2003).

28

4.5 Métodos de estudio

Hay diversos métodos analíticos para estudiar las biopelículas, entre las cuales se

encuentran varios modelos específicos como: los catéteres en disco, tira de acrílico,

microplaca de titulación y biopelículas prefundidas, entre otros. Con estos modelos se

cuantifica y crecimiento del microorganismo mediante la evaluación de: peso seco,

incorporación de isótopos radiactivos, reducción de sal de tetrazolio XTT,

bioluminiscencia ATP, ensayos de lectinas ligadas a enzimas y el sistema LIVE/DEAD

BacLight, entre otros. Se pueden realizar estudios de ultraestructura microscópica,

como la electrónica de barrido, láser confocal de Raman que permiten ver en tercera

dimensión la formación de biopelículas (Bos, 1999).

4.6 Importancia en salud pública

En 2008 se reportaron en Estados Unidos 99,000 muertes al año y 1.7 millones de

procesos infecciosos; y en la Comunidad Europea se informaron 50,000 muertes al año

y 3 millones de pacientes con infecciones en las vías urinarias (32%), diversos sitios

infectados (22%), neumonías (15%) y septicemias (14%) todos asociados a

microorganismos formadores de biopelículas (Bryers,2008). En México aún no existen

reportes que permitan esta asociación. Se ha demostrado que una fuente de infección

importante son las nosocomiales, derivadas de catéteres contaminados por

biopelículas (Perencevich, 2003).

29

V. BIOPELÍCULAS FORMADAS POR Helicobacter pylori

5.1 Reservorio y transmisión

El mecanismo de transmisión de H. pylori es vía fecal-oral o iatrogénica (Gamboa, 2003); sin embargo se ha encontrado que H. pylori está presente en sistemas de

distribución de agua, en la superficie de pozos subterráneos, ríos y en sistemas de

aguas residuales lo que lleva a pensar también estos lugares proveen una vía de

infección (Cole y col., 2004). Los análisis moleculares confirman la presencia de H.

pylori en diversos entornos acuáticos esto sugiere que las fuentes de agua están

contaminadas con materia fecal humana (Brown, 2000). Por lo tanto, el agua potable

podría ser el reservorio principal para la infección en humanos (Bellack, 2006). Uno de

los principales problemas para aceptar que el agua podría ser un posible reservorio de

H. pylori es la incapacidad para aislar a la bacteria mediante el cultivo microbiológico

(Al-Sulami y col., 2010). Métodos moleculares, como la PCR (polymerase chain

reaction), son los más importantes para buscar H. pylori en agua, aunque una limitación

de esta técnica es la incapacidad de diferenciar con precisión entre células vivas y

muertas (Lu y col., 2002). Las nuevas técnicas analíticas como la hibridación

fluorescente in situ hicieron posible detectar con éxito H. pylori en los sistemas de

distribución de agua y varias fuentes de agua (Moreno y col., 2012) la detección

rRNA, es indicativo no sólo de presencia bacteriana sino también de la viabilidad

debido a la mayor concentración de rRNA (Gião y col., 2008) , Braganra y

colaboradores (2007) detectaron, por hibridación fluorescente in-situ, a H. pylori en

biopelículas de los sistemas de distribución de agua en los EUA.

Durante la última década, la formación de biopelículas en ambientes acuáticos se ha

propuesto como una estrategia de H. pylori para sobrevivir en el medio ambiente, y ha

llamado la atención la posibilidad de que el agua actúe como reservorio del patógeno.

La primera evidencia experimental que muestra la capacidad de H. pylori para crecer

en biopelícula surgió en 1999 (Mackay y col., 1998). Los autores encontraron la

especie en la superficie del grifo de sistemas de distribución de agua. Park y

30

colaboradores (2001) también detectaron a H. pylori en los sistemas de distribución de

agua en Suecia, utilizando PCR. Un año más tarde, otro estudio informó de la

detección de genes del rRNA 16S de H. pylori en muestras de biopelícula obtenida a

partir de un sistema de distribución de agua en el oeste de África (Bunn y col., 2002). Watson y colaboradores (2004), obtuvieron 151 muestras de biopelìculas provenientes

de 11 casas residenciales, 7 establecimientos educativos e hidrantes., se detectó la

presencia del género Helicobacter en el 26% y en el 15% el microorganismo fue

identificado a nivel de especie.

5.2 Formación in vitro de biopelículas de Helicobacter pylori

La formación de biopelículas permite a H. pylori sobrevivir a largos periodos de

tiempo, esto se ha demostrado tanto in vivo como in vitro, Aproximadamente, 15 años

después de H. pylori se cultivó con éxito por primera vez (Marshall y col., 1984), se

obtuvo la primera evidencia de la formación de biopelículas por esta especie cuando se

encontró una biopelícula de la cepa de H. pylori ATCC 43504 en un medio

químicamente definido (Brucella caldo suplementado con 0,1% β-ciclodextrina), se

adhirió al vidrio en la interfaz vidrio-agua (Stark y col., 1999). Cinco años más tarde,

Cole y colaboradores (2004) estudiaron la capacidad de formar biopelículas de 19

aislados clínicos de H. pylori y cepas de referencia en caldo de infusión cerebro

corazón suplementado con 0,1% β-ciclodextrina. Ambos tipos de cepas fueron

capaces de formarla y ésta tenía una progresión similar a la formación de biopelículas

formadas por otras especies (Hall-Stoodley y col., 2004). Los pasos observados

fueron, una adherencia inicial, la expansión para formar microcolonias y el crecimiento

en tres dimensiones con la presencia de canales para la penetración de agua y

nutrientes. La adhesión de H. pylori a la mucosa gástrica es un paso clave en el

establecimiento de una interacción positiva con las células epiteliales. Esta adherencia

está mediada por Baba, una adhesina, que se une al antígeno Lewis b y facilita que H.

pylori colonice el epitelio gástrico humano (Tzouvelekis y col., 1991).

Las células epiteliales tienen como mecanismo de defensa a la mucina diversos

documentos indican que ésta evita la adhesión de H. pylori a las células epiteliales

31

gástricas (El-Azizi y col., 2005), Las células epiteliales gástricas secretan

principalmente MUC5AC que contiene un dominio rico en glicanos (incluyendo el

antígeno Lewis b). Por el contrario a MUC5AC, MUC6 mucina que se sintetiza en las

profundidades de la mucosa y es secretada por células de la mucosa glandular, en este

estudio MUC6 demostró funcionar como mecanismo de defensa actuando en la

inhibición de la adhesión de H. pylori, así evitando la colonización de la capa profunda

de la mucosa gástrica por el patógeno (Tzouvelekis y col., 1991), Cole y

colaboradores (2006), con el fin para comprender lo que sucede “in-vivo”, estudiaron el

efecto de la mucina en la formación de biopelículas por H. pylori. Ellos observaron que

concentraciones crecientes de mucina favorecen significativamente el crecimiento

planctónico de H. pylori sobre la formación de la biopelícula lo que sugiere que esta

especie vive principalmente en biopelículas pero prolifera rápidamente como bacterias

de vida libre después de estar en contacto con la mucina en el estómago humano. Sin

embargo a pesar de demostrar que la mucina evita la adhesión de las bacterias al

epitelio gastrico, se ha demostrado que la formación de biopelícula in-vivo también se

produce (Cellini y col., 2008).

Un estudio realizado en 2009 con cepas de referencia y aislados clínicos mostró que

todas las cepas de H. pylori fueron capaces para formar biopelícula en la interfase aire-

agua (Yonezawa y col., 2009). El aumento de la capacidad de formación de

biopelícula fue observado en la cepa de H. pylori TK1402, aislada de un paciente

japonés con úlcera péptica gástrica y duodenal. Un análisis de microscopía electrónica

de barrido mostró la presencia de vesículas en la membrana externa, lo que sugiere

que éstas pueden desempeñar un papel en la formación de biopelículas porque

solamente se observan en ellas. Un año más tarde, Yonezawa y colaboradores (2010)

en la búsqueda de factores de virulencia de esta cepa, mostraron que ninguno de los

factores de virulencia tradicionales descritos en las especies estaban relacionadas con

la capacidad de H. pylori TK1402 para formar biopelículas. Por lo tanto, se necesitan

nuevas evidencias para entender mejor por qué esta cepa muestra un aumento de la

capacidad de formar biopelículas.

32

5.3 Formación in vivo de biopelículas de Helicobacter pylori

En el 2006 se obtuvo la primera evidencia de la formación de biopelículas in vivo en

EUA. En este estudio se compararon, por microscopía electrónica de barrido, biopsias

gástricas de pacientes que dieron positiva la prueba de la ureasa (presencia de H.

pylori) y pacientes que dieron negativa para la misma prueba (ausencia de H. pylori),

los resultados mostraron la presencia de biopelículas en las biopsias de pacientes que

dieron positiva a la prueba para H. pylori mientras que no se formaron, en las biopsias

de pacientes que dieron la prueba negativa. Lo que indica que H. pylori es capaz de

formar biopelículas en la mucosa gástrica humana, éste grupo informó posteriormente

que, entre pacientes con úlcera péptica que fueron diagnosticados mediante la prueba

la ureasa, el promedio de superficies celulares con biopelícula fue 97.3%, en

comparación con los pacientes que dieron negativa la prueba de la ureasa, el promedio

fue de 1.64% (Carron y col., 2006).

En 2008, en Italia, se llevó a cabo un estudio para comprender si las enfermedades

gástricas causadas por esta especie son una consecuencia de su capacidad de formar

biopelículas. El estudio se hizo con biopsias gástricas obtenidas de pacientes que

recibieron terapia anti- H. pylori tres meses antes del análisis. Los autores buscaron a

la bacteria por cultivo microbiológico y realizaron la detección de los genes glmM (ureC)

y luxS por transcripción inversa acoplada a la reacción en cadena de polimerasa (RT-

PCR). Sólo el 30% de las muestras fueron positivas para H. pylori mediante cultivo,

mientras que se detectó el 90% de positividad por RT-PCR, lo que sugiere que H.

pylori podría estar presente en estos pacientes como forma cocoide, que es el estado

viable pero no cultivable. El análisis de las muestras que dieron cultivo positivo por

microscopía electrónica de barrido, mostraron imágenes de la bacteria en forma de S o

en espiral con varias células cocoides incrustadas en la matriz extracelular, todas esas

muestras fueron positivas para el cultivo microbiológico convencional, Por otro lado, el

mismo estudio hecho con las muestras positivas solamente por RT-PCR y negativas al

cultivo, hubo predominio de células cocoides observadas por microscopía electrónica,

observaron que el morfotipo S, que coexistió con el morfotipo cocoide, ambos

embebidos en una matriz, las muestras fueron positivas para el gen glmM y para el

33

gen luxS, este último relacionado con el quorum sensing, este gen es útil como

marcador de confianza de las cepas que tienen la capacidad de formación de

biopelículas.

Cammarota y colaboradores (2010) reportaron que, entre los pacientes que tenían una

historia de por lo menos cuatro fracasos de erradicación de H. pylori, el análisis por

microscopía electrónica de barrido de las biopsias gástricas mostró que H. pylori

formaba biopelícula sobre la mucosa gástrica. En todos los pacientes la biopelícula

desapareció cuando el microorganismo se erradicó.

5.4 Quorum sensing de Helicobacter pylori.

El gen luxS es el gen presente en el genoma secuenciado de H. pylori que está

relacionado con quorum sensing. Varios informes indican que H. pylori produce

moléculas de señalización extracelular relacionadas con AI-2, la producción de AI-2 es

dependiente de la función del gen luxS (Forsyth y col., 2000). Estos informes han

indicado que la producción de AI-2 por el gen luxS depende de la fase de crecimiento,

con una producción máxima a la mitad de la fase exponencial de crecimiento. Varios

informes indican que luxS tiene un papel alternativo en la regulación de la motilidad en

la modulación de la transcripción flagelar y la biosíntesis de flagelar (Rader y col., 2011). Otros estudios, demostraron que la cepa TK1402 con una mutación en el gen

luxS produjo significativamente una menor motilidad con respecto a una cepa sin la

mutación (Osaki y col., 2006). Además, la cepa mutada en el gen luxS mostró una

reducida tasa de infección en un jerbo de Mongolia comparada con la cepa silvestre

TK1402. Cole y colaboradores (2006) demostraron la relación del gen luxS en la

formación de biopelículas por H. pylori. Ellos encontraron que las mutantes luxS de

cepas clínicas, fueron aproximadamente dos veces mejores en la formación de

biopelícula que las cepas no mutadas. Por otro lado, Doherty y colaboradores (2006),

descubrieron que el gen luxS también cumple un papel metabólico en la activación del

ciclo del metilo.

34

5.5 Efecto de la biopelícula en la susceptibilidad de los agentes antimicrobianos

El tratamiento y la eliminación de H. pylori es importante no sólo para el tratamiento de

la úlcera gástrica / duodenal, sino también para la prevención del cáncer gástrico, así

como para evitar la propagación de este microorganismo. Para la erradicación de H.

pylori, se usa una terapia de combinada utilizando un agente antiácido (inhibidor de la

bomba de protones más dos agentes anti- H. pylori (amoxicilina, claritromicina o

metronidazol) (Malfertheiner y col., 2012). Las fluoroquinolonas también son

antibióticos de elección. En Japón, una combinación de un inhibidor de la bomba de

protones, amoxicilina, y claritromicina son comúnmente utilizados en el tratamiento

(Asaka y col., 2010). Sin embargo, la resistencia a claritromicina (10 al 30%) es un

problema creciente siendo ésta la mayor causa de fracaso terapéutico (Asaka y col., 2010; Malfertheiner y col., 2012). Se han reportado que las mutaciones puntuales en el dominio V del bucle del gen 23S

rRNA (comúnmente una transición-adenina-a guanina en la posición 2142 o 2143)

explnica la resistencia (Adamek y col., 1998; Versalovic y col., 1997).

En las biopelículas bacterianas, las células que se encuentran en éstas tienen

beneficios con respecto a las células planctónicas, uno de ellos es un aumento de la

resistencia a los agentes antimicrobianos. las células de una biopelícula pueden llegar

a ser 10 a 1000 veces más resistente.

Existen múltiples mecanismos de resistencia a los antimicrobianos en una biopelícula y

éstos son (Mah y col., 2001):

• La incapacidad del antimicrobiano para penetrar en la biopelícula

• El lento crecimiento de las células de la biopelícula debido a la limitación de

nutrientes.

• La activación de la respuesta al estrés en general

Sin embargo, el efecto de la formación de biopelícula y la susceptibilidad de H. pylori a

los antimicrobianos no está bien documentada. Por lo que se han investigado los

35

efectos de la claritromicina sobre las biopelículas de H. pylori (Yonezawa, 2013). La

formación de biopelículas por H. pylori aumenta la resistencia a la claritromicina en los

niveles de concentración mínima inhibitoria(CMI), hasta 4 veces en las biopelículas de

2 días y 16 veces en las de 3 días, así como la concentración mínima bactericida

(CMB) con concentraciones de hasta 4 veces, en comparación con las células

planctónicas.

En la biopelículas de H. pylori la incapacidad de penetración de la claritromicina es

debido a la presencia de la matriz extracelular. Se demostró que la formación de

biopelículas de H. pylori puede favorecer la generación de mutaciones y como

consecuencia la resistencia a claritromicina. Las células resistentes a claritromicina se

detectaron con más frecuencia en las biopelículas después de un tratamiento con

claritromicina (Yonezawa y col., 2013). 5.6 Agentes anti-biopelícula

Sabemos que la susceptibilidad microbiana es menor cuando no hay biopelícula

respecto que cuándo esta está presente (Aslam y col., 2007), se cree que una

combinación de agentes antimicrobianos y moléculas anti-biopelícula deben establecer

un sinergismo para que el antibiótico pueda penetrar y ejercer su mecanismo de acción

contra los microorganismos (Aslam y col., 2011). Sin embargo, sólo dos compuestos

anti-biopelícula se han descrito contra H. pylori: La curcumina, un colorante natural que

se extrae a partir de Curcuma longa, ésta inhibe de la formación de biopelículas

evitando la adhesión al epitelio gástrico (Pattiyathanee y col., 2009), el otro

compuesto estudiado es la N-acetil-cisteína, se estudió el efecto en la formación de

biopelícula, tanto in vitro como in vivo. Este compuesto fue capaz de evitar la formación

de biopelículas y desestabilizó las ya formadas. Por otro lado, en estudios in vivo con

dos grupos de 20 personas cada uno, un grupo (tratado) recibió N-acetil-cisteína

durante una semana antes del tratamiento anti H. pylori de elección, mientras que el

otro grupo (controles no tratados) no recibió el agente desestabilizador de biopelículas

pero recibiendo el tratamiento contra el patógeno. Se demostró la erradicación de la

36

infección en un 65% de los casos para el grupo que recibió la N-acetil-cisteína. El grupo

control mostró sólo el 20% de éxito en la erradicación, lo que sugiere que la N-acetil-

cisteína actúa como un agente desestabilizador de las biopelículas favoreciendo la

actividad in vivo de los antibióticos (Cammarota y col., 2010).

37

VI. CONCLUSIONES

• La contaminación de materia fecal en agua para consumo humano contribuye a la

presencia y transmisión de Helicobacter pylori.

• La formación de biopelículas por Helicobacter pylori es de suma importancia como

reservorio y transmisión en el medio ambiente así como en el ámbito clínico, ésta

tiene relevancia en la resistencia a antimicrobianos y en los fallos terapéuticos sobre

la eliminación de esta bacteria.

• Compuestos como la curcumina o la N-acetil-cisteína son importantes agentes

antibiopelícula los cuales están siendo probados como agentes alternativos o

complementarios en el tratamiento contra la infección de H. pylori.

38

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