“Impacto de las nuevas metodologías dediagnóstico rápido en los laboratorios de microbiología”

Bioq. Vanesa ReijtmanBioq. Diana Viale

Servicio de Microbiología

Laboratorios de microbiología clínica

Benbachir M. Guía para el control de infecciones asociadas a la atención en salud. ISID. 2018

Impacto del diagnóstico rápido

Paul, M. Et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2010, 54, 4851-4863Kumar, A. et al. Crit. Care Med. 2006, 34, 1589-1596.

Wisplinghoff H et al. Clin Infect Dis. 2003; 36:1103-10

Herramientas de la microbiología clínica clásica

Tiempos requeridos

Ventajas de la automatización

✔ Mayor trazabilidad

✔ Reducción de los costos de

las pruebas

✔ Procesamiento más rápido

✔ Facilidad de interacción con

los sistemas LIS/HIS

✔ Modularidad

✔ Más tiempo para capacitación

Herramientas de microbiología clínica moderna

Maldi tof MS

Técnica que permite la utilización de la espectrometría de masas en la identificación de microorganismos mediante el análisis de proteínas, principalmente ribosomales, a través de la creación de un espectro de masas que es específico para cada género y especie

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry(Desorción/ionización láser asistida por una matriz con detección de masas por tiempo de vuelo)

UNIDADES FUNCIONALES

Fuente ionizante: aplicación de energía mediante luz laser que interacciona con la mezcla MUESTRA/MATRIZ

Analizador de masas: Tubo de vacío en el cual los iones se separan de acuerdo con su tiempo de vuelo y su masa

Detector: Analiza e interpreta la distribución del espectro de masas y lo compara con la base de datos

Maldi tof MSMatrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry(Desorción/ionización láser asistida por una matriz con detección de masas por tiempo de vuelo)

Desempeño del MALDI TOF MS en el laboratorio de microbiología clínica

✔ Niveles de concordancia superiores al 90%, frente a los métodos convencionales de identificación

✔ ID 1,45 días mas temprano

✔ Tiempo de ID= 5-30’ VS 6-18 HS

✔ Se reduce hasta en una sexta parte el volumen de residuos biológicos

Seng, P. Et al. Clin Infect Dis. 2009 Aug 15;49(4):543-51 S. Q. Van Veen. et al. Journal of Clinical Microbiology. 2010, 48(3), 900-907.

MALDI-TOF directo de hemocultivos✔ Aplicación con mayor impacto= ID directa de muestra, ya que contribuye a una instauración más

oportuna de la terapia antimicrobiana dirigida

✔ Su uso ha demostrado un incremento en la supervivencia de los pacientes y la reducción de los costos derivados de la atención en salud

✔ Se validaron diferentes protocolos con el fin de eliminar interferencia de las proteínas humanas y del medio de cultivo y por la alta densidad de microorganismos requerida para obtener un buen espectro de proteínas (105 UFC) que permitan obtener un espectro confiable y específico

✔ A nivel global se demostró un % de ID para BGN superior al 90% a nivel de género y 82-85% a nivel de especie. Para Gram positivos los % de ID van desde el 65 al 75% a nivel de género

✔ Se logra una reducción del tiempo promedio del resultado de 34,3 hs en un escenario ideal y de 26,5 hs en una situación más práctica, en la que los microorganismos requieren subcultivos y pruebas adicionales para su caracterización definitiva.

Perez KK et al. Arch Pathol Lab Med. 2013 Sep;137(9):1247-54 Dixon P et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2015;863–76

Ferreira L et al. Clin Microbiol Infect. 2011;17(4):546–51Morgenthaler NG et al. Int J Microbiol. 2015;2015:1–10

.

Número de aislamientos= 941

El porcentaje global de ID correcta a nivel de género y especie fue de 83%

Datos no publicados

La intervención del Programa basado en la

nueva tecnología asociada a la difusión de

información en tiempo real permitió la adecuación de

los tratamientos y la suspensión precoz de

ATB innecesarios

Ruvinsky et al. 1º Congreso Argentino de Medicina Interna Pediátrica. Sociedad Argentina de Pediatría. 2 al 4 de noviembre de 2016

Sistema FilmArray • Sistema PCR multiplex que integra la preparación de muestras, amplificación, detección y análisis.

Requiere sólo 2 min., con un tiempo de ejecución total de aprox. de una hora.

• Permite la detección simultánea de bacterias, virus, levaduras, parásitos y / o genes resistentes a los

antimicrobianos. 

• Paneles disponibles:

• Respiratorio

• Meningitis/encefalitis

• Gastrointestinal

• Sepsis (BCID2)

Panel BCID2✔ Detección e identificación cualitativa simultánea de diferentes ácidos nucleicos de bacterias y levaduras (33

target) y determinantes genéticos seleccionados asociados a la resistencia a los antibióticos (10 target).

✔ Se realiza directamente sobre muestras de hemocultivos identificados como positivos mediante un sistema de hemocultivo de monitorización continua. 

✔ Los resultados deben interpretarse junto con los resultados de la tinción de Gram.

VENTAJAS LIMITACIONES

o 99.8% de especificidad y 99% de sensibilidad para resultados viables y de confianza.

o Abarca las principales causas de las infecciones del torrente sanguíneo que pueden provocar sepsis en todo el mundo y los principales genes de resistencia antimicrobiana.

o Resultados en 1 hora desde que positiviza el hemocultivo

o Posible discordancia entre la detección y los subcultivoso Puede que no distinga cultivos mixtos cuando haya dos o más especies del

mismo género o grupoo Probabilidad de resultados falsos negativos para P aeruginosa o

Stenotrophomonas spp. si hay otro organismo presente en el hemocultivo.o La resistencia a los antibióticos se puede producir por diferentes mecanismos.o En cultivos mixtos, el gen de resistencia puede estar asociado con cualquiera de

las bacterias aplicables detectadas o un organismo que no se detectó por el panel.

Panel BCID2✔ Gran cantidad de trabajos publicados demuestran una disminución significativa en los tiempos de

informes de los hemocultivos positivos con alta sensibilidad y especificidad

✔ NUESTRA EXPERIENCIA:

Impacto clínico: aumento de los pacientes en los que se adecuó el tratamiento ATB antes de las 48 h; disminución de días de vancomicina y meropenem empírico.

Rule R, et al. J Microbiol Methods. 2021 Aug 16:106303.Berinson B, et al.J Clin Microbiol. 2021 Jul 19;59(8):e0054321

Sparks R, et al.Pathology. 2021 Jun 10:S0031-3025(21)00133-1Mazzillo Vega L et al. Rev Chil Pediatr. 2020. 91 (4). 553-560

Soloaga et al. Acta Bioquím Clín Latinoam 2021; 55 (2): 165-70

La incorporación de estas herramientas moleculares, que suelen ser costosas para la rutina de un laboratorio de microbiología, requiere del buen criterio microbiológico, la capacitación de todo el equipo interviniente y la elaboración de un algoritmo diagnóstico para la utilización costo-efectiva de los recursos.

Impacto en nuestro laboratorioTodos estos cambios e incorporación de nueva tecnología:

✔Nos ayudaron a mejorar la calidad y precisión de los resultados y disminuir

ampliamente los tiempos de informe.

✔Nos llevaron a modificar el flujo de trabajo.

✔ Nos obligaron a permanecer actualizados en los conocimientos para poder hacer un

uso crítico de los recursos disponibles.

✔Acentuaron el diálogo fluido con médicos del Servicio de Infectología

Secuenciación total del genoma y análisis metagenómico

• Estudio de brotes

• Factores de virulencia

• Mecanismos de resistencia

• Utilidad en lento crecimiento

• Costos

Review Next-generation sequencing technologies and their application to the study and control of bacterial infections. J. Besser, H.A. Carleton, P. Gerner-Smidt*, R.L. Lindsey, E. Trees Enteric Diseases Laboratory Branch, Center for Disease Control & Prevention, Atlanta, GA, USA Clinical Microbiology and Infection 24 (2018) 335e341

Secuenciación total del genoma

✔ Puede reemplazar la caracterización tradicional de un patógeno

✔ Ejemplo: E coli productora de shiga toxina acorta tiempos: 3 semanas a menos de una semana

✔ Estudios de virulencia, resistencia, serotipos

Metagenómica clínica

• Pre extracción

• Extracción de ácidos nucleicos

• Secuenciación

• Controles

Metagenómica clínica

Principios de bioinformática aplicados a la metagenómica:

Tuberías bioinformáticas

Taxonomía

Análisis secundario

Validación/Reporte

Limitaciones actuales

✔ Uso de diferentes plataformas aún no comparables entre sí

✔ Falta de personal bioinformático

✔ Falta de procedimientos estandarizados

✔ Falta de bases de datos

✔ Costos, TAT largos

Impacto de la metagenómica

Detección de patógenos

Tratamiento certero/Fin tratamiento empírico

Menos procedimientos invasivos

Acciones en salud pública

Muchas gracias