9as Jornadas de la Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular

(SBBM, SUB)

Facultad de Agronomía Universidad de la República

(UdelaR)

15 y 16 de Octubre de 2015

Montevideo, URUGUAY

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ÍNDICE

Pág. I. Conferencias plenarias ............................................................................... 3

Plenaria Inaugural ....................................................................................... 4 Plenaria PABMB ......................................................................................... 5 Plenaria de cierre ........................................................................................ 6

II. Simposios .................................................................................................. 7

1. Biología Celular ....................................................................................... 8 2. Biotecnología ........................................................................................ 15 3. Virología ................................................................................................ 22 4. Bioquímica y Biología Molecular en Agronomía .................................... 30 5. Parasitología Molecular ......................................................................... 37 6. Educación en Ciencias .......................................................................... 44 7. Bioquímica y Biología Molecular de Microorganismos .......................... 50 8. Neurobiología ........................................................................................ 57 9. Genómica .............................................................................................. 64 10. Bioquímica de proteínas ..................................................................... 71 11. Bioquímica y Biología Molecular en Ciencias Animales ...................... 78 12. Biología de sistemas ........................................................................... 85 13. La imagen como fuente de información .............................................. 91

III. Posters ...................................................................................................... 97 1. Biología Celular ..................................................................................... 98 2. Biotecnología ...................................................................................... 112 3. Virología .............................................................................................. 122 4. Bioquímica y Biología Molecular en Agronomía .................................. 128 5. Parasitología Molecular ....................................................................... 140 6. Educación en Ciencias ........................................................................ 150 7. Bioquímica y Biología Molecular de Microorganismos ........................ 156 8. Neurobiología ...................................................................................... 163 9. Genómica ............................................................................................ 172 10. Bioquímica de proteínas ................................................................... 177 11. Bioquímica y Biología Molecular en Ciencias Animales .................... 186 12. La imagen como fuente de información ............................................ 189

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CONFERENCIAS PLENARIAS

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PLENARIA INAUGURAL

"The Fluid-Mosaic Model of cell membrane structure in 2015"

Prof. Emeritus Garth L. Nicolson

Cellular membranes are essential for transport of molecules into and outside cells, and they provide important cell recognition structures, receptors and enzyme platforms. Cellular membranes assemble because of their physical properties, which allow membrane constituents to form a lipid bilayer with intercalated proteins and glycoprotiens. These components can move laterally and selectively within the membrane plane and associate with similar or different constituents to form specific functional domains. In describing the macrostructure and dynamics of plasma membranes, membrane peripheral components, membrane-associated cytoskeletal structures and extracellular matrix are also important in maintaining membrane structure and dynamics by constraining the motions of membrane components and acting as traction points for cell motility. The matrix of cellular membranes is made up mostly of glycerolphospholipids, and the unsaturated fatty acids in the membrane phospholipids are especially sensitive to damage, mostly by oxidative events that occur in all chronic illnesses and aging. Damage to specific membrane glycerolphospholipids has important negative consequences for membranes and their functions, such as mitochondrial function and the production of cellular energy. Lipid Replacement Therapy using all-natural nutritional membrane lipid supplements have been used to repair cellular membranes and reverse damage to critical organelles, such as mitochondria. Recent clinical trials have shown the benefits of Lipid Replacement Therapy in increasing mitochondrial function, reducing fatigue, improving cognition, reducing pain, reducing the adverse effects of cancer therapy and other important functions without any toxicity and zero adverse events.

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PLENARIA PABMB

“From Systems to Synthetic Biology and back again: building new tools for biotechnological applications”

Prof. Rafael Silva-Rocha

Systems Biology aims the integration of high-throughput data (genomics, transcriptomics, proteomics, metabolomics, etc) in order to get deep understanding on the operation of living cells. On the other hand, Synthetic Biology targets the construction/modification of living organisms toward their utilisation on biomedical/biotechnological applications. This lecture will present an overview of Systems and Synthetic Biology fields, addressing recent progress made on the engineering of tools related to the construction and implementation of synthetic circuits in living cells. Special focus will be the engineering of microorganisms for biotechnological applications. Also, we well address some initial analysis performed in Trichoderma reesei, a biotechnologically relevant filamentous fungi, toward the deciphering the cis-regulatory elements controlling the expression of cellulase-coding genes in a genomic scale.

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PLENARIA DE CIERRE "La estructura 3D de la cápside nativa del virus de la leucemia bovina: las

capsides retrovirales son plásticas",

Prof. Alejandro Buschiazzo (Uruguay) G. Obal1, F. Trajtenberg2, F. Carrión1, L. Tomé1, N. Larrieux2, X. Zhang3, O.

Pritsch1, A. Buschiazzo2 1Unidad de Biofísica de Proteínas, y 2Unidad de Cristalografía de Proteínas,

Institut Pasteur de Montevideo; 3Unité de Virologie Structurale, Institut Pasteur (Francia)

Los retrovirus siguen un proceso de maduración para formar partículas infecciosas. La proteólisis de Gag resulta así en varias proteínas maduras, incluyendo la cápside (CA), que se auto-ensambla en un núcleo de tipo fulereno encerrando al genoma de ARN. A pesar del rol central que juega la CA en el ciclo de vida de retrovirus, su gran polimorfismo ha impedido hasta ahora su análisis estructural a alta resolución, para entender el mecanismo de ensamblado y eventualmente desarrollar nuevos medicamentos antiretrovirales. Reportamos ahora la estructura cristalográfica de CA madura del virus de la leucemia bovina (VLB), en estado nativo, a una resolución de 2.75 Å [1]. El VLB es un delta-retrovirus tumorigénico B-linfotrópico, que infecta al ganado bovino a escala global. Los cristales mostraron un hexámero de CA por unidad asimétrica, empaquetados lado a lado formando capas 2D que mimetizan la estructura de un núcleo retroviral maduro. Los hexámeros de CA se desvían sensiblemente de una simetría de orden 6 estricta, distorsionándose de manera de ajustarse al ensamblado 2D pseudo-hexagonal de la red supramolecular. Podemos observar y analizar los contactos intra- e inter-hexaméricos quasi-equivalentes, con interfaces laterales triméricas, más flexibles, y otras diméricas más rígidas formando la red. La conformación de cada protómero individual de CA está así dictada por fuerzas de largo alcance, revelando cómo la plasticidad de los hexámeros permite modular curvaturas y ensamblar/desensamblar partículas cerradas. En particular permite entender la acción de efectores alostéricos, con potenciales propiedades antiretrovirales.

[1] Obal, G. et al. (2015) Science 49:95-98.

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SIMPOSIOS

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Simposio 1: BIOLOGÍA CELULAR Coordinadores: C. Quijano, C. Escande, R. Rodríguez. Exposiciones: Nitroalquenos del alfa-tocoferol como una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de la aterosclerosis y otras enfermedades inflamatorias relacionadas. C. Batthyány. Caracterización de nuevos mecanismos anti-inflamatorios de la hidroxicloroquina. M. E. Shroeder. La senescencia celular induce una disminución de los niveles de la enzima acetil-coa carboxilasa 1. I. Marmisolle. Desorden global del citoesqueleto de actina en la fibra nerviosa periferica de ratones trembler-j. K. Cal. Estudio de la interacción entre el oncomir hsa-mir-183 y el supresor de tumor PDCD4 en cáncer de próstata. C. Olivera.

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RESÚMENES

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NUEVA ESTRATEGIA FARMACOLÓGICA PARA EL TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN DE LA ATEROSCLEROSIS: DESARROLLO DE

NITROALQUENOS ANÁLOGOS DEL Α-TOCOFEROL. ESTUDIO DE SUS MECANISMOS DE ACCIÓN ANTI-INFLAMATORIA.

Jorge Rodriguez1, 2, Germán Galluisi2, Gerardo Ferrer-Sueta3, Horacio

Botti2, Gloria V. lopez1, Carlos Batthyány2, 4 1 Grupo de Química Medicinal, Departamento de Química Orgánica,

Facultad de Química y Facultad de Ciencias, UDELAR; 2Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo; 3Laboratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, UDELAR; 4Departamento de Bioquímica, CEINBIO, Facultad de Medicina, UDELAR

La aterosclerosis es una enfermedad de distribución mundial y proporciones

epidémicas en las sociedades desarrolladas y una de las principales causas de muerte. La aterogénesis comienza en sitios especiales del sistema vascular con la retención de partículas de LDL en la capa íntima de la pared de la arteria, el reclutamiento de células inflamatorias y la generación de un foco inflamatorio crónico que conduce a modificaciones de la LDL, formación de células espumosas, disfunción endotelial, proliferación celular y desarrollo de una placa de ateroma.

En nuestro trabajo desarrollamos una nueva estrategia farmacológica para el tratamiento y la prevención de la aterosclerosis. Diseñamos y sintetizamos un compuesto híbrido análogo de la vitamina E (-tocoferol) a la que le adicionamos un grupo funcional electrófilo nitroalqueno (1). El raciocinio de nuestra idea es que el compuesto híbrido tocoferol-nitroalqueno se incorpore selectivamente en las partículas de lipoproteínas durante el metabolismo normal de las mismas y debido a la presencia del cromanol del -tocoferol. Una vez incorporado, las lipoproteínas distribuirán el compuesto por todo el organismo, incluyendo alas celulas espumosas de las lesiones ateroscleróticas, donde se enriquece por la acción del receptor barrendero y ejerceciendo las potentes propiedades anti-inflamatorias y anti-aterogénicas de los nitroalquenos.

Sintetizamos los compuestos y realizamos la caracterización fisicoquímica y biológica de los mismos. Los nitroalquenos análogos del tocoferol son electrófilos capaces de incorporarse a las lipoproteínas. Los compuestos estudiados presentan actividad anti-inflamatoria: inhiben la secreción de citoquinas pro-murinos, inducen la expresión de las enzimas de fase 2 dependientes del sistema Nrf2/Keap-1 (Hemo-oxigenasa 1, Glutamato Cistein ligasa, NQO1) tanto in vitro como in vivo e inhiben la secreción de interloquina 1-por el inflamasoma NLRP3 sobre macrófagos THP-1. En la actualidad estamos estudiando la capacidad de estos compuestos de inhibir el desarrollo de aterosclerosis en el modelo murino apo E-/- y de HTA inducido por angiotensina II. Ref. 1: (US PCT Patent WO 2015/073527 A1; co-inventores C. Batthyany y G.V. López)

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CARACTERIZACION DE NUEVOS MECANISMOS ANTI-

INFLAMATORIOS DE LA HIDROXICLOROQUINA

M.E.Schroeder1, M.C.Cuturi2, E.Cairoli3, M. Hill1,4 1.Laboratorio de Inmunoregulación e inflamación, Institut Pasteur de Montevideo; 2INSERMU 1064 (Nantes); 3Clinica Medica C, Hospital

de Clínicas, Facultad de Medicina (UDELAR); 4Departamento de Inmunobiologia, Facultad de Medicina (UDELAR)

La hidroxicloroquina es un tratamiento actualmente utilizado para enfermedades inflamatorias crónicas como Lupus Eritematoso Sistémico. Planteamos que la HCQ sería capaz de bloquear la producción de una de las citoquinas pro-inflamatorias más potentes, la IL-1beta, a través de su capacidad de modular el metabolismo iónico. La forma inactiva de esta citoquina debe ser clivada por la caspasa1 para generar la forma activa. La caspasa1 es activada por un complejo multiproteico llamado inflamasoma. Este se encuentra fuertemente regulado por niveles citoplasmáticos de K+ y Ca++. Se ha propuesto que para la activación del inflamosoma NLRP3, es necesario una reducción de niveles intracelulares de K+ ante estímulos variados como ATP. La HCQ es una droga derivada de la quinina, potente inhibidor de canales iónicos, particularmente de K+. El protocolo de estimulación utilizado para la activación del inflamosoma fue señal 1 (LPS), señal 2 (ATP,nigericina±HCQ). Los resultados obtenidos, han mostrado que en diferentes tipos celulares BMDCs, DCs y macrófagos humanos, la HCQ inhibe la producción de IL-1beta de manera dosis dependiente (ELISA). Ademas observamos HCQ inhibe activación de inflamosoma por inhibición Casp-1(Western Blot).Estos resultados fueron obtenidos con ATP, pero no se observó inhibición con nigericina, ni medio sin K+. Se cuantifico K+ intracelular y se observó la HCQ inhibe el eflujo de K+ estimulando con ATP pero no con nigericina. Se midió el Ca++ intracelular (Fura-2) y se observó aumento de Ca++en presencia de HCQ. Estos resultados conducirían a pensar que la HCQ podría estar inhibiendo canales de K+, posiblemente regulados por Ca++.

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LA SENESCENCIA CELULAR INDUCE UNA DISMINUCIÓN DE LOS NIVELES DE LA ENZIMA ACETIL- CoA CARBOXILASA 1

Marmisolle I.1; Martínez J.1; Moreno M.2; Quijano C.1

1 Departamento de Bioquímica y Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO), Facultad de Medicina (UDELAR); 2 Departamento de Desarrollo

Biotecnológico, Facultad de Medicina, Instituto de Higiene (UDELAR).

En las células de mamíferos el metabolismo y la proliferación celular están estrechamente vinculados. Por esto evaluamos la síntesis de ácidos grasos en fibroblastos de pulmón humano (IMR-90) proliferantes y no proliferantes por inducción de senescencia replicativa y prematura. Obtuvimos fibroblastos senescentes replicativos subcultivando sucesivamente al cultivo primario. Indujimos la senescencia prematura exponiendo las células al genotóxico doxorrubicina (0,2 µM, 2 horas), o al oxidante peróxido de hidrógeno (H2O2) (600 µM, 2 horas). Al alcanzar la senescencia replicativa, se activó la respuesta al daño al ADN (DDR), la proliferación cesó, aumentó la actividad β-galactosidasa asociada a senescencia (SA-β-Gal). También observamos una disminución en la síntesis de novo de lípidos a 61±4% y una caída en los niveles de las enzimas responsables de la síntesis de ácidos grasos, acetil- CoA carboxilasa 1 (ACC1) y ácido graso sintasa, a un 34±13% y 39±13% respectivamente del encontrado en fibroblastos proliferantes. La exposición de los fibroblastos a doxorrubicina o H2O2 activó la respuesta al daño al ADN, con la consecuente detención del ciclo celular, aumentó la SA-β-Gal y además condujo a una disminución inmediata en los niveles de ACC1, a un 49±14% y 63±11% del control respectivamente con un curso temporal que acompañó la activación de la respuesta al daño al ADN y la hipofosforilación de la proteína del retinoblastoma (pRB). Los niveles de ARNm de ACC1 se encontraron disminuidos tanto en la senescencia replicativa como prematura, sugiriendo que la regulación de esta enzima ocurre a nivel transcripcional.

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DESORDEN GLOBAL DEL CITOESQUELETO DE ACTINA EN LA FIBRA NERVIOSA PERIFÉRICA DE RATONES Trembler-J.

Cal K.1, Romeo C.1, Lafon-Hughes L.2, Bresque M.3, Sotelo J.R.1, Calliari

A.1,4 & Kun A.1,5

1Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos del IIBCE; 2Departamento de Genética del IIBCE; 3Laboratorio de Patologías del Metabolismo y

Envejecimiento del IP-Mon; 4Departamento de Biofísica de Facultad de Veterinaria; 5Sección Bioquímica de Facultad de Ciencias

Las neuropatías hereditarias periféricas humanas presentan defectos en la mielinización, siendo la más frecuente la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT). La mielinopatía CMT-1E, es causada por mutaciones puntuales en pmp22 codificante de la proteína mielínica PMP22. La correcta mielinización de los axones del Sistema Nervioso Periférico requiere la extensión del citoplasma de la célula de Schwann y la reorganización del citoesqueleto de actina (F-actina). Nuestro grupo ha señalado, en nervios ciáticos de ratones Trembler-J (TrJ), modelo murino de CMT1E, una distribución alterada y un marcado incremento en los niveles de F-actina respecto de los ratones de genotipo salvaje (wt). Nuestra hipótesis plantea que este incremento de F-actina, puede deberse al aumento de los niveles de actina monomérica que finalmente se ensambla y/o a un cambio en la estabilidad de F-actina que impide su desensamblaje. Para ello se caracterizaron los niveles de actina total, monomérica y filamentosa, así como, los niveles de ARNm de beta-actina, en nervios ciáticos de ratones wt y TrJ. También se evaluó la estabilidad de F-actina induciendo la depolimerización del filamento en nervios ciáticos de ambos genotipos incubados ex-vivo en presencia o ausencia de citocalasina-D. Nuestros resultados muestran que los nervios ciáticos de los ratones TrJ presentan niveles de ARNm y de proteína total, monomérica y filamentosa de beta-actina mayores que en el wt. La estabilidad de F-actina en el TrJ se encuentra disminuída respecto del wt. Esto refleja un desorden global del citoesqueleto de actina en la fibra nerviosa periférica de este modelo de mielinopatía humana.

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ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN ENTRE EL ONCOMIR HSA-MIR-183 Y EL SUPRESOR DE TUMOR PDCD4 EN CÁNCER DE PRÓSTATA

C. Oliveira1,2, R. Fort, G. Eastman3, J.Sotelo3, M. Duhagón1,2

1 Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias, UdelaR. 2

Departamento de Genética, Facultad de Medicina, UdelaR. 3 Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Montevideo, Uruguay.

El cáncer de próstata (PCa) es una de las enfermedades oncológicas de mayor incidencia en el mundo y la segunda causa de muerte por cáncer en Uruguay. Los métodos de detección actualmente utilizados no han reducido significativamente la mortalidad, y su falta de especificidad conduce a someter a pacientes con bajo riesgo a tratamientos innecesarios, por lo que es relevante la identificación de nuevos biomarcadores. Los microARNs son pequeños ARNs que regulan la expresión génica interaccionando con secuencias complementarias en la 3’UTR de sus ARNms blanco. Su amplia desregulación en cáncer les proporciona un valor diagnóstico, pronóstico y predictivo de la progresión de la enfermedad. Nosotros estudiamos la función de hsa-mir-183-5p, un microARN que fue identificado en un cribado de expresión diferencial de miRs modulados durante la diferenciación de células madre PCa. Nuestro grupo, al igual que otros, ha observado un incremento de los niveles de hsa-miR-183 en tejido tumoral o metastásico, sugiriendo su función como oncogén. Hemos seleccionado un grupo de genes blancos de este miR, entre los que se encuentra PDCD4, un conocido gen supresor de tumor con sitios blanco predictivos para hsa-miR-183. Para estudiar si efectivamente este gen constituye un blanco directo de hsa-miR-183, determinamos si hsa-mir-183 interacciona directa y específicamente con la región 3´UTR del ARNm de pdcd4, clonada corriente abajo del gen reportero luciferasa. También se estudia si el microRNA modula los niveles de la proteína PDCD4 endógena producida por las líneas celulares.

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Simposio 2: BIOTECNOLOGÍA Coordinadores: A. Villarino, P. González. Exposiciones: Levaduras como materia prima para la producción de biodiesel. S. Vero Mejora en la estabilidad de l-lactato deshidrogenasa mediante ingeniería de inmovilización. E. Jackson Plantas como biorreactores: expresión tejido específico en Brachypodium distachyon. M. Maidana Demanosidación de glicoproteínas: una estrategia para evaluar el potencial inmunomodulador de residuos de manosa en Fasciola hepatica. K. Francia Desarrollo de un biosensor para la detección de anticuerpos ANTI-ADNdc en pacientes con lupus eritematoso sistémico. P. Fagúndez

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RESÚMENES

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LEVADURAS COMO MATERIA PRIMA PARA LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL

V. Pereyra1, A. Martínez1, M. Sánchez1, G. Garmendia1, C. Rufo2, S. Vero1

1Microbiología, Departamento de Biociencias.2 Polo Tecnológico de Pando. Facultad de Química (UDELAR)

La búsqueda de fuentes de energía renovables propulsada por la disminución de fuentes de combustible fósil y las consecuencias ambientales de su explotación, ha determinado un creciente interés en los biocombustibles, tales como el biodiesel. Este biocombustible está constituido por una mezcla de ésteres metílicos o etílicos de ácidos grasos provenientes de triglicéridos de diferentes orígenes. En el proceso de producción se genera glicerina cruda como subproducto, en cantidades que representan un 10% del biodiesel producido. Nuestro país está actualmente desarrollando la producción de biodiesel, utilizando como materia prima los aceites vegetales, principalmente. Sin embargo, el alto costo asociado a la producción de cultivos oleaginosos podría afectar los rendimientos económicos del proceso. Además, el uso de cultivos comestibles para la producción de combustibles está siendo cuestionado desde un punto de vista social y cultural. En esta coyuntura, se plantean nuevos procesos para la obtención de biodiesel y para la utilización de la glicerina cruda obtenida en el proceso. Nuestro trabajo exploró la posibilidad de utilizar levaduras oleaginosas, producidas a partir de glicerina cruda, como materia prima para la producción de biodiesel. Se trabajó con 28 cepas nativas de las cuales se seleccionó una cepa cuyo porcentaje de lípidos acumulados por biomasa seca fue de 50.5%. Para dicha cepa se optimizaron las condiciones de cultivo para maximizar la producción de lípidos utilizando glicerol como fuente de carbono. Se realizó escalado a fermentador de 3 litros y se optimizaron las condiciones de transesterificación para la obtención del biodiesel.

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MEJORA EN LA ESTABILIDAD DE L-LACTATO DESHIDROGENASA MEDIANTE INGENIERÍA DE INMOVILIZACIÓN.

E. Jackson1, F. López-Gallego2,3, J.M. Guisan4, L. Betancor1.

1Laboratorio de Biotecnología, Universidad ORT Uruguay, Cuareim 1441, 11100, Montevideo, Uruguay; 2 IKERBASQUE, Basque foundation for Science, 48011, Bilbao (Spain); 3CICBiomagune. Parque Tecnológico de San Sebastián,

Edificio Empresarial C, Paseo Miramón 182, 20009 Donostia-San Sebastián, Guipúzcoa (Spain); 4 Instituto de Catálisis y Petroleoquímica. CSIC, c/Marie

Curie N2, Madrid, Spain La L-lactato deshidrogenasa (LDH) cataliza la conversión de piruvato a lactato utilizando NADH como cofactor (1). Esta enzima es de interés biotecnológico, ya que puede ser usada para producir bloques quirales para la industria alimentaria y farmacéutica y además puede ser utilizada como una biomolécula de reconocimiento en dispositivos de sensado (2). La inmovilización de esta enzima, con escasos precedentes en la literatura, facilita el uso aplicado de la LDH. En este trabajo, hemos estudiado la inmovilización de la LDH en soportes de agarosa activados con grupos aldehído (glioxil-agarosa). Aunque a priori, esta estrategia fue perjudicial para la enzima, la optimización de varios parámetros durante la inmovilización permitió la obtención de una preparación inmovilizada activa y altamente estable de LDH. Los tiempos de vida media a 55°C alcanzaron valores 1.600 veces mayores para la LDH inmovilizada en comparación con la enzima soluble. Por otro lado, la actividad de la enzima soluble en presencia de etanol decayó completamente dentro de los primeros 3 min de ensayo, mientras que, la LDH inmovilizada conservó 62,0 ± 0,2% de actividad luego de 21 h. Ensayos de estabilidad en pH demostraron un aumento de la resistencia de la LDH inmovilizada bajo condiciones tanto alcalinas como ácidas. La evaluación de los parámetros cinéticos de la enzima libre e inmovilizada no mostró cambios significativos en los valores de Km y Vmax. Creemos que estos resultados amplían las posibilidades de utilización de inmovilizados de LDH tanto para aplicaciones de biosensado como biocatalíticas. 1- K. T. Koivuranta, M. Ilmén, M. G. Wiebe, L. Ruohonen, P. Suominen and M. Penttilä, Microb. Cell Fact., 2014, 13, 107. 2- S. Thitiprasert, S. Sooksai and N. Thongchul, Appl. Biochem. Biotechnol., 2011, 164, 1305–22.

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PLANTAS COMO BIORREACTORES: EXPRESIÓN TEJIDO ESPECÍFICO EN BRACHYPODIUM DISTACHYON

M. Maidana1*; S.Murchio1; C. Leoni2;M. Señorale3; M. Reguera, M. Dalla

Rizza1 1Laboratorio de proteínas, Unidad Técnica de Biotecnología, INIA Las Brujas.

mdallarizza@inia.org.uy; 2Sección Protección Vegetal, INIA Las Brujas 3Sección bioquímica y biología molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República; * Estudiante de Maestría en Biotecnología, Facultad de Ciencias,

Universidad de la República. La producción heteróloga de proteínas en plantas es una tecnología emergente que ha tomado relevancia en la industria biotecnológica, obteniéndose buenos resultados para proteínas postraduccionalmente exigentes. Los péptidos antimicrobianos (AMP) son moléculas esenciales de la inmunidad innata. El péptido antifúngico Aq-AMP2 es resistente a temperaturas, pH extremos y proteasas, no presenta actividad hemolítica ni fitotóxica. Su tamaño aproximado es de 3KDa con una estructura tridimensional estabilizada por tres puentes disulfuro fundamentales para su funcionalidad. Las modificaciones postraduccionales y su pequeño tamaño resultan los principales obstáculos para su producción a gran escala. La expresión en endospermo de semilla se considera excelente alternativa para el escalado de péptidos Se evaluó la expresión tejido-específica y nivel de expresión del gen reportero β-glucuronidasa y de Aq-AMP2 empleando dos promotores, de glutelinas del endospermo de semilla (BdGlu1 de B. distachyon, y OsGt13a de Oryza sativa) y uno ubiquitario de expresión en todos los tejidos (BdUbi10 de B. distachyon). Empleando Agrobacterium tumefaciens como método de transformación se generaron 132 eventos primarios que fueron confirmados por PCR. Plántulas provenientes de semillas T1 fueron seleccionadas inicialmente en higromicina 25mg/ml, trasplantadas y crecidas individualmente en invernáculo bajo normas de Bioseguridad a las cuales posteriormente se confirmó la presencia de inserto mediante PCR. Se estimuló la floración con un fotoperiodo de 18h luz/6h oscuridad a 20o C en cámara de cultivo para evaluación de expresión del gene reportero. Se verificó la expresión tejido-específica para cada promotor, observándose diferencias en los niveles de acumulación del reportero en tejidos.

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DEMANOSIDACIÓN DE GLICOPROTEÍNAS: UNA ESTRATEGIA PARA EVALUAR EL POTENCIAL INMUNOMODULADOR DE RESIDUOS DE

MANOSA EN FASCIOLA HEPATICA

K. Francia1, E. Rodriguez2, T. Freire2, C. Giacomini1 1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de

Química (UdelaR);2 Departamento de Inmunobiología, Facultad de Medicina(UdelaR)

La fasciolosis, una parasitosis causada por helmintos del género Fasciola afecta principalmente al ganado, pero también a los seres humanos. Actualmente se considera un problema infeccioso emergente dada su amplia distribución a nivel mundial. Se ha reportado que algunos motivos glucídicos presentes en las glicoproteínas de parásitos helmintos serían los responsables de la modulación de la respuesta inmune del hospedero. En el caso de Fasciola hepatica, nuestro grupo de investigación ha generado evidencias que señalan que los motivos glucídicos conteniendo manosa estarían involucrados en la regulación de la maduración de células dendríticas. Por lo cual, sería interesante estudiar si glicoconjugados parasitarios desprovistos de residuos de manosa pierden su capacidad inmunomoduladora sobre células dendríticas.

Se utilizó -manosidasa inmovilizada (50 mg; 55UE/mg) para demanosidar lactoferrina (glicoproteína con alto contenido de manosa) y glicoproteínas de un extracto parasitario de Fasciola hepática con un contenido proteico de 14 mg y 0,6 mg respectivamente. Se estudiaron distintos pHs (4.5 y 6.5) y tiempos (7.5 y 24 hs) de reacción. Se confirmó liberación de manosa mediante TLC y HPLC y se observó pérdida de reconocimiento por ConA (lectina que reconoce manosa en forma específica) de un 50% y 36% para la lactoferrina y el extracto parasitario respectivamente. Fue posible reutilizar el derivado enzimático un mínimo de seis veces sin pérdida de su actividad enzimática. Estos resultados confirman la efectividad de esta herramienta enzimática que permite la obtención de glicoproteínas demanosidadas, sin alterar su estructura proteica, lo que permitiría estudiar la pérdida de su capacidad inmunomoduladora frente a células dendríticas.

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DESARROLLO DE UN BIOSENSOR PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-ADNdc EN PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO

SISTÉMICO

P. Fagúndez1, J.P Tosar1, G. Brañas1, J. Laíz1

1Unidad de Bioquímica Analítica, Centro de Investigaciones Nucleares (CIN), Facultad de Ciencias (UDELAR),Uruguay.

Nuestro objetivo es el diseño de un biosensor de base amperométrica capaz de detectar anticuerpos anti-ADNdc de un modo simple, económico y directo, de modo tal de obtener un dispositivo analítico portátil capaz de seguir los empujes del Lupus Eritematoso Sistémico (LES). Para alcanzar dicho objetivo se evaluaron, en este trabajo preliminar, tres métodos de inmovilización de ADNdc, sobre electrodos serigrafiados de carbono grafito: (1) coinmovilización de pirrol y ADNdc, (2) adsorción física mediante poli-L-lisina, y (3) adsorción a potencial constante en electrodos pre-tratados. La detección de los autoanticuerpos anti-ADNdc se determinó mediante ensayos electroquímicos y colorimétricos sobre la superficie de los electrodos, empleando un anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa. Los resultados mostraron que el mejor desempeño se obtuvo mediante la inmovilización de ADNdc a un potencial de +0.5 V, y un sistema de detección amperométrica del producto de la oxidación del sustrato 3, 3', 5, 5' tetrametilbenzidina (TMB), a un potencial de -0.1 V. El sistema, a su vez, fue capaz de responder de forma específica a la presencia de anti-ADNdc en muestras de laboratorio, discriminando anticuerpos específicos de otras inmunoglubulinas y obteniendo una sensibilidad comparable a la de los métodos colorímetricos. Estos resultados sientan las bases para futuras investigaciones tendientes al desarrollo de un dispositivo económico, automatizable y miniaturizable, capaz de ser empleado en medidas de rutina, con muestras reales de pacientes con LES.

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Simposio 3: VIROLOGÍA Coordinadores: P. Moreno, R. Colina, J. Arbiza. Exposiciones: Búsqueda de inhibidores del ensamblaje de la cápside de retrovirus de importancia en salud animal. N. Sierra. Variabilidad genética de las regiones NS3 y NS5B del genoma de Hepatitis C en pacientes uruguayos. N. Echeverría Respuesta a la vacunación contra el virus de la rabia en perros inmunizados en condiciones inmunosupresoras. R. Puentes Aproximación al estudio de cuasiespecies del virus Influenza A H3N2. M. Sóñora Caracterización molecular de virus en el ambiente en el Uruguay. R. Colina.

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RESÚMENES

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BÚSQUEDA DE INHIBIDORES DEL ENSAMBLAJE DE LA CÁPSIDE DE RETROVIRUS DE IMPORTANCIA EN SALUD ANIMAL

N. Sierra1, C. Guillon2, F. Carrión3, O. Pritsch3, L. Randall1, G. Alvarez1

1Laboratorio de Moléculas Bioactivas, CENUR Litoral Norte, UdelaR-Uruguay; 2Biocristallographie et Biologie Structurale des Cibles Thérapeutiques, Institut de Biologie et Chimie des Protéines, Université Lyon I, Lyon, France; 3 Unidad

de Biofísica de Proteínas, Institut Pasteur Montevideo.

Los retrovirus son una preocupación importante de salud pública. En los seres humanos, se estima que más de 35 millones de personas están infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), responsable del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). También afectan al ganado y los animales domésticos. Los gatos domésticos son susceptibles a la infección con virus de inmunodeficiencia felina (VIF), que causa una enfermedad similar al SIDA. El ganado, por otra parte, es afectado por el Virus de la Leucosis Bovina (VLB), agente causal de la Leucemia Bovina enzoótica. Contra estas infecciones que representan un importante problema económico y de salud, no existen vacunas aún. Existen múltiples medicamentos antivirales que logran la sobrevida de las personas infectadas de VIH, pero estos no son de uso veterinario y existe resistencia. Es por todo esto que se hace necesario el desarrollo de nuevos fármacos. Existen varios blancos moleculares para el diseño de fármacos antivirales, tales como la transcriptasa inversa, proteasas, integrasas, la proteína de la cápside (CA), etc. En particular, las interacciones intermoleculares en CA son esenciales para la formación de partículas virales infecciosas, convirtiéndola en un blanco interesante para el desarrollo de compuestos antivirales. En este trabajo se puso a punto una técnica sencilla de búsqueda de moléculas inhibidoras del ensamblaje de la CA de VLB y VIF. Se ensayó además una veintena de moléculas para validar la metodología, descubriéndose un potencial inhibidor del ensamblaje de CA de VLB in vitro.

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VARIABILIDAD GENÉTICA DE LAS REGIONES NS3 Y NS5B DEL GENOMA DE HEPATITIS C EN PACIENTES URUGUAYOS

N. Echeverría*1, G. Betancour*1, S. Boschi2, J. Cristina1, P Moreno1.

1Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República Oriental del Uruguay;

2Laboratorio de Biología Molecular, Asociación Española Primera de Socorros mutuos, Montevideo, Uruguay.

*ambos autores contribuyeron de igual forma a este trabajo. La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) es una de las principales causas de trasplante hepático dada su capacidad de derivar en cronicidad e incluso en hepatocarcinoma. La terapia estándar (interferón-α-pegilado/ribavirina), de acción indirecta, no es 100% efectiva. Recientemente se han desarrollado antivirales de acción directa (DAAs) que actúan a nivel de proteínas virales específicas (proteasa – NS3; polimerasa – NS5B) y se administran como triterapia junto con la terapia estándar. Concomitantemente con el desarrollo de estos fármacos, se han generado mutaciones de resistencia a éstos. El objetivo del presente estudio fue la genotipificación de VHC y la identificación de variantes nuevas y ya asociadas a resistencia a DAAs en las regiones codificantes para NS3 y NS5B en 16 pacientes uruguayos infectados con VHC, naïve a la triterapia. Los resultados muestran que 13 pacientes están infectados con VHC genotipo 1 (9 subtipo 1a y 3 subtipo 1b) y 4 con el genotipo 3 (subtipo 3a). En dos pacientes VHC 1a, la secuencia de NS3 evidenció la presencia de las sustituciones Q80K y Q80L (asociadas a resistencia al DAA simeprevir), y variantes no reportadas previamente. Ninguna sustitución asociada con resistencia a inhibidores de la polimerasa fue detectada en los aislamientos estudiados (si bien hay regiones no abarcadas en nuestro trabajo). La identificación de variantes de NS3 y NS5B resistentes a los DAAs (previo a la triterapia) podría ser útil para identificar a aquellos individuos con menor probabilidad de responder favorablemente a dicha terapia pudiendo ser seleccionados para tratamientos antivirales alternativos.

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RESPUESTA A LA VACUNACIÓN CONTRA EL VIRUS DE LA RABIA EN PERROS INMUNIZADOS EN CONDICIONES INMUNOSUPRESORAS

Calero, D 1; Caresani, B1; Eliopulos, N 2; Suárez, G 2; Silva, ACR3; Batista,

HBCR3; Puentes, R1, * 1Área de Inmunología – Facultad de Veterinaria – Universidad de la Republica

(UdelaR), 2Área de Farmacología – Facultad de Veterinaria - UdelaR – Lasplaces 1550 – Montevideo Uruguay. 3 Instituto Pasteur de Sao Paulo –

Brasil. * Autor para correspondencia: rpuentes@adinet.com.uy

Según la Organización Mundial de Salud (OMS) la forma más eficaz para reducir los casos de rabia anuales en humanos es a través de vacunaciones en perros y gatos, dado que el 90 % de los mismos son debido a mordeduras de perros infectados con el virus. En países de la región, donde se ha evaluado el nivel de protección de perros vacunados contra el virus de la rabia, se han encontrado variaciones importantes. Los objetivos de este trabajo fue evaluar la respuesta inmune humoral contra la rabia en perros con algún tipo de estrés (biológico, quirúrgico o farmacológico). Para esto se evaluó el título de anticuerpos anti-rábicos por la técnica Rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) en perros inmunizados a campo con vacunas polivalentes (Grupo 1) y monovalentes (Grupo 2), que fueron inmunizados al momento de la castración quirúrgica (Grupo 3) o que estaban en tratamiento con corticoides durante la inmunización (Grupo 4). En términos generales los resultados obtenidos indican que en todos los casos, la mayoría de los animales pudieron superar el límite mínimo de anticuerpos para estar protegido según la OMS (0.5UI/ml). Sin embargo, se encontraron diferencias significativas (p<0.05) en el empleo de vacunas monovalentes vs polivalentes, en el uso de corticoides al momento de la inmunización y en la vacunación durante la castración quirúrgica. Esta investigación deja de manifiesto que es viable la vacunación en caninos contra la rabia en determinadas situaciones estresantes para los animales (ej. en campaña de castraciones masivas), aunque la respuesta inmune sea significativamente menor.

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APROXIMACIÓN AL ESTUDIO DE CUASIESPECIES DEL VIRUS INFLUENZA A H3N2

M. Sóñora1, A. Fajardo1, H. Romero2, F. Álvarez2, G. Guerberoff2, J.

Cristina1

1Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, UdelaR, Montevideo, Uruguay; 2Laboratorio de Biomatemática, Facultad de Ciencias, UdelaR, Montevideo, Uruguay.

El virus Influenza A (VIA) es el agente etiológico de la gripe, enfermedad de alto impacto a nivel mundial en salud pública. Estos virus pertenecen a la familia Orthomixoviridae, son envueltos y presentan un genoma constituído por ocho segmentos génicos de ARN sh(-). Al igual que la gran mayoría de los virus con genoma ARN, el VIA presenta elevadas tasas de mutación, enormes tamaños poblacionales y cortos tiempos de generación. Estas características permiten a la población viral emerger y adaptarse rápidamente a nuevos ambientes y hospederos, así como evolucionar hacia resistencia a vacunas y/o drogas antivirales. Estos virus circulan como complejas poblaciones virales constituídas por múltiples variantes genéticamente relacionadas denominadas cuasiespecies. El objetivo del presente trabajo consiste en ahondar en el estudio de las cuasiespecies de VIA H3N2 circulantes en Uruguay entre los años 2011-2013, mediante estudios de secuenciación masiva. Asimismo este trabajo plantea la implementación de algoritomos bioinformáticos que permitan la reconstrucción de los haplotipos dentro de las poblaciones virales. Para esto nos propusimos la secuenciación masiva (NGS) de los genes HA y NA de nueve muestras de pacientes uruguayos, previamente caracterizadas por PCR y secuenciación de Sanger. Se desarrolló un pipeline para el procesamiento de los datos de NGS. Este diseño consiste en varias etapas de filtraje de lecturas, trimado de adaptadores y recorte de reads con baja calidad. Mediante este análisis se se logro la identificaciónde SNPs y sus frecuencias correspondientes, así como el ensamblado de las secuencias consenso. Como perspectiva planteamos la reconstrucción de los haplotipos.

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DIVERSIDAD GENETICA DE VIRUS GASTROENTERICOS EN MUESTRAS AMBIENTALES COLECTADAS EN REGIONES LIMITROFES Y TURISTICAS

DEL URUGUAY R. Colina1, M Victoria1, F López Tort1, A Lizasoain1, L Maya1, M Castells1, M

Miagostovich2, JP Leite2, M Berois3 1 Laboratorio de Virología Molecular. Regional Norte – CENUR Noroeste, Universidad de la República. Gral. Rivera 1350. Salto, 50000, Uruguay. 2 Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental. Instituto Oswaldo Cruz.

Fundação Oswaldo Cruz. Av. Brasil 4365, Rio de Janeiro, 21040-360, Brasil. 3 Sección Virología, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Iguá

4225, 11400, Montevideo, Uruguay.

La transmisión de virus entéricos entre poblaciones humanas a través de aguas superficiales contaminadas con aguas residuales constituye un serio riesgo de salud a nivel global. El objetivo de éste estudio fue determinar la diversidad genética de Rotavirus A (RVA), Norovirus Genogrupos I y II (NoV GI/GII), y Astrovirus Humanos (HAstV), en muestras de aguas residuales de seis ciudades del litoral oeste y noreste del Uruguay, limítrofes con Argentina y Brasil. Se colectaron 116 muestras (marzo 2011/ abril de 2013): a) Litoral oeste, ciudades de Bella Unión, Salto, Paysandú y Fray Bentos (n=96), colectadas quincenalmente (marzo 2011/ febrero 2012); b) Región Noreste, ciudades de Melo y Treinta y Tres (n=20), colectadas cada dos meses (setiembre 2011/ abril 2013). La concentración viral se realizó mediante el método de ultracentrifugación. La extracción del ARN viral, mediante el sistema comercial Qiagen Viral RNA®, y la síntesis del ADN copia (RT) con la enzima SuperScript II Invitrogen ®. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron las siguientes: a) NoV, semi-nested región parcial de la cápside; b) HAstV, región ORF2; y c) RVA, semi-nested multiplex genes VP4 y VP7 (WHO). Los productos de PCR fueron secuenciados bi-direccionalmente y analizados (MEGA 6). Un total de 53% de las muestras fueron positivas para RVA (n = 61); los genotipos P y/o G fueron determinados mediante análisis filogenético para el 61% de las muestras positivas (n= 37) y fueron los siguientes: G1P[8] (n = 1), G2P[4] (n = 4), G3P[8] (n = 1), G3P[3] (n = 1), G12P[8] (n = 1), G1P[X] (n = 1), G2P[X] (n = 10), G3P[X] (n = 3), G12P[X] (n = 1), GXP[3] (n = 1) y GXP[8] (n = 13). Se observó marcada estacionalidad en invierno. NoV fue detectado en todas las ciudades estudiadas: 72% (n=84). 9 pertenecieron a GI, 48 a GII y 27 fueron positivas para ambos genogrupos. Es de destacar la elevada diversidad genética identificada: GII.2 (n=13), GII.4 (n=13), GII.13 (n=4), GII.1 (n=3), GII.6 (n=3), GII.3 (n=1), GII.17 (n=1), GI.1 (n=5), GI.4 (n=5), GI.8 (n=4), GI.3 (n=1), GI.5 (n=1) y GI.6 (n=1). Se observó un completo re-emplazo de las variantes GII.4 New Orleans (2009) por GII.4 Sydney (2012), en 2012. No fue observada estacionalidad en la circulación de NoV. HAstV fue detectado en 49 % (n=57) de las muestras y 75 % (n=43) fueron secuenciadas. 54 % (n=31) pertenecieron al genotipo 1 (linaje 1a); 19 % (n=11) al genotipo 2 (9 al linaje 2d y 2 al linaje 2c) y 2% (n=1) al genotipo 5. El linaje 1a circuló durante todo el período, el 2d en invierno y el 2c solamente en la ciudad de Salto, dónde se observó la mayor diversidad genética, debido a que es un sitio turístico con arribo de personas de distintos países o regiones del Uruguay. Éste estudio, constituye el primer reporte en Uruguay, que ha

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permitido establecer la diversidad genética viral en aguas residuales que son vertidas a ríos de gran importancia y que pueden generar un riesgo para las distintas poblaciones que allí conviven.

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Simposio 4: BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN AGRONOMÍA

Coordinadores: M. J. Pianzzola, J. Monza, E. Casaretto. Exposiciones: “Developing abiotic stress-resistant crops modifying sink-source relationships”. Prof. M. Reguera (USA) Identificación de QTLs asociados a tolerancia/sensibilidad al déficit hídrico en Lotus japonicus. F. Franco Expresión heteróloga y caracterización funcional primaria de un péptido antimicrobiano de Ibirapitá. S. Rodríguez Decuadro Evaluación frente al estrés nitrosativo de mutantes de Arabidopsis deficientes en la acumulación de prolina. C. Imparatta Generación y caracterización de un mutante de la vía de señalización del ácido salicílico en Physcomitrella patens. M.V. Cantera

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RESÚMENES

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DEVELOPING ABIOTIC STRESS-RESISTANT CROPS MODIFYING SINK-SOURCE RELATIONSHIPS

Reguera M1. & Blumwald E2.

1Departamento de Biología, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, 28023, Spain; 2Department of Plant Sciences, University of California, Davis, CA

95616. The development of high yielding cultivars with improved stress tolerance is a major challenge in agriculture. Among the major abiotic stresses, drought is considered the main limiting factor affecting plant growth and productivity, reducing grain yield and compromising food-security worldwide. Drought accelerates plant senescence by reducing the ability to maintain proper sink/source relationships associated with carbon and nitrogen starvation. Using a multidisciplinary approach that combined genomics, proteomics, metabolomics and enzyme activity analysis we identify and characterize cellular/biochemical components that regulate water stress response(s) in crops. Three cases: i) Rice PSARK::IPT transgenic plants were used to investigate the hypothesis of increasing drought tolerance by delaying drought-induced leaf senescence in rice transgenic plants expressing the Agrobacterium tumefaciens IPT gene under the control of a senescence-associated receptor kinase (SARK) promoter (previously tested in Tobacco plants). ii) A chemical approach was used to characterize hormone-related mechanisms responsible for yield enhancements through the regulation of source function in rice grown under control and drought-stress conditions. iii) Also, we analyzed the water stress response in varieties of Chenopodium quinoa (quinoa) identifying pathways involved in the C- and N-partitioning during grain filling. This work contributes to a better understanding of the mechanisms that regulate stress tolerance in plants, indicating the great potential for crop improvement in water-limited areas of the world.

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IDENTIFICACIÓN DE QTLs ASOCIADOS A TOLERANCIA/SENSIBILIDAD AL DÉFICIT HÍDRICO EN Lotus japonicus

F. Franco1, P. Díaz1, J. Monza1, G. Quero1, L.Gutiérrez2, O. Borsani1

1Departamento de Biología Vegetal, Laboratorio de Bioquímica, Facultad de Agronomía, (UDELAR); 2Departamento de Biometría, Estadística y

Computación, Facultad de Agronomía, (UDELAR)

Aumentar el rendimiento de los cultivos en condiciones de déficit hídrico es uno de los mayores desafíos para el mejoramiento genético. El estudio de caracteres cuantitativos como la tolerancia al déficit hídrico, regulados por la acción conjunta de muchos genes, requiere de herramientas experimentales y analíticas que permitan discriminar los componentes genéticos asociados a la expresión fenotípica. En este sentido, la identificación de QTLs asociados a la tolerancia al déficit hídrico es fundamental para la definición de estrategias de mejoramiento. Para contribuir al conocimiento de la base genética de la tolerancia a la sequía, se realizó el fenotipado de una población de RILs de la leguminosa modelo L. japonicus (MG-20 x Gifu) en un sistema de cultivo hidropónico y a partir de la información generada se realizaron análisis de QTLs. Se obtuvieron datos de fenotípicos de peso seco de tallo y raíz, tasa de crecimiento relativa de tallo y raíz, relación raíz/tallo y la tasa de desarrollo de hojas y se identificaron un total de 20 QTLs. El QTL TM1150 en el cromosoma 2 co-localizó para rasgos de crecimiento de tallo y raíz, mientras que los QTLs TM0246 en el cromosoma 3 y TM0169 en el cromosoma 6 co-localizaron para rasgos de crecimiento de la raíz y rasgos de desarrollo. Esto sugiere que el crecimiento de tallo y raíz está controlado por los mismos loci y que el crecimiento de las raíces y los caracteres de desarrollo podrían estar genéticamente ligados.

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EXPRESIÓN HETERÓLOGA Y CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL PRIMARIA DE UN PÉPTIDO ANTIMICROBIANO DE IBIRAPITÁ

S. Rodríguez-Decuadro1,4

, A. de Freitas2, A. Benko-Iseppon

3, G. Cecchetto

4

1Laboratorio de Biotecnología, Facultad de Agronomía, Universidad de la

República; 2Laboratório de Estudos Moleculares e Terapia Experimental,

3Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal, Departamento de Genética.

Universidade Federal de Pernambuco, Brasil; 4Laboratorio de Microbiología

Molecular, Microbiología, Facultad de Ciencias-Facultad de Química, Universidad de la República, Uruguay

Las plantas y los animales poseen un conjunto de potentes péptidos antimicrobianos (AMPs, antimicrobial peptides), utilizados como defensa contra una amplia variedad de patógenos. Estos AMPs se caracterizan por su pequeño tamaño, carga positiva y amplia actividad biológica. En plantas, los principales grupos de éste tipo de péptidos son las defensinas, tioninas, esnaquinas, proteínas de transferencia de lípidos y ciclótidos Su utilización para el desarrollo de fármacos y de agentes para el biocontrol de plagas en la agricultura, justifica la investigación de este tipo de moléculas partir de fuentes naturales con alta diversidad genética pero aún muy poco exploradas como son las plantas nativas. El objetivo de este trabajo fue producir de forma recombinante un AMP de una especie vegetal nativa de nuestro país. Para ello, se aisló el ARNm de un péptido antimicrobiano de tipo esnaquina (PdSN1) a partir del brotes de Peltophorum dubium y se expresó de forma recombinante en E. coli. Se probaron dos sistemas cepa/vector a diferentes tiempos y temperaturas de crecimiento post-inducción. El sistema más efectivo resultó E. coli Rossetta-gami/pET102, en el que a las 24 hs post inducción y a una temperatura de crecimiento de 28°C, se detectó el péptido recombinante en la fracción soluble, en cantidades adecuadas para su purificación. Los primeros análisis de actividad antimicrobiana (ensayos de difusión en placa y MIC (mínima concentración inhibitoria), detectaron inhibición del crecimiento de la bacteria Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, enfrentada al péptido recombinante purificado.

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EVALUACIÓN FRENTE AL ESTRÉS NITROSATIVO DE MUTANTES DE ARABIDOPSIS DEFICIENTES EN LA ACUMULACIÓN DE PROLINA

C. Imparatta1, F.J. Corpas2, O. Borsani1, J. Monza1, S. Signorelli1

1Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía (UDELAR); 2Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas,

Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC-España) Una respuesta conservada en plantas frente a diversos estreses bióticos y abióticos es la acumulación de prolina. Si bien no se conoce su función en dichas condiciones, uno de los roles más asignados es el antioxidante, aunque las evidencias en este sentido no son claras. En este trabajo se utilizaron mutantes de Arabidopsis thaliana knockout para el gen p5cs1, gen responsable de la acumulación de prolina. En estas plantas se evaluó el estrés nitro-oxidativo en condición de estrés salino. En estas condiciones los mutantes evaluados, p5cs1-1 y p5cs1-4, acumularon menos prolina que el salvaje y no evidenciaron mayor nitración de proteínas que el salvaje. Esto sugiere que la prolina no participa en la protección frente al daño nitro-oxidativo. Para confirmarlo, se realizaron ensayos in-vitro con extractos proteicos de hoja, que se sometieron a tratamiento con SIN-1 (generador de peroxinitrito), con agregado de prolina 100Mm y sin prolina. Se determinó la nitración de proteínas y la actividad de la isocitrato deshidrogenasa, enzima que se inactiva por nitración. Los resultados evidenciaron que la nitración y la inactivación ocurren tanto en presencia como en ausencia de prolina. Analizando estos resultados y el mecanismo de nitración, concluimos que la prolina no es un scavenger del peroxinitrito (ONOO-/ONOOH), superóxido (O2

•-), óxido nítrico (•NO) y dióxido de nitrógeno (•NO2), y por lo tanto no es capaz de proteger frente a diversas especies reactivas como ha sido propuesto durante muchos años.

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GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN MUTANTE DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN DEL ÁCIDO SALICÍLICO EN PHYSCOMITRELLA PATENS

M.V. Cantera, A.V. García, C. Ruibal, A. Castro, S. Vidal

Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR) NPR1 (NON-EXPRESSOR OF PATHOGENESIS-RELATED GENES 1) es un regulador positivo de la vía de señalización dependiente del ácido salicílico (SA) en plantas. Esta proteína es requerida para la activación de la expresión de los genes de defensa (PR) y el establecimiento de la respuesta sistémica adquirida (SAR). Se ha demostrado que en Arabidopsis, el mutante npr1 es insensible al SA, posee una expresión reducida de genes PR, y es más susceptible a cierto tipo de patógenos. Se han realizado varios estudios sobre NPR1 en plantas vasculares, pero poco se sabe sobre su funcionamiento en plantas no vasculares. Physcomitrella patens es una briofita modelo que, debido a su alta taza de recombinación homóloga, es muy útil para estudios de genética reversa. Physcomitrella acumula SA en respuesta a la infección por ciertos patógenos, pero se desconoce la función qué cumple esta hormona en la defensa frente a patógenos. Physcomitrella contiene dos genes ortólogos a NPR1, aquí denominados PpNPL1 y PpNPL2, cuya función es también desconocida. El presente trabajo tuvo como objetivo analizar el rol de la proteína PpNPL2 durante el desarrollo y en respuesta a patógenos en Physcomitrella. Con la intención de dilucidar el rol fisiológico de PpNPL2 en Physcomitrella y dada la posibilidad de realizar disrupciones génicas dirigidas en su genoma, se obtuvo un mutante “knockout” para dicho gen. Análisis fenotípicos preliminares sugieren que los mutantes son más susceptibles a la infección con Botrytis cinerea.

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Simposio 5: PARASITOLOGÍA MOLECULAR Coordinadores: L. Pérez, H. Ferreira, V. Fernández. Exposiciones: “Transcriptomic and proteomic studies in cestode parasites”. Prof. H. Ferreira (Brasil, invitado SBBq) Repertorio de tipos celulares y expresión de marcadores moleculares en Mesocestoides corti. M. F. Domínguez. Nuevos compuestos organometálicos de n-óxido de amina aromática como potenciales agentes contra la enfermedad de Chagas. F. Mosquillo. Efectos de las mucinas de la capa laminar de Echinoccocus granulosus sobre células dendríticas diferenciadas in vitro en presencia de FLT3-L. Y. Martínez. Clonado y expresión de receptores nucleares tipo PPAR en Echinococcus granulosus. X. Riera.

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RESÚMENES

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TRANSCRIPTOMIC AND PROTEOMIC STUDIES IN CESTODE PARASITES

K. M. Monteiro 1, K. R Lorenzatto 1, T. Bazika 1; A. Teichmann 1, J. A Debarba 2, G. B. dos Santos 2, J. C. de Lima 1, A. Zaha 2 & H. B. Ferreira 1,2.

1 Laboratório de Genômica Estrutural e Funcional, Centro de Biotecnologia (CBiot), Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS, Brazil; 2 Laboratório de Biologia Molecular de Cestódeos, CBiot, UFRGS;

Porto Alegre, RS, Brazil. Echinococcus spp. and Mesocestoides corti are useful cestode models for studies on several aspects of flatworm parasite’s biology. Pioneering transcriptomic analyzes performed with Echinococcus granulosus, later complemented by genomic data, provided starting datasets of annotated gene products for subsequent proteomic studies. A comprehensive proteomic survey was performed with E. granulosus main metacestode (hydatid cyst) components (protoscoleces, cyst wall, and hydatid fluid), allowing the identification of hundreds of parasite proteins present in parasite-host interfaces and excretion/secretion (ES) products. Comparative proteomic analyzes are being carried out to identify differences between ES products of E. granulosus, Echinococcus ortleppi, and Echinococcus multilocularis, whose metacestodes are adapted to different host species and/or present developmental differences. Studies on newly synthesized proteins upon protoscolex activation by pepsin are also under way. Mass spectrometry-based proteomics has also been used for functional studies, mainly focused on protein-protein interactions, and top-down proteomics approaches are being used to investigate E. granulosus protoscolex subcellular fractions and proteins with post-translational modifications. Regarding M. corti, an in vitro culture system in which the whole strobilation process can be followed, from the tetrathyridium larval stage to the adult stage, was standardized and is being used for both RNA-seq and proteomics studies, in order to identify genes, miRNAs and proteins that are differentially expressed during strobilation. Overall, the generated results allowed to identify several molecules that are likely important for the survival, infectivity and/or development of parasite cestodes, as well as potential developmental markers, drug-targets, and diagnostic and vaccine antigens for echinococcosis and/or other cestodiases. Financial support: CAPES, CNPq, and FAPERGS.

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REPERTORIO DE TIPOS CELULARES Y EXPRESIÓN DE MARCADORES MOLECULARES EN MESOCESTOIDES CORTI.

M.F. Dominguez1, A. Costábile1, U, Koziol1, J.Tort2 , E. Castillo1

1Sección Bioquímica y biología molecular , Facultad de Ciencias, (UDELAR); 2

Departamento de Genética - Facultad de Medicina (UDELAR)

Nuestro grupo busca contribuir al estudio de células proliferativas de Cestodos, particularmente estamos interesados en el aislamiento y caracterización de estas células. En estos organismos se ha demostrado que no existe proliferación entre las células somáticas diferenciadas, siendo las células proliferativas las responsables de la renovación celular. Esto sugiere que estas juegan un rol importante durante el ciclo de vida de estos parásitos, la caracterización de estas células contribuiría a un mayor entendimiento de la biología del cestodo y aportaría nuevos blancos para su eventual control. En nuestro laboratorio se ha determinado la localización de estas células durante el desarrollo estrobilar de Mesocestoides corti, y hemos conseguido aislar estas células por citometría de flujo, identificando las poblaciones celulares en cada fase del ciclo celular. Para profundizar en el estudio de estas células, trabajamos en la optimización del cultivo in vitro partiendo de macerados celulares, la caracterización morfológica de los diferentes tipos celulares y determinamos la expresión de posibles marcadores moleculares. Utilizando diferentes tinciones sobre suspensiones celulares logramos la identificación de los diferentes tipos celulares presentes en M. corti. Los resultados de los cultivos celulares han sido muy alentadores, ya que logramos obtener células capaces proliferar en todos las condiciones testeadas. Determinamos los niveles de expresión de marcadores moleculares de estas células a lo largo del desarrollo de M. corti y analizamos estos marcadores en el genoma y transcriptoma. Estos resultados nos permiten avanzar para poder contribuir al conocimiento de las células proliferativas y eventualmente lograr el cultivo de líneas celulares.

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NUEVOS COMPUESTOS ORGANOMETÁLICOS DE N-ÓXIDO DE AMINA AROMÁTICA COMO POTENCIALES AGENTES CONTRA LA

ENFERMEDAD DE CHAGAS

F. Mosquillo1, D. Gambino2, L. Pérez-Díaz1 1Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias, UdelaR;

2Cátedra de Química Inorgánica, Facultad de Química, UdelaR La enfermedad de Chagas es una parasitosis potencialmente mortal causada por Trypanosoma cruzi, y constituye un importante problema de salud pública principalmente en Latinoamérica. Recientemente hemos reportado la caracterización de nuevos compuestos metálicos de N-óxido de amina aromática de paladio y platino, los cuales registran valores de IC50 en el rango submicromolar sobre T. cruzi, con excelentes valores de índice de selectividad. Para profundizar en el estudio del modo de acción de estos compuestos, realizamos ensayos de citometría de flujo usando sondas fluorescentes como marcadores de apoptosis temprana y necrosis, para estudiar el mecanismo de muerte celular que inducen. Por otro lado, estudios previos de docking molecular en T. cruzi sugieren que ambos compuestos serían buenos inhibidores de la enzima NADH-fumarato reductasa (FRD). Dado que esta enzima no está presente en el hospedero mamífero, y además cataliza un importante paso metabólico imprescindible para la viabilidad del parásito, resulta de interés como blanco terapéutico. El efecto de los compuestos sobre la actividad enzimática fue confirmado experimentalmente mediante el uso de extractos proteicos de T. cruzi, lo que motivó esfuerzos para producir la enzima recombinante. Actualmente estamos realizando ensayos de actividad enzimática in vitro con la proteína recombinante purificada para determinar su funcionalidad, lo que permitirá evaluar el efecto inhibitorio de los compuestos, con el fin de validar a FRD como blanco de acción de los mismos. Simultáneamente, estamos seleccionando parásitos transfectados sobreexpresando la enzima FRD para evaluar el efecto de la incubación con los compuestos organometálicos sintetizados.

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EFECTOS DE LAS MUCINAS DE LA CAPA LAMINAR DE ECHINOCCOCUS GRANULOSUS SOBRE CÉLULAS DENDRÍTICAS

DIFERENCIADAS IN VITRO EN PRESENCIA DE FLT3-L

Y. Martínez1, Á. Pittini1, Á. Díaz1, C. Casaravilla1 1Cátedra de Inmunología, Facultad de Química/Ciencias (UDELAR)

Echinoccocus granulosus es el parásito que causa la hidatidosis. Su larva está rodeada la capa laminar (LL), rica en mucinas, que además de protegerla, interacciona directamente con el medio interno del hospedero, contribuyendo a la fuerte regulación de la respuesta inflamatoria que caracteriza a estos helmintos. En este contexto, estudiamos los efectos de partículas de la LL (pLL) sobre el fenotipo de células dendríticas diferenciadas in vitro con FLT3-L (FL-DC, representativas de células residentes de tejidos) y su comparación con las diferenciadas con GMCSF (GM-DC, representativas de células condicionadas a responder de forma inflamatoria). Previamente, nuestro grupo caracterizó los efectos de pLL sobre GM-DC evaluando la expresión de moléculas coestimuladoras (CD40 y CD86), y la secreción de citoquinas pro (IL-6, IL-12) y anti-inflamatorias (IL-10), en ausencia y presencia de LPS. Se vio que en estas células pLL aumenta la expresión de CD86 y además afecta la respuesta a LPS, disminuyendo la expresión de CD40, IL-6 e IL-12 y potenciando la producción de IL-10. En el presente trabajo, se observaron las mismas tendencias al evaluar los efectos sobre FL-DC a excepción de CD40, cuya expresión se vio potenciada por pLL. En los estudios previos se había observado que la inhibición de la expresión de CD40 está correlacionada con una disminución de la fosforilación de AKT y de su sustrato GSK3. Actualmente evaluamos cómo se afectan dichas fosforilaciones en las FL-DC donde, debido a que la expresión de CD40 se ve potenciada, no esperamos observar la inhibición vista en GM-DC.

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CLONADO Y EXPRESIÓN DE RECEPTORES NUCLEARES TIPO PPAR EN ECHINOCOCCUS GRANULOSUS.

X. Riera, G. Alvite, A. Esteves

Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias (UDELAR) Nuestro grupo de investigación se ha centrado en el estudio de la estructura y función de las proteínas de unión de ácidos grasos (FABPs), en particular del platelminto parásito Echinococcus granulosus. Estos organismos son incapaces de sintetizar de novo ácidos grasos (AG), dependiendo de transportadores para la captura y distribución intracelular de los mismos. Distintas experiencias demuestran la presencia de FABPs en el núcleo celular y su interacción con receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPARs), para transferirles el ligando, y así actuar como reguladores de la expresión génica. Recientemente hemos demostrado la presencia de EgFABP1 en el núcleo de células de E. granulosus, siendo esta proteína un firme candidato para transportar AG hacia este compartimento. En este contexto, nos propusimos estudiar la posible interacción entre EgFABP1 y un receptor tipo PPAR. Para ello, iniciamos en primera instancia la búsqueda y clonado de parte de la región codificante correspondiente a una proteína tipo PPAR de E. granulosus y la purificación de la proteína recombinante correspondiente. El clonado se realizó mediante RT-PCR a partir de ARN de protoescólices, empleando varios pares de oligonucleótidos diseñados a partir de secuencias con similitud elevada con los factores buscados. El fragmento resultante fue secuenciado y clonado en el vector pGM-T, subclonado en el vector de expresión pET22b(+) y propagado en la cepa de E. coli BL21 pLysS. La proteína recombinante fue expresada a distintas temperaturas y condiciones de inducción para ser purificadas mediante cromatografía de afinidad.

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Simposio 6: EDUCACIÓN EN CIENCIAS “Leopoldo De Meis”

Coordinadora: A. Corbacho. Exposiciones: Mesa Redonda: Homenaje a Leopoldo De Meis Invitados: J. Soteo, J. C. Benech. Profesor Invitado: Prof. A. Galina (Brasil). Moderadores: A. M. Corbacho Rodríguez, J. Passarini y J. P. Damián. Mesa Redonda: Reflexiones sobre la Educación en Ciencias ¿Existe un modelo de educación de las ciencias? J. Leymonié La motivación académica y el desarrollo de competencias. A. M. Corbacho Rodríguez Moderadores: J. Passarini y J. P. Damián. Presentación de trabajos libres. Moderadores: A. M. Corbacho Rodríguez, J. Passarini y J. P. Damián. Juegos didácticos para la enseñanza de la inmunología veterinaria. A. Porro. Talleres extracurriculares de apoyo en bioquímica para estudiantes del curso de biología molecular y celular de la facultad de veterinaria. M. Rodríguez Piñón.

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RESÚMENES

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¿CÓMO ENSEÑAR CIENCIAS EN LA UNIVERSIDAD? APORTES DESDE LA DIDÁCTICA DE LAS CIENCIAS.

J. Leymonié Sáenz1

1 Departamento de Educación Veterinaria – Facultad de Veterinaria (UDELAR)

En los años 60 del siglo XX se desarrolló un especial interés por el mejoramiento de la enseñanza de las ciencias, fundamentalmente en Europa y EEUU, en la educación básica y media. Este interés estuvo motivado por factores políticos y económicos: en el año 1957 la URSS, mostrando un fuerte poderío tecnológico – industrial, puso en órbita el primer satélite artificial de la humanidad, el Sputnik. El mundo occidental debía ponerse a tono realizando profundas reformas en los currículos de ciencias, estimulando el desarrollo de una nueva área del conocimiento, la Didáctica de las Ciencias. Hoy, internacionalmente, esta disciplina está interesada en investigar el poco interés que despierta en los estudiantes el abordaje de carreras científicas, así como el bajo rendimiento en las áreas científicas. Nuestro país no es ajeno a este fenómeno. Si bien las investigaciones de la Didáctica de las Ciencias han estado centradas en la educación básica y media, en el momento actual han comenzado a enfocarse en la enseñanza de las ciencias en el nivel superior (formación docente y universidad). En esta ponencia nos proponemos presentar una breve panorámica de algunas estrategias de enseñanza interesantes para ser aplicadas en ambientes universitarios. Las mismas aprovechan las posibilidades de los docentes, que a la vez son investigadores, asociando así la enseñanza y la investigación. Estas estrategias podrían estimular la motivación, tanto de profesores como de estudiantes, logrando así mejoras en la calidad de la enseñanza y del aprendizaje de las ciencias naturales en la universidad.

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LA MOTIVACIÓN ACADÉMICA Y EL DESARROLLO DE COMPETENCIAS. RESULTADOS DE UN MODELO INTENSIVO DE EDUCACIÓN

INTERDISCIPLINARIA A NIVEL DE GRADO

A. M. Corbacho Espacio Interdisciplinario, UdelaR

El aprendizaje basado en problemas (ABP) y los modelos de educación interdisciplinaria (Ed InterD) son frecuentemente mencionados como metodologías de educación superior que pueden conducir a incrementar la motivación académica, el aprendizaje autorregulado y el desarrollo de competencias profesionales y/o académicas. Sin embargo, frecuentemente se utilizan argumentos sobre la dificultad de utilizar estas aproximaciones de manera efectiva en clases masificadas y en el contexto de programas enfocados a cubrir amplias cantidades de conocimiento en corto tiempo. Esta puja entre lo que podría parecer ideal y el contexto real de la educación superior nos deja frecuentemente en una encrucijada en que elegir una vía implica dejar de lado los beneficios de la otra. En esta ponencia presentaremos el diseño, la implementación y los resultados, a corto y largo plazo, de un mini curso intensivo de bioquímica/química analítica diseñado para capitalizar los beneficios del ABP y la Ed InterD. El curso tuvo dos semanas duración y fue dictado durante 6 años consecutivos en la Universidad de California Davis. Para la recolección y el análisis de datos se utilizó un abordaje de métodos mixtos. Se presentarán resultados del impacto inmediato y a largo plazo (1-6 años después del curso) en aspectos de motivación, autoeficacia y desarrollo de competencias. Como resultado de este estudio concluimos que la participación de estudiantes de grado en mini cursos de corte intensivo y altamente integrativo puede motivar el desarrollo de competencias de manera específica y tener un efecto a largo plazo en el desarrollo de su identidad profesional.

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JUEGOS DIDACTICOS PARA LA ENSEÑANZA DE LA INMUNOLOGÍA VETERINARIA.

A. Porro23, E. De Palleja23, C. Lobecio23, J. Passarini2, R. Puentes1

1Área de Inmunología, 2 Departamento de Educación Veterinaria, 3Tesistas de Grado, Facultad de Veterinaria. Universidad de la República. Lasplaces 1550.

CP 11600. Montevideo – Uruguay. Introducción El presente trabajo describe una innovación para la enseñanza de Inmunología en la Facultad de Veterinaria. Está centrado en la incorporación de estrategias lúdicas que desarrollaron algunos estudiantes seleccionados del curso impartido en el año 2014. La premisa es que los juegos didácticos son una acción educativa que parte de una concepción integral de la persona, incorporando sus emociones, pensamientos y experiencias, para promover aprendizajes significativos en términos de conocimiento de la asignatura y de habilidades sociales. El objetivo fue desarrollar y utilizar juegos didácticos como herramientas de aprendizaje, evaluando si existen mejoras en la motivación por la materia y el rendimiento académico. Se realizó una prueba diagnóstica, para conformar 4 grupos de estudiantes con rendimientos similares. Tres grupos participaron de juegos especialmente diseñados (grupo 1: Trivia; grupo 2: Puzzle; grupo 3: Twistter) y un grupo no jugó (control), participando un total de 49 individuos. Luego de la participación en los juegos se compararon los resultados en las evaluaciones parciales de todos los estudiantes y se realizó una encuesta a los que jugaros. Los resultados obtenidos demuestran que los estudiantes consideran que la técnica implementada es de utilidad para la enseñanza de inmunología ya que facilita el aprendizaje a través del uso de diferentes estrategias: realizar preguntas a los compañeros, participar del trabajo en equipo para responder y colaborar con la preparación de pruebas parciales. Sin embargo no se encontraron diferencias significativas en el rendimiento de los estudiantes. Se entiende que se deben realizar otros ensayos para profundizar estas investigaciones.

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TALLERES EXTRACURRICULARES DE APOYO EN BIOQUÍMICA PARA ESTUDIANTES DEL CURSO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR DE

LA FACULTAD DE VETERINARIA

M. Rodríguez-Piñón, C. López, A. Freitas-de-Melo, D. Casuriaga, J. P. Damián, C. Tasende

Departamento de Biología Molecular y Celular, Área de Bioquímica, Facultad de Veterinaria (UDELAR)

El objetivo fue contribuir a mejorar la performance en el curso de Biología Molecular y Celular (BMC) de los estudiantes con menor desempeño (< 50%) en los contenidos de química y biología en una prueba diagnóstica previa al curso. Se dictaron talleres extra curriculares en paralelo con el curso de BMC, con contenido teórico y práctico de Bioquímica, totalizando 120 presenciales/alumno y posteriormente tutorías de preparación para los exámenes. El curso de BMC se aprueba con más del 80% de asistencia a los prácticos y los estudiantes tienen la opción de realizar dos parciales. Aquellos estudiantes que superan el 65% de exigencia en los dos parciales rinden una prueba globalizadora con un 50% de exigencia para exonerar (la exigencia del examen de BMC es de 60%). De los alumnos que asistieron a los talleres de apoyo (n=112), el 74,1% aprobaron el curso de BMC sin exonerar, 24,1% exoneraron y el 1,8% no aprobaron. Del total de alumnos que cursaron BMC (n=476), el 63,4% aprobaron sin exonerar, 24,5% exoneraron y el 11,8% no aprobaron. El porcentaje de aprobación del curso de BMC fue mayor en los estudiantes que asistieron a los talleres de apoyo respecto al total de estudiantes que cursaron BMC (98,2% vs. 88,2%; p<0,01; χ2). No hubo diferencias entre ambas poblaciones en el porcentaje de aprobación de los exámenes. Se concluye que los talleres de apoyo contribuyeron a mejorar la aprobación del curso de BMC en la población objetivo, manteniendo los niveles de exoneración y de aprobación de exámenes. Financiación: Comisión Sectorial de Enseñanza y Comisión de Evaluación Interna y Acreditación (Programa 348), UdelaR.

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Simposio 7: BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS

Coordinadores: P. Irisarri, I. Bado, V. García. Exposiciones: Cepas y serotipos de Salmonella Enterica en Uruguay, una mirada a la epidemiología desde los genomas completos. L. Betancor Degradación de compuestos aromáticos y resistencia a metales pesados en beta-rizobios asociados a Mimosas nativas. L. Sandes Entornos genéticos de blaVIM-2 en aislamientos clínicos de Pseudomonas spp. R. Papa Regulación de la expresión del gen que codifica para la bacterioferritina de Sinorhizobium meliloti 1021. D. Costa Rol del dominio c-terminal de UreA en el tráfico intracelular, desde y hacia la membrana plasmática. M. Sanguinetti

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RESÚMENES

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CEPAS Y SEROTIPOS DE SALMONELLA ENTERICA EN URUGUAY, UNA MIRADA A LA EPIDEMIOLOGÍA DESDE LOS GENOMAS.

L. Betancor*, B. D´Alessandro, V. Pérez, A. Martínez, L. Yim, A. Iriarte y A.

Chabalgoity Depto. Bacteriología y Virología – Depto. Desarrollo Biotecnológico, Instituto de

Higiene, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. *laurabet@higiene.edu.uy

Salmonella enterica representa una de las principales causas de enfermedad trasmitida por alimentos, siendo Enteritidis y Typhimurium los serotipos predominantes como causa de infección humana. En Uruguay, estos dos serotipos, se han turnado en diferentes períodos como el que prevalece frente al resto. S. Typhimurium prevaleció hasta 1995, cuando se registró el primer brote epidémico en el país por S. Enteritidis. Entre 1995 y 2004, puede definirse un “período epidémico” de serovar Enteritidis, que causa muchísimos brotes y casos aislados, superando ampliamente a todos los demás serotipos circulantes. Desde 2005 en adelante, se registra un nuevo incremento de los aislamientos del serovar Typhimurium y a partir de 2010 Enteritidis vuelve a prevalecer. Las cepas del mismo serovar provenientes de distintos períodos han demostrado ser genéticamente muy similares, resultando indistinguibles por MLST. La tipificación aplicando PFGE, RAPD y DNA microarrays ha resultado insuficiente en su capacidad de discriminación intra-serotipo. Nos planteamos analizar la circulación de grupos genéticos de estos dos serotipos a lo largo del tiempo, basándonos en el análisis de SNPs de genomas completos. Para esto, seleccionamos 43 cepas del serovar Typhimurium y 56 Enteritidis aisladas entre 1976 y 2013, de manera de representar diferentes orígenes y períodos. Los genomas fueron secuenciados utilizando Illumina, ensamblados utilizando Spades y utilizados para realizar análisis filogenético basado en SNPs. Dentro del serovar Typhimurium encontramos 2 grupos genéticos, uno que se mantiene en el tiempo y otro que disminuye a partir del período de prevalencia de Enteritidis para volver a aumentar luego de 2005. Dentro del serovar Enteritidis se definieron 3 grupos, uno de los cuales desaparece antes del período epidémico, un segundo grupo que circuló en baja prevalencia y aumentó en frecuencia en el período post-epidémico, mientras que un tercer grupo aparece al comienzo de la epidemia y se mantiene circulando hasta la actualidad. En el período actual, co-circulan 2 grupos genéticos de cada uno de los serotipos. Al comparar los genomas de las cepas uruguayas con los de aislamientos de otras regiones del mundo, encontramos que nuestras cepas de Enteritidis se diferencian en una rama distinta de la mayoría de los otros genomas disponibles. Por otra parte, al considerar las cepas de Typhimurium en un contexto internacional, uno de los tipos parece ser propio de nuestra región, mientras que el otro tipo agrupa con distintos aislamientos europeos y americanos. Estos resultados resaltan la importancia de secuenciar cepas de la región, ya que los genomas disponibles no representan la realidad regional. Nuestros resultados muestran también que la epidemia de S. Enteritidis coincide con la circulación de dos linajes, pero solo uno de ellos sería responsable de la diseminación epidémica de este serovar. Ciertos subgrupos genéticos pueden corresponder a variantes asociadas a períodos epidemiológicos particulares.

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DEGRADACIÓN DE COMPUESTOS AROMÁTICOS Y RESISTENCIA A METALES PESADOS EN BETA-RIZOBIOS ASOCIADOS A Mimosas

NATIVAS

L. Sandes, M. Zabaleta, A. Iriarte, F. Battistoni, R. Platero y E. Fabiano

Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas (BIOGEM). Instituto de Investigaciones Biológicas “Clemente Estable”. Ministerio de Educación y

Cultura. Los rizobios son bacterias del suelo que tiene la habilidad de formar asociaciones simbióticas con leguminosas. Durante esta asociación, los rizobios llevan a cabo el proceso de fijación biologica de nitrógeno, permitiendo a las plantas cercer sin la necesidad de agregado de fertilizantes nitrogenados. En trabajos previos encontramos que el género Mimosa en Uruguay está preferentemente asociado a rizobios pertenecientes a las beta-proteobacterias con una marcada preferencia por el género Cupriavidus. El análisis filogenético de representantes de esta colección mostró las existencia de nuevas especies de Cupriavidus asociados a Mimosas en nuestro país. Considerando que este genero bacteriano se caracteriza por tener una gran versatilidad metabólica y elevada resistencia a metales, decidimos ensayar la capacidad de algunas cepas de metabolizar compuestos aromáticos (fenol, tolueno), de usar n-butanol, citrato, succinato y glicerol como fuentes carbonadas y de crecer en presencia de metales pesados tales como Cd, Cu, Mn, Co, Zn, Ni, Ag y Fe. Se observó en general una buena respuesta de las cepas, excepto frente a Cd, Te y Ag. Interesantemente, algunas cepas formaron precipitados en presencia de CuSO4 1mM, K2TeO3 50 μM o CoCl2 1mM. También se analizó la presencia en el genoma de tres cepas, de genes relacionados a estos fenotipos. Los resultados muestran la presencia de genes y vias metabólicas implicadas tanto en la degradación de compuestos aromáticos como en la resistencia a metales pesados. Estas funciones, importantes para la adaptación ambiental de las bacterias, podrían tener uso en la biorremediación de suelos y otras aplicaciones biotecnológicas.

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ENTORNOS GENÉTICOS DE blaVIM-2 EN AISLAMIENTOS CLÍNICOS DE Pseudomonas spp.

R. Papa1, I. Bado1, C. Gutiérrez2, P. Hytategui3, V. Seija2, 4, R. Vignoli1

1Departamento de Bacteriología y Virología, Facultad de Medicina (UDELAR); 2Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina (UDELAR); 3Hospital de Florida;

4Hospital Pasteur En Uruguay, desde el año 2012 se han aislado Pseudomonas spp. resistentes a carbapenemes debido a la producción de una metaloenzima del tipo VIM-2. Debido a la frecuente asociación de blaVIM-2 con elementos genéticos movilizables, se realizó la búsqueda y caracterización molecular de integrones. Se analizaron 28 aislamientos clínicos de P. aeruginosa (n=19) y P. putida (n=9) portadores de blaVIM-2, a los que se les realizó PCR para la búsqueda de integrones de clase 1, 2 y 3, regiones variables, e ISCR1. Los amplicones fueron confirmados por secuenciación. Se detectaron 26 integrones de clase 1, encontrándose regiones variables con los siguientes arreglos de cassettes: blaVIM-2; blaVIM-2/blaGES-7/aacA7/aacA4/aacA7; blaVIM-2/aacA4/cmlA/catB; blaVIM-

2/aacA4. No se amplificaron integrasas de clase 2 y 3 ni ISCR1. Los genes hallados confieren resistencia a aminoglucósidos, cloranfenicol y beta-lactámicos. La resistencia a aminoglucósidos y a otros antibióticos es común en microorganismos portadores de metalo-beta-lactamasas, dando origen a multi o panresistencia. Esto disminuye las opciones terapéuticas, ya que tanto carbapenemes como aminoglucósidos son ampliamente utilizados contra infecciones intrahospitalarias ocasionadas por estos gérmenes. En la bibliografía se han reportado integrones de clase 1 con blaVIM-2 junto a aac, cat o cml, pero ninguno con las configuraciones halladas en este trabajo y tampoco asociado a blaGES. La presencia de mecanismos de resistencia a tres familias de antibióticos en un mismo integrón facilita su diseminación a otros microorganismos, y permite su asociación a nuevos genes de resistencia. Esta asociación a un mecanismo emergente como las carbapenemasas es un desafío para el sistema de salud.

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REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN QUE CODIFICA PARA LA BACTERIOFERRITINA DE SINORHIZOBIUM MELILOTI 1021

D. Costa1, V. Amarelle1, C. Valverde2, E. Fabiano1

1Departamento de Bioquímica y Genómica Microbiana, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Uruguay; 2Universidad Nacional

de Quilmes, Argentina El hierro es un metal esencial para la mayoría de los organismos, debido a que participa como cofactor en una gran variedad de procesos celulares. Sin embargo, su acumulación en el citosol puede ser tóxica, debido a la formación de especies reactivas del oxígeno. Por esto, la homeostasis del hierro debe ser finamente regulada. Así entran en juego las proteínas de almacenamiento de hierro, que protegen a las células del efecto oxidativo, al almacenar hierro en su cavidad. El propósito de este trabajo fue determinar la regulación de la expresión del gen que codifica para la bacterioferritina en la bacteria diazótrofa Sinorhizobium meliloti. Nuestra hipótesis es que el hierro almacenado en proteínas tipo ferritina, es empleado por los rizobios como fuente de hierro cuando se enfrenta a condiciones de baja biodisponibilidad del metal. En trabajos previos se identificó el gen de la bacterioferritina (bfr) como el único gen que codifica para proteínas de almacenamiento de hierro en S. meliloti y se construyó una mutante donde bfr fue interrumpido con un casete conteniendo el gen de la beta-galactosidasa. Esta construcción permite estudiar indirectamente la regulación general de la expresión de Bfr. En este trabajo se construyeron también diferentes plásmidos que contienen el gen que codifica para GFP bajo la acción de diferentes regiones promotoras de bfr¸ para analizar la regulación transcripcional. Los resultados obtenidos indican que la regulación del gen es compleja e involucraría la acción de diferentes proteínas reguladoras y quizás también de mecanismos de regulación mediados por ARN. Agradecimientos: ANII-Beca Posgrado DC y PEDECIBA

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ROL DEL DOMINIO C-TERMINAL DE UreA EN EL TRÁFICO INTRACELULAR, DESDE Y HACIA LA MEMBRANA PLASMÁTICA.

M. Sanguinetti1, A. Ramón1

1Sección Bioquímica, Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias (UdelaR)

Las proteínas de membrana son sintetizadas y translocadas cotraduccionalmente en la membrana del retículo endoplásmico (RE). El posterior tráfico vesicular hacia el Golgi y luego a la vía endosomal, la vacuola o la membrana plasmática, así como su internalización por endocitosis, son procesos dinámicamente regulados en respuesta a diferentes señales fisiológicas. En estos mecanismos de control participan tanto elementos en cis como factores en trans que son coordinados para lograr un correcto tráfico vesicular. En este trabajo se pretende aportar al conocimiento de estos mecanismos de regulación, utilizando como modelo UreA, el transportador de urea de Aspergillus nidulans. En base a resultados previos obtenidos por nuestro grupo de investigación, se generó una versión mutante de UreA que carece del dominio C-terminal y que es incapaz de alcanzar la membrana plasmática, permaneciendo retenida en el RE. Con la finalidad de identificar que regiones del dominio C-terminal estarían involucradas en el correcto tráfico intracelular de UreA, se realizaron distintas deleciones parciales de este dominio, investigando las consecuencias de éstas en el tráfico del transportador desde y hacia la membrana. Para esto se generaron cepas portadoras de dichas deleciones en la proteína UreA-GFP (UreA fusionado a la proteína verde fluorescente, GFP, que permite realizar un seguimiento a nivel subcelular de UreA mediante microscopia de fluorescencia), obteniendo resultados prometedores. Por ejemplo, a partir de estos mutantes se pudo identificar una posible señal de salida del RE, que sería esencial para el tráfico del transportador hacia la membrana.

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Simposio 8: NEUROBIOLOGÍA Coordinadores: P. Lagos, G. Prunell. Exposiciones: Relaciones axo-gliales en el mantenimiento del equilibrio dinámico de la fibra nerviosa periférica durante la regeneración. A. Kun Caracterización genómica de ARNs asociados a ZBP1 y MyoVa en sistema nervioso periférico. J. Farias Neuroprotección de la vía nigro-estriatal inducida por agonísmo nicotínico crónico en un modelo experimental de Enfermedad de Parkinson. C. Mouhape Estudio de nitronas como inhibidores de apoptosis en células neuronales. S. Cancela HIG-1, una posible señal anti-apoptótica en el sistema nervioso. El caso de un núcleo sexualmente dimórfico. L. López

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RESÚMENES

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RELACIONES AXO-GLIALES EN EL MANTENIMIENTO DEL EQUILIBRIO DINÁMICO DE LA FIBRA NERVIOSA PERIFÉRICA, DURANTE LA

REGENERACIÓN.

A. Kun1

1Dep. de Proteínas y Ácidos Nucleicos‐IIBCE‐Unidad Asociada Sección

Bioquímica‐Facultad de Ciencias.

Los largos axones del Sistema Nervioso Periférico de los vertebrados permiten integrar las regiones corporales periféricas, gracias a la existencia de la fibra nerviosa. En los axones mielinados, esta unidad estructural se conforma por un axón, el conjunto de las células de Schwann (CS) que lo envainan y la matríz extracelular que la rodea y empaqueta.. Las relaciones entre las CS y el axón en la fibra nerviosa está caracterizada por vastos dominios de contacto axo-gliales (los internodos), excluidos de la depolarización/repolarización nodal. El mantenimiento de la fibra nerviosa, base fisiológica y estructural del estado de equilibrio dinámico (stady state), depende ampliamente de estas extensas regiones intermodales, insuficientemente exploradas aún. Durante la degeneración/regeneración nerviosa, este equilibrio se ve desplazado y la nueva homeostasis responde específicamente a la lesión aguda o crónica, diferentemente en condiciones saludables o patológicas. Hemos explorado la relación axón-células de Schwann en la fibra periférica de vertebrados, en desarrollo, mantenimiento y regeneración crónica y aguda, in vivo, ex vivo e in vitro. La interrelación entre las células de la fibra nerviosa parece involucrar procesos de modulación de la expresión génica a nivel transcripcional, traduccional y postraduccional. En este contexto, asume particular relevancia el rol de la célula de Schwann en el abastecimiento de maquinaria traduccional, incluyendo ARN mensajeros y ribosomas, y las estructuras y vías que hacen posible el tránsito intercelular (citoesqueleto, proteínas transportadoras, etc). La polaridad transversal axón-glia, contribuye así con la homeostasis de la fibra nerviosa, integrándose con el abastecimiento somático, de polaridad longitudinal.

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CARACTERIZACIÓN GENÓMICA DE ARNs ASOCIADOS A ZBP1 Y MyoVa EN SISTEMA NERVIOSO PERIFÉRICO

J. Farias 1,2, L. Canclini 3, J. R. Sotelo-Silveira 1,4

1. Departamento de Genómica, IIBCE; 2. Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, IIBCE; 3. Departamento de Genética, IIBCE; 4. Departamento de

Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, UdelaR.

El transporte activo de diversas cargas, en particular ARNm, para su localizacion subcelular ha sido abordado desde distintas areas de la biologia celular, siendo de particular importancia en la biologia neuronal debido a la peculiar anatomia de estas celulas. Los ARNm transportados se encuentra formando parte de ribonucleopartículas, que contienen proteínas de unión al ARN, motores moleculares, y pueden poseer o no ribosomas y proteínas de represión de traducción. Actualmente se plantea que ZBP1 (proteína de unión al ARN) puede actuar como adaptador entre los ARNm y los motores moleculares asociados al microtúbulos o actina. Utilizando la técnica RIP-Seq se buscó describir qué mensajeros se encuentran asociados a ZBP1 y Miosina Va en axones mielínicos adultos. Primero se realizaron inmunoprecipitaciones de las dos proteínas en estudio a partir de homogenados de raices ventrales de ratas. Luego se realizó la extracción de ARNs, amplificación lineal y secuenciación masiva mediante la tecnología Ion Torrent. Se obtuvieron listas de ARNs que co-inmunoprecipitan con ZBP1 y MyoVa. Mediante la comparación de las mismas pudimos identificar un set de mensajeros que potencialmente son reconocidos por ZBP1 y transportados a través del citoesqueleto de actina mediante la Myova. La ontología de este set está enriquecida en categorías relacionadas al citoesqueleto y traducción. Mediante la comparación con el transcriptoma axonal, identificamos aquellos ARNs presentes en el axón que pueden haber sido transportados hasta ese dominio celular a través de ribonucleopartículas que contengan ZBP1 y MyoVa.

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NEUROPROTECCIÓN DE LA VÍA NIGRO-ESTRIATAL INDUCIDA POR AGONÍSMO NICOTÍNICO CRÓNICO EN UN MODELO EXPERIMENTAL

DE ENFERMEDAD DE PARKINSON

C. Mouhape, G. Costa, JA. Abin-Carriquiry, F. Dajas y G. Prunell Dpto. Neuroquímica, IIBCE, Montevideo, Uruguay

La Enfermedad de Parkinson (EP) se caracterizada por alteraciones motoras asociadas a la pérdida de neuronas dopaminérgicas de la Sustancia Nigra parscompacta (SNc) y una disminución de dopamina en sus terminales del Cuerpo Estriado (CE). Los tratamientos disponibles no detienen el proceso neurodegenerativo. Estudios epidemiológicos indican que los fumadores de tabaco tienen menor incidencia de EP lo que podría atribuirse a la acción de la nicotina sobre los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR). Para estudiar los efectos del agonísmo nicotínico en un modelo de EP, se indujo la muerte de las neuronas dopaminérgicas de la SNc de ratas inyectando rotenona unilateralmente en el haz-medial del cerebro-anterior, y se administró nicotina a los animales desde 5-días antes y hasta 30-días post-lesión. Los resultados muestran que los animales tratados con nicotina tienen más células dopaminérgicas remanentes en la SNc y mayor numero de terminales dopaminérgicas en CE dorso-lateral a los 30 días-post-lesión en comparación a los animales no tratados, determinado por inmunohistoquímica para Tirosina Hidroxilasa. Esto está asociado a mayores niveles de dopamina en el CE determinados por HPLC-DE y a un mejor desempeño motor en el test del cilindro. Por otro lado las neuronas dopaminérgicas remanentes de los animales tratados con nicotina mostraron una mayor señal de sub-unidad α4 de nAChR en comparación a los no tratados. Los resultados evidencian un efecto neuroprotector inducido por agonísmo nicotínico en un modelo de EP in-vivo, apoyando la hipótesis de que los nAChR podrían ser un blanco terapéutico para la EP.

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ESTUDIO DE NITRONAS COMO INHIBIDORES DE APOPTOSIS EN CÉLULAS NEURONALES

S. Cancela1, 2, P. Hernández2, G. Mourglia-Ettlin3, W. Porcal4, A. Merlino1

1Laboratorio de Química Teórica y Computacional, Facultad de Ciencias (UDELAR); 2Laboratorio de Epigenética e Inestabilidad Genómica, IIBCE; 3Cátedra de Inmunología-DEPBIO/IQB Facultad de Química/Facultad de Ciencias (UDELAR); 4Departamento de Química Orgánica, Facultad de

Química (UDELAR)

La enfermedad del Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo de gran incidencia a nivel mundial. Si bien las causas de esta enfermedad son objeto de controversia, se ha propuesto que el aumento en la actividad caspasa-3 en las etapas iniciales de la enfermedad está vinculado al desarrollo de alteraciones en la transmisión sináptica. Por otro lado, se sabe que el estrés oxidativo juega un papel importante en patologías neurodegenerativas. Se ha descrito con anterioridad la capacidad de nitronas de atrapar radicales libres, atravesar la barrera hematoencefálica y tener propiedades neuroprotectoras, así como también de inhibir la cascada apoptótica dependiente de la mitocondria. Es por estos motivos que en el presente trabajo se ha determinado la capacidad de quince nitronas no citotóxicas de inhibir la apoptosis inducida por Camptotecina mediante Annexina V y anticuerpo anti-caspasa-3 activa en células neuronales HT22. Los resultados obtenidos muestran que la mayoría de los compuestos evaluados inhiben la apoptosis en las células y al menos seis de éstos lo hacen mediante un mecanismo que implica su interacción con la enzima caspasa-3. Por otro lado, estudios de docking y dinámica molecular han permitido analizar a nivel atómico detallado el modo de unión de dichas nitronas frente a caspasa-3 activa, mostrando que las mismas se unen en una región próxima al sitio activo interaccionando con residuos que no se encuentran conservados en otras caspasas y provocando cambios conformacionales a nivel del sitio catalítico. Actualmente se están probando estos compuestos mediante ensayos de inhibición enzimática de caspasa-3 in vitro.

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HIG-1, UNA POSIBLE SEÑAL ANTI-APOPTÓTICA EN EL SISTEMA NERVIOSO. EL CASO DE UN NÚCLEO SEXUALMENTE DIMÓRFICO

L. López1, M. J. Zuluaga2, D. Agrati2, P. Lagos3, G. Bedó1

1 Sección Genética Evolutiva Facultad de Ciencias; 2 Sección Fisiología y Nutrición Facultad de Ciencias; 3 Departamento de Fisiología Facultad de

Medicina

HIG-1 es una pequeña proteína mitocondrial que ha sido vinculada al aumento de la supervivencia celular, mediada por inhibición de la liberación del Citocromo C y preservación de la integridad mitocondrial. El Núcleo Sexualmente Dimórfico, en el Área Preóptica Media (NSD-MPOA) se caracteriza por sufrir una fuerte remodelación durante el desarrollo. Es 8 veces mayor en ratas machos que en hembras adultas debido a un mayor número de células apoptóticas en hembras, durante los primeros días de vida postnatal. Este mecanismo representa un modelo de apoptosis diferencial en el desarrollo normal del Sistema Nervioso Central (SNC) señalizada por la vía mitocondrial a través de la liberación de citocromo C. Dado que hemos descrito previamente una amplia distribución de HIG-1 en el SNC de la rata y que se le propone un rol citoprotector, nos proponemos analizar si su expresión presenta un patrón dimórfico en la formación del NSD-MPOA, con mayores niveles en machos que en hembras. Se detectó HIG-1 en dicha área mediante inmunohistoquímica en ratas de ambos sexos, de 5 y 8 días de edad y se cuantificó su expresión mediante análisis de imágenes. Los niveles de HIG-1 fueron mayores en animales de 5 que de 8 días. En animales de 5 días fueron mayores en hembras y en animales de 8 días fueron mayores en machos, correspondiéndose inversamente con las variaciones en número de células apoptóticas en cada edad descritos en la literatura, en coherencia con la hipótesis de una función anti-apoptótica de la proteína HIG-1.

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Simposio 9: GENÓMICA Coordinadores: P. Smircich, J. Sotelo Silveira. Exposiciones: “Micro-Exon Genes: a complex genetic system to produce variant antigens in schistosomes”. Prof. R. De Marco (Brasil, Invitado SBBq) Carroñeo de datos y genómica evolutiva. H. Romero Genes claves en el desarrollo del intenso color púrpura de la variedad de uva vinifera Tannat. C. Da Silva El transcriptoma del cestodo modelo Mesocestoides corti. A. Costábile Ta-trims: primer familia de retrotransposones no autónomos identificada en parásitos. S. Radío

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RESÚMENES

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MICRO-EXON GENES: A COMPLEX GENETIC SYSTEM TO PRODUCE VARIANT ANTIGENS IN SCHISTOSOMES.

Ricardo De Marco

Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, SP, Brazil

Schistosoma mansoni is a well-adapted blood-dwelling parasitic helminth, persisting for decades in its human host despite being continually exposed to potential immune attack. A class of Schistosoma genes called micro-exon genes (MEG), which represent a specialized parasitic molecular system for creating protein variation through the alternate splicing of short (≤36 bp) symmetric exons organized in tandem. Evidence for this mechanism for producing MEG proteins variants pools is produced by RT-PCR and proteomic analysis. Microarray experiments showed that the majority of MEGs are up-regulated in life cycle stages associated with establishment in the mammalian host after skin penetration. Whole-mount in situ hybridization and immunolocalization in adult worms showed that MEG transcripts and proteins concentrate in the upper apparatus of the digestive system and tegument of the parasite. Evolutionary analysis using bioinformatics indicate that these genes are under great evolutionary pressure, as expected for proteins exposed to the host. Preliminary functional data suggests that this family of genes is to interact with cells and proteins from the host immune system. Keywords: Schistosoma mansoni, Genome, Secreted protein.

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CARROÑEO DE DATOS Y GENÓMICA EVOLUTIVA

Héctor Romero En los últimos 20 años la cantidad de datos generados ha crecido en forma abrumadora en todas lás áreas del conocimiento. La biología no ha estado ajena a este proceso y se acumulan hoy cantidades casi innumerables de bits por día. En el ámbito biológico esta cantidad de datos no solo se limita a secuencias de ADN, sino también a estructuras proteicas, datos de metabolitos, datos sobre condiciones experimentales, datos ambientales, etc. El uso de estos datos son un imperativo creciente en la comunidad biológica para crear nuevo conocimiento Tanto para encontrar patrones alli existentes, interrogar esos datos con preguntas específicas, potenciar y complementar las investigaciones en curso, etc. Más allá de aquellos entrenados para su análisis específico, toda la comunidad de investigadores, interviene, en forma creciente. En esta charla voy a contar desde una óptica personal y basada en mi limitada experiencia el uso de esta información para responder algunas preguntas biológicas de marcado corte evolutivo. Para ello utilizaré, no por mejores, sino porque conozco, ejemplos que estamos trabajando en nuestro laboratorio que abarcan evolución viral, dinámica evolutiva de genes y genomas, y evolución del código genético.

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GENES CLAVES EN EL DESARROLLO DEL INTENSO COLOR PÚRPURA DE LA VARIEDAD DE UVA VINIFERA TANNAT

C. Da Silva1, A. Dal Molin2, A. Ferrarini2, E. Boido3, C. Gaggero1, M.

Delledonne2, F. Carrau3. 1Departamento de Biología Molecular, IIBCE, Montevideo, Uruguay; 2Centro di Genomica Funzionale, Dipartimento di Biotecnologie, Universitá degli Studi di

Verona, Italia; 3 Sección Enología, Facultad de Química, UDELAR, Montevideo, Uruguay.

Tannat (Vitis vinifera) es la variedad de vid mas cultivada en Uruguay para la producción de vinos tintos de calidad. Sus bayas tienen niveles de compuestos polifenólicos inusualmente altos, produciendo vinos con intenso color púrpura y notables propiedades antioxidantes. Las antocianinas son pigmentos naturales polifenólicos que dan color a la piel de las uvas y al vino tinto; y su biosíntesis comienza durante el envero. Recientemente, secuenciamos el genoma de Tannat, y encontramos expansión de las familias génicas relacionadas con la biosíntesis de polifenoles. Secuenciamos por RNA-Seq cuatro muestras por triplicado de cáscaras en diferentes momentos del desarrollo de la baya: 5 semanas después de la floración (WAF) (fase verde); 10 WAF (envero) tomando por separado cáscaras verdes y coloreadas; y 15 WAF (cosecha). Análisis preliminares del cambio abrupto de color durante envero detectan 1302 genes con expresión diferencial significativa (Log2FoldChange ≥ 2 y padj < 0,01), incluyendo genes relacionados con el crecimiento de la baya y biosíntesis de aromas. En particular, 123 genes están relacionados a la biosíntesis de polifenoles en general (Chalcone synthase, Chalcone isomerase, Flavanon-3-hydroxylase); taninos y antocianidinas (Flavonoid-3',5'-hydroxylase, Flavonoid-3'-hydroxylase, Dihydroflavonol-4-reductase, Leucocyanidin oxygenase); antocianinas (Anthocyanidin-3-O-glucosyltransferase, Flavonoid-3',5'-methyltransferase); genes relacionados con el transporte de antocianinas a vacuolas (Glutatión S-transferasa, Antocianidin permeasa-AnthoMATE); y los factores de transcripción MybA1, MybA2, y MybA3 (regulación de la biosíntesis de antocianinas). Se identificaron putativos genes claves para el desarrollo del color en las bayas Tannat, proporcionando así información útil y actualizada para la comprensión de la maduración y calidad de la fruta.

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EL TRANSCRIPTOMA DEL CESTODO MODELO MESOCESTOIDES CORTI

A.Costábile1, F.Dominguez1, A.Iriarte2,3, G.Lamolle4, J.F.Tort4, E.Castillo1

1Sección Bioquímica – Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR); 2Departamento de Bioquimica y Genómica Microbiana; 3Departamento de

Genómica (IIBCE) y Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Instituto de Higiene, Facultad de Medicina (UDELAR); 4Departamento de Genética,

Facultad de Medicina (UDELAR)

Los cestodos representan un modelo interesante en la biología del desarrollo dada la marcada plasticidad morfológica durante su ciclo biológico. Esta es dependiente de los neoblastos, las únicas células con capacidad proliferativa, encargadas de la renovación tisular y los procesos de proliferación en general. Verificamos que la radiación gamma es efectiva para la depleción de neoblastos en Mesocestoides corti, cestodo utilizado como modelo de estudio dadas las facilidades para mantener parte de su ciclo de vida en el laboratorio. Interesados en conocer los genes involucrados en los eventos de proliferación de este parásito, analizamos el transcriptoma de larvas irradiadas y controles. Generamos más de 40 millones de reads pareados por condición (en duplicados biológicos) los que fueron ensamblamos usando como referencia un borrador del genoma recientemente disponible y el pipeline Tuxedo. Mientras que el genoma disponible predice algo más de 9 mil genes dispersos en 120 Megabases, los datos transcriptómicos resultan en más de 14 mil genes putativos, muchos de ellos con evidencia de transcriptos múltiples. Observamos una reducción de algunas vías metabólicas consistentes con lo encontrado en otros cestodos, y detectamos algunas familias génicas muy amplificadas específicamente en M. corti. Los datos generados resultan útiles para mejorar la anotación del genoma, abriendo nuevas posibilidades para el estudio de la biología del parásito y la búsqueda de nuevos blancos para el desarrollo de estrategias de control parasitario.

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TA-TRIMS: PRIMER FAMILIA DE RETROTRANSPOSONES NO AUTÓNOMOS IDENTIFICADA EN PARÁSITOS

S. Radío1,2, U. Koziol3,4, M. Zarowiecki5, K. Brehm3, C. Fernández6 y P.

Smircich1,2 1Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias (UDELAR);

2Departamento de Genética, Facultad de Medicina (UDELAR);3 Institute of Hygiene and Microbiology, University of Wurzburg, Germany; 4Sección

Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR); 5Parasite Genomics, Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus,

Hinxton, Cambridge, United Kingdom; 6Cátedra de Inmunología, Facultad de Química (UDELAR)

Una porción significativa de los genomas de varios organismos eucariotas está compuesta por elementos transponibles (TEs). Los cestodos taenidos (incluidos los parásitos humanos Echinococcus  y Taenia solium) tienen un número muy bajo TEs con respecto a eucariotas de tamaño genómico similar. Estos elementos están virtualmente inexplorados, habiendo escasos datos acerca de su expresión y silenciamiento, sin embargo debido al rol evolutivo que cumplen en otros platelmintos su estudio es de vital importancia. El análisis del transcriptoma de E. granulosus mostró que los ESTs más abundantes en varios estadios corresponden a ARNnc. En el presente trabajo, reportamos el descubrimiento de una novel familia de retrotransposones del tipo "Terminal Repeat Retroransposons in Miniature" (TRIMs), siendo esta una nueva familia de elementos transponibles en taenidos que hemos denominado ta-TRIMs. ta-TRIMs son la segunda familia de TRIMs descubierta en animales, y probablemente estas familias sean el resultado de evolución reductiva convergente en diferentes grupos taxonómicos. Estos elementos se han originado en la base del árbol filogénetico taenido y se han expandido durante la divergencia taenida, incluso luego de la separación de especies cercanas como E. multilocularis y E. granulosus. Los ta-TRIMs son masivamente expresados en estadios larvarios a partir de una pequeña población de elementos ta-TRIMs completos y LTRs aislados. Estos últimos son capaces de actuar como promotores alternativos, influyendo en la expresión de regiones cercanas, generando nuevos ARN no codificantes y fusiones transcripcionales con genes codificantes. En E. multilocularis, los ta-TRIMs son específicamente expresados en células germinativas durante la reproducción asexual del metacestodo larvario.

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Simposio 10: BIOQUÍMICA DE PROTEÍNAS Coordinadores: M. Trujillo, M. Graña. Exposiciones: Utilización de compuestos mercuriales para caracterizar la unión hemo-tiolato de la enzima cistationina β-sintasa. D. Benchoam Reducción de peroxinitrito por peroxirredoxina 3 mitocondrial. R. Esteves Aproximaciones estructurales-funcionales para comprender el papel de CCDC28B en ciliogénesis. M. Fabregat Estructura del complejo DESK-DESR de Bacillus subtilis en el estado fosfatasa. J. A. Imelio

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RESÚMENES

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UTILIZACIÓN DE COMPUESTOS MERCURIALES PARA CARACTERIZAR

LA UNIÓN HEMO-TIOLATO DE LA ENZIMA CISTATIONINA -SINTASA

D. Benchoam1, E. Cuevasanta1, B. Alvarez1 1Laboratorio de Enzimología, Facultad de Ciencias (UDELAR)

-sintasa (CBS) participa en el metabolismo de

aminoácidos azufrados, catalizando la formación de cistationina y H2O (o H2S) a partir de homocisteína y serina (o cisteína) utilizando como cofactor piridoxal-5’-fosfato. La enzima cuenta también con un hemo tipo b, de función probablemente regulatoria, coordinado por una histidina y una cisteína. Es de interés caracterizar la estabilidad cinética de la unión entre la cisteína y el hemo, pues se ha planteado que la pérdida de esta unión lleva a la inactivación. Cuando el hemo se encuentra en estado férrico, esta unión es muy estable. Los compuestos mercuriales podrían competir con el hemo por la cisteína y facilitar la caracterización de esta unión. El hemo férrico presenta un pico de absorción a 428 nm que resulta útil para seguir la reacción con el p-cloromercuribenzoato (pCMB). Utilizando un equipo de flujo detenido, se pudo determinar las constantes cinéticas involucradas siguiendo la disminución exponencial de la absorbancia al agregar pCMB en exceso a diferentes concentraciones. A partir de la relación hiperbólica entre las kobs y la concentración de pCMB, se determinó una koff(Cys-hemo) de 0.34 s-1 y una relación kon(Cys-hemo)/kon(Cys-pCMB) de 1 x 10-3 M. Además, el comportamiento hiperbólico de la amplitud frente a la concentración de pCMB permitió estimar una koff(Cys-pCMB) de 0.009 s-1. También se observaron cambios espectrales con los mercuriales mercuriocromo y HgCl2, todavía en estudio. Se concluye que la CBS con la cisteína coordinando al hemo se encuentra en equilibrio con una especie con la cisteína libre.

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REDUCCION DE PEROXINITRITO POR PEROXIRREDOXINA 3 MITOCONDRIAL

R. Esteves, A. Reyes1,2, R. Radi1,2, V.Tortora1,2, M.Trujillo1,2,

1Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina y 2Centro de Investigaciones Biomédicas, Universidad de la República

Las peroxirredoxinas (Prx) son enzimas antioxidantes, que participan en la detoxificación de peróxidos y en la señalización redox. Poseen por lo menos un residuo de cisteína crítico, y catalizan reacciones bisustráticas por un mecanismo de tipo ping-pong. Tienen una amplia variedad de sustratos oxidantes, catalizando la reducción de peróxido de hidrogeno, hidroperóxidos de ácidos grasos y peroxinitrito, con eficiencia catalítica variable dependiendo de la subfamilia. En este trabajo caracterizamos la actividad peroxinitrito reductasa de la Prx3, exclusivamente mitocondrial, realizando ensayos de cinética de ciclo catalítico único, utilizando un espectofotómetro/fluorímetro de flujo detenido. Demostramos que la enzima reduce rápidamente al peroxinitrito, y utilizando ensayos de competencia, determinamos una constante de velocidad de 9.6 x 106 M-1s-1 a 25°C, pH7.8. Mediante la utilización de anticuerpos especificos, demostramos que la exposicion de la enzima a peroxinitrito en exceso conduce a la sobreoxidacion de su tiol peroxidatico, y a la nitracion de residuos de tirosina. Por su parte, utilizando el cambio de fluorescencia intrínseca de la enzima dependiente de su estado redox, determinamos la constante de velocidad de formacion del enlace disulfuro entre la cisteina peroxidática oxidada y la resolutiva como 2 x 106 s-1 a 14°C, pH 7,8. Nuestros datos indican que la Prx3 conjuntamente con la Prx5 anteriormente estudiada en nuestro laboratorio, dan cuenta del 90% de la reducción de peroxinitrito intramitocondrial.

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APROXIMACIONES ESTRUCTURALES-FUNCIONALES PARA COMPRENDER EL PAPEL DE CCDC28B EN CILIOGÉNESIS

M. Fabregat1*, M. Cárdenas-Rodríguez1*, F. Trajtenberg3, Nicole Larrieux, A. Buschiazzo3, J.L. Badano1, F. Irigoín1,4

1Lab. Genética Molecula Humana; 2Unidad de Proteínas Recombinantes; 3Unidad de Cristalografía de Proteínas, Institut Pasteur de Montevideo;

4Depto.Histología y Embriología, Fac. de Medicina, UdelaR

La cilia primaria es un organelo que participa en la comunicación de la célula con el entorno y su mal funcionamiento es causante de varias enfermedades llamadas ciliopatías, de las cuales el síndrome de Bardet-Biedl (BBS) es un ejemplo. Nuestro proyecto se centra en una proteína que se ha encontrado mutada en BBS: CCDC28B. Estudios previos vincularon a CCDC28B con la proteína SIN1, regulando ciliogénesis y la vía de señalización de mTORC2. CCDC28B es una proteína de 200 aminoácidos sin homólogos de función o estructura conocida. Nuestro objetivo es entender cómo CCDC28B interacciona con SIN1 y regula ciliogénesis, mediante abordajes bioquímico-estructurales y funcionales. Produjimos CCDC28B humana en forma recombinante, obteniendo una mezcla de monoméro y dímero. Testeamos diferentes condiciones para concentrar la muestra y rastreamos condiciones de cristalización utilizando la forma monomérica de CCDC28B, sin resultados exitosos. En paralelo intentamos obtener información funcional a través de mutar regiones de CCDC28B que se predicen in silico como potenciales motivos funcionales. Determinamos que regiones predichas como secuencias de localización (NLS) y exportación (NES) nuclear son funcionales y podrían tener vinculación con la relación CCDC28B-SIN1. La localización nuclear de los mutantes NLS y NES de CCDC28B correlaciona en forma inversa con la localización de SIN1 en el núcleo, sugiriendo que CCD28B podría facilitar la salida de SIN1 de dicho compartimiento. Esto podría ser relevante para la función de SIN1 en ciliogénesis, ya que en condiciones en que ciliogénesis está afectada por disminución de los niveles de CCDC28B, SIN1 se acumula en el núcleo.

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ESTRUCTURA DEL COMPLEJO DESK-DESR DE BACILLUS SUBTILIS EN EL ESTADO FOSFATASA

J. A. Imelio, F. Trajtenberg, A. Mechaly, N. Larrieux, A. Buschiazzo Unidad de Cristalografía de Proteínas, Instituto Pasteur de Montevideo

Los sistemas de dos componentes (SDC) permiten a las bacterias sensar cambios ambientales y disparar respuestas adaptativas. Los SDC están constituídos por una proteína sensora con actividad de histidin-quinasa (HQ), y un regulador de respuesta (RR), que frecuentemente funciona como factor de transcripción. Típicamente coexisten docenas de SDCs diferentes en una célula. La detección de la señal por una HQ controla su capacidad de autofosforilarse a expensas de ATP, para luego transferir el grupo fosforilo a su RR específico. La fosforilación del RR lo activa, disparando procesos celulares adaptativos. Muchas HQs también catalizan la desfosforilación del RR, cuando la vía de señalización está apagada. Nuestro trabajo apunta a dilucidar las bases moleculares de la especificidad entre pares HQ-RR evitando el cross-talk. Estudiando el SDC DesK-DesR de Bacillus subtilis, sensor del choque frío, presentamos ahora la estructura cristalográfica del complejo DesK-DesR a 2.8 Å de resolución. Los mapas de densidad electrónica son claros, mostrando que cada dímero de DesK se une a dos moléculas de DesR, resultando en un complejo simétrico. La configuración inaccesible al solvente de las histidinas fosforilables de DesK, así como la posición clave de las glutaminas 193 aproximando al aspártico 54 del RR, sugieren fuertemente que este complejo representa al estado fosfatasa Estamos realizando ensayos bioquímicos de fosfotransferencia para confirmar esta hipótesis, así como ensayos cristalográficos de un mutante del complejo que estabilizaría al mismo en el estado fosfotransferasa. Las interacciones HQ-RR parecen variables, dependientes del estado funcional de la vía de señalización.

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PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS, AL RITMO DE CODONES Y OTROS ENIGMAS

M. Marín

Sección Bioquímica-Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República.

La función y la actividad de las proteínas dependen de su estructura nativa y de la conformación adoptada por la cadena polipeptídica. En el plegamiento in vitro así como in vivo, la secuencia de los aminoácidos y las propiedades fisicoquímicas de los residuos que componen la cadena son esenciales en el plegamiento. Sin embargo, en un contexto celular, la síntesis y el plegamiento de una proteína se ven afectados por elementos regulatorios contenidos en la secuencia codificante que se conocen aun parcialmente. El uso de codones sinónimos afecta fuertemente la cantidad, la solubilidad y actividad de una proteína expresada de manera recombinante en bacterias. En eucariotas, la secuencia codificante contiene múltiples lenguajes superpuestos de información genética que aún resta descifrar. Con el propósito de comprender las bases del plegamiento de proteínas en la célula, analizamos posibles alteraciones de las propiedades funcionales de p53 y del receptor de estrógenos alfa, cuando son sintetizadas a partir de secuencias codificantes portadoras de variantes sinónimas puntuales. A modo de ejemplo, en células transfectadas, la variante Alanina 87 del receptor de estrógenos muestra cambios en su actividad que dependen del tipo celular. Las variantes sinónimas pueden generar efectos de diversa significación aun difíciles de predecir, pero que habría que tener en cuenta en el área de la salud, para el diagnóstico, la biomedicina y la farmacología. Agradecimientos: ANII-FCE; PEDECIBA-Biología; Programa ECOS; Embajada de Francia en Uruguay

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Simposio 11: BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN CIENCIAS ANIMALES

Coordinadores: P. Zunino, J. P. Damián. Exposiciones: Oferta de forraje del campo natural en vacas de cría: mecanismos biológicos asociados a la eficiencia de producción. M. Carriquiry Modulación de la fermentación ruminal con microorganismos nativos: una perspectiva desde el aislamiento a la administración. M. Fraga Metabolismo de la glucosa en rumiantes: efecto de la suplementación con grano y relación con el consumo y digestibilidad. M. Aguerre Estudios endócrino-moleculares, histológicos y bioquímicos en el cérvix ovino durante el ciclo estral. M. Rodríguez Carcinoma tiroideo en caninos. Mecanismos moleculares y tratamiento. P. Pessina

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RESÚMENES

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OFERTA DE FORRAJE DEL CAMPO NATURAL EN VACAS DE CRIA: MECANISMOS BIOLOGICOS ASOCIADOS A LA EFICIENCIA DE

PRODUCCION

M. Carriquiry1, A.C. Espasandin1, A.L Astessiano1, A. Casal1, M. Claramunt2, M. Do Carmo3, J. Laporta4, S. Scarlato3, C. Viñoles3, P. Soca1

1Departamento de Producción Animal y Pasturas, Facultad de Agronomía (UDELAR); 2Departamento de Salud en Sistemas Pecuarios, Facultad de

Veterinaria (UDELAR); 3Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA); 4Department of Animal Sciences, University of Florida

El control de la intensidad de pastoreo ha permitido mejorar la captación, uso y conversión de la energía solar en producto animal del ecosistema pastoril criador. Un cambio de baja a alta oferta de forraje (BOF vs. AOF; 2.5 vs. 4 kgMS/kgPV promedio anual), permitió incrementar la masa, altura y producción de forraje sin modificar la capacidad de carga del sistema. Las vacas en AOF presentaron una estrategia de pastoreo que evidenció un mayor consumo de energía y/o reducción en los costos de actividad. El mejor balance energético de las vacas en AOF se reflejó en mayores reservas energéticas y en el perfil de hormonas metabólicas (mayores concentraciones de insulina e IGF-I) y de expresión génica en hígado (eje hormona de crecimiento-IGF-I, metabolismo glucosa y propionato) a lo largo del ciclo gestación-lactación. El mejor estatus metabólico/energético de las vacas en AOF no estaría acompañado de mayores requerimientos para metabolismo basal ya que la masa relativa tanto de la proteína corporal como del tracto gastrointestinal no difirieron de BOF. Mas aún, la expresión de genes que codifican proteínas mitocondriales del complejo-I a nivel del intestino delgado fue mayor en AOF que BOF lo que podría asociarse a una mayor eficiencia energética. Finalmente, la respuesta reproductiva fue mayor en AOF que BOF asociada a un menor largo de anestro y a cambios a nivel folicular y en el ambiente uterino. Los cambios en el forraje, pastoreo, consumo y metabolismo podrían explicar la mayor productividad y eficiencia biológica de las vacas en AOF.

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MODULACIÓN DE LA FERMENTACIÓN RUMINAL CON MICROORGANISMOS NATIVOS: UNA PERSPECTIVA DESDE EL

AISLAMIENTO A LA ADMINISTRACIÓN

M. Fraga1, 2, C. Cajarville3, P. Zunino1 1Departamento de Microbiología, IIBCE; 2Plataforma de Salud Animal, INIA-La

Estanzuela; 3Departamento de Nutrición Animal, Facultad de Veterinaria (UDELAR)

Los microrganismos ruminales son responsables de la degradación de la fibra aportando ácidos grasos volátiles (AGV) y biomasa microbiana, fuentes de energía y proteína respectivamente. La modulación de la fermentación es una preocupación para productores y profesionales y los probióticos (microorganismos benéficos) aparecen como una opción prometedora. En este trabajo se describe la estrategia experimental que se empleó en la búsqueda de probióticos, comenzando por el aislamiento en distintos medios de cultivo y en condiciones anaeróbicas. La modulación de la fermentación se evalúo en fermentadores in vitro, evaluándose diversos parámetros como la composición de la microbiota ruminal por pirosecuenciación, la dinámica de producción de gas, de AGV y la producción de metano. En los ensayos in vivo se utilizaron Prevotella bryantii (Pb3C5) y Pseudobutyrivibrio ruminis (Pr50C) que se administraron a corderos con cánula permanente en rumen. La modulación se evalúo registrando la evolución de pH, amoniáco y de AGV así como de la microbiota, entre otros parámetros. Se conformó una colección de aislamientos bacterianos entre los que se identificaron representantes de los géneros Pseudobutyrivirio, Butyrivibrio, Selenomas, Prevotella e incluso algunos representaron especies y géneros nuevos. La administración de Pb3C5 o de Pr50C logró modificar parámetros de la feremntación ruminal. Los animales tratados con Pr50C y con Pb3C5 mostraron mayor concentración diaria de ácido butírico mientras que la administración de Pb3C5 indujo cambios en la dinámica diaria del amoniáco ruminal. Los resultados son alentadores en cuanto a la modulación de la fermentación ruiminal con cepas nativas y justifican futuros abordajes experimentales.

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METABOLISMO DE LA GLUCOSA EN RUMIANTES: EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN CON GRANO Y RELACIÓN CON EL CONSUMO Y

DIGESTIBILIDAD

M. Aguerre1, M. Carriquiry2, A.L. Astessiano2, C. Cajarville3, J.L Repetto1

1 Departamento de Bovinos, Facultad de Veterinaria (UDELAR); 2 Departamento de Producción Animal y Pasturas, Facultad de Agronomía (UDELAR); 3 Departamento de Nutrición Animal, Facultad de Veterinaria

(UDELAR)

Se evaluó el efecto de la suplementación con grano de sorgo sobre la concentración plasmática de glucosa, insulina y glucagón y la concentración hepática de ARNm del receptor de insulina (INSR) y de las enzimas piruvato carboxylasa (PC) y fosfoenolpyruvato carboxikinasa (PCK1) en bovinos y ovinos, en balance energético positivo, consumiendo una pastura. A su vez, se buscaron asociaciones de estas variables con el consumo y la digestión de los nutrientes. En ambas especies, la suplementación con grano de sorgo disminuyó la concentración hepática del ARNm de la enzima PCK1, pero no afectó la PC ni el INSR. Estos resultados se asociaron a cambios en la concentración plasmática de glucosa y en el perfil endocrino de los bovinos pero no de los ovinos, lo que estuvo asociado a un efecto diferente de la suplementación sobre el consumo y la fermentación ruminal en ambas especies. En los bovinos, la suplementación fue efectiva para incrementar el consumo total de alimento y la utilización digestiva de la dieta. Sin embargo, en los ovinos la suplementación con sorgo determinó una caída en el pH ruminal y una reducción en la digestibilidad de la fibra y en el consumo total de alimento. En conclusión, la suplementación con granos a bovinos u ovinos, en balance energético positivo, modificó el metabolismo hepático para priorizar el uso de propionato como precursor neoglucogénico, sin embargo los efectos de la suplementación sobre el consumo y la digestibilidad de los nutrientes condicionó la magnitud de la respuesta.

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ESTUDIOS ENDÓCRINO-MOLECULARES, HISTOLÓGICOS Y BIOQUÍMICOS EN EL CÉRVIX OVINO DURANTE EL CICLO ESTRAL

M. Rodríguez Piñón

Área Bioquímica, Departamento de Biología Molecular y Celular, Facultad de Veterinaria, (UDELAR)

Se investigaron factores involucrados con la remodelación del colágeno cervical durante el ciclo estral ovino. Se utilizaron ovejas Corriedale ciclando naturalmente y sacrificadas los días 1 (n=7), 6 (n=6) o 13 (n=7) de detectado estro. Se determinaron 17β-estradiol y progesterona circulantes por RIA. En tejido cervical se determinaron: el receptor de estrógenos (RE) por ensayo de unión; el ARNm REα por hibridización en solución; los REα, los receptores de LH (RLH) y de oxitocina (ROx) y la ciclooxigenasa-2 (COX-2) por inmunohistoquímica; las colagenasas MMP-2 y MMP-9 por inmunhistoquímica y zimografía en SDS-PAGE y el colágeno por histoquímica y espectrofotometría. Las concentraciones de ARNm REα y RE fueron mayores al día 1 (luego del pico preovulatorio de 17β-estradiol), que en los días 6 y 13 (concentraciones de progesterona luteales) (P<0.005). La inmunopositividad a REα, RLH, ROx y COX-2 fue mayor en el epitelio que en el estroma, siendo al día 1 mayor para REα y menor para RLH, ROx y COX-2, respecto a los días 6 y 13 (P<0.05). La inmunopositividad y actividad de MMP-2 fue predominante sobre la MMP-9 y estuvo asociada fundamentalmente a fibroblastos activos. La actividad MMP-2 aumentó al día 1, concomitante con la disminución del área de fibras de colágeno y de su concentración (P<0.02). Se infiere que los E preovulatorios, a través del REα epitelial, dirigen directa o indirectamente la cascada de eventos que llevan a la desagregación y degradación del colágeno cervical por aumento de la actividad MMP-2.

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CARCINOMA TIROIDEO EN CANINOS MECANISMOS MOLECULARES Y TRATAMIENTO

P. Pessina1, Castillo V2, Sartore I1, Meikle A1

1Laboratorio de ténicas Nucleares, Facultad de Veterinaria, (UDELAR); 2

Unidad de Endocrinología, Hospital Escuela Medicina Veterinaria, Facultad de Ciencias Veterinarias, Buenos Aires. Argentina

El carcinoma tiroideo canino es la patología que afecta la glándula tiroides con mayor frecuencia después del hipotiroidismo. Si bien la incidencia de esta neoplasia no es muy alta, cuando se presenta es muy agresiva. Tiene en general una presentación unilateral, es de origen folicular y la mayoría de los perros son eutiroideos. Se estudiaron las bases moleculares de tejido tiroideo sano y carcinomatoso así como la respuesta a diferentes tratamientos acorde al patrón histopatológico del tumor (folicular, folicular-compacto y compacto). Se encontró mayor contenido proteico (por inmunohistoquímica) de factores vinculados a la proliferación y angiogénesis (TTF-1, PCNA, IGF-1, IGF-1R y VEGF) en el carcinoma que en el tejido sano, lo que fue consistente con una mayor densidad celular y capilaridad, lo que constituye una red de señales que estarían en la base de la oncogénesis. El contenido proteico estuvo afectado por el tipo de carcinoma, siendo mayor la expresión de factores mitogénicos y angiogénicos en las células del estroma de cánceres más indiferenciados; los resultados sostienen el rol de éstas células en la progresión tumoral. El tratamiento del carcinoma con ácido retinoico 9-cis (AR-9cis) post-cirugía aumenta de forma significativa el tiempo de recurrencia y sobrevida en comparación con el tratamiento con doxorrubicina y controles (solo cirugía). Los efectos del tratamiento dependieron del patrón histopatológico del carcinoma tiroideo, los carcinomas foliculares no presentaron diferencias, pero los pacientes con carcinomas foliculares-compactos y compactos tratados con AR-9cis tuvieron mayor tiempo libre de enfermedad y sobrevida que los tratados con doxorrubicina y controles.

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Simposio 12: BIOLOGÍA DE SISTEMAS Coordinadores: L. Acerenza, R. Platero. Exposiciones: Estrategias de la Biología de Sistemas para la modificación de Flujos metabólicos con fines biotecnológicos. L. Acerenza Análisis de modos elementales de flujo para optimizar la producción de P3HB en cultivos de Herbaspirillum seropedicae con glucosa. A. I. Catalán Synthetic Biology: Constructing bacterial promoters using in silico evolution. R. Silva Rocha Aplicaciones de herramientas moleculares sintéticas para el estudio de la interacción bacteria-hospedero. R. Platero

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RESÚMENES

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ESTRATEGIAS DE LA BIOLOGIA DE SISTEMAS PARA LA MODIFICACION DE FLUJOS METABÓLICOS CON FINES BIOTECNOLÓGICOS

L. Acerenza

Laboratorio de Biología de Sistemas, Facultad de Ciencias (UDELAR)

La Biología de Sistemas desarrolla un conjunto de estrategias para contribuir a resolver problemas complejos de la Biología fundamental y sus aplicaciones. Las nuevas aproximaciones vienen a complementar el enfoque reduccionista, en casos donde los métodos tradicionales resultan insuficientes. Las aproximaciones sistémicas apuntan a estudiar el sistema biológico en su conjunto, de forma de no perder interacciones relevantes al problema que se quiere resolver. Un problema abordado por la Biología de Sistemas es la cuantificación, re-direccionamiento y modificación de flujos metabólicos con el fin de aumentar la producción de metabolitos primarios y secundarios de interés. Para estos fines se han empleado diversos tipos de estrategias, encontrándose entre las más usadas el Análisis de Flujos Metabólicos (Metabolic Flux Analysis, MFA), el Análisis de Balance de Flujos (Flux Balance Analysis, FBA) y el Análisis de Vías Metabólicas (Metabolic Pathway Analysis, MPA). Además, se han empleado estrategias modulares relacionadas al Análisis del Control Metabólico (Metabolic Control Analisis, MCA) y estrategias derivadas. En la presentación repasaremos algunas aplicaciones de estas aproximaciones. En particular, ilustraremos como el Método de Modulación Modular (Modular Modulation Method, MMM), combinado con herramientas de la Biología Sintética, puede ser empleado para aumentar la producción de metabolitos en cepas altamente productoras1. [1] Acerenza L, Monzon P & Ortega F (2015) Biotechnol Prog 31:656-667.

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ANALISIS DE MODOS ELEMENTALES DE FLUJO PARA OPTIMIZAR LA PRODUCCION DE P3HB EN CULTIVOS DE Herbaspirillum seropedicae

con glucosa

A.I. Catalán1, G. Cabrera-Gómez2, M. Keico Taciro2, A.K. Malan1, F. Ferreira3, S. Batista1

1Unidad de Microbiología Molecular, BIOGEM, IIBCE; 2Departamento de Microbiología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad de San Pablo, Brasil; 3Laboratorio de Carbohidratos y Glicoconjugados, Departamento de

Química Orgánica, Facultad de Química (UDELAR),

Herbaspirillum seropedicae es una β-proteobacteria que acumula poli 3-hidroxibutirato (P3HB), biopolímero termoplástico y biodegradable de interés industrial. Los estudios de producción utilizando glucosa como fuente de carbono indican que el rendimiento de transformación (YP3HB/gluc) de la misma en polímero es menor que el valor teórico calculado. Se realizó un análisis de modos elementales de flujo (MEF) para evaluar y optimizar el YP3HB/gluc en H. seropedicae Z69. La red metabólica en este organismo incluyó las siguientes rutas: Entner Doudoroff, pentosas fosfato (en dirección anabólica), gluconeogénesis, ciclos de Krebs y glioxilato. Se incluyó como restricción adicional una ecuación general que contempla la cantidad de biomasa generada, el P3HB acumulado, y la cantidad de citrato excretada durante la fase exponencial de crecimiento determinada en un ensayo en bioreactor empleando glucosa fuente carbonada. Los rendimientos experimentales obtenidos en este ensayo se encuentran dentro de los calculados con MEF, sin embargo existen MEFs con YP3HB/gluc mayores a los experimentales, todos con un mayor flujo por la vía de ED cíclica. Se obtuvo una correlación de los moles de biomasa total producida en función del flujo por la enzima fructosa 1,6 bifosfatasa (Fbf), indicando un blanco para mejorar la producción de P3HB. Se construyó la cepa Z69 pRK767::fbf, sobre-expresando la enzima Fbf. Dicha cepa cultivada en condiciones de bioreactor presentó un mayor YP3HB/gluc. Un flujo cíclico por ED implica un mayor flujo de carbono por la gluconeogénesis, generando más moles de glucosa 6-fosfato y de NADPH, el cual es requerido para la síntesis de P3HB. Mediante el análisis de MEF fue posible identificar en forma sistémica una posible modificación genética que mejoró la transformación de glucosa en P3HB.

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SYNTHETIC BIOLOGY: CONSTRUCTING BACTERIAL PROMOTERS USING IN SILICO EVOLUTION.

R. Silva Rocha

In the field of Synthetic Biology, biological systems can be treated similarly as electronic circuits, were molecular components are analogues to physical parts that can be interlinked to give rise to autonomous circuits with properties of interest. In this context, the logic gate abstraction is useful since it allows the construction of biological circuits in a similar way as electronic chips are constructed to generate computers. In this sense, there is a growing interest for new approaches to implement logic behaviours in biological systems. This talk will address some new strategies related to the engineering of cis-regulatory elements in bacteria to construct new-to-nature logic behaviours. Special focus will be the utilisation of in silico modelling tools to construct these cis-elements. These algorithms are constructed to mimic evolution, where the system of interest is subjected to several rounds of mutation and selection based on a fitness function implemented by the user.

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APLICACIONES DE HERRAMIENTAS MOLECULARES SINTÉTICAS PARA EL ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN BACTERIA-HOSPEDERO

R. Platero

Departamento de Bioquímica y Genómica Microbianas. Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable. MEC.

En los últimos años las aproximaciones de Biología de Sistemas y Biología Sintética, han revolucionado el campo de la Ingeniería Metabólica. Una de las ramas de la investigación en Biología Sintética actual se basa en el uso de “chasis” bacterianos sobre los cuales se puedan ensamblar y desensamblar circuitos genéticos para así dotar a los organismos con nuevas propiedades o funciones metabólicas. Para cumplir con este propósito, es deseable que las partes (genes o vías metabólicas), herramientas (vectores/transposones) y chasis (organismos) utilizados cumplan con ciertos estándares que aseguren la funcionalidad y reproductibilidad de los circuitos implantados. Los vectores SEVA (Standar European Vector Architecture, seva.cnb.csic.es) fueron diseñados, siguiendo estos patrones de calidad, como herramientas genéticas modulares para el estudio de bacterias ambientales. Durante la presentación exploraremos la utilidad de estas herramientas sintéticas para caracterizar algunos aspectos de la interacción bacteria-hospedero en modelos utilizados en nuestro Instituto. En particular, veremos algunos ejemplos del uso de estas herramientas para estudiar la función de genes clave en bacterias nativas promotoras del crecimiento vegetal pertenecientes a colecciones generadas en nuestro laboratorio.

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Simposio 13: LA IMAGEN COMO FUENTE DE LA INFORMACIÓN

Coordinadores: Mesa temática de microscopía propuesta por la Sociedad Uruguaya de Microscopía e Imagenología (SUMI). Moderadores: A. Kun, A. Fernández, A. Richieri. Exposiciones: Se hizo la luz… ¿y ahora qué?: Experiencias didácticas en análisis de imágenes de un biólogo cualquiera. N. Unsain Aplicaciones de la Microscopía de Fuerza Atómica en biología y áreas biomédicas. J. C. Benech Poli-ADP-ribosilación: nuevas localizaciones en diferentes epitelios y nervios periféricos de ratones wild-type y TremblerJ. L. Lafón Efectos de la rigidez de las matrices de colágeno tipo I en el crecimiento de las neuritas simpáticas. G. Martínez Absorción intestinal en vertebrados: rol de las proteínas transportadoras de ácidos grasos. M. Suárez

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SE HIZO LA LUZ… ¿Y AHORA QUÉ?: EXPERIENCIAS DIDÁCTICAS EN ANÁLISIS DE IMÁGENES DE UN BIÓLOGO CUALQUIERA

Dr. Nicolás Unsain

Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra- INIMEC-CONICET-UNC. Córdoba, Argentina.

La luz que sale de nuestros especímenes en estudio contiene información. La misma sufre transformaciones inherentes al método de adquirir y registrar esa información. Luego, tenemos que aplicar transformaciones matemáticas a esa información de manera de poder transformar características cualitativas del espécimen en valores matemáticos. El resultado de esa transformación abre un mundo nuevo: ahora nuestra imagen en susceptible de ser “investigada” con la ayuda de la exquisita maquinaria de la matemáticas. En el contexto de esta charla hablaremos de la información y cuantificación de la información que podemos extraer de imágenes obtenidas por microscopía óptica, pero los principios valen para cualquier análisis de imágenes. En la mesa discutiré principios básicos de análisis de imágenes, tratando de ejemplificar su importancia e utilidad de cada paso involucrado en la obtención, transformación, análisis y cuantificación de imágenes a partir de ejemplos propios en los que tuve que usar y explotar esos principios para responder preguntas biológicas. La idea es que más allá de las formalidades, pueda trasmitir mi experiencia no desde el lugar del matemático que modela el análisis cuantitativo de las imágenes, ni el físico que mejora los aparatos que usamos para obtener esas imágenes, sino más bien desde la perspectiva de un biólogo que ha tenido que digerir algunos conceptos para responder preguntas biológicas a partir de la toma y análisis de imágenes.

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APLICACIONES DE LA MICROSCOPÍA DE FUERZA ATÓMICA EN BIOLOGÍA Y ÁREAS BIOMÉDICAS

Dr. Juan C. Benech

Laboratorio de Señalización Celular y Nanobiología. Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE). Av. Italia 3318, Montevideo, Uruguay.

La Microscopía de Fuerza Atómica (MFA), se ha convertido en una herramienta muy versátil que ayuda a dar respuestas a preguntas fundamentales en áreas claves de la biología y biomedicina. Además de imagenología de alta resolución en medio fisiológico, la MFA permite el estudio de las propiedades dinámicas y nanomecánicas de material biológico vivo. La técnica permite el estudio de las propiedades nanomecánicas a nivel de célula única y a nivel de molécula única. Diferentes eventos celulares como la locomoción, diferenciación, envejecimiento, electromotilidad y patologías pueden ser analizados con esta herramienta. En la presentación, se describirán ejemplos de diferentes aplicaciones de la MFA en biología y áreas biomédicas. Particularmente, mostraremos resultados que muestran como la diabetes modifica la nanomecánica del cardiomiocito.

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POLI-ADP-RIBOSILACIÓN: NUEVAS LOCALIZACIONES Y AUMENTO EN NERVIOS PERIFÉRICOS DE RATONES TremblerJ.

L. Lafon-Hughes (1), C. Romeo (2), K. Cal (2), G. Folle (1), J.R. Sotelo (2), A.

Kun (2, 3). (1)Departamento de Genética-IIBCE, (2) Departamento de Proteínas y Ácidos

Nucleicos-IIBCE, (3) Sección Bioquímica Facultad de Ciencias-UdelaR. La poli-ADP-ribosilación (PARilación) es una modificación postraduccional de proteínas consistente en la adición de sucesivos monómeros de ADP-ribosa generando cadenas de longitud variable de poli-ADP-ribosa (PAR). Los estudios de la PARilación se han focalizado mayormente en proteínas nucleares. Sin embargo, recientemente hemos comunicado la presencia de PAR asociada al cinturón de adhesión de las células VERO (epitelio renal de mono). Demostramos que la inhibición de la síntesis de PAR induce cambios de forma y pérdida de adhesión celular, en tanto el desensamblaje del citoesqueleto de actina conlleva la disrupción del cinturón de PAR, sugiriendo asociación estructural y funcional de actina y PAR. Nos preguntamos si la PARilación está restringida a las uniones intercelulares de VERO o es una modificación postraduccional relacionada también con la actina en otros tejidos. Detectamos PAR en: epitelio intestinal, epidermis, acinos dérmicos y capilares hepáticos, demostrando que este fenómeno se extiende a diversas células epiteliales. Considerando que recientemente hemos descrito en fibras nerviosas periféricas de ratones Trembler-J (modelo murino de la neuropatía periférica humana CMT1E) incrementos significativos en la expresión del citoesqueleto de actina, analizamos los niveles de PARilación en el nervio ciático de ratones de genotipos TrJ y salvaje. Confirmamos que el aumento de actina se correlaciona con aumento de PAR , agregando así un dato más a favor de la interacción estructural y funcional de actina y PAR cuyo significado biológico habrá que intentar dilucidar en el futuro.

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EFECTOS DE LA RIGIDEZ DE LAS MATRICES DE COLÁGENO TIPO I EN EL CRECIMIENTO DE LAS NEURITAS SIMPÁTICAS

G. F. Martínez 1, A. Richeri1, N. Unsain2, A. Cáceres2,3, M.M. Brauer 1

1Laboratorio de Biología Celular. Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE), MEC. Montevideo, Uruguay;

2Laboratorio de Neurobiología. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra (IMMF), INIMEC-CONICET, Universidad Nacional de Córdoba.

Córdoba, Argentina; 3Instituto Universitario de Ciencias Biomédicas de Córdoba (IUCBC), Córdoba, Argentina

El colágeno es el componente más abundante de la matriz extracelular (MEC), siendo el Tipo I una de las formas predominantes. Andamios que contienen colágeno Tipo I alineado son ampliamente utilizados en ingeniería de tejidos para promover la regeneración de nervios periféricos. Evidencias indican que la rigidez de la MEC afecta el crecimiento neurítico. En el presente trabajo se caracterizó el crecimiento axonal en matrices tridimensionales de colágeno Tipo I (matrices-3D) de distinto grado de rigidez. Con este fin, se cultivaron explantos de ganglios simpáticos de rata en geles de colágeno control (no rígidos) y geles tratados con glicoaldehído, un agente promotor del entrecruzamiento de fibrillas de colágeno, que aumenta su rigidez. Los explantos ganglionares crecidos en matrices-3D rígidas presentaron halos neuríticos de tamaño significativamente menor que los crecidos en geles control. La morfología del cono de crecimiento de las neuritas (CC) también se vio afectada. El análisis de los cultivos por inmunofluorescencia reveló diferencias en la morfología del citoesqueleto de F-actina. La cuantificación mostró que el 25 % de las neuritas crecidas en geles rígidos presentaba CCs con morfología típica de colapsados, mientras que sólo un 3 % de los CCs crecidos en geles control mostraron esta morfología. Estos resultados sugieren que no sólo el alineamiento de las fibrillas de cólageno en una matriz, sino también su grado de rigidez es relevante para el crecimiento de los nervios.

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ABSORCIÓN INTESTINAL EN VERTEBRADOS: ROL DE LAS PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE ÁCIDOS GRASOS

M. Suárez1, A. Esteves1

1Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR) Las FABPs (fatty acid binding proteins) son proteínas intracelulares, que unen en forma no covalente ácidos grasos de cadena larga y otros ligandos hidrofóbicos. Se distinguen entre ellas, por su distribución tisular y por los ligandos que unen. La función específica de las FABPs está aún bajo investigación, si bien recientemente se han obtenido hallazgos prometedores. Algunos de sus miembros estarían implicados en la modulación del crecimiento y proliferación celular, regulación de la expresión génica. El pez cebra (Danio rerio) resulta útil para el estudio del metabolismo lipídico de los vertebrados. Diferentes FABPs se expresan en el intestino del pez cebra y en particular, las formas I-FABP y L-FABP se expresan en el tercio anterior del intestino por lo cual se cuestiona si estas proteínas ejercen una función redundante o complementaria. En este trabajo se estudió la localización celular de las proteínas I-FABP y L-FABP en el enterocito de Danio rerio en respuesta a la dieta. Se observó por microscopía laser confocal y electrónica de transmisión que ambas proteínas se distribuyen tanto en el núcleo como en el citoplasma del enterocito, en dos condiciones alimenticias. Se realizó la cuantificación de la fluorescencia en los núcleos de ambos grupos de peces, resultando en un aumento significativo para la L-FABP en los peces alimentados con respecto a los no alimentados. Resultados similares fueron obtenidos por microscopía electrónica de transmisión. En cuanto a la I-FABP los resultados obtenidos no son estadísticamente significativos.

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PÓSTERS

Todos los posters permanecerán expuestos durante los dos días de las jornadas, serán evaluados por investigadores consolidados y se otorgarán premios a los que obtengan mejor puntuación. A cada poster se le ha sido asignado un número, la presentación de los mismos se realizará en 2 sesiones, exponiendo el jueves 15 (Sesión 1) los posters con número impar y el viernes 16 (Sesión 2) los número par.

ÁREAS TEMÁTICAS 1. Biología Celular 2. Biotecnología 3. Virología 4. Bioquímica y Biología Molecular en Agronomía 5. Parasitología Molecular 6. Educación en Ciencias 7. Bioquímica y Biología Molecular de Microorganismos 8. Neurobiología 9. Genómica 10. Bioquímica de proteínas 11. Bioquímica y Biología Molecular en Ciencias Animales 12. La imagen como fuente de información

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BIOLOGÍA CELULAR (1-8, 10-13, 15)

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1. PREPARADOS COMERCIALES DE Mercaptothion (PLAGUICIDA), COMPROMETEN DRAMATICAMENTE FUNCIÓN CARDÍACA

M. Alonso1,2, C.Costa2, T. González1, J. Dutra 1, G. Ferreira 1,3

1Laboratorio de Canales Iónicos. Departamento de Biofísica, Facultad de Medicina (UDELAR); 2Igual contribución al trabajo; 3Correspondencia

El Mercaptothion (MPT) es un insecticida organofosforado liposoluble de uso

bastante común a nivel agropecuario también conocido como malation. De

acuerdo con la clasificación de OMS (2009), que establece el grado de

peligrosidad de exposición a agroquímicos para la salud humana, MPT es

categoría II, toxicidad moderada, con riesgos de gravedad en seres humanos

por exposición directa por inhalación, ingestión o penetración cutánea. Su uso

en Uruguay comprende aprox. un 5-10% de los agroquímicos (DGSA, 2010).

MPT oxidado, se transforma a malaoxon, con potente actividad

anticolinesterasa. El corazón presenta abundantes receptores muscarínicos

para AcetilColina (ACh). La toxicidad de MPT se evaluó en corazones aislados

de cobayo y rata. Exposición de corazones a concentraciones mayores que

100 uM detuvo por completa e irreversiblemente, contractilidad y excitabilidad

cardíacas. La muerte cardíaca fue precedida de contracciones alternantes y

fibrilación ventricular. Concentraciones entre 5 y 70 uM tuvieron efecto

inotrópico negativo con IC50 de aprox. 17 + 5 uM (n=5). Estas concentraciones

disminuyeron la duración de la meseta de potenciales de acción monofásicos.

Ambos efectos ocurrieron menos de 3 minutos luego de la exposición. El

lavado de MPT llevó 8-15 minutos. MPT exhibió efecto cronotrópico negativo

con IC50 mayor, en comparación con la contractilidad. Los resultados

presentados son consistentes con efecto agonista de receptores M de ACh,

inhibiendo el automatismo del nodo sinusal, disminuyendo corrientes por

canales de Ca2+, con probable aumento por canales de K+ y alteración

contráctil directa o indirecta.

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2. CARACTERIZACIÓN DE LOS METABOLITOS DERIVADOS DEL PÉPTIDO SINTÉTICO ANTITUMORAL CIGB-552 EN LA LÍNEA

CELULAR HUMANA MCF-7

S. Astrada1, Y. Gómez2, G. Obal3, M.G. Vallespí2, M. Bollati1 1Unidad de Biología Celular, Institut Pasteur de Montevideo; 1Departamento de

Farmacéuticos, Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, La Habana; 3Unidad de Biofísica de Proteínas, Institut Pasteur Montevideo

Los péptidos anti-microbianos constituyen un ejemplo de agentes peptídicos con potenciales funciones terapéuticas. Existen antecedentes que estas moléculas son capaces de atacar células tumorales (Mader y Hoskin, 2006). A partir de la región 32-51 de la proteína antimicrobiana LALF se desarrolló un péptido sintético, CIGB-552, el cual demostró tener capacidad de penetración en líneas celulares, presentar toxicidad selectiva en líneas tumorales y aumentar la sobrevida de animales portadores de tumores (Vallespí y col. 2000; Vallespí y col. 2003; Vallespí y col. 2004; Vallespí y col. 2010). La proteína COMMD1, responsable de la inhibición de la vía NF-kB, ha sido identificada y validada como posible blanco de acción del CIGB-552 siendo necesaria su expresión para la inducción de apoptosis producida por CIGB-552 en líneas celulares humanas. Luego de la administración sistémica del CIGB-552, éste sufre una rápida degradación en suero produciendo metabolitos derivados que difieren en la extensión de su secuencia aminoacídica. Estos metabolitos presentaron diferencias en su citotoxicidad y su capacidad de penetración en líneas celulares humanas (Vallespí y col. 2014). En este trabajo, se estudió la capacidad de producir apoptosis y de penetración de los metabolitos en relación al péptido CIGB-552. También se evaluó su interacción con la proteína COMMD1 y con modelos de membranas lipídicas. Los metabolitos no fueron capaces de producir apoptosis en la línea celular MCF-7 y mostraron una menor capacidad de penetración. Además, dichos péptidos mostraron menor afinidad que el péptido completo CIGB-552 para interaccionar con COMMD1 y con membranas lipídicas.

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3. ROL DE LA PROTEÍNA DBC1 EN LA REGULACIÓN DE LA FISIOLOGÍA NORMAL Y PATOLÓGICA DEL TEJIDO ADIPOSO

DURANTE LA OBESIDAD

N. Bobba1, V. Prieto2, J M. Fernández-Real3, J. Badano2, C. Escande1

1Laboratorio de Patologías del Metabolismo y Envejecimiento, Institut Pasteur de Montevideo; 2Laboratorio de Genética Molecular Humana, Institut Pasteur

de Montevideo; 3 Departamento de Diabetes, Endocrinología y Nutrición, Instituto de Investigación Biomédica de Girona

La obesidad es una de las principales patologías del siglo XXI, afectando al 40% de la población adulta en Uruguay y en gran parte de occidente. Es actualmente considerada el principal factor de riesgo para el desarrollo de diabetes tipo II y enfermedades cardiovasculares, mayores causantes de mortalidad en el mundo. El trabajo de nuestro laboratorio ha demostrado que la proteina DBC1, regulador negativo de SIRT1, juega un rol esencial en la transicion normal-patológica del tejido adiposo. De hecho, nuestros hallazgos apuntan a que DBC1 limita la capacidad expansiva del tejido adiposo durante la obesidad, conduciendo a un derrame o “spillover” de ácidos grasos que ocasiona resistencia a la insulina, esteatosis hepática y aterosclerosis. Actualmente nos encontramos estudiando las vías moleculares que regulan la expresión y función de DBC1. Resultados preliminares nos señalan que las vías de insulina e IGF, ambas alteradas durante la obesidad, regulan la expresión de DBC1 in vitro en in vivo. Por otro lado, encontramos que FSTL1, una glicoproteína de secreción involucrada en la adipogénesis y en procesos de tipo inflamatorio, también podría estar involucrada en la transición normal-patológica del tejido adiposo. En suma, pretendemos aportar a la comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la fisiopatología del tejido adiposo durante la obesidad, y cómo esto impacta en el resto de los tejidos en el organismo.

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4. ROL DE SIRT6 EN LA INFLAMACION CRONICA ASOCIADA A LA OBESIDAD. ESTUDIO PRELIMINAR EM MACROFAGOS Y CELULAS

SENESCENTES.

M. Bresque1, P. Garat1, N. Bobba1, J. Matalonga2 C, A. Fernandez-Valledor2, C Quijano3, C. Batthyany4 y C.Escande1

1 Laboratorio de Patologias del Metabolismo y el Envejecimiento, Institut Pasteur Montevideo; 2 Departamento de Fisiologia e Imunologia, Facultad de Biologia, Universidad de Barcelona. 3 Departamento de Bioquímica, Facultad

de Ciencias, Universidad de la Republica. 4 Unidad de Bioquímica y Proteómica Analítica, Institut Pasteur Montevideo.

Antecedentes generales: A nivel mundial la preocupación por el sobrepeso y la obesidad toma cada vez más relevancia y Uruguay no es ajeno a esta problemática. La obesidad y el sobrepeso constituyen el principal factor de riesgo para el desarrollo de diabetes tipo II, enfermedades cardiovasculares y del Síndrome Metabólico. Dentro de la etiología de este último se destaca: la generación de resistencia a la insulina y la inflamación sistémica crónica y “estéril”. Un órgano clave en la fisiopatología de la obesidad y el Síndrome Metabólico es el tejido adiposo, el cual presenta en la patología un estado disfuncional y pro-inflamatorio característico. Antecedentes específicos: Los principales actores del estado patológico del tejido adiposo son los pre-adipocitos con un fuerte componente secretor pro-inflamatorio y los macrófagos y neutrófilos, etc., los cuales infiltran el tejido e incrementan aún más la respuesta inflamatoria. Nuestro grupo propone que SIRT6, podría tener una participación en la modulación de la respuesta inflamatoria. Su activación de por ácidos grasos, plantea un posible vínculo muy interesante entre la actividad enzimática de SIRT6 y los niveles de ácidos grasos libres observados durante la obesidad. Nuestro Trabajo: En este trabajo se presentaran los resultados preliminares obtenidos del estudio de macrófagos derivados de la medula ósea, así como de líneas celulares de macrófagos, junto a resultados obtenidos de células IMR90 con fenotipo senescente, donde se analizó cómo es la expresión, distribución y regulación de SIRT6 tanto en respuesta a estímulos pro-inflamatorios como en condiciones de senescencia. Conclusiones: Los resultados obtenidos hasta el momento indican que SIRT6 responde a los estímulos pro-inflamatorios incrementando su expresión y disminuyendo su actividad desacetilasa a nivel nuclear. En las células senescentes hemos observado incrementos en su expresión así como una relocalización de la proteína. Estos resultados muestran una respuesta de la enzima en ambos componentes que contribuyen a la inflamación local del tejido adiposo presente en la obesidad.

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5. ROL DE LA PROTEÍNA DBC1 EN LA REGULACIÓN DE HIPERTENSIÓN ARTERIAL INDUCIDA POR ANGIOTENSINA II

M. Caggiani1,2, P. Contreras1,2, A. Carlomagno2,3, C. Batthyany3,4,

C. Escande2. 1. Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, UdelaR; 2. Laboratorio de Patologías del Metabolismo y Envejecimiento, Instituto

Pasteur de Montevideo; 3. Unidad de Bioquímica y Proteómica Analítica, Instituto Pasteur de Montevideo; 4. Departamento de Bioquímica,

Facultad de Medicina, UdelaR.

Los cambios en los estilos de vida han determinado un constante incremento en la incidencia de enfermedades crónicas no transmisibles (ECNT), las que constituyen la principal causa de muerte a nivel mundial. Las complicaciones de la hipertensión arterial (HTA) producen una parte importante de los fallecimientos por ECNT. La injuria vascular constituye una de las principales consecuencias observadas en la HTA mantenida. Los mecanismos celulares y metabólicos involucrados en la injuria vascular son numerosos, complejos y multifactoriales, dentro de los cuales el sistema renina-angiotensina - aldosterona juega un rol protagónico. La Angiotensina II (ANGII) presenta un rol clave en la generación de inflamación, fibrosis, y apoptosis; modificaciones que se observan en la HTA. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen estos procesos aún no han sido completamente elucidados. Nuestro grupo ha venido trabajando en el rol de la proteína DBC1, un inhibidor de SIRT1, en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares. Los ratones Knock Out (KO) para DBC1 están protegidos contra la aterosclerosis en situación de obesidad experimental. En este contexto, nos planteamos evaluar si DBC1 desempeña un papel relevante en la HTA. Los resultados obtenidos apoyan esta hipótesis. El tratamiento con ANGII in vivo induce la expresión de DBC1 tanto a nivel vascular como renal. Sorprendentemente, los ratones KO para DBC1 son más sensibles a la ANGII, generando mayor hipertensión comparados con los ratones Wild Type. Nuestros resultados sugieren que DBC1 juega un rol preponderante en las enfermedades cardiovasculares, aunque aún debemos comprender en profundidad los mecanismos involucrados.

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6. LA INCORPORACION DE GLICEROFOSFOLIPIDOS A ESPERMATOZOIDES HUMANOS AUMENTA SU MOVILIDAD Y

TOLERANCIA A STRESS OXIDATIVO

C.Costa 1, T. González 1, G. Nicolson 2, G. Ferreira 1,3 1 Laboratorio de canales iónicos, Depto. de Biofísica, Facultad de Medicina (UDELAR); 2. The Institute for Molecular Medicine, Huntigton, CA, USA; 3

Correspondencia.

La movilidad de los espermatozoides es un buen estimador de su capacidad para fecundar. Ésta puede ser medida por “computer assisted sperm analysis” (CASA) (Larsen 2000). La composición de la membrana plasmática es un factor determinante de la movilidad espermática por mecanismos de asociación a distintas vías metabólicas y de control de canales iónicos y Ca2+ intracelular. El espermatozoide produce especies reactivas de oxigeno (ROS), que se incrementan con la edad y producen entre otros efectos, lipoperoxidación de las membranas repercutiendo en la movilidad espermática. La terapia de reposición lipídica consiste en la incorporación y reemplazo en las membranas biológicas, de lípidos peroxidados por lípidos nuevos, resistentes a la lipoperoxidación. En este trabajo evaluamos la terapia de reposición lipídica, mediante el análisis de cambios en movilidad espermática al incubar espermatozoides humanos con distintas concentraciones de glicerofosfolipidos (NTFL). Valoramos la movilidad mediante pautas de standard globales de acuerdo con OMS. Los resultados muestran aumento en las velocidades, área de membrana y “beat crossing frequency” (BCF), con el aumento de concentración de NTFL entre 0.05% y 2%. Adicionalmente, la exposición a NTFL, atenúa la disminución marcada en movilidad observada al tratar los espermatozoides con intervenciones que incrementan su stress oxidativo (bajas temperaturas y exposición a H2O2). Nuestros ensayos sugieren que la reposición lipídica de membranas con NTFL, mejora la calidad de los espermatozoides, ya sea revirtiendo o protegiendo contra el stress oxidativo, pudiendo ser un agente a emplear en casos de infertilidad masculina relacionados a aumento de ROS.

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7. ACTIVACIÓN DE LA PKA EN RESPUESTA A LA DESPOLARIZACIÓN DEL POTENCIAL DE MEMBRANA

PLASMÁTICA EN CÉLULAS ENDOTELIALES

F. Evans1, J.A. Hernández2, S. Chifflet3

Departamentos de 1Histología y Embriología y de 3Bioquímica, Facultad de

Medicina (UDELAR), 2Sección Biofísica, Facultad de Ciencias (UDELAR)

Se ha sugerido que el potencial de membrana plasmática (PMP) podría actuar como un intermediario en diversas vías de señalización celular. En este sentido, hallamos que la despolarización del PMP (DPMP) provoca un incremento en la concentración de cAMP en monocapas de células endoteliales en cultivo. Asimismo, en nuestro laboratorio se encontró que la

DPMP conduce a la remodelación de la actina‐F cortical y a la desfosforilación

de la cadena liviana de la miosina no muscular II monofosforilada (pMLC). Mediante inmunofluorescencia, Western blot e inhibición de la PKA con un péptido específico (iPKA), investigamos, por un lado, si ocurren cambios en la activación de la PKA en respuesta a la DPMP en células endoteliales en cultivo. Por otro, si la PKA está implicada en los cambios observados en la actina-F y en la p-MLC provocados por la DPMP. Las DPMP se indujeron mediante soluciones salinas despolarizantes. Empleando un anticuerpo contra los sustratos fosforilados de la PKA, se pudo establecer que el perfil de bandas de Western Blot obtenido con tratamientos despolarizantes es distinto al del control, observándose el aumento de la señal de un par de bandas con la DPMP. El iPKA bloqueó los efectos de la DPMP sobre la pMLC y la remodelación del citoesqueleto de actina-F. En su conjunto, estos resultados y nuestros antecedentes, sugieren que la vía de la cAMP/PKA podría ser una de las implicadas en los cambios del citoesqueleto de actina-F cortical en respuesta a la DPMP.

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8. PRE-MIR-886/HSA-MIR-886-3P PROVOCA UNA DISMINUCIÓN DE LA PROLIFERACIÓN Y UN RETRASO EN G2/M EN CÉLULAS

TUMORAL DE PRÓSTATA. R. Fort 1,2; M. Geraldo 3; A. Yamashita 3; K. R. Leite 4; E. T. Kimura 3; J. R.

Sotelo-Silveira 5,6; M. A. Duhagon 1,2. 1Laboratorio de Interacciones Moleculares (L.I.M.), F. Ciencias, UdelaR,

Uruguay. 2Depto. de Genética, F. Medicina, UdelaR, Uruguay. 3Depto. de Biología Celular y del Desarrollo, ICB, USP, Brasil. 4Laboratorio de

Investigación Médica, Departamento de Urología, LIM55, Facultad de Medicina, USP, Brasil. 5Depto. de Genómica. IIBCE; 6Depto. de Biología Celular y

Molecular, UdelaR, Uruguay. Los microARNs son ARNs moduladores de la expresión génica que están extensamente desregulados en el cáncer. El microARN hsa-miR-886-3p fue identificado como un posible supresor de tumor (TS) en el tejido de próstata. Nosotros extendemos el estudio del perfil de expresión del microRNA así como el de su ARN precursor (Pre-miR-886) en líneas celulares y muestras histológicas de pacientes. Observamos que ambas moléculas están sub-expresado en el tumor, lo que apoya su papel de TS. La aparición de una controversia sobre la naturaleza de hsa-miR-886-3p como microARN motivó el metanálisis de datos de smallRNA-seq disponibles públicamente para validar la existencia de los microARNs procesados a partir del precursor. Los resultados sugieren que hsa-miR-886-3p presenta las características típicas de un microARN. Nuestro trabajo busca también comprender su efecto en el fenotipo neoplásico y su mecanismo molecular de acción. Para esto se utilizó la línea celular DU145, transfectada establemente con la construcción Pre-miR-886/hsa-miR-886-3p o con una construcción control. Se realizaron ensayos de proliferación in vitro por conteo directo y MTT, e in vivo por xenoinjertos en ratones BALB-C NUDE, encontrándose que la sobreexpresión de Pre-miR-886/hsa-miR-886-3p resulta en un menor crecimiento tumoral respecto al control. Finalmente, en búsqueda de posibles vías, procesos y genes blanco de acción del hsa-miR-886-3p, se realizó ensayos de microarreglos de expresión Affymetrix para los transfectantes DU145. Esto permitió identificar vías, procesos y potenciales genes blanco candidatos a ser regulados por el microARN, que participan en el ciclo celular, proliferación y motilidad celular.

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10. LA INDUCCIÓN DE SENESCENCIA POR EXPOSICIÓN A QUIMIOTERAPIA CONDUCE A UNA REPROGRAMACIÓN

METABÓLICA EN CÉLULAS DE MELANOMA

Martínez-Cazarré, J.1; Moreno, M.2;Agorio, C.3; Quijano, C.1 1 Centro de Investigaciones Biomédicas y Departamento de Bioquímica,

Facultad de Medicina (UdelaR)2 Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Instituto de Higiene(UdelaR) 3 Cátedra de Dermatología, Hospital de Clínicas,

Facultad de Medicina (UdelaR)

La quimioterapia empleando agentes alquilantes, como la temozolomida (TMZ), sola o en combinación con otras terapias, es la mas utilizada actualmente para el tratamiento del melanoma metastásico. Interesantemente, se han encontrado células senescentes en tumores tratados con TMZ, evidenciando que la senescencia constituye un nuevo “punto final” de la terapia contra el cáncer. Nuestros resultados muestran que la exposición de células B16F1 a TMZ (200 µM, dos dosis) induce la aparición de marcadores de la senescencia en aproximadamente un 60 % del cultivo: observamos un cese en la proliferación celular, activación de la respuesta al daño al ADN (evidenciado por la fosforilación de ATM, p53 y H2AX), importantes cambios en la morfología y tamaño celular y en la actividad de la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-βGal). Además, encontramos que las células tratadas presentan un aumento en la transcripción de genes de citoquinas y factores de crecimiento, incluyendo IL6, CCL2, CXCL9, CXCL10, IL18, TGF-β. La inducción de senescencia en melanoma resultó en un cambio considerable de la función mitocondrial. El consumo máximo de oxígeno (determinado por el agregado de un desacoplante) fue tres veces más alto en las células tratadas con TMZ, indicando un aumento en el número o actividad de los complejos mitocondriales. Además, las células senescentes presentaron aproximadamente un 50 % menos de acidificación extracelular, sugerente de una disminución en la producción de lactato. Nuestros resultados indican que la inducción de senescencia por quimioterapia en células de melanoma está acompañada de una reprogramación en el metabolismo energético celular.

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11. CARACTERIZACIÓN DE LOS NITROALQUENOS ANÁLOGOS DEL

-TOCOFEROL (NA--TOH): UNA NUEVA HERRAMIENTA TERAPÉUTICA PARA LAS ENFERMEDADES VASCULARES

J. Rodriguez Duarte1, 2, G. Galliussi2, G. Ferrer-Sueta3, H. Botti2, G. V.

López1, C. Batthyány2, 4 1Grupo de Química Medicinal, Departamento de Química Orgánica, Facultad

de Química-Facultad de Ciencias, UDELAR; 2Unidad de Bioquímica y Proteómica Analíticas, Institut Pasteur de Montevideo; 3Laboratorio de

Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias, UDELAR; 4Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, UDELAR.

La aterosclerosis constituye una de las principales causas de muerte en nuestro país y en su desarrollo se reconocen dos eventos patogénicos principales: un proceso inflamatorio crónico mediado por la activación del inflamasoma por señales estériles y la acumulación de lípidos (LDL) en la intima arterial. En nuestro trabajo desarrollamos una nueva estrategia farmacológica para el tratamiento de la aterosclerosis y enfermedades vasculares inflamatorias:

análogos de -tocoferol conteniendo el grupo electrofílico nitroalquenilo en su estructura1. El diseño de esta estrategia fue basado en el rol que desempeñan las lipoproteínas en el desarrollo de la enfermedad y en que la vitamina E se transporta en dichas partículas. Al incorporar la función nitroalqueno2 en su estructura buscamos transformar a la vitamina E en un potente agente anti-inflamatorias y anti-aterogénicas, a la vez de aprovechar su metabolismo como una estrategia para lograr un transporte hacia los sitios de lesión. En este trabajo sintetizamos y demostramos que los NA- -TOH son electrófilos, que se incorporan a las lipoproteínas tanto in vitro como in vivo y muestran una potente actividad anti-inflamatoria: 1. inhiben la secreción de

citoquinas pro-inflamatorias dependientes de NFB (IL- 6, MCP-1, TNF); 2. inducen la expresión de enzimas de fase 2 controladas por el sistema Nrf2/Keap-1 (HO-1, GCLM, NQO1) en macrófagos murinos; y 3. inhiben la

secreción de IL-1 regulada por el inflamasoma NLRP3 en células THP-1. Actualmente estamos evaluando en modelos murinos su capacidad para inhibir el desarrollo de placas de ateroma y de revertir la HTA mediada por Ang II.

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12. CARACTERIZACIÓN Y PURIFICACIÓN DE CÉLULAS PRECURSORAS DE MEIOSIS Y CÉLULAS SOMÁTICAS DE

TESTÍCULO POR CITOMETRÍA DE FLUJO

Souza E.1, Santiñaque F.2, Geisinger A.1,3, Rodríguez-Casuriaga R.1 1Departamento de Biología Molecular, IIBCE; 2Servicio de Citometría de Flujo y

Clasificación Celular, IIBCE; 3Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias,UDELAR.

La heterogeneidad celular del testículo de mamíferos (contiene células germinales en diferentes estadios de maduración y diversas células somáticas) representa una dificultad importante para estudios moleculares de espermatogénesis. Nuestro grupo ha desarrollado métodos para analizar la espermatogenésis y obtener poblaciones celulares enriquecidas en ciertos estadios utilizando citometría de flujo (CMF). Las células presentes en una suspensión celular son analizadas según su contenido de ADN (C, 2C, 4C), tamaño y complejidad interna-externa. El objetivo de este trabajo ha sido evaluar el potencial de un nuevo fluorocromo vital (Vybrant DyeCycle Green) en la distinción de diversas poblaciones celulares testiculares de ratón mediante CMF. Particularmente, la posibilidad de obtener células precursoras de meiosis (espermatogonias) por un lado, y células de sostén (Sertoli) en forma pura sería de interés para varias aplicaciones prácticas (trasplante de espermatogonias con fines de asistencia reproductiva, etc). A partir del análisis de los citogramas, mediante clasificación en flujo (sorting) hemos obtenido una población con contenido de ADN 2C con alta dispersión lateral (side scatter), que presentó gran homogeneidad al microscopio (aspecto, tamaño, complejidad interna). Esta población presentó abundantes gránulos citoplasmáticos y se marcó positivamente para la proteína citoplasmática vimentina (presente en células somáticas de testículo como Sertoli y Leydig, y ausente en espermatogonias). Por otra parte, se obtuvo otra población celular 2C con baja dispersión lateral que presentó marca positiva para proteínas presentes en espermatogonias. Los resultados obtenidos hasta el momento sugieren que es posible, mediante las metodologías aquí empleadas, obtener los tipos celulares de interés en forma pura.

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13. EL GENOTIPO Trembler-J PRESENTA CAMBIOS TRADUCCIONALES DE PMP22 MAG Y VIMENTINA

Romeo C.1, Cal K.1, Bresque M.1, Lafon Hughes L.2, Sotelo J.R.1, Calero

M.3 & Kun A.1,4 1 Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos del IIBCE;2 Departamento de Genetica del IIBCE 3; Unidad de Encefalopatías Espongiformes - Instituto de

Salud Carlos III; 4 Sección Bioquímica de Facultad de Ciencias

Antecedentes generales: Las neuropatías hereditarias periféricas humanas constituyen un grupo de síndromes que difieren a nivel clínico y genético. Más del 50% son causadas por alteraciones en el gen que codifica para la proteína glial de mielína periférica - PMP22. Dentro de ellas, la neuropatía desmilinizante Charcot – Marie – Tooth de tipo 1E (CMT 1E) se origina en una sustitución L16P, que impide a la proteína insertarse en la mielina. Como consecuencia, la célula de Schwann (CS) sufre un desequilibro estructural y funcional que también afecta al axón y a la fibra nerviosa en su conjunto. Antecedentes específicos: El modelo murino Trembler J ha sido validado para el estudio de CMT1E, constituyendo una herramienta genuina y versátil. En este modelo, PMP22 además de presentar las dificultades habituales en su plegamiento, presenta una mutación puntual (en heterocigosis) que impide a la proteína insertarse en la membrana, formando agregados perinucleares y disminución de la proteína en la mielina. Trabajos realizados recientemente en nuestro laboratorio han reportado cambios en la distribución y cantidad de proteínas de membrana y estructurales del citoesqueleto, asociados al genotipo TrJ. Nuestro abordaje: Enfocándonos en estos cambios hemos estudiado en la fibras nerviosa periférica del genotipo salvaje y Tr-J, la expresión transcripcional de los genes gliales: pmp22, vimentina y mag y explorado la correlación entre niveles de expresión de ARNm y de proteína, de estos genes. Nuestros resultados parecen indicar que se produce una regulación traduccional diferencial, genotipo específica, para estos genes.

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15. LA MAQUINARIA DE IMPORTACIÓN NUCLEAR ESTÁ INVOLUCRADA EN EL TRANSPORTE DE GLI2 A LA CILIA

B. Torrado1, M. Graña2, J.L. Badano1 y F. Irigoín1,3

1Laboratorio de Genética Molecular Humana, Institut Pasteur de Montevideo, 2Unidad de Bioinformática, Institut Pasteur de Montevideo, 3Depto. de

Histología y Embriología, Facultad de Medicina, UdelaR Gli2 es el principal activador transcripcional de la vía de Hedgehog. En vertebrados esta vía de señalización depende de la cilia primaria, y al activarse Gli2 se transloca primero a la cilia y luego al núcleo donde activa genes blanco. Los mecanismos que mueven Gli2, y muchas otras proteínas, a la cilia son poco entendidos. Dado que se han reportado similitudes entre el transporte de proteínas del citosol al núcleo y a la cilia, decidimos investigar si la maquinaria de importación nuclear (señales de localización nuclear clásicas (cNLS), importinas, RanGTP/GDP) está también involucrada en el movimiento de Gli2 a la cilia. Primero determinamos que mientras el transporte nuclear de Gli2 es mediado por importina-beta1 interaccionando con las dos cNLS presentes en Gli2, el movimiento a la cilia no depende de ninguno de estos factores. Sin embargo, cuando sorbre-expresamos una forma mutada de Ran (RanG19V) que bloquea el transporte mediado por importinas, observamos una reducción en la cantidad de Gli2 que es transportado a la cilia, sugiriendo la participación de alguna importina en el proceso. Efectivamente, utilizando un inhibidor específico de importina-beta2 (M9M) determinamos que esta importina está involucrada en el transporte ciliar de Gli2. Por lo tanto, la maquinaria de transporte núcleo-citoplasma, participa en la entrada de Gli2 a la cilia utilizando Importina-beta2, mientras que la entrada al núcleo depende de Importina-beta1. Nos encontramos ahora estudiando la interacción Gli2-Importina-beta2 para determinar si la misma es directa o a través de un adaptador.

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BIOTECNOLOGÍA (16-23, 83)

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16. INMUNOSENSOR PARA EL AISLAMIENTO DE EXOSOMAS EN SOBRENADANTE DE CULTIVOS CELULARES.

X. Doldán, J. Laíz; J.P Tosar

Unidad de Bioquímica Analítica, Centro de Investigaciones Nucleares (Facultad de Ciencias-UdelaR)

Los exosomas son vesículas extracelulares de aproximadamente 100nm secretadas por la mayoría de las células y especialmente por las células tumorales. Estas vesículas pueden ser internalizadas por otros tipos celulares, afectando su expresión génica. Más allá de su rol biológico, los exosomas transportan por el torrente sanguíneo un muestreo del contenido de proteínas y ARNs expresados por sus células parentales. De aquí que exista gran interés en disponer de métodos rápidos y eficientes para la captación y análisis de exosomas tumorales circulantes, por su promisorio uso como biomarcadores no invasivos. Sin embargo, las tecnologías actuales para el aislamiento y cuantificación son laboriosas y/o costosas. Por esto, hemos comenzado a desarrollar un inmunosensor de base electroquímica que permita la purificación y cuantificación de exosomas de una forma rápida y compatible con la automatización. Por medio de la formación de una monocapa auto-ensamblada de ácido mercaptoundecanoico sobre electrodos serigrafiados de oro, hemos inmovilizado anticuerpos anti-CD9 sobre la superficie del biosensor, logrando una plataforma de anclaje para los exosomas. Luego de optimizar las condiciones de inmovilización, hemos procedido a evaluar el pegado de exosomas purificados de medio condicionado de la línea celular MCF-7. Al aumentar la cantidad de exosomas retenidos a la superficie del biosensor, disminuye proporcionalmente la corriente originada por la reducción electroquímica del sustrato TMB, previamente oxidado por la enzima peroxidasa funcionalizada a anticuerpos anti-IgG agregados junto a la muestra. Se logra así la obtención de un dispositivo capaz de cuantificar exosomas, discriminándolos adecuadamente de otros tipos de vesículas extracelulares.

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17. LA EXPOSICIÓN AGUDA DEL CORAZÓN A Clorpirifós (Preparado comercial), OCASIONA DISMINUCIÓN DE LA FUNCIÓN CARDÍACA. M. Alonso1,2, C.Costa2, T. González1, J. Dutra 1, G. Ferreira 1,3

1Laboratorio de Canales Iónicos. Departamento de Biofísica, Facultad de Medicina (UDELAR); 2Igual contribución al trabajo; 3Correspondencia

El Clorpirifós (CPF) es un insecticida organofosforado de baja hidrosolubilidad, de uso bastante común a nivel agropecuario y domiciliario. Los preparados comerciales suelen asociarse a lípidos para aumentar su penetración en organismos. De acuerdo con la clasificación de OMS (2009), que establece el grado de peligrosidad de exposición a agroquímicos para la salud humana, CPF es categoría II, siendo moderadamente tóxico con riesgos de gravedad por exposición directa en seres humanos. Su uso en Uruguay comprende aprox. un 5-10% de los agroquímicos (DGSA, 2010). CPF puede dar lugar a varios intermediarios de mayor toxicidad por oxidación o transformación metabólica, siendo el más conocido el clorpirifós-oxón. Su mecanismo de acción es actividad anticolinesterasa. El corazón presenta abundantes receptores muscarínicos para AcetilColina (ACh). La toxicidad de CPF se evaluó en corazones aislados de cobayo y rata. Al igual que Mercaptotathion(MPT), la perfusión con concentraciones mayores a 100 uM detuvo completa e irreversiblemente contractilidad y excitabilidad cardíacas, precedidas por contracciones alternantes y fibrilación ventricular. Concentraciones 10-100 uM tienen efecto inotrópico negativo con IC50 aprox. 40 + 7 uM(n=5). Estas concentraciones alargaron potenciales de acción monofásicos. Ambos efectos ocurrieron en menos de 3 minutos luego de la exposición. A diferencia de MPT, hubo potenciación contráctil transitoria y rigidez final. El lavado de CPF llevó 10-20 minutos. CPF mostró marcado efecto cronotrópico negativo (IC50 similar a contractilidad). Estos resultados sugieren efecto agonista de receptores M de ACh, inhibiendo automatismo del nodo sinusal, con alteración de canales de Ca2+/K+ y contráctiles de forma directa o indirecta.

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18. MEJORA EN LA ESTABILIDAD DE L-LACTATO DESHIDROGENASA MEDIANTE INGENIERÍA DE

INMOVILIZACIÓN.

E. Jackson1, F. López-Gallego2,3, J.M. Guisan4, L. Betancor1. 1Laboratorio de Biotecnología, Universidad ORT Uruguay, Cuareim 1441,

11100, Montevideo, Uruguay; 2 IKERBASQUE, Basque foundation for Science, 48011, Bilbao (Spain); 3CICBiomagune. Parque Tecnológico de San Sebastián,

Edificio Empresarial C, Paseo Miramón 182, 20009 Donostia-San Sebastián, Guipúzcoa (Spain); 4 Instituto de Catálisis y Petroleoquímica. CSIC, c/Marie

Curie N2, Madrid, Spain

La L-lactato deshidrogenasa (LDH) cataliza la conversión de piruvato a lactato utilizando NADH como cofactor (1). Esta enzima es de interés biotecnológico, ya que puede ser usada para producir bloques quirales para la industria alimentaria y farmacéutica y además puede ser utilizada como una biomolécula de reconocimiento en dispositivos de sensado (2). La inmovilización de esta enzima, con escasos precedentes en la literatura, facilita el uso aplicado de la LDH. En este trabajo, hemos estudiado la inmovilización de la LDH en soportes de agarosa activados con grupos aldehído (glioxil-agarosa). Aunque a priori, esta estrategia fue perjudicial para la enzima, la optimización de varios parámetros durante la inmovilización permitió la obtención de una preparación inmovilizada activa y altamente estable de LDH. Los tiempos de vida media a 55°C alcanzaron valores 1.600 veces mayores para la LDH inmovilizada en comparación con la enzima soluble. Por otro lado, la actividad de la enzima soluble en presencia de etanol decayó completamente dentro de los primeros 3 min de ensayo, mientras que, la LDH inmovilizada conservó 62,0 ± 0,2% de actividad luego de 21 h. Ensayos de estabilidad en pH demostraron un aumento de la resistencia de la LDH inmovilizada bajo condiciones tanto alcalinas como ácidas. La evaluación de los parámetros cinéticos de la enzima libre e inmovilizada no mostró cambios significativos en los valores de Km y Vmax. Creemos que estos resultados amplían las posibilidades de utilización de inmovilizados de LDH tanto para aplicaciones de biosensado como biocatalíticas. 1- K. T. Koivuranta, M. Ilmén, M. G. Wiebe, L. Ruohonen, P. Suominen and M. Penttilä, Microb. Cell Fact., 2014, 13, 107. 2- S. Thitiprasert, S. Sooksai and N. Thongchul, Appl. Biochem. Biotechnol., 2011, 164, 1305–22.

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19. GENERACIÓN DE NANOHÍBRIDOS DE SILICA BIOMIMÈTICA-GFP Y ESTUDIO DE SU CITOTOXICIDAD IN VITRO.

N. Larrieux, F. Maresca, L. Betancor, J. Louge

1Departamento de Biotecnología, Universidad ORT Uruguay

Los materiales a escala nanométrica presentan propiedades fisicoquímicas y funcionales con alto potencial de aplicabilidad en diversas industrias y áreas de investigación. Las nanopartículas de sílica biomimética han cobrado gran interés en los últimos años debido a que sus condiciones moderadas de síntesis las hacen adecuadas para la formación de híbridos con biomoléculas lábiles. Se hace necesaria la comprensión de la toxicidad y los riesgos potenciales para la salud asociados al uso de estos nanomateriales. Los ensayos de citotoxicidad in vitro permiten una primera aproximación a la toxicidad reduciendo la experimentación con animales. En este trabajo hemos abordado la síntesis de nanohíbridos de sílica biomimética-GFP (proteína verde fluorescente) y la evaluación su toxicidad in vitro. Los experimentos de atrapamiento de GFP en nanopartículas de sílica indicaron rendimientos de inmovilización del orden de 35%. Los nanohíbridos presentaron rangos de estabilidad de fluorescencia ampliados con respecto a la GFP soluble en distintos medios de cultivo y pHs. Se estudió la citotoxicidad in vitro de los nanohíbridos en las líneas celulares NIH-3T3 y HaCat, en un rango de concentraciones de nanopartículas comprendido entre 5ug/mL y 1mg/mL. Se ensayaron tiempos de exposición de 2 y 20 hs. Se evaluó la viabilidad celular por el método de Cristal Violeta y la actividad metabólica celular empleando Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT). En todos los ensayos llevados a cabo en las condiciones menciondas los nanohíbridos no presentaron toxicidad.

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20. INMOVILIZACIÒN Y ESTABILIZACION DE TRIPANOTIÓN SINTETASA.

C.Maciel1,2, M. Comini1, L Betancor2.

1Laboratorio de Biología Redox de Trypanososmas, Institut Pasteur

2Departamento de Biotecnología, Facultad de Ingeniería, Universidad ORT Uruguay

El tripanotión es un compuesto de importancia biológica que se genera como producto de la acción de una enzima esencial para los tripanosomátidos: la tripanotión sintetasa (TRS). Es por tanto de significancia clínica ya que el análisis de su metabolismo permite evaluar nuevas dianas para drogas antiparasitarias. Es además un producto de alto valor agregado (USD 200/mg), y por tanto interesante desde el punto de vista biotecnológico. En este trabajo nos propusimos diseñar una estrategia de inmovilización/estabilización de la enzima TRS como primer paso para lograr sintetizar cantidades preparativas de tripanotión. Nuestra estrategia incluyó el uso de diferentes metodologías de inmovilización de TRS, su caracterización en términos de actividad retenida y la evaluación de las propiedades de estabilidad de los inmovilizados. La TRS fue inmovilizada sobre soportes de agarosa y soportes silíceos mediante atrapamiento físico, adsorción iónica, entrecruzamiento químico y unión covalente. Los porcentajes de inmovilización resultaron ser mayores de 90% en todos los casos. Sin embargo, la actividad que conservó la enzima luego de unida al soporte varió entre 100% y 17,8% para las diferentes estrategias de unión. La recuperación de actividad en soportes activados con grupos aldehídos mejoró cuando la inmovilización se realizó en presencia de trehalosa y se optimizaron condiciones de incubación con los soportes tales como tiempo, temperatura y concentración de reactivos para la interacción covalente. Los ensayos de estabilidad demostraron que la unión covalente permitió mejorarla significativamente aumentando el tiempo de vida media de la enzima inmovilizada 250 veces con respecto a la enzima soluble.

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21. SOPORTES NANOESTRUCTURADOS PARA LA PURIFICACION DE TOXINA EPSILON DE Clostridium perfringens TIPO D.

J. Rodriguez, F. Pirotti, L Betancor.

Departamento de Biotecnología, Facultad de Ingeniería, Universidad ORT Uruguay

La toxina épsilon de Clostridium perfingens tipo D es uno de los principales antígenos implicados en la enterotoxemia de animales domésticos, una de las infecciones que más afectan al ganado provocando importantes pérdidas económicas a nivel mundial.La purificación de las toxinas clostridiales es de especial importancia para el desarrollo de tecnologías de biosensado así como la mejora de formulación en vacunas veterinarias. Las partículas submicrométricas resultan interesantes en cromatografía ya que ofrecen grandes áreas superficiales para la interacción con biomoléculas, maximizan la capacidad de carga del soporte y aumentan la eficiencia de los procesos de purificación. En este trabajo hemos explorado el uso de soportes nanoestructurados para la purificación de toxina épsilon de C. perfringens. Los nanosoportes estudiados en base a sílica y magnetita se utilizaron como intercambiadores aniónicos y se compararon con soportes catiónicos micrométricos estándar basados en agarosa (DEAE). Aún con un peso molecular de 31.2 KDa, no se logró adsorber proteína sobre DEAE agarosa a pHs por encima de su punto isoeléctrico, lo que sugirió la presencia de agregados proteicos que se confirmaron por electroforesis nativa. La formación de agregados de toxina épsilon en solución resulta habitual pero dificulta la purificación mediante soportes porosos. Los nanosoportes no porosos testeados sin embargo resultaron exitosos en la preparación de toxina pura, siendo las nanopartículas magnéticas las que proporcionaron mejores rendimientos luego de eluciones con 1M de NaCl. La muestra pura fue identificada por western blot con anticuerpos monoclonales y por análisis de mapeo peptídico mediante LC-MS y MS/MS.

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22. IDENTIFICACIÓN DE BIOMARCADORES PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN ACTIVA POR Mycobacterium tuberculosis

P. Tucci1, G. González-Sapienza2, C. Rivas3, M. Marin1

1Sección Bioquímica-Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR); 2Cátedra de Inmunología, DEPBIO, Instituto de Higiene, Facultad de Química (UDELAR); 3Comisión Honoraria de Lucha Antituberculosa y Enfermedades

Prevalentes.

La tuberculosis es una enfermedad producida por bacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis, que representa a nivel mundial la segunda causa de muerte por una enfermedad infecciosa. El diagnóstico de la tuberculosis activa es uno de los puntos críticos para el control de esta enfermedad. Los métodos de diagnóstico convencionales (microscopía y cultivo microbiológico) requieren personal calificado y una infraestructura de laboratorio altamente especializada. Si bien se han desarrollado métodos moleculares rápidos, estos no son aún lo suficientemente simples ni económicos. El presente trabajo busca detectar e identificar marcadores moleculares presentes en muestras de pacientes con infección activa por M. tuberculosis. La hipótesis de este trabajo es que durante la infección activa estarían presentes antígenos derivados del patógeno en muestras clínicas, los que podrían ser detectados por medio de anticuerpos policlonales específicos. Con este objetivo se prepararon y caracterizaron extractos proteicos concentrados a partir del sobrenadante de cultivo de la cepa H37Rv. Estas proteínas se utilizaron para obtener antisueros hiperinmunes en conejos, los que posteriormente se purificaron con resinas de proteína A. Las inmunoglobulinas purificadas están siendo utilizadas para rastrear, por medio de electroforesis bidimensional, espectrometría de masas y western blot, la presencia de antígenos derivados del patógeno en muestras de orina de pacientes con tuberculosis activa. Se espera que los resultados obtenidos sirvan de base para diseñar herramientas de detección de antígeno, que contribuyan a la generación de un sistema de diagnóstico rápido, sensible, específico y económico que complemente las estrategias de diagnóstico de la tuberculosis activa. Financiación: ANII (FMV_3_2013_1_100859)

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23. DESARROLLO Y CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-NITRONGF

Varela, V.1, Richter, M.1, De León, A.1, Alzari, P.2, Cassina, P.3, Barbeito, L.1

1Laboratorio de Neurodegeneración (IPMON);Structural Microbiology (Institut Pasteur París) 2; 3Laboratorio de Histología, Facultad de Medicina (UdelaR)

El NGF (Nerve Growth Factor), proteína perteneciente a la familia de las neurotrofinas, es esencial para la diferenciación y supervivencia de poblaciones específicas de neuronas durante el desarrollo, y modula la plasticidad del sistema nervioso maduro. En condiciones inflamatorias, hay una sobreexpresión de NGF, actuando como mediador nociceptivo en el sistema sensorial. Nuestro laboratorio demostró la existencia de especies nitradas de NGF (nitroNGF) bajo condiciones oxidantes y nitrantes de la inflamación, adquiriendo una “ganancia de función” con respecto a la neurotrofina no nitrada. Recientemente hemos desarrollado anticuerpos monoclonales (mAbs) que reconocen un epítope específico del nitroNGF, empleando como antígeno un péptido de NGF de 11 aminoácidos que contiene la Tirosina de interés nitrada [VFKQ{Tyr52-NO2}FFETKC]. Mediante Western Blot y ELISA se caracterizó la especificidad de los mAbs por el nitroNGF frente al NGF no nitrado, y mediante co-cristalización de los mAbs con el péptido se modelizó la interacción entre ambos. Estos resultados fueron coherentes con el alanine scan desarrollado para determinar los aminoácidos relevantes en dicha interacción. En cultivos primarios de motoneuronas de rata, los mAbs mostraron una actividad neutralizante de la muerte celular provocada por nitroNGF. Además, se demostró que no interfieren con la actividad trófica del NGF no nitrado en bioensayos con células PC12. En su conjunto, estos resultados demuestran un gran potencial terapéutico de los mAbs anti-nitroNGF.

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83. DEMANOSIDACIÓN DE GLICOPROTEÍNAS: UNA ESTRATEGIA PARA EVALUAR EL POTENCIAL INMUNOMODULADOR DE RESIDUOS DE

MANOSA EN FASCIOLA HEPATICA

K. Francia1, E. Rodriguez2, T. Freire2, C. Giacomini1 1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biociencias, Facultad de

Química (UdelaR);2 Departamento de Inmunobiología, Facultad de Medicina(UdelaR)

La fasciolosis, una parasitosis causada por helmintos del género Fasciola afecta principalmente al ganado, pero también a los seres humanos. Actualmente se considera un problema infeccioso emergente dada su amplia distribución a nivel mundial. Se ha reportado que algunos motivos glucídicos presentes en las glicoproteínas de parásitos helmintos serían los responsables de la modulación de la respuesta inmune del hospedero. En el caso de Fasciola hepatica, nuestro grupo de investigación ha generado evidencias que señalan que los motivos glucídicos conteniendo manosa estarían involucrados en la regulación de la maduración de células dendríticas. Por lo cual, sería interesante estudiar si glicoconjugados parasitarios desprovistos de residuos de manosa pierden su capacidad inmunomoduladora sobre células dendríticas.

Se utilizó -manosidasa inmovilizada (50 mg; 55UE/mg) para demanosidar lactoferrina (glicoproteína con alto contenido de manosa) y glicoproteínas de un extracto parasitario de Fasciola hepática con un contenido proteico de 14 mg y 0,6 mg respectivamente. Se estudiaron distintos pHs (4.5 y 6.5) y tiempos (7.5 y 24 hs) de reacción. Se confirmó liberación de manosa mediante TLC y HPLC y se observó pérdida de reconocimiento por ConA (lectina que reconoce manosa en forma específica) de un 50% y 36% para la lactoferrina y el extracto parasitario respectivamente. Fue posible reutilizar el derivado enzimático un mínimo de seis veces sin pérdida de su actividad enzimática. Estos resultados confirman la efectividad de esta herramienta enzimática que permite la obtención de glicoproteínas demanosidadas, sin alterar su estructura proteica, lo que permitiría estudiar la pérdida de su capacidad inmunomoduladora frente a células dendríticas.

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VIROLOGÍA (24-27, 80)

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24. DETECCIÓN DE VARIANTES RECOMBINANTES GII.P7/GII.6 CIRCULANDO ENTRE POBLACIONES DE NOROVIRUS EN

URUGUAY

Á. Fajardo1, F. López-Tort2, M. Victoria2, T.M. Fumian3, M.P. Miagostovich3, J.P.G. Leite3, J. Cristina1 y R. Colina2.

1Laboratorio de Virología Molecular, CIN, Facultad de Ciencias (UdelaR); 2Laboratorio de Virología Molecular. Regional Norte (UdelaR); 3Laboratorio de

Virologia Comparada e Ambiental, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. Introducción: Los norovirus (NoV) son unos de los principales agentes etiológicos responsables de brotes de gastroenteritis aguda (GA) en todo el mundo. Distintos genotipos de NoV han sido asociados con diferentes patrones de transmisión y gravedad de la enfermedad en los seres humanos. Es por ello que resulta importante identificar genéticamente los diferentes genotipos de NoV que circulan en una región particular. Sin embargo, la genotipificación se ha convertido en un importante desafío debido a la alta frecuencia de eventos de recombinación que ocurren principalmente en la región de solapamiento de los marcos abiertos de lectura ORF1/ORF2. Objetivo: Investigar la presencia de presuntos eventos de recombinación en poblaciones de NoV circulantes en pacientes uruguayos con GA. Metodología: Se obtuvieron secuencias conteniendo la región de solapamiento ORF1/ORF2 de diferentes cepas de NoV provenientes de pacientes uruguayos con GA. Se realizaron diferentes abordajes in silico con el objetivo de investigar la posible presencia de variantes recombinantes. Resultados: Este estudio evidencia la presencia de eventos de recombinación en cuatro de las seis cepas analizadas para las que el gen de la polimerasa corresponde al genotipo GII.P7 mientras que la región codificante de la cápside pertenece al genotipo GII.6. Se trata del primer reporte de variantes recombinantes GII.P7/GII.6 en las Américas. Asimismo, su frecuencia relativa indica que estas variantes circulan naturalmente entre poblaciones de NoV en esta región del noroeste de Uruguay.

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25. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR DE HERPESVIRUS BOVINO EN ANIMALES INFECTADOS NATURALMENTE

Puentes, R.*1; Campos, F.S.*2; Furtado, A.1; Torres, F.2; Franco, A.C. 2;

Maisonnave, J.1; Roehe, P.M.2. 1 Departamento de Ciencias Microbiológicas, Facultad de Veterinaria

Universidad de la Republica Oriental del Uruguay (UdelaR). 2 Laboratório de Virologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil. *autor para

correspondencia: rpuentes@adinet.com.uy Herpesvirus bovino 1 (BoHV-1) y 5 (BoHV-5) son agentes capaces de establecer infecciones latentes en los ganglios neuronales de bovinos. Para evaluar la infección viral en un rodeo, se utilizan pruebas serológicas como la seroneutralización (SN) in vitro o ELISA (Ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas). Con el objetivo de evaluar el nivel de correlación existente entre la detección de anticuerpos y el real status de infección de los animals, se procedió al procesamiento de 248 muestras de suero y ADN genómico de ganglio trigemino (GT) de bovinos enviados a faena. Se detectaron anticuerpos neutralizantes contra BoHV-1 y BoHV-5 y anticuerpos anti gB por ELISA comercial. Por otro lado se realizó una nested-PCR para la detección de BoHV-1 y BoHV-5 en muestras de GT y se correlacionaron estos resultados. Se detectaron 85.9% (213/248) de los animales infectados con BoHV mediante presencia de ADN viral en GT, mientras la SN in vitro detectó 44.8% (111/248) y el ELISA 51.2% (127/248). La sensibilidad y especificidad encontrada fue de 48.83% (IC 95%: 41.94% a 55.75%) y 80.00 % (IC 95%: 63.06% a 91.56%) para la SN in vitro y 57.28% (IC 95%: 50.34% a 64.01%) y 85.71 % (IC 95%: 69.74% a 95.19%) para el ELISA respectivamente. La concordancia (valor kappa) entre Nested-PCR y VN in vitro fue de 0.13 mientras que con Nested-PCR y ELISA fue 0.21. Estos resultados dejan de manifiesto las limitaciones que tienen las técncias de diagnóstico a campo disponibles para BoHV y deberían tenerse en cuenta a la hora de diseñar programas de control o erradicación de la enfermedad.

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26. DIAGNÓSTICO DE LEUCOSIS BOVINA ENZOÓTICA (BLV) EN SANGRE PERIFÉRICA DE ANIMALES ASINTOMÁTICOS MEDIANTE

DROPLET DIGITAL PCR (DDPCR).

Puentes, R.1,*; Flatschart, A.2; Panei, J.3,4; Galosi, C.3,5; Nicolini, P.1; LLambí, S.1; Flatschart, R2.

1Facultad de Veterinaria – Universidad de la Republica - Uruguay; 2Instituto Nacional de Metrologia, Calidad y Tecnología (Inmetro) - Brasil; 3Facultad de

Ciencias Veterinaria – Universidad Nacional de La Plata –Argentina. 4CONICET; 5Comisión de Investigaciones Científicas de la Pcia de BsAs. *autor

para correspondencia: rpuentes@adinet.com.uy

La ddPCR es una herramienta novedosa desarrollada para la cuantificación precisa y altamente sensible de ácidos nucleicos, lográndose mediciones de pequeñas diferencias porcentuales y cuantificaciones de variantes raras, con ventajas importantes comparadas con la Real time PCR. En base a esto, se analizaron 63 muestras de ADN bovinos por la técnica ddPCR y nested PCR (nPCR, técnica de referencia para la OIE) con el fin de evaluar la capacidad de la ddPCR para detectar BLV en su forma de provirus. La sensibilidad encontrada fue de 92.86% (IC95%: 80.52% - 98.50%) y la especificidad de 19.05% (IC95%: 5.45% - 41.91%). La concordancia entre ambas técnicas se evaluó por el índice Kappa obteniéndose un valor de 0.14. El valor predictivo (VP) positivo encontrado fue de 69% y el VP negativo fue de 57%. Se pudo observar un alto número de muestras negativas por nPCR que fueron positivas por ddPCR (17/21). Analizando los resultados de la cuantificación por ddPCR, se observó que la mediana de las muestras que fueron positivas por ddPCR y negativas por nPCR fue 36,6 copias/ul, mientras que la de las muestras positivas por ambas técnicas fue de 534 copias/ul, lo que demuestra que las muestras negativas por nPCR tenían un número considerablemente menor de copias de provirus cuando utilizamos la ddPCR y posiblemente por esa razón no fueron detectadas por la técnica de referencia (nPCR). Otra explicación podría ser que existan un gran número de falsos positivos en ddPCR, a pesar de utilizar cebadores y sondas marcadas altamente específicas para BLV. Más investigaciones son necesarias para clarificar los resultados obtenidos y poder determinar la utilidad y capacidad diagnóstica de esta nueva técnica, comparando además con la Real time PCR.

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27. RESPUESTA A LA VACUNACIÓN CONTRA EL VIRUS DE LA RABIA EN PERROS INMUNIZADOS EN CONDICIONES

INMUNOSUPRESORAS

Calero, D 1; Caresani, B1; Eliopulos, N 2; Suárez, G 2; Silva, ACR3; Batista, HBCR3; Puentes, R1, *

1Área de Inmunología – Facultad de Veterinaria – Universidad de la Republica (UdelaR), 2Área de Farmacología – Facultad de Veterinaria - UdelaR –

Lasplaces 1550 – Montevideo Uruguay. 3 Instituto Pasteur de Sao Paulo – Brasil. * Autor para correspondencia: rpuentes@adinet.com.uy

Según la Organización Mundial de Salud (OMS) la forma más eficaz para reducir los casos de rabia anuales en humanos es a través de vacunaciones en perros y gatos, dado que el 90 % de los mismos son debido a mordeduras de perros infectados con el virus. En países de la región, donde se ha evaluado el nivel de protección de perros vacunados contra el virus de la rabia, se han encontrado variaciones importantes. Los objetivos de este trabajo fue evaluar la respuesta inmune humoral contra la rabia en perros con algún tipo de estrés (biológico, quirúrgico o farmacológico). Para esto se evaluó el título de anticuerpos anti-rábicos por la técnica Rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) en perros inmunizados a campo con vacunas polivalentes (Grupo 1) y monovalentes (Grupo 2), que fueron inmunizados al momento de la castración quirúrgica (Grupo 3) o que estaban en tratamiento con corticoides durante la inmunización (Grupo 4). En términos generales los resultados obtenidos indican que en todos los casos, la mayoría de los animales pudieron superar el límite mínimo de anticuerpos para estar protegido según la OMS (0.5UI/ml). Sin embargo, se encontraron diferencias significativas (p<0.05) en el empleo de vacunas monovalentes vs polivalentes, en el uso de corticoides al momento de la inmunización y en la vacunación durante la castración quirúrgica. Esta investigación deja de manifiesto que es viable la vacunación en caninos contra la rabia en determinadas situaciones estresantes para los animales (ej. en campaña de castraciones masivas), aunque la respuesta inmune sea significativamente menor.

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80. VARIABILIDAD GENÉTICA DE LAS REGIONES NS3 Y NS5B DEL GENOMA DE HEPATITIS C EN PACIENTES URUGUAYOS

N. Echeverría*1, G. Betancour*1, S. Boschi2, J. Cristina1, P Moreno1.

1Laboratorio de Virología Molecular, Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República Oriental del Uruguay;

2Laboratorio de Biología Molecular, Asociación Española Primera de Socorros mutuos, Montevideo, Uruguay.

*ambos autores contribuyeron de igual forma a este trabajo. La infección por el virus de la hepatitis C (VHC) es una de las principales causas de trasplante hepático dada su capacidad de derivar en cronicidad e incluso en hepatocarcinoma. La terapia estándar (interferón-α-pegilado/ribavirina), de acción indirecta, no es 100% efectiva. Recientemente se han desarrollado antivirales de acción directa (DAAs) que actúan a nivel de proteínas virales específicas (proteasa – NS3; polimerasa – NS5B) y se administran como triterapia junto con la terapia estándar. Concomitantemente con el desarrollo de estos fármacos, se han generado mutaciones de resistencia a éstos. El objetivo del presente estudio fue la genotipificación de VHC y la identificación de variantes nuevas y ya asociadas a resistencia a DAAs en las regiones codificantes para NS3 y NS5B en 16 pacientes uruguayos infectados con VHC, naïve a la triterapia. Los resultados muestran que 13 pacientes están infectados con VHC genotipo 1 (9 subtipo 1a y 3 subtipo 1b) y 4 con el genotipo 3 (subtipo 3a). En dos pacientes VHC 1a, la secuencia de NS3 evidenció la presencia de las sustituciones Q80K y Q80L (asociadas a resistencia al DAA simeprevir), y variantes no reportadas previamente. Ninguna sustitución asociada con resistencia a inhibidores de la polimerasa fue detectada en los aislamientos estudiados (si bien hay regiones no abarcadas en nuestro trabajo). La identificación de variantes de NS3 y NS5B resistentes a los DAAs (previo a la triterapia) podría ser útil para identificar a aquellos individuos con menor probabilidad de responder favorablemente a dicha terapia pudiendo ser seleccionados para tratamientos antivirales alternativos.

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BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN AGRONOMÍA (28-38)

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28. DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS EN TRANSGÉNICOS DE PAPA-EFR (Solanum tuberosum L.) POR PCR EN TIEMPO REAL

F. Boschi1, M. Menoni1, S. Murchio2. M. Dalla Rizza2 1Área Evaluación y Registro de Cultivares, Instituto Nacional de Semillas (INASE); 2Unidad de Biotecnología, Instituto Nacional de Investigación

Agropecuaria (INIA) Las plantas reconocen patógenos potenciales a través de dos modos de percepción: Inmunidad Inducida por Efectores (ETI) o la Inmunidad inducida por PAMP (PTI). Esta última reconoce patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) o daño (DAMP), a través de receptores de reconocimiento (PRRs). El receptor EFR, es un PRR de Arabidopsis thaliana, que proporciona una amplia respuesta de defensa frente a bacterias fitopatógenas, desencadenando la resistencia basal al reconocer el PAMP bacteriano EF-Tu (factor de elongación Tu). El desarrollo de los eventos transgénicos puede ser limitado por muchos factores. Éstos incluyen los niveles de expresión, estabilidad de la inserción y herencia, y la identificación de eventos de copia única. Todos los factores pueden estar relacionados con el número de copias del transgén. Se determinó el número de copias del inserto efr en 10 líneas transgénicas de papas del cultivar INIA Iporá. Se realizó una cuantificación relativa, mediante PCR en tiempo real, utilizando sondas fluorescentes de hibridación. Como gen endógeno se utilizó el UDP-glucosa pirofosforilasa (UGPasa), de copia única en el genoma de papa. Esta metodología es muy rápida y requiere poco material vegetal en comparación con la técnica tradicional de Southern blot. Los resultados obtenidos fueron: 7 eventos presentaron copia única, uno presentó 2 copias y dos presentaron 4 copias del inserto efr. El cultivar sin transformar no mostró copias del transgén. Las líneas con 4 copias del gen efr no se recomendarían utilizar en un programa de mejoramiento porque presentaría segregación en la progenie y potencialmente una respuesta diferencial.

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29. CARACTERIZACIÓN DE β-CIANOALANINA SINTASA DE Echinochloa crus-galli Y SU ROL EN LA RESISTENCIA AL

HERBICIDA QUINCLORAC.

M.Diez1, F.Franco1, M.Sainz1, O.Borsani1, N.Saldain2, P.Diaz1 1Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía (UDELAR), 2

Proyecto Arroz, INIA Treinta y Tres

Uno de los factores que afectan la productividad, sostenibilidad y calidad de la producción arrocera es la aparición de malezas asociadas al cultivo. El capín (Echinochloa crus-galli) es la maleza que tiene mayor presencia en arrozales del Uruguay. Uno de los herbicidas más utilizados para controlar el capín es la auxina sintética quinclorac. Recientemente en el este del país se detectaron biotipos de capín resistentes, lo que ha sido confirmado a través de ensayos in vitro de dosis – respuesta. La acción de quinclorac se caracteriza por la activación de vías metabólicas, seguido de la reducción en el crecimiento de raíces y tallo, con incrementos en la síntesis de etileno y cianuro. Mientras que el etileno juega un rol importante en una gran variedad de procesos durante el desarrollo de las plantas, el cianuro es un agente citotóxico, inhibidor de enzimas que forman parte de importantes vías metabólicas, como la cadena respiratoria, asimilación de nitrógeno y carbono. En plantas, la enzima clave para la desintoxicación de cianuro es la β-cianoalanina sintasa (β-Cas), que cataliza la reacción del aminoácido cisteína con cianuro para dar β-cianoalanina. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la enzima β-Cas de capín y evaluar si existen diferencias en la actividad e inducibilidad en biotipos resistentes a quinclorac con respecto a biotipos sensibles.

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30. PRESENCIA DE TRANSGENES EN CULTIVOS DE MAIZ NO TRANSGÉNICO DERIVADA DE LA INTERPOLINIZACIÓN ENTRE

CULTIVOS

P. Galeano1, M. Arleo2, B. Rocha3, C. Martínez2, G. A. Galván3, L. Franco Fraguas1

1Cátedra de Bioquímica, DEPBIO, Facultad de Química, Universidad de la República (UdelaR); 2Sección Bioquímica, Instituto de Biología,, Facultad de Ciencias, UdelaR; 3Departamento de Producción Vegetal, CRS, Facultad de

Agronomía, UdelaR. En Uruguay se cultiva maíz transgénico (GM) desde 2003. La ocurrencia de interpolinización entre cultivos GM y no-GM es relevante para la coexistencia de distintas modalidades productivas. La conservación in situ de recursos genéticos locales, la producción orgánica y convencional no-GM y la producción de semilla de maíz de calidad se ven afectados por este fenómeno. En 2011 fue derogada la exigencia de una distancia mínima de 250 m de aislamiento entre cultivos de maíz GM y no-GM. Este estudio evaluó la presencia de transgenes en la progenie de cultivos de maíz no-GM, derivada de la interpolinización entre cultivos comerciales en dos zafras consecutivas. Se identificaron diez situaciones potenciales en distintos departamentos, considerando la distancia entre los cultivos y las fechas de siembra. Se confirmó la identidad GM y no-GM de los cultivos involucrados en cada caso. A la cosecha se muestrearon espigas de los cultivos no-GM en sitios definidos dentro de cada chacra. En la progenie no-GM se analizó presencia de la proteína Cry1Ab mediante DAS-ELISA y se confirmó la presencia del transgen por PCR. Los resultados mostraron flujo de transgenes en cinco de los diez casos identificados con potencial riesgo. En estos cinco casos, las distancias entre los cultivos de maíz GM y no-GM fueron desde 24 a 1600 m. Las frecuencias de individuos que portaban transgenes en la progenie no-GM fueron desde 0.33% a más del 1%. Esta información contribuirá al diseño de estrategias de conservación de los recursos genéticos locales de maíz. Financiación: Proyecto CSIC-SP 601

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31. UTILIZACIÓN DE GENES REPORTEROS PARA EVALUAR LA COMPETITIVIDAD DE CEPAS RIZOBIANAS A SER USADAS COMO

INOCULANTES

P. Gutiérrez1, O. Sabattini1, G. Cardozo3, R. Reyno4, M. Rebuffo2, P. Irisarri1 y J. Monza1

1Laboratorio de Bioquímica, Facultad de Agronomía (UDELAR); 2INIA La Estanzuela; 3INIA Treinta y Tres; 4INIA Tacuarembó.

Trifolium repens (trébol blanco) es utilizado para el mejoramiento de praderas, cuyo desplazamiento a suelos marginales hace necesario evaluar al inoculante comercial en este nuevo escenario y contar con cepas más competitivas. Para evaluar la competencia utilizamos al gen reportero gusA, con el que se transformó a la cepa usada como inoculante comercial y a tres cepas nativas promisorias por su eficiencia simbiótica. Los transformantes fueron utilizados para inocular semillas que se sembraron en cilindros con los suelos problema, con y sin historia de inoculación. En los distintos suelos las cepas promisorias ocuparon entre el 50 y 60% de los nódulos y el inoculante comercial el 6%. La ocupación de nódulos en suelos con historia de inoculación fue del 25% y en suelos sin historia de inoculación el 56%, diferentes estadísticamente. La ocupación de nódulos por los rizobios también dependió del tipo de suelo y varió entre el 25% y 70%. El uso de cepas marcadas permitió concluir que: i) en suelos donde hay más rizobios específicos los inoculantes ocupan menos nódulos, ii) que el inoculante comercial es menos competitivo que las cepas nativas, iii) que las cepas nativas son un recurso para desarrollar inoculantes rizobianos más competitivos y que iiii) el uso del gen gusA es una estrategia rápida y precisa para evaluar cepas según su competencia, en condiciones controladas.

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32. RESPUESTAS FOTOSINTÉTICAS CONTRIBUYEN A EXPLICAR LA DIFERENTE TOLERANCIA AL FRÍO EN DOS GENOTIPOS DE Lotus

japonicus

I. Núñez1, P. Calzadilla2, S. Signorelli1, O. Borsani1, O. Ruíz2, J. Monza1 1Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía (UDELAR); 2 UB1,

IIB-INTECH (UNSAM-CONICET, Argentina) Las bajas temperaturas pueden generar un estrés que impacta negativamente en la productividad de los cultivos. Las leguminosas del género Lotus son ampliamente utilizadas como forraje y se han descripto genotipos de Lotus japonicus tolerantes (MG20) y sensibles (MG1) al frío. En este trabajo se caracterizaron ambos genotipos con el fin de contribuir a la comprensión de los mecanismos bioquímicos implicados en la tolerancia al frío. Para ello, plantas MG1 y MG20 de 30 días se expusieron a 7°C durante 1, 4 y 7 días. Los resultados evidenciaron que la eficiencia máxima fotosintética (FV/FM) disminuyó hasta el día 4 para posteriormente aumentar significativamente, lo que sugiere un proceso de adaptación de las plantas al frío. Como indicador de la actividad fotosintética se determinó la relación NADPH/NADP y se observó que esta tuvo un descenso en los días 1 y 4 en ambos genotipos, siendo mayor la caída en el genotipo sensible al frío. Para explicar el descenso de la actividad fotosintética se analizó el estado de las proteínas D1 y D2 y se observó que la cantidad de proteína D1 permanece constante durante el estrés, con un ligero incremento al día 7 en el genotipo tolerante. La proteína D2 descendió en el día 1 y posteriormente se recuperó y superó al control en el día 7. Esta recuperación fue mayor en el genotipo tolerante al igual que la relación NADPH/NADP y la FV/FM, lo que sugiere que esta proteína juega un papel en la regulación de la actividad fotosintética.

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33. PROGRESOS EN LA CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LA ESPECIE Acca sellowiana (Berg.) Burret

M. Quezada1,4 , C. Pritsch1, M. Alvarez1, G. Machado2, N. Nikichuk3, L.

Luna3, B.Vignale2, D.Cabrera4, A. A.F. Garcia5

1Departamento Biología Vegetal, Facultad de Agronomía (UDELAR); 2Departamento de Producción Vegetal, Facultad de Agronomía (UDELAR);

3Laboratorio de Marcadores Moleculares, Estación Tacuarembó (INIA);

4Programa Fruticultura, Estación Las Brujas (INIA); 5Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (USP)

Acca sellowiana (2n=2x=22) es un frutal nativo de Brasil y Uruguay, para la cual los estudios genéticos están poco desarrollados. Pertenece a la familia Myrtaceae (subfamilia Myrtoideae) junto con las especies del género Eucalyptus (subfamilia Leptospermoideae). Con el objetivo de desarrollar en esta especie, herramientas de análisis genético de las variables de interés productivo, nuestro equipo construyó el primer mapa genético de A. sellowiana, conteniendo 219 marcadores (ISSR, AFLP y SSR) en 10 grupos de ligamiento mayores, con un largo total de mapa de 2875 cM, utilizando una población F1 (H5) de 160 individuos. Actualmente, trabajamos en el desarrollo de un mapa genético saturado utilizando la metodología GBS (genotyping by sequencing) la cual identifica polimorfismos y genotipifica individuos simultáneamente, aún en casos de especies con escaso conocimiento genómico. En este trabajo describimos el desarrollo de marcadores SNPs, utilizando dos poblaciones de mapeo F1 H5 (160 individuos) y H6 (186 individuos) y los padres respectivos. Empleando la enzima PstI y con 192-plex fueron obtenidas 456.962.262 lecturas. Sin considerar genoma de referencia (pipeline Uneak, Tassel3), se obtuvieron 539 y 494 marcadores SNPs (cobertura promedio 10, datos perdidos 10%) para las poblaciones H5 y H6, respectivamente. Utilizando como referencia el genoma de Eucalyptus (pipeline Discovery, Tassel4), se obtuvo un 32,5% de alineamiento, con 1.377 y 1.324 buenos SNPs para H5 y H6, respectivamente. Estos resultados permitirán la construcción de un nuevo mapa genético consenso de alta densidad para la especie así como estudiar las asociaciones con caracteres agronómicos de interés.

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34. RESPUESTAS A ESTRÉS HÍDRICO EN DOS VARIEDADES DE OLIVO (Olea europaea): Arbequina y Coratina

A. Pua1, I. Núñez1, C. Imparatta1, P. Conde2, M. Arias3, H. Rubbo4,

S. Signorelli1 1Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía (UDELAR); 2

Programa Nacional de Investigación Frutícola, INIA; 3Departamento de Producción Vegetal, Facultad de Agronomía (UDELAR); 4Departamento de

Bioquímica, Facultad de Medicina (UDELAR) El déficit hídrico puede producir daño nitro-oxidativo en algunas plantas. En este trabajo evaluamos si el estrés hídrico, produce estrés nitro-oxidativo en plantas de oliva. Para ello se analizaron indicadores de estrés nitro-oxidativo a nivel de hojas de Olea europaea en diferentes condiciones de estrés hídrico. En particular se trabajó con las variedades Coratina y Arbequina, utilizadas para producir aceite en nuestro país. Las hojas se sometieron a potenciales hídricos de 0 MPa, -1.5 MPa, -3.5 MPa, -5.0 MPa y -7.0 MPa con PEG 8000 durante 0, 24 y 48 horas. Como indicador de estrés hídrico se utilizó la acumulación de prolina y como indicador de estrés oxidativo los TBARS. En Arbequina se observó acumulación de prolina a medida que el potencial hídrico desciende y en Coratina sólo a -7.0 MPa. Además en esta variedad la concentración de prolina fue superior a 0 MPa que a -1.5 MPa lo que sugiere que se encuentra mejor adaptada a potenciales hídricos relativamente bajos y sería más sensible al exceso de agua. El menor daño oxidativo en las dos variedades fue a -1.5 MPa. Si bien este potencial hídrico es muy bajo para la mayoría de plantas y aseguraría daño oxidativo, el olivo es una planta adaptada a climas secos donde el potencial hídrico de suelo es aproximadamente -3.5 MPa, lo que explicaría este resultado.

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35. A SOBREEXPRESIÓN DE UN POSIBLE FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN CON DOMINIO AP2 AUMENTA LA RESISTENCIA

A PATÓGENOS EN LA PLANTA Physcomitrella patens

G. Reboledo1, I. Ponce de León1 1Departamento de Biología Molecular, IIBCE

El musgo Physcomitrella patens (P. patens) ha surgido como una fuente de genes para aumentar la tolerancia a diferentes tipos de estrés mediante la transferencia de sus genes a diversos cultivos de interés agrícola. Por medio de la generación de una biblioteca de expresión diferencial obtenida con la técnica “Supression Subtractive Hybridization” (SSH), se identificaron 400 ADNc de P. patens inducidos por el filtrado de cultivo (CF) de la bacteria fitopatógena Pectobacterium carotovorum. Uno de los genes identificados (nombrado PpAP2) codifica para una proteína de unión al ADN, con un dominio AP2/EREBP. La expresión de PpAP2 aumenta en respuesta a elicitores de dos cepas de Pectobacterium y al tratamiento con esporas del hongo Botrytis cinerea. En el presente trabajo se sobreexpresó el gen PpAP2 en P. patens con el fin de estudiar la posible función de este gen en el desarrollo y en la respuesta a patógenos. No se evidenciaron diferencias en el desarrollo. Sin embargo, dos transformantes que expresan altos niveles de PpAP2 presentaron una disminución significativa en el daño celular generado por CF y esporas de B. cinerea en comparación a plantas salvajes. En las plantas sobreexpresantes de PpAP2 se detectó una menor deposición de compuestos fenólicos en los sitios de infección y un menor crecimiento del micelio en comparación con plantas salvajes. Se discute el efecto de la sobreexpresión de PpAP2 en el aumento de la resistencia a patógenos en las plantas de P. patens así como perspectivas futuras para esta línea de investigación.

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36. METABOLISMO DE ESTEROLES EN RESPUESTAS A HIPERSENSIBILIDAD A SEQUÍA EN PLANTAS

F. Sena1, M. Sotelo1, L. Malacrida2, M.A. Botella3, O. Borsani1

1Laboratorio de Bioquímica, Facultad de Agronomía (UdelaR); 2 Laboratorio de Fisiopatología, Hospital de Clínicas (UdelaR); 3 Departamento de Bioquímica y

Biología Molecular, Universidad de Málaga, España

La sequía es un tipo de estrés abiótico que influye negativamente en el crecimiento, desarrollo y productividad de las plantas. En la búsqueda de componentes asociados a la sensibilidad / tolerancia a la sequía nos centramos en la participación de moléculas lipídicas, principalmente los esteroles, en las repuestas al déficit hídrico. Este trabajo se centró en el análisis de las respuestas a estrés en un mutante de Arabidopsis thaliana hipersensible a la sequía, dry2/sqe1, el cual presenta mutado el gen de la escualeno epoxidasa 1, generando una alteración en el perfil de esteroles en raíz. Para conocer como los esteroles pueden estar mediando la hipersensibilidad al estrés, se analizó el estado de fluidez de las membranas celulares. Encontramos que las membranas plasmáticas se encuentran altamente fluidas, consecuencia del déficit de esteroles, y esto causa que proteínas embebidas en dichas membranas como la NADPH oxidasa o fosfolipasas están deslocalizadas, lo que alteraría su funcionalidad. Esto sería parte de la incapacidad de señalizar y responder al estrés. Además de las membranas plasmáticas, el sistema endomembranas intracelular y el tráfico de vesículas en el citosol parece verse alterado por el cambio en el perfil de esteroles. Se postula que la organización de lípidos, en especial los esteroles, es esencial en el empaquetamiento de membranas tanto plasmáticas como intracelulares y en consecuencia en el mantenimiento de la homeostasis celular.

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37. ESTUDIO DE LA PARTICIPACIÓN DE LOS GENES TTL EN LA TOLERANCIA A ESTRÉS ABIÓTICO Y SU RELACIÓN CON LAS

RESPUESTAS MEDIADAS POR BRASINOSTEROIDES

M, Sotelo1, M Sainz1, M, Cuadrado1, M, Diez1 y O, Borsani1. 1Laboratorio de Bioquímica, Facultad de Agronomía (UdelaR).

Los brasinosteroides, al igual que otros reguladores, permiten que las plantas crezcan y se adapten ante señales internas y frente a los cambios en las condiciones ambientales, incluyendo los estreses bióticos y abióticos. Varios resultados demuestran que la regulación de las respuestas frente al estrés está organizada a nivel tisular y celular y que este proceso depende de reguladores clave del desarrollo. Sin embargo, se desconoce la interconexión entre estas respuestas y las vías de señalización mediadas por estos reguladores. Las proteínas Tetratrico-peptide Thioredoxin-Like (TTL) se han identificado como componentes que potencialmente podrían estar involucrados en la conexión entre dichas respuestas. Para comprender mejor como la señalización por brasinosteroides contribuye a la tolerancia frente al estrés abiótico se plantea evaluar el papel de la proteína TTL1 en condiciones de estrés osmótico en combinación con tratamientos con brasinosteroides. El conocimiento de la red de proteínas que interactúa con la proteína TTL1 y las respuestas transcripcionales generadas por dicha proteína (TTL1) en la planta modelo Arabidopsis thaliana permitirá ampliar el conocimiento de la relación entre los brasinosteroides y la tolerancia al estrés. Esta información es valiosa ya que permite identificar nuevas fuentes de tolerancia a ser incorporadas como caracteres de utilidad en el mejoramiento de cultivos de interés económico.

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38. GUAYABO DEL PAIS: 40% DE REPETICION!

M. Vaio1, N. Baz1, M. Quezada1, 2, C. Pritsch1 1Departamento Biología Vegetal, Facultad de Agronomía (UDELAR);

2Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (USP), Brasil

Las secuencias repetidas de ADN son las responsables de las grandes variaciones (63 Mpb hasta 150 Gpb) en el tamaño del genoma de plantas. La introducción de la metodologías de secuenciación de nueva generación y nuevas herramientas bioinformáticas permiten caracterizar todas las secuencias repetidas presentes en cualquier genoma. Estos estudios han mostrado que la dinámica de las distintas familias de repetidos, en abundancia y localización, parece variar entre distintos genomas. Sin embargo, se han centrado principalmente en especies cultivadas. El guayabo del país, Acca sellowiana, es una especie nativa, con un genoma haploide muy pequeño de 382 Mpb. Para estudiar las secuencias repetidas en esta especie utilizamos NGS (1x) y un enfoque de clusters implementado en el pipeline RepeatExplorer. Los análisis preliminares muestran que el ADN repetido en A. sellowiana representa 40% del genoma. Más del 70% de los repetidos está conformado por retrotransposones tipo LTR de los cuales Ty3/Gypsy y Ty1/Copia están similarmente representados. Los transposones de ADN (linajes: Mule, Harbinger, CACTA y hAT) corresponden a un 6%. Otras secuencias son tipo satélite, como el ADNr 45S y 5S y repetidos en tándem. Los menos representados fueron las secuencias LINE y pararetrovirus (2%). Las próximas etapas incluirán el mapeo físico de algunas secuencias para analizar su localización. Los resultados obtenidos representan los primeros datos en secuencias repetidas para una Myrtaceae de frutos carnosos y serán en una próxima etapa incluidos en un análisis comparativo con Eucalyptus grandis.

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PARASITOLOGÍA MOLECULAR (39-47)

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39. ¿QUÉ OMNIBUS ME DEJA EN LA MITOCONDRIA?

L. Becco1, S. Chavez1,2, M. Duhagon1,2 , P. Smircich1,2, B.Garat1 1Laboratorio de interacciones moleculares, Facultad de Ciencias (UDELAR);

2Catedra de Genética, Facultad de Medicina (UDELAR) Trypanosoma cruzi, el protozoario causante de la Enfermedad de Chagas posee una única mitocondria cuyo genoma se encuentra concentrado en una estructura particular denominada kinetoplasto. Al igual que lo que sucede en la mayoría de los eucariotas, el genoma mitocondrial apenas codifica para algunas proteínas y/o ARN necesarios para el cumplimiento de su función. La mayoría de las proteínas mitocondriales, así como la totalidad de los ARNt, están codificados a nivel nuclear. Dado que tan solo el 40% de estas proteínas contienen algún tipo de señal peptídica de localización mitocondrial, y teniendo en cuenta los antecedentes en otros organismos, deben existir señales a nivel de las regiones regulatorias del ARNm. Con el objetivo de buscar este tipo de señales inicialmente se generó una base de datos conteniendo los genes de proteínas mitocondriales codificadas a nivel nuclear (MiNT).En un primer abordaje se encontró una señal estructural (MiSSTres) que a pesar de su representación significativa en un subgrupo de transcriptos, no pudo atribuírsele la función de señal de localización mitocondrial. Como alternativa, aquí planteamos la búsqueda de señales tanto a nivel de secuencia como a nivel de estructura en subgrupos generados según los perfiles de expresión a lo largo del ciclo de vida del parásito así como a lo largo del ciclo celular del estadio epimastigota. Mediante análisis in silico se estudió la especificidad de las señales localizadas así como su posible asociación con factores en trans que pudieran reconocer dichas señales y participar del proceso de localización.

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40. IDENTIFICACIÓN DE LOS ARN PEQUEÑOS EN MESOSESTOIDES CORTI PRE Y POS IRRADIACIÓN

S.Fontenla1, A. Costabile2, E. Castillo2, J. Tort1

1Departamento de Genética, Facultad de Medicina (UDELAR); 2 Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR)

Mesocestoides corti es un cestodo que se presenta como un modelo interesante para el estudio de la biología del desarrollo. La irradiación de gusanos causa la depleción de neoblastos, por lo que es una forma alternativa para caracterizar la expresión génica en estas células, las únicas con capacidad proliferativa. Los microRNAs son reguladores de la expresión génica a nivel post-transcripcional. Con el fin de comenzar a estudiar el papel de los miRNAs en la regulación de la expresión génica en M.corti y en particular en neoblastos, analizamos por secuenciación masiva los ARN pequeños expresados en gusanos irradiados y controles. Luego de filtrar los reads obtenidos por calidad y homología con secuencias codificantes, mapeamos con miRDeep2 los reads restantes al borrador del genoma. Los miRNAs predichos fueron clasificados utilizando como referencia los miRNAs disponibles en miRBase y otros identificados recientemente en otros platelmintos y aun no incorporados a la base de datos. Al igual que en otros platelmintos encontramos una drástica reducción del miRNoma, y una diferencia muy marcada en los niveles de expresión de miRNAs. En ambas condiciones observamos que las familias miR-10 y let-7 representan en conjunto aproximadamente el 90% de los miRNAs expresados. Detectamos miRNAs específicos de platelmintos, de platelmintos endoparásitos y describimos nueve miRNAs nuevos, que podrían estar regulando vías metabólicas específicas en M.corti. Observamos diferencias en los niveles de expresión entre las dos condiciones, por ejemplo miR-2a presenta mayor expresión en organismos no-irradiados y por lo tanto podrían estar siendo expresado mayoritariamente en neoblastos.

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41. RELAVANCIA DEL CONTENIDO DE FE-SUPEROXIDO DISMUTASA CITOSOLICA DE TRYPANOSOMA CRUZI DURANTE LA INFECCION

A MACROFAGOS Y CARDIOMIOCITOS.

Martinez, A1,2; Prolo, C1,2; Estrada, D1,2; Piñeyro, D1,2,3; Robello, C1,2,3; Radi, R1,2; Piacenza, L1,2.

1Departamento de Bioquimica, Facultad de Medicina, UDELAR; 2Centro de Investigaciones Biomédicas; 3Unidad de Biología Molecular, Instituto Pasteur

de Montevideo.

Los macrófagos forman parte de la primera línea de defensa del huésped frente a la invasión por Trypanosoma cruzi. Durante la fagocitosis se activa la NADPH-oxidasa con la consiguiente generación de radical superóxido (O2

•-) a nivel intrafagosomal. El tejido cardíaco es de interés debido a la persistencia del parásito durante la fase crónica. En este trabajo se genera una línea de parásitos sobrexpresantes de la Fe-SODB citosólica, se estudia su resistencia a oxidantes y su comportamiento en infecciones celulares. En el fagosoma (pH=6) el O2

•- puede protonarse volviéndose un radical neutro (HO2•

pka=4.88). A este pH, flujos externos de O2•- (xantina-xantina oxidasa)

producen inactivación de la enzima aconitasa parasitaria y aumento en la detección de 2-hidroxietidio en parásitos preincubados con dihidroetidio, sugiriendo la presencia intraparasitaria del O2

•-. Parásitos sobrexpresantes expuestos a peroxinitrito generado in situ mediante flujos de O2

•- y •NO (SIN-1 1mM) mostraron una mayor proliferación (Abs=600nm) asi como una disminución en la formación de peroxinitrito intraparasitario (evaluado por oxidación de DHR y fluoresceína de boronato por citometría de flujo). Adicionalmente, mostraron una mayor proliferación que el control en infecciones a macrófagos (J774A.1 y derivados de médula ósea de ratón) en condiciones basales y de inmunoestimulación (inducción de la iNOS), así como en cardiomiocitos H9C2 inmunoestimulados. Este resultado se revirtió con el uso de macrófagos deficientes de la NADPH oxidasa (gp91-/-) y en cardiomiocitos sin inmunoestimular. Estos resultados sugieren que el contenido de Fe-SODs podría ser considerado un factor de virulencia para la infección por T. cruzi.

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42. CARACTERIZACIÓN DE GLICOPROTEÍNAS PRESENTES EN UNA FRACCIÓN ANTIGÉNICA DE PROTOSCOLECES DE Echinococcus

granulosus

M. Navatta, A. Irazusta, S. Dematteis Cátedra de Inmunología, Departamento de Biociencias, Facultad de Química

(UDELAR)

Los glicoconjugados de Echinococcus granulosus (agente etiológico de la hidatidosis), parecerían tener un papel importante en la interacción hospedero experimental-parásito. Nuestro grupo ha reportado que una fracción enriquecida en carbohidratos obtenida a partir de antígenos somáticos de protoscoleces de E. granulosus (E4+), induce actividades biológicas relevantes. Sin embargo, es muy pobre la información disponible sobre los componentes presentes en E4+. El objetivo de este trabajo se centró en la identificación de los componentes glicoproteicos presentes en esta fracción. Primero, se analizó la capacidad potencial de estructuras glucídicas existentes en E4+, resueltos mediante SDS-PAGE y electrotransferidos a membranas de PVDF, de interaccionar con la lectina ConA. Los resultados indican que ConA interacciona específicamente con dos glicoproteínas de PM aparente entre 45-66 kDa. Por otra parte, para identificar estructuras proteicas presentes en E4+, los componentes de esta fracción fueron resueltos por electroforesis en dos dimensiones, electrotransferidos a membranas de PVDF, e identificación de los spots reconocidos por el AcMo E492/G1. El análisis por espectrometría de masa demostró que la anexina de E.granulosus es uno de los componentes presente tanto en la fracción E4+ así como en antígenos somáticos de protoscoleces. Recientemente, se ha propuesto que las anexinas de parásitos podrían estar involucradas en modulación de la respuesta inmune del hospedador y en algunos casos, se las ha considerado como blancos potenciales para el desarrollo de vacunas. En este contexto, los resultados obtenidos en este trabajo podrían constituir la base en el diseño racional de inmuno-intervención en el hospedero intermediario natural.

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43. ANÁLISIS DEL ROL DE LA PROTEÍNA TCALBA30 EN EL CONTROL DE LA EXPRESIÓN DE AMASTINAS EN TRYPANOSOMA CRUZI

L Perez-Díaz1, P Smircich1, SMR Teixeira2

1Facultad de Ciencias, UdelaR, Uruguay; 2Universidad Federal de Minas Gerais, UFMG, Brasil

Las amastinas son una familia de glicoproteínas de superficie que constituyen potenciales factores de virulencia y que fueron inicialmente descritas en amastigotas de T.cruzi y Leishmania. Su expresión diferencial resulta de mecanismos que alteran la estabilidad del ARNm y/o control traduccional. Aunque se han identificado elementos regulatorios en las 3’UTR del ARNm para amastinas, hasta ahora, sólo se caracterizó una proteína regulatoria en Leishmania (LiAlba20), que posee un dominio Alba y reconoce el 3’UTR del ARNm amastina. Experimentos de knock out, mostraron que LiAlba20 contribuye a la regulación estadío específica modulando la estabilidad de transcritos amastinas. En este trabajo, investigamos el rol del ortólogo de LiAlba20 en T.cruzi en la regulación post-transcripcional de transcriptos amastinas. Identificamos 2 ortólogos dispuestos en tándem (TcAlba30/TcAlba40). Ensayos de Western blot y qRT-PCR, mostraron que TcAlba30/40 se expresa a lo largo del ciclo de vida de T.cruzi. Generamos parásitos donde deletamos una copia del alelo TcAlba30/40 y parásitos que expresan TcAlba30 fusionada a cMyc. Éstos últimos, se usaron para analizar la interacción TcAlba30-ARNm amastinas mediante inmunoprecipitación. Ensayos de qRT-PCR, mostraron que los niveles de ARNm amastina están alterados en los transfectantes. Realizamos análisis de expresión diferencial por RNAseq comparando parásitos cMycAlba30 con parásitos salvajes. Se observó que TcAlba30 modula los niveles de ARNm de un grupo de genes localizados en la misma región cromosómica. Análisis de ontología, muestran que en el grupo de transcriptos disminuidos, existe un enriquecimiento significativo de transcriptos que codifican para proteínas involucradas en la traducción

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44. ESTUDIO DEL SISTEMA DE SEÑALIZACIÓN PEPTIDÉRGICO EN EL CICLO DE VIDA DEL CESTODO MODELO HYMENOLEPIS

MICROSTOMA

M. Preza1, E. Castillo1, U. Koziol1 1Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR);

Los Platelmintos parásitos son de gran importancia sanitaria ya que afectan a animales domésticos y al hombre. En este grupo encontramos a los cestodos, que tienen ciclos de vida complejos con estadios que afectan a diferentes hospederos. El estudio de los sistemas de comunicación peptidérgicos en estos parásitos no ha sido estudiado en profundidad, sin embargo su estudio es de gran importancia ya que son potenciales blancos para la generación de nuevos fármacos. El modelo de cestodo Hymenolepis microstoma (Hm) tiene un ciclo de vida que puede ser mantenido por completo en el laboratorio, permitiendo acceder a todas las etapas de desarrollo. En este trabajo se está realizando la puesta a punto de Hm como modelo, estableciendo el ciclo de vida completo en colaboración con el Laboratorio de Experimentación Animal, Facultad de Química. Se realizó la identificación bioinformática de los neuropéptidos codificados en el genoma de Hm y otros platelmintos parásitos utilizando un nuevo método desarrollado en el laboratorio. Además se buscó en el genoma la presencia de la proproteín convertasa PC2 (requerida para el procesamiento de neuropéptidos) y de enzimas implicadas en las vías de síntesis de neurotransmisores clásicos como acetilcolina, serotonina y dopamina. Se detectaron por RT-PCR de Hm adultos la expresión de genes codificantes para neuropéptidos y PC2. Los ensayos de hibridación in situ que permitirán detectar su expresión a lo largo del ciclo vital están en proceso. En paralelo se realizaron inmunohistoquimicas con anticuerpos anti-tropomiosina y tubulina acetilada como marcadores de los sistemas muscular y nervioso.

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45. CLONADO Y EXPRESIÓN DE RECEPTORES NUCLEARES TIPO PPAR EN ECHINOCOCCUS GRANULOSUS.

X. Riera, G. Alvite, A. Esteves

Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias (UDELAR)

Nuestro grupo de investigación se ha centrado en el estudio de la estructura y función de las proteínas de unión de ácidos grasos (FABPs), en particular del platelminto parásito Echinococcus granulosus. Estos organismos son incapaces de sintetizar de novo ácidos grasos (AG), dependiendo de transportadores para la captura y distribución intracelular de los mismos. Distintas experiencias demuestran la presencia de FABPs en el núcleo celular y su interacción con receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPARs), para transferirles el ligando, y así actuar como reguladores de la expresión génica. Recientemente hemos demostrado la presencia de EgFABP1 en el núcleo de células de E. granulosus, siendo esta proteína un firme candidato para transportar AG hacia este compartimento.

En este contexto, nos propusimos estudiar la posible interacción entre EgFABP1 y un receptor tipo PPAR. Para ello, iniciamos en primera instancia la búsqueda y clonado de parte de la región codificante correspondiente a una proteína tipo PPAR de E. granulosus y la purificación de la proteína recombinante correspondiente. El clonado se realizó mediante RT-PCR a partir de ARN de protoescólices, empleando varios pares de oligonucleótidos diseñados a partir de secuencias con similitud elevada con los factores buscados. El fragmento resultante fue secuenciado y clonado en el vector pGM-T, subclonado en el vector de expresión pET22b(+) y propagado en la cepa de E. coli BL21 pLysS. La proteína recombinante fue expresada a distintas temperaturas y condiciones de inducción para ser purificadas mediante cromatografía de afinidad.

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46. SOBREEXPRESIÓN DE PEROXIRREDOXINAS Y RESPUESTA AL NIFURTIMOX EN Trypanosoma cruzi

G.Specker1,2, D. Estrada1,2, D. Piñeyro1, 2,3, C. Robello1, 2,3, R. Radi1,2, L.

Piacenza1,2

1Departamento de Bioquímica y 2Centro de Investigaciones Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de la República. 3Institut Pasteur de

Montevideo Trypanosoma cruzi es el parásito intracelular causante de la Enfermedad de Chagas. Existen dos fármacos utilizados para su tratamiento, Nifurtimox (NFX) y Benznidazol, que tienen eficacia limitada en la etapa crónica de la enfermedad. Este trabajo se centra en los efectos de la sobreexpresión de enzimas antioxidantes de T.cruzi en la toxicidad inducida por NFX sobre la forma epimastigota del parásito. Se observó que la sobreexpresión de las peroxirredoxinas mitocondrial y citosólica (MPX y CPX respectivamente) aumenta la resistencia de los parásitos al NFX. Luego de 3 días, se observó pérdida del potencial de membrana mitocondrial en los parásitos wt pero no en los sobreexpresantes de MPX/CPX. Se evaluó la participación de especies reactivas de oxigeno (ROS) en nuestro modelo, determinando la generación de H2O2 y O2

•-, así como la relación dímero/monómero de peroxirredoxina. No se observaron cambios en estos parámetros. Se ha reportado que los agregados de alto peso molecular de las peroxirredoxinas típicas de dos cisteínas tienen actividad chaperona-like. Se analizó la presencia de agregados de CPX y MPX, encontrándolos en los sobreexpresantes de peroxirredoxinas luego del tratamiento con NFX. Se estudió la actividad chaperona-like de extractos proteicos de alto PM, observando un aumento de esta actividad en los extractos de sobreexpresantes y de parásitos wt tratados con NFX. Además se apreció un aumento en la expresión de TcMPX al exponer a parásitos wt a NFX. En conclusión estos resultados sugieren que la oligomerización de las peroxirredoxinas de T.cruzi protege a los parásitos de la desnaturalización de proteína causada por NFX.

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47. Obtención de Caspasa-3 de Echinococcus granulosus

M. Varela1, C. Chalar1 1Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias (UDELAR)

La apoptosis es una forma de muerte celular programada fundamental para el desarrollo y el mantenimiento de la homeostasis de los metazoarios. Es desencadenada por la activación de programas específicos que confluyen en la activación de una familia de proteínas compuesta por las caspasas iniciadoras y las caspasas efectoras del proceso. Con el objetivo de contribuir a la comprensión del mecanismo de la muerte celular programada en E. granulosus, nos propusimos clonar y caracterizar el gen que codifica para una caspasa efectora en este organismo: la caspasa-3. Mediante herramientas bioinformáticas identificamos en el genoma de E. granulosus el gen caspasa-3. Diseñamos oligonucleótidos específicos con los que realizamos reacciones de RT-PCR sobre ARN de protoescólex. La banda del tamaño esperado fue clonada obteniéndose el plásmido recombinante egcasp-3 cuya identidad fue confirmada por secuenciación. Obtuvimos en el vector de expresión pET22b+ la proteína recombinante y se está trabajando sobre las condiciones óptimas de expresión. Una vez purificada la proteína, se comprobará su identidad por espectrometría de masas (MALDI-TOF). Posteriormente, determinaremos su actividad utilizando EnzChek® Caspase-3 Assay Kit (Molecular Probes). Asimismo, se generará un anticuerpo específico que permitirá estudiar la expresión espacio-temporal de caspasa-3 en los diferentes estadíos del parásito.

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EDUCACIÓN EN CIENCIAS (48-51, 81)

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48. LA MOTIVACIÓN ACADÉMICA Y EL DESARROLLO DE COMPETENCIAS

RESULTADOS DE UN MODELO INTENSIVO DE EDUCACIÓN INTERDISCIPLINARIA A NIVEL DE GRADO

A. M. Corbacho1

1Espacio Interdisciplinario, UdelaR El aprendizaje basado en problemas (ABP) y los modelos de educación interdisciplinaria (Ed InterD) son frecuentemente mencionados como metodologías de educación superior que pueden conducir a incrementar la motivación académica, el aprendizaje autorregulado y el desarrollo de competencias profesionales y/o académicas. Sin embargo, frecuentemente se utilizan argumentos sobre la dificultad de utilizar estas aproximaciones de manera efectiva en clases masificadas y en el contexto de programas enfocados a cubrir amplias cantidades de conocimiento en corto tiempo. Esta puja entre lo que podría parecer ideal y el contexto real de la educación superior nos deja frecuentemente en una encrucijada en que elegir una vía implica dejar de lado los beneficios de la otra. En esta ponencia presentaremos el diseño, la implementación y los resultados, a corto y largo plazo, de un mini curso intensivo de bioquímica/química analítica diseñado para capitalizar los beneficios del ABP y la Ed InterD. El curso tuvo dos semanas duración y fue dictado durante 6 años consecutivos en la Universidad de California Davis. Para la recolección y el análisis de datos se utilizó un abordaje de métodos mixtos. Se presentarán resultados del impacto inmediato y a largo plazo (1-6 años después del curso) en aspectos de motivación, autoeficacia y desarrollo de competencias. Como resultado de este estudio concluimos que la participación de estudiantes de grado en mini cursos de corte intensivo y altamente integrativo puede motivar el desarrollo de competencias de manera específica y tener un efecto a largo plazo en el desarrollo de su identidad profesional.

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49. DISEÑO EXPERIMENTAL Y RESULTADOS DE UN CURSO INTERDISCIPLINARIO INTENSIVO EN BIOQUÍMICA Y QUÍMICA

ANALÍTICA

A. M. Corbacho1 1Espacio Interdisciplinario, UdelaR

En este trabajo se presenta una actividad de Aprendizaje Basado en Problemas (ABP) diseñada como un desafío contextualizado para motivar a estudiantes de grado en carreras de corte científico, incluyendo: química, medicina, veterinaria, agronomía, biología, bioingeniería, física. La estrategia general del curso fue brindar un contexto en que estudiantes sin experiencia en investigación fueran capaces de trabajar en equipo para resolver un “problema real” en tiempo acotado. Los participantes trabajaron en equipos de cuatro, donde cada integrante provenía de una carrera diferente. Cada equipo investigó y determinó los métodos a emplear dentro de los límites de los recursos existentes, explicando los principios utilizados y justificando los reactivos necesarios y su forma de eliminación. Los estudiantes tuvieron libre acceso a búsquedas en línea, comunicación entre grupos y a toda fuente de información que consideraron pertinente. El instructor jugó el papel de facilitador y se inhibió de proporcionar información. Los estudiantes se enfrentaron a cuatro problemas secuenciales: a) determinar el contenido de cuatro soluciones erróneamente etiquetadas; b) determinar la presencia de contaminación en doce muestras conteniendo una proteína de interés; c) repurificar la proteína manteniéndola bioactiva; d) cuantificar la proteína purificada. En esta presentación se muestran resultados de la evaluación del aprendizaje realizado durante el curso en contexto de la Taxonomía de Bloom. Además, nuestros datos indican que la participación en el curso llevó a un aumento de la auto-eficacia en diversas áreas.

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50. FACILITACIÓN DEL DESARROLLO DE COMPETENCIAS ACADÉMICO-PROFESINALES DURANTE UN CURSO

INTERDISCIPLINARIO EN BIOQUÍMICA Y QUÍMICA ANALÍTICA

A. M. Corbacho1 1Espacio Interdisciplinario, UdelaR

Con la tendencia a la especialización se hace complejo participar de intercambios interdisciplinarios. La tendencia predominante es la de mantenerse dentro de la disciplina donde la comunicación se facilita por la exitencia de vocabulario especializado, abordajes similares e intereses comúnes. Esta visión disciplina-específica se enseña y se refuerza a través de los procesos de socialización de las experiencias educativas. Se habla de mapas cognitivos disciplinares o profesionales para hacer referencia a los aspectos cognitivos y de percepción dentro de una disciplina. A medida de que estos mapas se arraigan, la comunicación entre disciplinas se hace cada vez más difícil. En el contexto de la interdisciplina, existe coincidencia en que los aspectos de enseñanza y apredizaje que facilitan la colaboración entre disciplinas y el propio desarrollo interdisciplinario se centran en el desarrollo de competencias de trabajo de equipo. Entre las competencias específicas se encuentran la capacidad de adaptación y flexibilidad, la capacidad de comunicarse en forma efectiva, el manejo adecuado del estés, la capacidad de liderazgo facilitativo y el desarrollo de una conciencia de diversidad. En este trabajo presentamos un programa diseñado para facilitar el desarrollo de estas competencias. El programa fue parte integral y fundamental de un curso interdisciplinario intensivo en bioquímica y química analítica a nivel de grado. Para la recolección y el análisis de datos se utilizó un abordaje de métodos mixtos. Se presentan resultados del impacto del abordaje integrado sobre el desarrollo de competencias de acuerdo a la percepción de los participantes a corto y largo plazo.

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51. ELABORACIÓN DE MAQUETAS EN EL PROCESO DE APRENDIZAJE DE LA INMUNOLOGÍA VETERINARIA

Puentes, R1, *; Benavides, U1; Yaneselli, K1; Cabrera, M 1; Passarini, J2;

Vilar del Valle, M2; Maisonnave, J 1 1Área de Inmunología – Facultad de Veterinaria – Universidad de la Republica (UdelaR),2Departamento de Educación Veterinaria – Facultad de Veterinaria -

UdelaR – Lasplaces 1550 – Montevideo Uruguay. * Autor para correspondencia: rpuentes@adinet.com.uy

El curso de Inmunología Básica se dicta en el tercer semestre de la carrera de Doctor en Ciencias Veterinarias – Facultad de Veterineria – UdelaR. Tradicionalmente hasta el año 2009 los estudiantes eran evaluados a través de dos pruebas parciales escritas, enfocadas principalmente a los contenidos teóricos de la asignatura. Desde el año 2010, y debido a la necesidad de implementar métodos alternativos de aprendizaje, los docentes instrumentaron la elaboración de maquetas por parte de los estudiantes de estructuras del sistema inmunológico. Con esto se pretende que el estudiante pueda visualizar de forma más clara los componentes más importantes del sistema inmune, deteniéndose en detalles relevantes de distintas células o moléculas. Para esto, se encomienda al inicio del curso, a cada grupo de estudiantes (de 4 a 6 integrantes) la elaboración de una estructura específica en forma de maqueta que represente una célula o molécula (ejemplos macrófagos, linfocitos T, linfocitos B, neutrófilos, anticuerpos, etc.). Para su elaboración pueden utilizar cartón, gelatinas, gomas, plástico, espuma plast u otros elementos que permitieran una adecuada representación de la estructura funcional y morfológica. Al finalizar el curso los estudiantes exponen y defienden sus trabajos frente a un tribunal examinador, que asigna hasta un máximo de 10% al puntaje global de la materia. Lo que se ha podido observar en estos 5 años de experiencia, es una actitud muy positiva y creativa por la mayoría de los grupos, despertando el interés por la materia de forma sustancial, lo que la consideran ellos una actividad muy motivadora del curso. Los docentes de Inmunología y del Departamento de Educación Veterinaria evalúan como muy positiva la instancia porque los estudiantes abordan desde otra perspectiva los conocimientos, facilitando el aprendizaje con una metodología participativa y colaborativa.

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81. JUEGOS DIDACTICOS PARA LA ENSEÑANZA DE LA INMUNOLOGÍA VETERINARIA

A. Porro23, E. De Palleja23, C. Lobecio23, J. Passarini2, R. Puentes1

1Área de Inmunología, 2 Departamento de Educación Veterinaria, 3Tesistas de Grado, Facultad de Veterinaria. Universidad de la República. Lasplaces 1550.

CP 11600. Montevideo – Uruguay. Introducción El presente trabajo describe una innovación para la enseñanza de Inmunología en la Facultad de Veterinaria. Está centrado en la incorporación de estrategias lúdicas que desarrollaron algunos estudiantes seleccionados del curso impartido en el año 2014. La premisa es que los juegos didácticos son una acción educativa que parte de una concepción integral de la persona, incorporando sus emociones, pensamientos y experiencias, para promover aprendizajes significativos en términos de conocimiento de la asignatura y de habilidades sociales. El objetivo fue desarrollar y utilizar juegos didácticos como herramientas de aprendizaje, evaluando si existen mejoras en la motivación por la materia y el rendimiento académico. Se realizó una prueba diagnóstica, para conformar 4 grupos de estudiantes con rendimientos similares. Tres grupos participaron de juegos especialmente diseñados (grupo 1: Trivia; grupo 2: Puzzle; grupo 3: Twistter) y un grupo no jugó (control), participando un total de 49 individuos. Luego de la participación en los juegos se compararon los resultados en las evaluaciones parciales de todos los estudiantes y se realizó una encuesta a los que jugaros. Los resultados obtenidos demuestran que los estudiantes consideran que la técnica implementada es de utilidad para la enseñanza de inmunología ya que facilita el aprendizaje a través del uso de diferentes estrategias: realizar preguntas a los compañeros, participar del trabajo en equipo para responder y colaborar con la preparación de pruebas parciales. Sin embargo no se encontraron diferencias significativas en el rendimiento de los estudiantes. Se entiende que se deben realizar otros ensayos para profundizar estas investigaciones.

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BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGANISMOS (52-57)

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52. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS DE LA FLORA NATIVA: CARACTERIZACIÓN DE EcgDf, AISLADO DE BROTES DE CEIBO,

PARA SU PRODUCCIÓN EN Escherichia coli

S. Rodríguez-Decuadro 1,2, A. Borba2, G. Cecchetto2

1Laboratorio de Biotecnología, Facultad de Agronomía, UdelaR; 2Laboratorio de Microbiología, Facultad de Ciencias - Facultad de Química, UdelaR

Los péptidos antimicrobianos (AMPs-antimicrobial peptides) tienen un rol fundamental en la formación de barreras de defensa, contra una amplia variedad de patógenos incluyendo bacterias, hongos, virus y protozoarios. El uso de AMPs vegetales puede resultar útil en la producción agrícola, ya que el control de plagas resulta un factor determinante para asegurar la cosecha, mejorar rendimientos y aumentar la vida útil poscosecha. Por su alto rendimiento y bajo costo, el método utilizado más ampliamente para la producción de AMPs es la expresión heteróloga. Varios sistemas (organismo productor/vector) se han desarrollado para alcanzar una producción costo-efectiva de varias proteínas. Entre los sistemas microbianos, Escherichia coli, es uno de los más populares, debido a su alta tasa de crecimiento, requerimientos de bajo costo y vasto conocimiento sobre su genética y fisiología. El objetivo de este trabajo fue aislar genes de AMPs de tipo defensinas de una planta nativa de nuestro país (Erythrina crista-galli), para su posterior expresión en E. coli. El gen EcgDf obtenido por amplificación por PCR, tiene similitud significativa con genes de defensinas. La detección de ARNm de EcgDf en brotes de ceibo permitió confirmar la expresión de dicho gen y tener la secuencia codificante completa para su producción recombinante. Se transformó E. coli (BL21DE3 y Rosetta-gami) con el vector de expresión pET102 conteniendo la secuencia codificante de dicho péptido. Se están evaluando las condiciones más efectivas (sistema cepa/vector, temperatura de crecimiento, tiempo post-inducción) para la recuperación del péptido recombinante en la fracción soluble en cantidades adecuadas para su purificación.

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53. CARACTERIZACIÓN DE MANGANESO-PEROXIDASAS DE Punctularia atropurpurascens: HACIA SU EXPRESIÓN

HETERÓLOGA EN Aspergillus nidulans

G. da Rosa1, M. Barraco Vega1, M. P. Cerdeiras1, C. M. Ibáñez2, G Cecchetto1.

1Lab. Microbiología Molecular, Microbiología, Facultad de Ciencias - Facultad de Química, UdelaR; 2 Instituto Superior de Estudios Forestales, Sede

Tacuarembó, UdelaR. Los basidiomicetes de la podredumbre blanca son los únicos organismos capaces de degradar totalmente la lignina de los tejidos leñosos de plantas superiores, lo que los hace potencialmente útiles en aplicaciones biotecnológicas. Las manganeso-peroxidas (MnP), enzimas que forman parte del sistema ligninolítico extracelular, son hemoglicoproteínas conservadas (PM 43-49 kda), cuyo rol se relaciona con la oxidación de Mn+2 a Mn+3 en presencia de H2O2; el Mn+3 quelado por ácidos orgánicos oxida variedad de compuestos fenólicos. En este trabajo se caracterizó la familia MnP de Punctularia atropurpurascens, basidiomicota nativo de Sudamérica. P. atropurpurascens tiene por lo menos siete genes, identificados por rastreo genómico con primers degenerados. A diferencia de lo observado en otros organismos, estos genes se expresan en etapas tempranas de crecimiento; no son inducidos por la limitante de fuente de carbono ó nitrógeno; y son inhibidos por la presencia de Mn+2. Los péptidos deducidos presentan alta similitud con MnPs de P. chrysosporium y otros basidiomicotas, y conservan los motivos típicos: grupo hemo, sitios de unión a Mn+2 y Ca+2 y puentes disulfuro característicos. Actualmente están en curso ensayos para caracterizar la actividad de cada una de estas proteínas, mediante su expresión heteróloga en Aspergillus nidulans y medición de la capacidad de degradar los colorantes remazole Brillant blue y poly R478. El objetivo final es encontrar variantes con utilidad industrial.

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54. PRODUCCIÓN DE LAS PROTEÍNAS HOMÓLOGAS A Srp54 y Rps9 DE Aspergillus nidulans EN Escherichia coli

M. González*, M. Lapido*, M. Sanguinetti, A. Ramón

*Ambas autoras contribuyeron en igual medida. Sección Bioquímica, Dpto. de Biología Celular y Molecular, Facultad de

Ciencias (UDELAR).

Nuestro grupo construyó una cepa de Aspergillus nidulans en la que se mutaron dos codones de uso poco frecuente (codones 24-25) que codifican para aminoácidos presentes en el extremo N-terminal del transportador de urea, UreA, por codones de uso frecuente. El mutante presenta defectos en el crecimiento sobre urea y disminución de los niveles de UreA en la membrana celular. No se han detectado diferencias significativas entre las cepas salvaje y la mutante en los niveles de ARNm de ureA ni en la estructura secundaria predicha. Se plantea entonces que éstos codones podrían estar determinando una pausa traduccional necesaria para que se den correctamente las primeras etapas del plegamiento y la inserción co-traduccional de UreA en la membrana del retículo endoplasmático (RE). Actualmente se están desarrollando ensayos in vitro para determinar el posible rol de los codones 24-25 en la interacción de los complejos ribosoma-cadena polipeptídica naciente con la partícula de reconocimiento de señal (SRP), para su direccionamiento al RE. Estos implican la producción de las proteínas Srp54, una proteína conservada de SRP y Rps9, perteneciente a la subunidad menor del ribosoma y anticuerpos contra ellas. Para este fin las secuencias codificantes se han clonado en un vector de propagación y posteriormente subclonado en el vector de expresión pET-28. Los clones de interés se verificarán por secuenciación. Se pondrán a punto las condiciones de inducción óptimas para la obtención de las proteínas recombinantes. Las mismas se purificarán y serán utilizadas para producir los anticuerpos en un laboratorio externo.

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55. LA ACLIMATACIÓN AL ESTRÉS OSMÓTICO MODIFICA EL DAÑO OXIDATIVO GENERADO POR UV-B EN UNA CIANOBACTERIA

G. Pérez1, S. Doldán2, P. Scavone3, O. Borsani2, P. Irisarri1

1 Laboratorio de Microbiología. Depto. Biología Vegetal. Facultad de Agronomía (UdelaR), 2 Laboratorio de Bioquímica. Biología Vegetal. Facultad de Agronomía (UdelaR), 3 Depto. Microbiología. Instituto Investigaciones

Biológicas Clemente Estable

Las cianobacterias en arrozales están sometidas a condiciones ambientales fluctuantes y por tanto han desarrollado una serie de estrategias para sobrellevar los efectos de diferentes tipos de estrés. Con el objetivo de comprender la respuesta de una cianobacteria con heterocisto aislada de un arrozal a más de un tipo de estrés simultáneo, se expuso a Calothrix sp. BI22 a estrés osmótico inducido por PEG y a radiación UV-B. Se encontró que el contenido de prolina aumentó en presencia de estrés osmótico pero la combinación de ambos tipos de estrés generó la mayor acumulación. Los mismos resultados se obtuvieron evaluando peroxidación lipídica. Se determinó la presencia de especies reactivas del oxígeno (EROS) in vivo con microscopía confocal. UV-B provocó la mayor acumulación de superóxido (O2

.-) mientras que la combinación con estrés osmótico bajó los niveles del mismo. El estrés osmótico acumuló otros EROS. Esto concuerda con un aumento de las actividades de enzimas antioxidantes, superóxido dismutasa, catalasa y ascorbato peroxidasa. En presencia de UV-B la eficiencia del fotosistema decayó drásticamente mientras que la fotoevolución de O2 fue afectada tanto por UV-B como por el estrés osmótico. La combinación del estrés osmótico y el producido por la radiación UV desencadena una respuesta diferente en esta cianobacteria que la inducida por la exposición independiente a cada uno de ellos.

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56. ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE SRP EN ASCOMYCOTAS Y ESTUDIO DEL ROL DE LA SUBUNIDAD SRP54 EN EL DIRECCIONAMIENTO

DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA

M. Veyga1; M. Sanguinetti1; A. Iriarte2; A. Ramón1 1Sección Bioquímica, Dpto. de Biología Celular y Molecular, Facultad de

Ciencias (UDELAR), 2Departamento de Bioquímica y Genómica Microbiana y Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente

Estable.

La partícula de reconocimiento de señal (SRP) es un complejo ribonucleoproteico con una función clave en el reconocimiento y direccionamiento de proteínas de membrana hacia el retículo endoplásmatico. SRP está presente tanto en procariotas como en eucariotas, siendo su composición variable, aumentando su complejidad con la evolución biológica. La subunidad SRP54 es la más conservada y constituye el centro funcional del complejo, siendo esencial para varios de los organismos estudiados. En este trabajo hemos realizado un análisis filogenético de los componentes proteicos de SRP en la familia Ascomycota del reino Fungi. Los resultados muestran que existe un grado de conservación diferencial entre las subunidades. Además, en Aspergillus nidulans encontramos dos proteínas que poseen homología con los dominios conservados correspondientes a los componentes SRP21 y SRP19. También se estudiará la funcionalidad de SRP54 en A. nidulans, expresando este gen bajo el control del promotor dependiente de doxiciclina Tet-On en cepas cuyo gen endógeno será deletado. Esto permitirá verificar la esencialidad de SRP54 y el efecto de su carencia o sobreexpresión sobre la funcionalidad y localización subcelular, tanto del transportador de urea de A. nidulans (UreA) como de un mutante sinónimo de dos codones del extremo N-terminal de UreA, el cual presenta un defecto en los niveles de proteína mutante en la membrana. De esta manera esperamos aportar al conocimiento de SRP de hongos y de la función de uno de sus componentes. Además, la implementación del sistema Tet-On en A. nidulans aportará una herramienta útil para estudios moleculares futuros. Palabras clave: localización subcelular, SRP, transportador de urea.

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57. ESTUDIO DEL EFECTO DE FUENTES DE CARBONO SOBRE LA BIOSÍNTESIS DE ACIDO INDOL ACETICO EN BACTERIAS

MEDIANTE HPLC Y LC/MS

S. Vico1, N. Rigamonti1, A. Rodriguez2, A. Montaňez1 1Laboratorio de Microbiología de Suelo, Instituto Ecología y Ciencias

Ambientales, Facultad de Ciencias, UDELAR; 2Facultad de Química - UDELAR / Instituto Polo Tecnológico de Pando.

El 80 % de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal producen acido indol acético (AIA). El AIA es el responsable de la división, expansión y diferenciación de las células y tejidos de las plantas, estimula la elongación de las raíces y promueve la defensa contra fitopatógenos. La producción de AIA en bacterias está regulada por factores ambientales. Los mecanismos por los cuales las bacterias regulan los niveles de AIA son complejos y no están completamente estudiados. Se ha establecido que el AIA es sintetizado principalmente a partir del triptófano y se conocen al menos tres vías metabólicas para la producción de AIA a partir de este compuesto. Más allá de la regulación genética es necesario conocer los factores ambientales que regulan la utilización de las distintas vías metabólicas implicadas en la biosíntesis. Es posible que distintos recursos nutricionales, como por ejemplo la fuente carbonada, module la biosíntesis de AIA y la síntesis de distintos conjugados. En este trabajo se estudió la biosíntesis de AIA en cinco bacterias endófitas nativas aisladas de maíz: E7, Pseudomona flourescens; E10, Rhanella sp; E18, Rhanella sp; E17, Burkholderia sp; y E19, Rhizobium sp. Las bacterias crecieron en medio mínimo conteniendo 2 mg de triptófano y con distintas fuentes carbonadas: rafinosa, glucosa, glicerol, sorbitol, sacarosa, lactosa y manitol. La biosíntesis de AIA se determinó a los 7 días por HPLC y LC/MS. Los resultados preliminares constatan diferencias en la biosíntesis de AIA por las distintas cepas y en los distintos medios de cultivo.

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NEUROBIOLOGÍA (58-65)

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58. ESTUDIO DE LA SÍNTESIS PROTEICA LOCAL EN AXONES PERIFÉRICOS UTILIZANDO PROTOCOLOS DE

TRANSPARENTACIÓN DE TEJIDOS

A. Di Paolo1,2, G. Eastman2, J. Farias2, J.R. Sotelo Sosa1, J.R. Sotelo Silveira2-3

1Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Montevideo, Uruguay; 2Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable,

Montevideo, Uruguay; 3 Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, UdelaR

Actualmente los estudios de síntesis proteica local (SPL) axonal son en su mayoría in vitro, demostrándose su importancia en el crecimiento y direccionamiento del cono axónico y en la regeneración axonal. Sin embargo, los estudios de SPL in vivo en axones maduros son escasos y los métodos de análisis utilizados hasta el momento no mantienen intacta la estructura nativa de los axones. Un ejemplo es la descripción de las Placas Periaxoplásmicas Ribosomales (PARPs) que hasta el momento han sido visualizadas únicamente por la extracción de axoplasmas. Son estructuras que contienen ARN y componentes esenciales para la traducción, desconociéndose si son centros de traducción activos. En este contexto, nos planteamos estudiar la SPL en axones maduros in vivo con un método que los mantenga en su estado nativo para también identificar las PARPs. Para ello adaptamos un protocolo de transparentación de nervios enteros (CLARITY) combinado con tecnologías para visualizar proteínas neo-sintetizadas por microscopía confocal de fluorescencia (Click iT). Pudimos observar regiones axonales con proteínas neo-sintetizadas, su co-localización con marcadores ribosomales y verificamos el mantenimiento de estas señales a lo largo de prácticamente toda la pieza de nervio. También identificamos estructuras tipo PARPs conteniendo proteínas neo-sintetizadas y ribosomas en regiones donde los lípidos de la mielina prácticamente han desaparecido tras la transparentación. En suma, estos protocolos nos han permitido por primera vez analizar SPL axonal en nervios intactos obteniendo datos preliminares que identifican la actividad biosintética de proteínas en las PARPs.

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59. SILENCIAMIENTO INDUCIBLE DE PDCD4 EN UN MODELO CELULAR NEURONAL PARA EL ESTUDIO DE SU PAPEL REGULATORIO EN LA

TRADUCCIÓN G. Eastman1, A. Di Paolo1, J.R. Sotelo Sosa2, D. Munroe3, J.R.

Sotelo-Silveira1,4

1Departamento de Genómica, IIBCE; 2Departamento de Proteínas y Ácidos Nucléicos, IIBCE; 3Frederick National Laboratory for Cancer Research (USA);

4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias (UdelaR).

Programmed Cell Death 4 (PDCD4) es un gen supresor de tumores ampliamente estudiado en modelos tumorales. Previamente hemos estudiado su papel como regulador negativo de la traducción en modelos celulares de cáncer de mama, encontrando un amplio espectro de regulación (>500 ARNm). Nuestro grupo a constatado que PDCD4 se expresa en altos niveles en células neuronales incluyendo dominios dendríticos y axonales. Dado que el papel de PDCD4 como regulador de la traducción está empezando a ser estudiado, y su rol en modelos neuronales todavía no ha sido investigado en detalle, nos resulta de interés conocer el papel que ejerce este factor en neuronas. Para esto, hemos establecido cultivos celulares de PC12 y optimizado las condiciones de diferenciación neuronal en presencia de NGF. Esto nos permitió caracterizar los patrones de expresión de esta proteína conforme las células diferencian a neuronas, observando expresión en somas y neuritas. A partir de dichas células, generamos un modelo in vitro capaz de silenciar PDCD4 de manera inducible, mediante el uso de vectores lentivirales con shARNs. La inducción del silenciamiento de PDCD4, además de reflejarse en la expresión de GFP, fue verificada a nivel transcripcional y proteico mediante qRT-PCR y cuantificación de imágenes de inmunofluorescencia, respectivamente. Haciendo uso de este modelo, hemos realizado distintos tipos de estudios para conocer más en detalle el papel de PDCD4 en modelos neuronales: características morfológicas, distribución de maquinaria traduccional, así como su papel en la regulación traduccional estudiado de manera ómica, mediante Ribosome Profiling.

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60. CARACTERIZACIÓN GENÓMICA DE ARNs ASOCIADOS A ZBP1 Y MyoVa EN SISTEMA NERVIOSO PERIFÉRICO

J. Farias 1,2, L. Canclini 3, J. R. Sotelo-Silveira 1,4

1. Departamento de Genómica, IIBCE; 2. Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, IIBCE; 3. Departamento de Genética, IIBCE; 4. Departamento de

Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, UdelaR.

El transporte activo de diversas cargas, en particular ARNm, para su localizacion subcelular ha sido abordado desde distintas areas de la biologia celular, siendo de particular importancia en la biologia neuronal debido a la peculiar anatomia de estas celulas. Los ARNm transportados se encuentra formando parte de ribonucleopartículas, que contienen proteínas de unión al ARN, motores moleculares, y pueden poseer o no ribosomas y proteínas de represión de traducción. Actualmente se plantea que ZBP1 (proteína de unión al ARN) puede actuar como adaptador entre los ARNm y los motores moleculares asociados al microtúbulos o actina. Utilizando la técnica RIP-Seq se buscó describir qué mensajeros se encuentran asociados a ZBP1 y Miosina Va en axones mielínicos adultos. Primero se realizaron inmunoprecipitaciones de las dos proteínas en estudio a partir de homogenados de raices ventrales de ratas. Luego se realizó la extracción de ARNs, amplificación lineal y secuenciación masiva mediante la tecnología Ion Torrent. Se obtuvieron listas de ARNs que co-inmunoprecipitan con ZBP1 y MyoVa. Mediante la comparación de las mismas pudimos identificar un set de mensajeros que potencialmente son reconocidos por ZBP1 y transportados a través del citoesqueleto de actina mediante la Myova. La ontología de este set está enriquecida en categorías relacionadas al citoesqueleto y traducción. Mediante la comparación con el transcriptoma axonal, identificamos aquellos ARNs presentes en el axón que pueden haber sido transportados hasta ese dominio celular a través de ribonucleopartículas que contengan ZBP1 y MyoVa.

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61. EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA P53 EN HIPOCAMPO Y CEREBELO DE RATONES TREMBLER-J, MODELO MURINO DE LA

MIELINOPATÍA HEREDITARIA HUMANA CMT1E

M.V. Di Tomaso(1), C. Romeo(2), G. Folle(1), J.R. Sotelo(2), A. Kun(2,3) (1)Departamento de Genética-IIBCE, (2)Departamento de Proteínas y Ácidos

Nucleicos-IIBCE, (3)Sección Bioquímica Facultad de Ciencias-UdelaR. El grupo de neuropatías periféricas hereditarias humanas más frecuentes, conocidas como Charcot- Marie-Tooth (CMT) es responsable de un conjunto de síndromes que revelan la afectación del equilibrio célula de Schwann (CS)/axón en las fibras nerviosas periféricas. Recientemente, ha sido señalado que el sistema nervioso central también presenta alteraciones estructurales y congnitivo-conductuales asociadas a fenotipos CMTs. El gen pmp22, codificante de la proteína de mielina periférica PMP22, es patognomónico de la mielinopatía CMT1E, que se acompaña de parálisis espástica del tren posterior, sugiriendo la afectación de neuronas motoras centrales. En el modelo murino CMT1E (ratones Trembler-J) hemos demostrado la expresión de de pmp22 no sólo a nivel de la CS sino también en hipocampo y cerebelo. El genotipo mutante para pmp22 (T1703C) mostró una expresión diferencial del ARN mensajero y la proteína de este gen, tanto a nivel citoplásmico como nuclear. Dos roles principales han sido atribuidos a pmp22: (1) la integración de su proteína a la mielina periférica y (2) su expresión durante el detenimiento del ciclo celular . Esta última función, si bien no claramente interpretada, ha sido vinculada con el balance pmp22-G0/p53/PERP-apoptosis. Con el fin de abordar el papel de pmp22 en dicha encrucijada, hemos comenzado a explorar la expresión de p53 en el hipocampo y cerebelo de ratones Trembler-J y wildtype, observando que existe una expresión diferencial de la proteína p53 asociada a la mutación Trembler-J. La relación pmp22-G0/p53 deberá ser aún extensamente explorada a nivel central para comprender su contribución en el fenotipo neurodegenerativo CMT1E.

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62. APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE LA CILIA PRIMARIA DURANTE LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CELULAS GANGLIONARES DE LA

RETINA

P. Lepanto1, J. Badano1, F. R. Zolessi1,2

1Institut Pasteur de Montevideo; 2Sección Biología Celular, Facultad de Ciencias (UDELAR)

Las cilias primarias son organelos celulares que funcionan como centros de recepción y transmisión de señales extracelulares. Está presente en neuronas e influye en procesos como la proliferación de progenitores, la migración de neuroblastos y la remodelación de las dendritas. Sin embargo, se desconoce si tiene alguna función durante la adquisición de polaridad neuronal. Para aproximarnos a este problema estamos estudiando el rol de las cilias primarias durante la diferenciación de las células ganglionares de la retina (CGR) en embriones de pez cebra. Nuestros resultados indican que las CGR poseen cilias primarias previo y durante la retracción del proceso apical, y durante el inicio de la dendritogénesis. Para explorar su función, utilizamos morfolinos destinados a inhibir la expresión de proteínas necesarias para su formación. En estos embriones observamos que la capa de CGR y la plexiforme interna se ven reducidas, principalmente a las 48hpf, mientras que a las 60hpf la reducción es menor, indicando un retraso en la diferenciación neuronal. Este efecto es específico, ya que los otros tipos celulares de la retina no se ven afectados. Al evaluar el comportamiento individual de las células, pudimos observar que, al reducir las cilias primarias, los núcleos de las CGR ocupan posiciones ectópicas. Estos resultados sugieren que la señalización a través de las cilias primarias es necesaria para la diferenciación de las CGR.

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63. LOS PANEXONES DE LOS PERICITOS MEDIAN UNA INTERACCION NEUROVASCULAR

Mai, S1, Abudara V1.

1-Laboratorio de Comunicación Celular, Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina (Udelar)

La actividad neuronal incrementa los requerimientos metabólicos a expensas del flujo sanguíneo local y del transporte a través de la barrera hematoencefálica. El estado metabólico neuronal es sensado por los pericitos pericapilares ubicados en la interfase neurovascular. Una vía para la interacción neurovascular es la constituida por canales formados por hexámeros proteícos de conexinas (conexones) o panexinas (panexones). Estos canales poseen un poro central que permite el intercambio de iones y moléculas (Ca++, ATP, glucosa) entre el citosol y el medio extracelular. Nuestro objetivo es determinar si estas vías de comunicación son funcionales entre el pericito y el medio cerebral en hipocampo de ratón. Utilizando marcadores e inmunofluorescencia identificamos pericitos adosados a capilares vinculándose con astrocitos, endotelio y neuronas. Mediante inmunofluorescencia detectamos conexina 43(Cx43), panexina 1(Px1) y el receptor purinérgico P2X7 (P2x7R) en la membrana pericitaria. En rodajas de hipocampo la captación de bromuro de etidio (Etd+, trazador que permea hemicanales y uniones gap) por los pericitos fue inhibida por bloqueantes de panexones/conexones (carbenoxolona) y de Px1 (probenecid; 10Px1) y no fue sensible a bloqueantes de conexones (lantano; Gap26). Además la captación fue inhibida al degradar el ATP extracelular (apirasa) y en presencia de bloqueantes de P2X7R (BrilliantBlue-G). In vivo confirmamos la captación de Etd+ por los pericitos y su inhibición por probenecid. Estos resultados sugieren que los pericitos expresan panexones de Px1 funcionales en condiciones basales; si bien detectamos Cx43, los resultados no demuestran conexones abiertos. La vía ATP-P2X7R activaría los panexones comunicando los pericitos con el medio cerebral.

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64. Efectos de la rigidez de las matrices de colágeno Tipo I en el crecimiento de las neuritas simpáticas

G. F. Martínez 1, A. Richeri1, N. Unsain2, A. Cáceres2,3, M.M. Brauer 1

1Laboratorio de Biología Celular. Instituto de Investigaciones Biológicas

Clemente Estable (IIBCE), MEC. Montevideo, Uruguay; 2Laboratorio de Neurobiología. Instituto de Investigación Médica Mercedes y

Martín Ferreyra (IMMF), INIMEC-CONICET, Universidad Nacional de Córdoba. Córdoba, Argentina; 3Instituto Universitario de Ciencias Biomédicas

de Córdoba (IUCBC), Córdoba, Argentina El colágeno es el componente más abundante de la matriz extracelular (MEC), siendo el Tipo I una de las formas predominantes. Andamios que contienen colágeno Tipo I alineado son ampliamente utilizados en ingeniería de tejidos para promover la regeneración de nervios periféricos. Evidencias indican que la rigidez de la MEC afecta el crecimiento neurítico. En el presente trabajo se caracterizó el crecimiento axonal en matrices tridimensionales de colágeno Tipo I (matrices-3D) de distinto grado de rigidez. Con este fin, se cultivaron explantos de ganglios simpáticos de rata en geles de colágeno control (no rígidos) y geles tratados con glicoaldehído, un agente promotor del entrecruzamiento de fibrillas de colágeno, que aumenta su rigidez. Los explantos ganglionares crecidos en matrices-3D rígidas presentaron halos neuríticos de tamaño significativamente menor que los crecidos en geles control. La morfología del cono de crecimiento de las neuritas (CC) también se vio afectada. El análisis de los cultivos por inmunofluorescencia reveló diferencias en la morfología del citoesqueleto de F-actina. La cuantificación mostró que el 25 % de las neuritas crecidas en geles rígidos presentaba CCs con morfología típica de colapsados, mientras que sólo un 3 % de los CCs crecidos en geles control mostraron esta morfología. Estos resultados sugieren que no sólo el alineamiento de las fibrillas de cólageno en una matriz, sino también su grado de rigidez es relevante para el crecimiento de los nervios.

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65. SEMA3A/NRP1 EN LA REMODELACIÓN DE LA INERVACIÓN UTERINA EN RESPUESTA A ESTRÓGENO

A. Richeri 1, G.F. Martínez 1, C. Chalar 2, M.M. Brauer 1

1 Laboratorio de Biología Celular, IIBCE; 2Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias, (UDELAR)

El útero se denerva en condiciones fisiológicas y esto es mimetizado por administración sistémica de estradiol (E2), convirtiéndolo en un modelo ventajoso para estudiar los mecanismos que regulan la plasticidad del sistema nervioso adulto. En búsqueda de señales que cambian en el microambiente uterino en respuesta a E2 y ejercen efectos negativos sobre su inervación, demostramos por RT-PCR que Sema3A se expresa en el útero de la rata y se induce en respuesta al E2. Mediante hibridación in situ, revelamos que Sema3A se induce en las áreas de distribución de los nervios intrauterinos con un perfil temporal que coincide con la denervación provocada por E2. Evaluamos por trazado retrógrado e inmunofluorescencia si las neuronas que proyectan al útero expresan el receptor de Sema3A, neuropilina-1 (NRP1). Demostramos que las neuronas simpáticas y sensoriales de proyección uterina expresan NRP1 y encontramos distintos perfiles de regulación en las diferentes poblaciones neuronales: NRP1 no cambia en las simpáticas en degeneración mientras que disminuye en la subpoblación sensorial de neuronas medianas. Estos resultados sugieren que los incrementos en la producción de Sema3A en el útero estrogenizado pueden ser detectados por los nervios uterinos y podrían explicar el desbalance simpático/sensorial que se observa en estas condiciones. Sema3A se suma a la ya demostrada redundancia de otras señales en el útero estrogenizado con efectos negativos para los nervios y pone de manifiesto la relevancia biológica del proceso neurodegenerativo que ocurre en el útero y que hoy se sabe está alterado en varias patologías ginecológicas.

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GENÓMICA (66-69)

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66. GENÓMICA FUNCIONAL DEL MICROAMBIENTE INTRACORONARIO DE PACIENTES CON INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO

A. Di Paolo1,2, F. Giorello2, N. Lluberas3, R. Mila3, G. Vignolo3, P. Trujillo3,

R. Lluberas3, J. Sotelo-Silveira2,4. 1Departamento de Proteínas y Ácidos Nucleicos, IIBCE; 2Laboratorio de Genómica, IIBCE; 3Departamento de Cardiología, Hospital de Clínicas,

Facultad de Medicina, UdelaR, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, UdelaR

En Uruguay las enfermedades coronarias es causa de aproximadamente el 25% de las muertes certificadas. Entre los síndromes coronarios agudos, el infarto agudo de miocardio (IAM) es una enfermedad frecuente. Con el objetivo de investigar lo que ocurre en el microambiente coronario a nivel celular y molecular analizamos el transcriptoma de sangre intracoronaria (IC) durante el infarto y el correspondiente a la sangre arterial periférica (SP) del mismo paciente. Fueron secuenciados 11 pacientes de los cuales 3 se utilizaron para controlar que la extracción de las globinas no sesgaba el análisis de RNA-seq, 1 para estudiar de manera preliminar la respuesta transcripcional de infartos con una etiología distinta (trombosis de stent) y los 8 restantes se utilizaron para analizar la expresión génica durante un infarto agudo de miocardio como consecuencia de la rotura de placa de ateroma. El análisis de expresión diferencial entre las muestras de IC y SP de los 8 pacientes resultó en más de 100 genes expresados diferencialmente. Con nuestro trabajo, encontramos 7 genes ya confirmados en otro estudio pero además reportamos muchos otros ya relacionados con la respuesta inflamatoria en general (pero no aún en el infarto) y otros noveles que, por su función, probablemente estén interviniendo en dicha respuesta. Por otro lado, nuestros resultados preliminares indican que la respuesta transcripcional entre ambos tipos de infartos sería notoriamente disímil, los genes que comparten se expresan en dirección contraria. Creemos que nuestros resultados serán útiles para elaborar una teoría funcional de este evento con mayor precisión.

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67. REGULACIÓN ESTADIO ESPECÍFICA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN Trypanosoma cruzi POR COMPARTIMENTACIÓN NUCLEAR

L. Pastro1, P. Smircich1, A. Di Paolo2, M. A. Duhagon1, J. Sotelo-Silveira2

and B. Garat1

1Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias, Montevideo; 2Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente

Estable, Montevideo Uruguay.

Trypanosoma cruzi es el parásito causante de la enfermedad de Chagas responsable de la muerte de miles de personas al año en América Latina. Debido a la aparente falta de control del inicio de la transcripción de los genes que codifican para proteínas, este organismo constituye un excelente modelo para el estudio de la regulación postranscripcional de la expresión génica. Salvo por algunos reportes puntuales, los estudios de regulación postranscripcional de la expresión génica en T. cruzi se han dirigido al análisis de niveles de ARNm de homogenados celulares. Nuestra hipótesis es que la compartimentación subcelular de ARN es importante para el control de la expresión génica en este parásito, por lo que el análisis de secuenciación masiva de ARN de fracciones subcelulares aporta una perspectiva nueva en la comprensión de este fenómeno. Para evidenciar si el tráfico núcleo-citoplasma juega un rol en la expresión génica en T. cruzi utilizamos análisis de secuenciación masiva de ARN extraído de fracciones nuclear, citoplásmica y de homogenado total del estadio epimastigota. Los resultados indican que existe una distribución subcelular diferencial de transcriptos en epimastigotas. La fracción nuclear está enriquecida en transcriptos codificantes para proteínas que no se expresan en este estadio del parásito. Los resultados fueron confirmados mediante RT-PCR cuantitativo y FISH de algunos transcriptos seleccionados. Nuestros datos muestran nueva evidencia acerca del control de los mecanismos de regulación de la expresión génica a nivel postranscripcional en este parásito.

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68. ANÁLISIS DE GENES ARGONAUTAS Y CÁNCER DE MAMA ESPORÁDICO

S. Rodriguez1, Brignoni L1, M. Cappetta1, P. Hidalgo2, M. Sans2, C.

Bonilla3, N. Artagaveytia4 y B.Bertoni1

1 Departamento de Genética, Facultad de Medicina. (UDELAR); 2 Departamento de Antropología Biológica, Facultad de Humanidades y Ciencias

de la Educación, (UDELAR); 3 School of Social and Community Medicine, University of Bristol, United Kingdom; 4 Departamento Básico de Medicina,

Facultad de Medicina, (UDELAR). El cáncer de mama en Uruguay constituye la tercera causa de muerte general y es el tipo de cáncer más frecuente entre las mujeres uruguayas. El cáncer de mama esporádico representa entre el 70 al 90% de los casos, sin embargo los estudios a nivel nacional se han focalizado en identificar mutaciones altamente penetrantes en familias afectadas. En este trabajo se realizó un estudio de asociación en cáncer de mama esporádico, utilizando 142 mujeres afectadas y 141 mujeres sanas. Se analizaron 4 SNPs ubicados en el cromosoma 1 dentro del cluster que forman AGO 1, AGO 3 y AGO 4. Se estudió la asociación alélica y haplotípica con cáncer de mama. Dado que nuestra población es mestizada, todos los estudios de asociación genética fueron corregidos para ancestría mediante regresión logística. Se detectó 1 SNPs (rs595961) en el gen AGO 3 asociado con cáncer de mama (p=0.04277). Por otra parte, rs2791966 del gen AGO 4 presentó asociación con cáncer de mama (p=0.009868) que perdió significancia al corregir por ancestría. Se identificó 1 haplotiopo (GGGA) asociado con cáncer de mama (p=0.04129) y un haplotipo significativamente más frecuente en controles que en casos: AAGG, p=0.04129 (alelos correspondientes a los SNPs rs671816, rs2791966, rs636832, rs595961 respectivamente). Al comparar nuestra muestra con las poblaciones disponibles en HapMap encontramos que los casos no difieren en su estructura poblacional, para los SNPs analizados, con los CEU: FST = 0.00078 (p = 0.26270), mientras que los controles si lo hacen: FST = 0.03848 (p = 0.00195).

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69. ESTUDIOS DE TRADUCCIÓN POR “RIBOSOME PROFILING” EN Trypanosoma cruzi

P. Smircich1,2, G. Eastman3, S. Bispo4, M.A Duhagon1,2, B. Garat1, S.

Goldenberg4, D. Munroe5, B. Dallagiovanna4, F. Holetz4, J. Sotelo-Silveira3 1Laboratorio de Interacciones Moleculares, Facultad de Ciencias (UDELAR);

2Departamento de Genética. Facultad de Medicina (UDELAR); 3Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable;

4Laboratorio de estudios de regulación de la expresión génica. Instituto Carlos Chagas, FIOCRUZ. Curitiba, Brazil; 5Cancer Research Technology Program, Leidos Biomedical Research, Inc., Frederick National Laboratory for Cancer

Research, Frederick, MD 21702, USA La regulación post-transcripcional constituye el principal nivel regulatorio en tripanosomátidos. Por lo tanto, el estudio de los transcritos que están siendo traducidos (traductoma) resulta clave para entender el control de su expresión génica. En este trabajo, determinamos el traductoma de Trypanosoma cruzi en los estadíos epimastigota y trypomastigota metacíclico, usando la metodología ribosome profiling. El estadio trypomastigota metacíclico es responsable de la infección del mamífero y resulta de un proceso de diferenciación a partir de los epimastigotas replicativos. Nuestros resultados correlacionan muy bien con datos proteomicos previos, siendo estas correlaciones mejores que las correspondientes al transcriptoma. Esto revela que la traductomica es más adecuada que la transcriptomica para estimar la expresión a nivel proteico. Los datos muestran que una gran proporción del traductoma de epimastigotas está ausente en el estadio infectivo. Además, la eficiencia traduccional presenta un amplio rango dinámico y varios genes cambian su eficiencia en ambos estadios, apoyando la importancia de este nivel regulatorio en la expresión génica diferencial. En el estadio tripomastigota metacíclico, la eficiencia traduccional de importantes factores de virulencia como las proteínas trans-sialidasas aumenta, mientras que la eficiencia de otras familias como las proteínas ribosomales disminuye. Por otra parte, el análisis traductómico permitió la detección de pausas traduccionales. El análisis del uso de codones diferencial en estos sitios sugiere que el uso de codones modula la cinética del movimiento de los ribosomas sobre el ARNm en estos parásitos. Globalmente, el estudio resalta la importancia de la regulación traduccional durante la diferenciación del parásito.

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10. BIOQUÍMICA DE PROTEÍNAS (70-76, 82)

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70. ROL DEL HACINAMIENTO MOLECULAR EN EL DAÑO OXIDATIVO PROTEICO

A. Aicardo1, A. Cassina1, R. Radi1

1Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina (UDELAR); 2Centro de Investigaciones Biomédicas, CEINBIO, Facultad de Medicina (UDELAR)

La interacción entre proteínas y oxidantes ha sido ampliamente estudiada, sin embargo la mayoría de los datos publicados fueron obtenidos bajo condiciones que difieren del ambiente intracelular. Las condiciones de hacinamiento molecular encontradas en los compartimientos celulares facilitan interacciones intermoleculares que modifican propiedades biofísicas y bioquímicas comparado con soluciones diluidas. Proponemos que la alta densidad a la cual las proteínas están presentes en bioambientes celulares, permite reacciones oxidativas radicalares entre diferentes cadenas polipeptídicas desencadenando eventos de propagación en cadena comparables con procesos de lipoperoxidación de membrana. En este trabajo evaluamos la participación de reacciones de oxidación en cadena en soluciones altamente concentradas de albúmina sérica bovina (BSA). Realizamos estudios de oximetría, quimioluminiscencia, y fluorescencia para demostrar la formación en el tiempo de especies radicalares producto de la exposición de BSA a generadores de radicales proteicos (peroxinitrito). La producción de radicales derivados de amino acidos lleva a la formación de radicales peroxilo que propagan el proceso oxidativo. Estos resultados apoyan el concepto de que en ambientes hacinados como el citoplasma celular, el daño oxidativo puede ser inducido y amplificado via reacciones radicalares en cadena mediados por proteinas y dependientes de oxígeno, lo cual representa un proceso bioquímico no evidenciado previamente.

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71. DESARROLLO DE MÉTODOS FLUORESCENTES PARA MEDIDA DE LA ACTIVIDAD CINÉTICA DE PKNG DE M. TUBERCULOSIS

J. Dalla Rizza1, M. Gil2, M. Möller1, A. Denicola1

1Labratorio de Fisicoquímica Biológica, Facultad de Ciencias (UDELAR); 2 Unidad de Bioquímica y Proteómica Analítica, Instituto Pasteur

Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la tuberculosis, constituye un grave problema de salud pública a escala mundial. La quinasa PknG de M. tuberculosis ha emergido como un posible blanco farmacológico ya que juega un rol crítico en la regulación del metabolismo del glutamato en dicho organismo. Se sabe además que PknG es secretada al interior del fagosoma del macrófago y estaría involucrada en la inhibición de la maduración del mismo siendo esencial para la supervivencia del bacilo dentro del macrófago. En el presente trabajo nos propusimos desarrollar métodos continuos de medida de actividad quinasa de PknG tomando ventaja del cambio estructural de su sustrato fisiológico, GarA, al fosforilarse. Para ello se marcó GarA con la sonda fluorescente cloruro de dansilo esperando observar cambios tanto en su espectro de emisión de fluorescencia como en la anisotropía de fluorescencia ocasionados por el cambio conformacional de GarA. En otra aproximación, se utilizó 1,8-ANS en los ensayos de fosforilación de GarA por PknG, con el objetivo de evaluar si existe unión diferencial al ANS por parte de las conformaciones fosforilada y desfosforilada. Estos abordajes no fueron exitosos en detectar la fosforilación de GarA, por lo que usamos una estrategia independiente de su cambio estructural. Se acopló la formación de ADP como producto de fosforilación a la acción de las enzimas piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa, permitiendo seguir la oxidación de NADH por fluorescencia. Con este método se determinaron los parámetros cinéticos PknG Km = 1.9 × 10-6 M y kcat = 1.8 × 10-2 s-1.

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72. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ACONITASA MITOCONDRIAL HUMANA EXPUESTA A OXIDANTES

S. Mansilla, V. Tórtora y L. Castro

Departamento de Bioquímica, CEINBIO, Facultad de Medicina (UDELAR)

La aconitasa mitocondrial es una enzima esencial del ciclo de Krebs que cataliza la isomerización reversible de citrato a isocitrato. Esta enzima ha sido identificada como uno de los principales blancos de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno siendo preferencialmente modificada e inactivada por oxidantes durante el envejecimiento y en patologías que cursan con disfunción mitocondrial. La alta reactividad de la aconitasa a los oxidantes mitocondriales se debe a la presencia centro [4Fe-4S] con un Fe lábil (Feα) en su sitio activo. Sin embargo, modificaciones oxidativas en los aminoácidos de esta proteína también podrían modificar la actividad o el destino de esta proteína. Nuestro grupo ha caracterizado la reactividad de la aconitasa con el óxido nítrico nítrico (•NO), el peroxinitrito (ONOO-) y el radical carbonato (CO3

•-). Además, se ha evaluado el impacto metabólico y sobre la producción de especies reactivas mitocondriales que genera la inactivación de la aconitasa mitocondrial. En estos trabajos se utilizó una enzima recombinante porcina y mitocondrias de rata(ref Tortora 2007, Scandroglio 2014). En el presente trabajo nos planteamos evaluar aspectos bioquímicos (estructurales y funcionales) de la aconitasa mitocondrial recombinante humana expuesta a sistemas oxidantes in vitro. Estamos actualmente expresando y purificando la aconitasa mitocondrial recombinante humana con éxito y los avances de este trabajo se discutirán en las jornadas de la SBBM.

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73. EFECTO DEL Y- TOCOFEROL EN PROCESOS OXIDATIVOS DE

MEMBRANAS MEDIADOS POR PEROXINITRITO

Martinez, D. M.¹,3 , Radi, R. ¹,2 y Bartesaghi, S.1,2

¹Centro de Investigaciones Biomédicas (CEINBIO); ²Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad de la República-Uruguay;

3Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq – Brasil)

El peroxinitrito (ONOO-) es un oxidante formado in vivo que participa en reacciones de oxidación de biomoléculas incluidos lípidos y proteínas de membranas. Los radicales derivados del peroxinitrito promueven la nitración de tirosinas para dar el producto 3-nitrotirosina (NT).

e capaz de inhibir las reacciones de lipoperoxidación y se ha demostrado su efecto en la nitración de tirosinas asociadas a membranas 1.

--tocoferol y análogos derivados

sintéticos) en las reacciones de lipoperoxidación y nitración de tirosinas, se trabajó con un modelo de liposomas de fosfatidilcolina a los que se incorporó el análogo hidrofóbico de tirosina, N-t-BOC tert butil ester L-tirosina (BTBE)1-2. Se prepararon liposomas de fosfatidilcolina de huevo (EYPC, 30 mM) con BTBE (0.3 mM) y tocoferoles en distintas concentraciones (1-expusieron ONOO- (0.1-1 mM) adicionado en forma de bolo o mediante infusión lenta. Los productos de lipoperoxidación fueron determinados midiendo la concentración de hidroperóxidos lipidicos (LOOH) por espectrofotometría (560 nm; ε = 43000 M-1 cm-1) y la nitración del BTBE por RP-HPLC con detección UV/Vis/Fluo. Los datos muestran que el α y γ-tocoferol poseen un efecto similar y dosis-dependiente en la inhibición de la lipoperoxidación (máx. ~30%) y formación del NO2-BTBE (~58 %). Estos datos son relevantes para el estudio de nuevos análogos sintéticos de tocoferol3 en búsqueda de compuestos mas eficientes en inhibir las reacciones oxidativas a nivel de fosfolípidos y proteínas de membrana. 1 Bartesaghi S. et al. Biochemistry, 45(22): 6813-25 (2006). 2 Bartesaghi S. et al. Chem Res Toxicol, 23(4): 821-35 (2010). 3 Li B. et al. J Am Chem Soc,135(4):1394-405 (2013).

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74. ESTUDIO A NIVEL MOLECULAR DE LA ESPECIFICIDAD POR SUSTRATO OXIDANTE EN PEROXIRREDOXINAS: EL CASO DE

AHPE DE TUBERCULOSIS MYCOBACTERIUM

A. M. Reyes1, A. Zeida2, P. Lichtig2, M. Hugo1, D. S Vazquez3, J. Santos3, L. González Flecha3, R. Radi1, D. Estrín2, M. Trujillo1.

1 Departamento de Bioquímica and Center for Free Radical and Biomedical Research, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay; 2 Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química-Física

and INQUIMAE-CONICET, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina; 3 IQUIFIB-Dpto.

Química Biológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina.

Las peroxirredoxinas (Prxs) son peroxidasas dependientes de tioles que cumplen un importante rol en la reducción de peróxido de hidrógeno (H2O2), peroxinitrito y hidroperóxidos orgánicos. Entre ellas, la alquilhidroperóxido reductasa E de Mycobacterium tuberculosis (MtAhpE) representa una subfamilia de las Prxs, presentes en arqueas y bacterias. Previamente, hemos determinado que MtAhpE descompone hidroperóxidos de ácidos grasos (LOOH) ~104 veces más rápido que H2O2. Esta sorprendente alta reactividad se podría atribuir a un surco hidrofóbico que se forma en la interfaz dimérica de la enzima. Aquí, caracterizamos el surco y estudiamos la cinética con hidroperóxidos orgánicos, analizando la posible interacción y reactividad a nivel molecular. Se confirmo la existencia del surco hidrófobico expuesto y que hay una correlación entre la reactividad con la longitud de la cola alifática del hidroperóxido. También, determinamos experimentalmente los parámetros termodinámicos de activación para la reducción de LOOH, que muestran que la enzima reduce significativamente la energía libre del estado de transición, con un efecto entrópico favorable en comparación con la reducción de H2O2. Además, simulaciones QM/MM muestran que ocurre el mismo mecanismo catalítico de reducción de LOOH como de H2O2 por la MtAhpE, que consiste en un arreglo del sitio activo donde se establece una red de enlaces de hidrógeno que activan a las especies reaccionantes. Además, la interacción entre la enzima y la cola alifática hace ubicar el grupo hidroperóxido dentro del sitio activo favoreciendo la conformación reactiva de la enzima. Este estudio proporciona nuevos conocimientos sobre la especificidad por sustratos oxidantes en Prxs.

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75. PUESTA A PUNTO DE TÉCNICAS PARA LA DETECCIÓN DE ÁCIDO SULFÉNICO EN ALBÚMINA DEL PLASMA

M. Steglich1, L. Turell1, B. Alvarez1

1Laboratorio de Enzimología, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

La formación de ácido sulfénico (RSOH) en cisteínas está vinculada a procesos de señalización y catálisis. Trabajos previos de nuestro grupo han demostrado la formación in vitro de este intermediario en la única cisteína libre (Cys34) de la albúmina humana (HSA). En este trabajo se comenzó la puesta a punto de técnicas para detectar la formación de HSA-SOH a nivel del plasma. Inicialmente se utilizó un análogo de dimedona biotinilado (DCP-Bio1, Kerafast) y el FluoReporter Biotin Quantitation Assay Kit (Molecular Probes) para detectar la marca de biotina. Se evaluaron diversas condiciones de reacción pero en ningún caso se observaron diferencias entre la muestra reducida y la oxidada (H2O2 4 mM, 4 min, 37 °C, pH 7.4). Si bien los controles aseguraron el funcionamiento del sistema de detección, estudios cinéticos mostraron que la reacción con la sonda es lenta y no compite con el decaimiento espontáneo de HSA-SOH. Posteriormente se realizaron ensayos con una sonda más reactiva, que consiste en un cicloalquino biotinilado (BCN-Bio1, donado por Dr. Furdui, Wake Forest). Se evaluaron distintas relaciones HSA:BCN-Bio1, obteniendo resultados positivos para la relación 1:1 cuando se incluyó proteasa en las mezclas previo a la detección. En este caso se detectaron 0.19 biotinas/HSA para la muestra reducida y 0.35 para la oxidada. Esto significa que se atraparon ~0.16 HSA-SOH/HSA, consistente con resultados previos utilizando TNB. El análisis por espectrometría de masa confirmó que efectivamente BCN-Bio1 reaccionó con HSA-SOH, y no con HSA-SH. En breve evaluaremos esta sonda en muestras de plasma.

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76. ACTIVIDAD PEROXIDASA DEL CITOCROMO C: ESTUDIOS EN CITOCROMO C MODIFICADO OXIDATIVAMENTE E

INTERACCIONES CON CARDIOLIPINA

F. Tomasina1; D.A. Capdevila2; V. Demicheli1; S. Oviedo Rouco2; D.H. Murgida2; R. Radi1

1Center for Free Radical and Biomedical Research, Facultad de Medicina, Universidad de la República, Uruguay; 2INQUIMAE y Departamento de

Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Argentina.

El citocromo c (cyt c) es una hemo proteína que está involucrada en diversos procesos central, tanto para la vida como para la muerte. En la mitocondria actúa como transportador de electrones en la cadena respiratoria, y como mediador pro-apoptótico a nivel del citosol. Nuestro grupo ha trabajado en demostrar que ciertas modificaciones oxidativas postraduccionales como son la nitración de tirosinas (cyt74YNO2) y la oxidación de la metionina 80 (cyt80MSO) disparan un cambio estructural que influye en el microambiente del hemo. Este cambio estructural promueve la ganancia de actividad peroxidasa. El cyt c interactúa con un fosfolípido específico de la mitocondria, la cardiolipina, esta interacción induce un cambio conformacional que aumenta la actividad peroxidasa del cyt c. El objetivo de este trabajo es caracterizar como los diferentes cyt c modificados oxidativamente promueven la actividad peroxidasa y cuál es la conexión con la oxidación de la cardiolipina. Se determinó la actividad peroxidasa en solución así como también en liposomas con cardiolipina, usando peróxido de hidrógeno y a los hidroperóxidos de cardiolipina como sustrato. Cyt80MSO y cyt74YNO2 muestran una mayor actividad peroxidasa para el sustrato peróxido de hidrógeno, mientras que el cyt c tiene una mayor actividad peroxidasa para los hidroperóxidos de cardiolipina. Por lo tanto, cyt74YNO2 y cyt80MSO podrían ser los responsables de la oxidación inicial de la membrana mitocondrial y el cyt c ser la proteína responsable de la propagación de los hidroperóxidos lipídicos. Estos datos podrían explicar un mecanismo de oxidación de la membrana mitocondrial relacionada con el programa de muerte celular.

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82. APROXIMACIONES ESTRUCTURALES-FUNCIONALES PARA COMPRENDER EL PAPEL DE CCDC28B EN CILIOGÉNESIS

M. Fabregat1*, M. Cárdenas-Rodríguez1*, F. Trajtenberg3, Nicole Larrieux, A. Buschiazzo3, J.L. Badano1, F. Irigoín1,4

1Lab. Genética Molecula Humana; 2Unidad de Proteínas Recombinantes; 3Unidad de Cristalografía de Proteínas, Institut Pasteur de Montevideo;

4Depto.Histología y Embriología, Fac. de Medicina, UdelaR

La cilia primaria es un organelo que participa en la comunicación de la célula con el entorno y su mal funcionamiento es causante de varias enfermedades llamadas ciliopatías, de las cuales el síndrome de Bardet-Biedl (BBS) es un ejemplo. Nuestro proyecto se centra en una proteína que se ha encontrado mutada en BBS: CCDC28B. Estudios previos vincularon a CCDC28B con la proteína SIN1, regulando ciliogénesis y la vía de señalización de mTORC2. CCDC28B es una proteína de 200 aminoácidos sin homólogos de función o estructura conocida. Nuestro objetivo es entender cómo CCDC28B interacciona con SIN1 y regula ciliogénesis, mediante abordajes bioquímico-estructurales y funcionales. Produjimos CCDC28B humana en forma recombinante, obteniendo una mezcla de monoméro y dímero. Testeamos diferentes condiciones para concentrar la muestra y rastreamos condiciones de cristalización utilizando la forma monomérica de CCDC28B, sin resultados exitosos. En paralelo intentamos obtener información funcional a través de mutar regiones de CCDC28B que se predicen in silico como potenciales motivos funcionales. Determinamos que regiones predichas como secuencias de localización (NLS) y exportación (NES) nuclear son funcionales y podrían tener vinculación con la relación CCDC28B-SIN1. La localización nuclear de los mutantes NLS y NES de CCDC28B correlaciona en forma inversa con la localización de SIN1 en el núcleo, sugiriendo que CCD28B podría facilitar la salida de SIN1 de dicho compartimiento. Esto podría ser relevante para la función de SIN1 en ciliogénesis, ya que en condiciones en que ciliogénesis está afectada por disminución de los niveles de CCDC28B, SIN1 se acumula en el núcleo.

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11. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN CIENCIAS ANIMALES (77-78)

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77. ALTA EXPRESIÓN DE HSP27 EN LA TRANSFORMACIÓN MALIGNA DE CÁNCER DE TIROIDES CANINO

Pessina P2., Boiani M1, 2., Sartore I.2., Menezes C.2, Bausero M.1

1Área de Bioquímica, Facultad de Veterinaria, UdelaR, Montevideo, Uruguay 2 Laboratorio de Técnicas Nucleares, Facultad de Veterinaria, UdelaR,

Montevideo, Uruguay. Las proteínas de estrés térmico (Hsp), son proteínas altamente conservadas durante los procesos evolutivos y se encuentran en todos los procariotas y eucariotas. Tanto en condiciones de estrés celular como en procesos de transformación maligna y progresión tumoral, estas proteínas aumentan su expresión. Varios autores han demostrado la relevancia de la expresión de Hsp27 en tumores del sistema reproductivo y su rol en la progresión tumoral y metástasis. Sin embargo, los estudios de Hsp27 en cáncer de tiroides en canino son insuficientes. En este trabajo, presentamos datos preliminares que sugieren la presencia de Hsp27 en tumores foliculares de tiroides indicando un posible rol de esta proteína en mecanismos de transformación maligna. La determinación de la expresión de Hsp27 por inmunohistoquímica (IHQ) revelan una reacción fuertemente positiva en el tejido carcinomatoso tiroideo (+++) comparado con la ausencia de expresión de Hsp27 en tejido tiroideo normal (neg.). En validación de los datos de IHQ, los datos obtenidos por “Real Time PCR” (qRT-PCR) revelan un aumento en la expresión relativa de mRNA de Hsp27 de 1,0 en el tejido normal a 2.5 en tejido tumoral. Si bien estos datos son aún preliminares, sugieren una fuerte asociación de la expresión de Hsp27con procesos de malignización en cáncer de tiroides canino.

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78. ESTUDIO DE LAS DEFENSAS INNATAS DEL ESTURIÓN.

M. Castellano1,2, V. Silva1, E. Fernandéz3, D. Conijeski3, A. Villarino2, A. Ferreira1.

1Cátedra de inmunología, Instituto de Higiene, Facultad de Ciencias (UDELAR); 2Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias (UDELAR);

3Empresa Esturiones del Río Negro. El esturión (Acipenser spp.) es criado en Uruguay para la producción de carne y caviar. Aunque su cultivo ha sido exitoso, durante el verano se registra un aumento en la mortalidad de los peces, atribuido a factores medioambientales adversos que posiblemente afectan su sistema inmune, particularmente sus componentes innatos. Con el fin de abordar esta problemática, se optimizaron técnicas para determinar la actividad de tres componentes de la inmunidad innata: la vía alternativa del sistema del complemento (VA), la lisozima y la ceruloplasmina. Se evidenció que la actividad de estos componentes presentó variaciones en verano respecto al invierno en hembras adultas mantenidas en las condiciones de cultivo de la granja; observamos un descenso significativo en la funcionalidad de la VA y un modesto aumento en la actividad lisozima en suero. Sospechando que la elevada temperatura del agua en el verano podría contribuir a las alteraciones observadas, se estudió el efecto de la exposición a baja (18°C) o alta (24°C) temperatura en peces mantenidos durante 37 días en condiciones controladas. La exposición a 24°C redujo la actividad de la VA y de la ceruloplasmina, a la vez que provocó un aumento en los niveles de lisozima. La administración de un suplemento alimenticio (Biopack) con potencial inmunestimulante revirtió levemente los efectos adversos de la alta temperatura. Globalmente, este estudio sugiere que las condiciones ambientales del verano, en particular las altas temperaturas, generan un estado de estrés en los peces que deprime la funcionalidad de sus defensas innatas, favoreciendo el desarrollo de infecciones.

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12. LA IMAGEN COMO FUENTE DE INFORMACIÓN (9, 14, 79)

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9. POLI-ADP-RIBOSILACIÓN: NUEVAS LOCALIZACIONES Y AUMENTO EN NERVIOS PERIFÉRICOS DE RATONES TremblerJ.

L. Lafon-Hughes (1), C. Romeo (2), K. Cal (2), G. Folle (1), J.R. Sotelo (2), A.

Kun (2, 3). (1)Departamento de Genética-IIBCE, (2) Departamento de Proteínas y Ácidos

Nucleicos-IIBCE, (3) Sección Bioquímica Facultad de Ciencias-UdelaR. La poli-ADP-ribosilación (PARilación) es una modificación postraduccional de proteínas consistente en la adición de sucesivos monómeros de ADP-ribosa generando cadenas de longitud variable de poli-ADP-ribosa (PAR). Los estudios de la PARilación se han focalizado mayormente en proteínas nucleares. Sin embargo, recientemente hemos comunicado la presencia de PAR asociada al cinturón de adhesión de las células VERO (epitelio renal de mono). Demostramos que la inhibición de la síntesis de PAR induce cambios de forma y pérdida de adhesión celular, en tanto el desensamblaje del citoesqueleto de actina conlleva la disrupción del cinturón de PAR, sugiriendo asociación estructural y funcional de actina y PAR. Nos preguntamos si la PARilación está restringida a las uniones intercelulares de VERO o es una modificación postraduccional relacionada también con la actina en otros tejidos. Detectamos PAR en: epitelio intestinal, epidermis, acinos dérmicos y capilares hepáticos, demostrando que este fenómeno se extiende a diversas células epiteliales. Considerando que recientemente hemos descrito en fibras nerviosas periféricas de ratones Trembler-J (modelo murino de la neuropatía periférica humana CMT1E) incrementos significativos en la expresión del citoesqueleto de actina, analizamos los niveles de PARilación en el nervio ciático de ratones de genotipos TrJ y salvaje. Confirmamos que el aumento de actina se correlaciona con aumento de PAR , agregando así un dato más a favor de la interacción estructural y funcional de actina y PAR cuyo significado biológico habrá que intentar dilucidar en el futuro.

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14. ABSORCIÓN INTESTINAL EN VERTEBRADOS: ROL DE LAS PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE ÁCIDOS GRASOS

M. Suárez1, A. Esteves1

1Sección Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias (UDELAR) Las FABPs (fatty acid binding proteins) son proteínas intracelulares, que unen en forma no covalente ácidos grasos de cadena larga y otros ligandos hidrofóbicos. Se distinguen entre ellas, por su distribución tisular y por los ligandos que unen. La función específica de las FABPs está aún bajo investigación, si bien recientemente se han obtenido hallazgos prometedores. Algunos de sus miembros estarían implicados en la modulación del crecimiento y proliferación celular, regulación de la expresión génica. El pez cebra (Danio rerio) resulta útil para el estudio del metabolismo lipídico de los vertebrados. Diferentes FABPs se expresan en el intestino del pez cebra y en particular, las formas I-FABP y L-FABP se expresan en el tercio anterior del intestino por lo cual se cuestiona si estas proteínas ejercen una función redundante o complementaria. En este trabajo se estudió la localización celular de las proteínas I-FABP y L-FABP en el enterocito de Danio rerio en respuesta a la dieta. Se observó por microscopía laser confocal y electrónica de transmisión que ambas proteínas se distribuyen tanto en el núcleo como en el citoplasma del enterocito, en dos condiciones alimenticias. Se realizó la cuantificación de la fluorescencia en los núcleos de ambos grupos de peces, resultando en un aumento significativo para la L-FABP en los peces alimentados con respecto a los no alimentados. Resultados similares fueron obtenidos por microscopía electrónica de transmisión. En cuanto a la I-FABP los resultados obtenidos no son estadísticamente significativos.

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79. PROPIEDADES ANTIOXIDANTES Y METABOLICAS DEL SEMEN ASOCIADAS A LA MOTILIDAD ESPERMATICA

C. Pritsch1,, Silveira P1, Santos L2, , Cassina A3, Escande C4, Sapiro R.1 1Departamento de Histología, (Fmed), 2Facultad de Ciencias (UDELAR);

3Departamento de Bioquimica, (FMed-UDELAR) 4 Instituto Pasteur- Montevideo

La infertilidad humana afecta al 15 % de las parejas en edad de concebir. En el 50%de los casos existe un componente masculino evidenciado por la presencia de espermatozoides defectuosos en el eyaculado. Existen datos que indican que la generación de especies reactivas del oxigeno (ROS) mitocondriales está aumentada en los espermatozoides defectuosos y poco motiles. CD38 es una enzima bifuncional capaz de sintetizar e hidrolizar la ADP-ribosa cíclica (cADPR). cADPR es un posible segundo mensajero relacionado a la entrada de Ca++ a la célula. CD38 también es considerada la principal NAD+asa de los tejidos de mamíferos. CD38 se encuentra en el líquido seminal humano y es regulada por factores presentes en el semen. En este trabajo la posibilidad de que la actividad de esta enzima pueda estar relacionada con la motilidad espermática así como con las propiedades antioxidantes del semen fue investigada. Para ello se analizó la actividad enzimática de CD38 en muestras de semen de pacientes que presentaban espermatozoides con diferentes motilidades. Se encontró que aquellas muestras con menor porcentaje de espermatozoides móviles presentaban una mayor actividad enzimática. Mediante inmunoblotting se analizó las modificaciones nitro-oxidativas de muestras de espermatozoides con diferentes motilidades en presencia y ausencia de semen. Se observó un efecto protector del semen en la nitración de las proteínas espermáticas. Las muestras con espermatozoides de mayor motilidad presentaron menores modificaciones nitro-oxidativas. Estos datos sugieren que la actividad de CD38 podría aumentar la producción de ROS mitocondrial espermático y esto conducir a una disminución de la motilidad espermática.