Identificacion de Proteinas de Alto Peso Molecular Hmw en Trigo Duro

5/9/2018 Identificacion de Proteinas de Alto Peso Molecular Hmw en Trigo Duro - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/identificacion-de-proteinas-de-alto-peso-molecular-hmw-en-trigo-duro 1/7

IDENTIFICACION DE PROTEINAS DE ALTO PESO MOLECULAR HMW EN TRIGO DURO

INTRODUCCION

Los cereales contribuyen un conjunto de plantas de gran impacto para la humanidad ya que son el

alimento que contribuye con numerosos nutrientes, el trigo en particular es una planta gramínea

anual, de la familia del césped, con espiga de cuyo granos molidos se obtiene la harina, su nombre

científico es del Genus triticum, es uno de los cereales mas utilizados en la elaboración de

alimentos, de ahí la necesidad de hacer el análisis de las proteínas especificas que contiene cada

variedad.

El cultivo de grano en México es importante para el desarrollo socioeconómico del país ya que es

una de las fuentes mas importante de nutrientes en la dieta del mexicano sobre todo para las

poblaciones rurales y urbanas de escasos recursos y por que tanto su cultivo como su

procesamiento y consumo genera una derrama económica y un gran numero de empleos en

varios sectores y actividades de la cadena del sistema producto-trigo. (Peña et al .,2008)

La electroforesis representa actualmente una de las herramientas mas complejas empleadas en el

laboratorio analítico moderno, ya que se ha aplicado a la investigación básica o aplicada e incluso

industrialmente, en particular la electroforesis en gel de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida

constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas dado que reúnen

una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y

compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos. La poliacrilamida se forma por

copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis acrilamida (N,N metilen-bis-acrilamida),

en una reacción iniciada por la Tetrametilendiamina (TEMED) y el per sulfato de amonio.

Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE por sus siglas en inglespolyacrylamide gel electrophoresis) probablemente la mas utilizada es la modalidad que se lleva a

cabo en presencia de detergente duodecilsulfato de sodio (SDS).

MATERIALES Y METODOS

Material vegetal

Muestras de trigo duro proporcionadas por la institución

Reactivos

1. 1M TRIS, pH 8.5

2. 1M TRIS, pH 6.8

3. SDS (dodecilsulfato de sodio) 10%

4. Stock de acrilamida

a) Precaución: usar guantes y mascarilla

b) Almacenar en frasco obscuro y mantener en refrigeración



5. Stock Buffer de muestra (extracción)

6. Stock TRIS- Glicina para buffer de tanque

7. Solución tinción coloración

8. Acido tricloroacetico

NOTA: Todos los reactivos son preparados con anterioridad para ser usados en

determinado momento según lo marca el método propuesto por Peña et al . 2004 y son

proporcionados por la institución.

Metodología

La muestra de trigo de 5 g ,cada una se molió en un molino UDY para obtener harina integral. El

análisis electroforético de proteínas de alto peso molecular se realizo por el método de Peña et al .,

2004 en el laboratorio de Química y Calidad de trigo del Centro Internacional de Mejoramiento de

Maíz y Trigo. La separación de las proteínas se obtuvo de una muestra de 40 mg de harina integral

pesada en una balanza analítica (Sartorius), colocando la muestra en tubos eppendorf de 1.5 ml de

capacidad.

Adicionamos 1.5 ml de propanol al 50% para la separación de proteínas solubles en alcohol,

mezclamos e incubamos a 65° C y centrifugamos a 10 000 rpm usando una Eppendorf micro

centrifuga 5415 C, Brinkmann Instruments N.Y., el sobrenadante es evaporado en su totalidad en

un tubo limpio y el residuo seco es extraído por medio de la solución de extracción con pH 8.0

(Obtención de gliadinas)

El residuo solido es mezclado con una solución DTT (Dithiothreitol) al 2% y posterior mente con

otra solución de Vinil piridina, se agito, se sónico, incubo y se centrifugo hasta obtener un

sobrenadante el cual contiene las proteínas gluteninas, específicamente que son extraídas con la

solución de extracción de pH 6.8.

El corrimiento electroforético se realizo utilizando geles de 15% de 17cm de alto y 1.5 mm de

ancho, ejemplo para dos geles:

y 24.67 ml de TRIS pH 8.5

y 21.14 ml Stock de Acrilamida

y 0.65 ml SDS

y 17.21 ml Agua destilada

La mezcla es desairada con un desgacificador Branson 5510, se filtra y se adiciona 1.3 ml de

persulfato de amonio al 1.5%, posteriormente adicionamos el TEMED justo antes de utilizar la

solución.

El gel de aplicación se utilizo al 4.8% de 3cm aproximadamente por 1.5 mm de ancho, entes de

que este gelifique se coloco un peine con 20 carriles.



La cámara de electroforesis utilizada fue larga de forma vertical Electrophoresis Protean II xi an XL

Cell con capacidad para 6 geles con 20 carriles cada uno, y la separación electroforética se llevo a

cabo con 9-11 mA por gel durante 15 o16 horas, fue necesario utilizar un aparato enfriador que

mantenga la temperatura a 15 ° C.

Después de este tiempo es retirado de los cristales y colocado en una solución para colorear lasbandas por alrededor de 4 horas en agitación suave, el gel es retirado y colocado en agua para

empezar la decoloración.

La fotografía del gel se consigue colocando los geles en un recipiente de cristal o acrílico y

exponerlo a la luz, sin embargo se utilizo un escáner GS-710 Calibrated Imaging Densitometer para

la mejor apreciación de los geles.

RESULTADOS

Las proteínas de alto peso molecular se definen en tres locus Glu-A1, Glu-B1y Glu-D1, en la Figura

1 se observan las áreas donde se localizan cada uno de los alelos correspondientes a cada locus.

Figura 1. Locus Glu-A1, Glu-B1,

Glu-D1 y Gli-B1 de proteína en

geles de poliacrilamida.

Glu-A1

Glu-B1

Glu-D1

Gli-B1

LMW

HMW



7

8

12*

17

18

75

10

2

12

G-APM

9

713

16

6

19?

A

7

8

7

8

12*

17

18

75

10

2

12

G-APM

9

713

16

6

19?

A

En la figura 2 se observa los diferentes perfiles de bandas de proteína de alto peso molecular y en

el cuadro 1 su identificación completa.

No.Muestra

HMWGlu-A1

HMWGlu-B1

HMWGlu-D1

1 2* 17+18 5+10

2 1 17+18 2+12

3 2* 7+8 5+10

4 2* 7+9 5+10

5 1 13+16 2+12

6 2* 7 5+10

Figura 2. Subunidades de proteínas

de alto peso molecular (HMW) en

geles de poliacrilamida

Cuadro 1. Bandeo correspondiente

a las proteínas de alto peso

molecular (HMW)

No. Muestra 1 2 3 4 5 6



Las proteínas solubles en alcohol también llamadas gliadinas se pueden observar en la Figura 3,

correspondiente al locus Gli-B1.

La T observada en la figura 3 se refiere a la traslocación que consiste en el remplazo del brazo

corto del cromosoma 1B del trigo por el brazo corto 1R del centeno. Dicha traslocación se

encuentra asociados a genotipos de amplia adaptación y alto rendimiento (Rajaram y Braun 2008);

sin embargo desfavorece la calidad del gluten (Liu et al ., 2005).

Figura 3. Subunidades de proteína (gliadinas) en geles de poliacrilamida, T=

traslocación 1B/1R



Las gliadinas identificadas en el locus Gli-B1 se encuentran ligadas a las gluteninas de bajo peso

molecular aunque estas proteínas no son nuestro objeto de estudio es importante saber que el

perfil del locus Gli-B1 permite confirmar los alelos del locus Glu-B3. En el cuadro 2 se observa

dicha relación.

Las bandas (locus Glu-A1, locus Glu-B1, locus Glu-D1 y locus Gli-B1) se identificaron en base a lo

nomenclatura propuesta por Payne y Lawrence (1983), Jackson et al . (1996) y Branlard et al .

(2003) para las subunidades pertenecientes a las gliadinas.

Glu-B3 b G C´ h d i j

Gli-B1 b F i d h k lCuadro 2. Correspondencia alelica

entre Gli-B1 y Glu-B3



LITERATURA CITADA

y Branlard, G., M. Dardevet, N. Amiour, and G. Igrejas. 2003. Allelic diversity of HMW

and LMW glutenin subunits and omega-gliadins in French bread wheat (T riticum

aestivum L.). Gen. Res. Crop Evol. 50: 669679.

y He, Z. H., L. Liu, X.C. Xia, J. J. Liu, and R. J. Peña. 2005. Composition of HMW and

LMW glutenin subunits and their effects on dough properties, pan bread, and

noodle quality of chinese bread wheats. Cereal Chem. 82:345350.

y Jackson, E. A., M. H. Morel, T. Sontag-Strohm, G. Branlard, E. V. Metakovsky, and R.

Redaelli. 1996. Proposal for combining the classification systems of alleles of Gli-1

and Glu-3 loci in bread wheat (T riticum aestivum L.). J. Genet. Breed. 50:321-336.

y Payne, P. I., E. A. Jackson, and L. M. Holt. 1984. The association between K-gliadin

45 and gluten strength in durum wheat varieties: a direct causal effect or the result

of genetic linkage? J. Cereal Sci. 2:73-81

.

y Peña, B. R. J., H. González S., and F. Cervantes. 2004. Relationship between Glu-

D1/GluB-3 allelic combinations and breadmaking quality-related parameters

commonly used in wheat breeding. In: Masci, S. and D. Lafiandra (eds. Proceedings

of the 8th

International Gluten Workshop.. Viterbo, Italy. pp: 156-157.

y Rajaram, S. R. and H. J. Braun. 2008. Wheat yield potential. In: Reynolds, M. P. J.

Pietragalla, and H. J. Braun (eds). International Symposium on Wheat Yield

Potential: Challenges to International Wheat Breeding. CIMMYT. México, D. F. pp:

103-107.

Identificacion de Proteinas de Alto Peso Molecular Hmw en Trigo Duro

Documents

Transcript of Identificacion de Proteinas de Alto Peso Molecular Hmw en Trigo Duro