IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA …
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IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMD/DMB) JAIME E. SIMBAQUEBA GONZALEZ PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA BOGOTÁ D.C. MARZO 8 DEL 2006
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IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGIA
BOGOTAacute DC
MARZO 8 DEL 2006
IDENTIFICACIOacuteN DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
TRABAJO DE GRADOPresentado como requisito parcial
Para optar por el titulo de
BIOacuteLOGO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANAFACULTAD DE CIENCIASCARRERA DE BIOLOGIacuteA
BOGOTAacute DCMARZO DEL 2006
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NOTA DE ADVERTENCIA
Artiacuteculo 23 de la Resolucioacuten Ndeg 13 de Julio de 1946
ldquoLa Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis Solo velaraacute por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catoacutelica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna antes bien se vea en ellas el anhelo de
buscar la verdad y la justiciardquo
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IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
APROBADO
------------------------------------- ----------------------------------- Claudia Silva Biol MSc Fernando Suaacuterez MD
DIRECTOR ASESOR
-------------------------------------- ----------------------------------- Dora Fonseca Biol MSc Juan Carlos Prieto MD MSc JURADO JURADO
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IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
APROBADO
----------------------------------------- -----------------------------------------------
Aacutengela Umantildea Biol MPhill Carmen Cecilia Espiacutendola Biol MSc
DECANO ACADEMICO DIRECTOR DE CARRERA
AGRADECIMIENTOS
bull En primer lugar quiero dar las gracias a la Universidad Javeriana que me
abrioacute las puertas a la vida profesional por todo lo que he aprendido
5
durante estos maacutes de 5 antildeos por el apoyo y la aceptacioacuten de este
trabajo para obtener mi titulo profesional
bull La exitosa realizacioacuten de este estudio se dio gracias al apoyo de la
Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario tambieacuten en gran
parte a mis compantildeeros de laboratorio quienes compartieron ademaacutes de
su amistad el conocimiento y las habilidades que me permitieron lograr
correctamente los objetivos planteados Quiero dar un merecido
agradecimiento a Dora J Fonseca profesora de la materia de geneacutetica de
la Universidad del Rosario quien fue una persona fundamental quien
con su ayuda aprendiacute y adquiriacute los conocimientos y habilidades que
ahora manejo ademaacutes de todos los consejos que hicieron de mi un
mejor profesional Tambieacuten quiero agradecer por el tiempo la
dedicacioacuten y la confianza que tuvo en mi a la persona quien dirigioacute este
estudio Claudia T Silva tambieacuten profesora de la Unidad de Geneacutetica de
la Universidad del Rosario Al Instituto de Geneacutetica de la Universidad
Javeriana que sirvioacute de respaldo dentro de la facultad en la presentacioacuten
de este estudio a traveacutes de Fernando Suaacuterez quien muy gentilmente
acepto asesorar la realizacioacuten y presentacioacuten de este estudio a la
universidad
bull Un especial agradecimiento a todos mis compantildeeros de laboratorio en
especial a Nelson Rangel Milena Rondoacuten Paola Cruz Giovanni
Villalba y la persona que da lo mejor de si y ayuda a todos los
estudiantes en sus proyectos Lida Trivintildeo quien me ensentildeo a realizar la
teacutecnica de extraccioacuten de DNA y preparar los geles Por ultimo quiero
agradecer y desearle lo mejor a la directora del Instituto de Ciencias
Baacutesicas de la Universidad del Rosario Sandra Ramiacuterez a demaacutes de
aceptarme como un miembro maacutes del equipo del laboratorio
TABLA DE CONTENIDO
1 INTRODUCCIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
2 MARCO TEORICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
3 FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 18
6
31 Formulacioacuten del problema de investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphellip 18 32 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 18
4 OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 19
41 Objetivo Generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16 42 Objetivos Especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
5 MATERIALES Y METODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20
51 Disentildeo de la investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20 511 Poblacioacuten de estudio y muestrahelliphelliphelliphelliphellip 20
512 Variables del estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
52 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
521 Estandarizacioacuten de condicioneshelliphelliphellip 22
5211 Disentildeo de los sistemas multiplexhelliphellip 24
5212 Caracteriacutesticas molares de las soluciones 24
53 Recoleccioacuten de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26 54 Anaacutelisis de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
6 RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCRhelliphelliphellip 28
62 Anaacutelisis de delecioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
63 Anaacutelisis de comparacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
7 DISCUSIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 38
8 CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
9 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
10 REFERENCIAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 45
11 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 52
INDICE DE TABLAS
Tabla1 Condiciones y caracteriacutesticas de los primers utilizadoshelliphellip 23
Tabla 2 Organizacioacuten de los diferentes sistemashelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Tabla 3 Condiciones iniciales de la mezclas maestras de PCRhelliphellip 257
I
Tabla 4 Condiciones de corrido de PCRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4Chelliphellip 31
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4Bhelliphelliphellip 31
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3Bhelliphellip 32
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2Ahelliphelliphellip 33
Tabla 10 Comparacioacuten de la distribucioacuten de las delecioneshelliphelliphellip 41
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estandarizacioacuten de los primeros sistemas 5C y 3Bhelliphelliphellip 28
Figura 2 Secuencia del exon 65 (BLAST NCBI)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
Figura 3 Estandarizacioacuten inicial de los sistemas 4B y 4Chelliphelliphelliphellip 32
8
II
Figura 4 Resultados del sistema 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 5 Resultados del sistema 2Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 6 Resultados del sistema 3Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Figura 7 Resultados del sistema 4Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Figura 8 Resultados del sistema 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
Figura 9 Distribucioacuten de deleciones en el gen de la distrofina 42
RESUMEN
La distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB) es una enfermedad
muscular degenerativa causada por mutaciones en el gen de la distrofina el cual
se encuentra en el cromosoma X y presenta un patroacuten de herencia recesiva
ligada a este cromosoma Se analizaron deleciones de 15 exones del gen de la
distrofina en 36 pacientes afectados con diagnostico cliacutenico de distrofia
muscular de Duchenne o Becker 29 de los cuales con diagnostico cliacutenico de
Duchenne y 7 con diagnostico cliacutenico de Becker con el fin de analizar la
frecuencia de delecioacuten en una poblacioacuten colombiana afectada con distrofia 9
III
muscular El anaacutelisis de deleciones se realizo a traveacutes de PCR multiplex en 15
exones del gen de DMDDMB ubicados fuera de los puntos proclives a
mutaciones denominados hot spots reportados en la literatura mundial Solo en
un paciente de los 36 se encontroacute delecioacuten en un exon que corresponde al 27
de la poblacioacuten analizada en este estudio Asiacute mismo se establecioacute una
comparacioacuten con lo reportado para Colombia con respecto a lo descrito para
sitios fuera de los hot spots del gen de la distrofina en la literatura mundial Se
puede afirmar que la frecuencia de deleciones en el gen de la distrofina es muy
baja para Colombia con respecto a lo reportado para otras poblaciones y que
solo con el anaacutelisis de deleciones en los hot spots se puede hacer un correcto
diagnostico molecular para la DMDDMB
1 INTRODUCCIOacuteN
Las distrofias musculares (DM) tipo Duchenne y Becker son enfermedades de
caraacutecter hereditario ocasionadas por mutaciones presentes en un gen del
cromosoma X se caracterizan por presentar un patroacuten de herencia recesiva
ligada al X de tal forma que las madres portadoras de una mutacioacuten del gen
tendraacuten una posibilidad del 50 de tener hijos varones afectados y una
probabilidad del 50 de tener hijas portadoras Los pacientes que presentan
esta enfermedad tienen debilidad muscular progresiva lo cual conlleva a una
degeneracioacuten o atrofia completa del muacutesculo
10
El gen que produce la enfermedad de DMD y DMB se encuentra en el brazo
corto del cromosoma X en la banda Xp21 y codifica para la distrofina una
proteiacutena de 427 kD y 3685 aminoaacutecidos este gen es uno de los mas grandes
que se ha descrito hasta el momento La distrofina es una proteiacutena ubicada en la
membrana del sarcolema que interactuacutea con el complejo de sarcoglicanos y
distroglicanos ayudando en la contraccioacuten muscular al generar una interaccioacuten
entre el dominio intracelular y el complejo extracelular Las mutaciones en el
gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y mutaciones puntuales
de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a deleciones y
duplicaciones de uno o maacutes exones del gen mientras que el resto corresponde a
mutaciones puntuales e inserciones El 60 de los casos de DMDDMB se
presentan por mutaciones heredadas mientras que el 40 se deben a
mutaciones de novo durante la gametogenesis de la madre del afectado o del
abuelo por liacutenea materna
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de vida y muerte al finalizar
la segunda deacutecada
En Colombia se han realizado estudios previos por Silva et al en donde se han
analizado los 17 exones mas frecuentemente relacionados con DMBDMD en
estos se ha reportado una frecuencia de deleciones menor a la reportada en la
literatura mundial Por esta razoacuten en este trabajo se analizaron 15 exones
adicionales mediante PCR multiplex 11 de estos ubicados fuera de los 2 hot
spots mientras que los 4 restantes se ubican en los hot spots en 36 pacientes
con DMBDMD
11
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
IDENTIFICACIOacuteN DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
TRABAJO DE GRADOPresentado como requisito parcial
Para optar por el titulo de
BIOacuteLOGO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANAFACULTAD DE CIENCIASCARRERA DE BIOLOGIacuteA
BOGOTAacute DCMARZO DEL 2006
2
NOTA DE ADVERTENCIA
Artiacuteculo 23 de la Resolucioacuten Ndeg 13 de Julio de 1946
ldquoLa Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis Solo velaraacute por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catoacutelica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna antes bien se vea en ellas el anhelo de
buscar la verdad y la justiciardquo
3
IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
APROBADO
------------------------------------- ----------------------------------- Claudia Silva Biol MSc Fernando Suaacuterez MD
DIRECTOR ASESOR
-------------------------------------- ----------------------------------- Dora Fonseca Biol MSc Juan Carlos Prieto MD MSc JURADO JURADO
4
IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
APROBADO
----------------------------------------- -----------------------------------------------
Aacutengela Umantildea Biol MPhill Carmen Cecilia Espiacutendola Biol MSc
DECANO ACADEMICO DIRECTOR DE CARRERA
AGRADECIMIENTOS
bull En primer lugar quiero dar las gracias a la Universidad Javeriana que me
abrioacute las puertas a la vida profesional por todo lo que he aprendido
5
durante estos maacutes de 5 antildeos por el apoyo y la aceptacioacuten de este
trabajo para obtener mi titulo profesional
bull La exitosa realizacioacuten de este estudio se dio gracias al apoyo de la
Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario tambieacuten en gran
parte a mis compantildeeros de laboratorio quienes compartieron ademaacutes de
su amistad el conocimiento y las habilidades que me permitieron lograr
correctamente los objetivos planteados Quiero dar un merecido
agradecimiento a Dora J Fonseca profesora de la materia de geneacutetica de
la Universidad del Rosario quien fue una persona fundamental quien
con su ayuda aprendiacute y adquiriacute los conocimientos y habilidades que
ahora manejo ademaacutes de todos los consejos que hicieron de mi un
mejor profesional Tambieacuten quiero agradecer por el tiempo la
dedicacioacuten y la confianza que tuvo en mi a la persona quien dirigioacute este
estudio Claudia T Silva tambieacuten profesora de la Unidad de Geneacutetica de
la Universidad del Rosario Al Instituto de Geneacutetica de la Universidad
Javeriana que sirvioacute de respaldo dentro de la facultad en la presentacioacuten
de este estudio a traveacutes de Fernando Suaacuterez quien muy gentilmente
acepto asesorar la realizacioacuten y presentacioacuten de este estudio a la
universidad
bull Un especial agradecimiento a todos mis compantildeeros de laboratorio en
especial a Nelson Rangel Milena Rondoacuten Paola Cruz Giovanni
Villalba y la persona que da lo mejor de si y ayuda a todos los
estudiantes en sus proyectos Lida Trivintildeo quien me ensentildeo a realizar la
teacutecnica de extraccioacuten de DNA y preparar los geles Por ultimo quiero
agradecer y desearle lo mejor a la directora del Instituto de Ciencias
Baacutesicas de la Universidad del Rosario Sandra Ramiacuterez a demaacutes de
aceptarme como un miembro maacutes del equipo del laboratorio
TABLA DE CONTENIDO
1 INTRODUCCIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
2 MARCO TEORICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
3 FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 18
6
31 Formulacioacuten del problema de investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphellip 18 32 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 18
4 OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 19
41 Objetivo Generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16 42 Objetivos Especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
5 MATERIALES Y METODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20
51 Disentildeo de la investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20 511 Poblacioacuten de estudio y muestrahelliphelliphelliphelliphellip 20
512 Variables del estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
52 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
521 Estandarizacioacuten de condicioneshelliphelliphellip 22
5211 Disentildeo de los sistemas multiplexhelliphellip 24
5212 Caracteriacutesticas molares de las soluciones 24
53 Recoleccioacuten de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26 54 Anaacutelisis de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
6 RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCRhelliphelliphellip 28
62 Anaacutelisis de delecioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
63 Anaacutelisis de comparacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
7 DISCUSIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 38
8 CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
9 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
10 REFERENCIAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 45
11 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 52
INDICE DE TABLAS
Tabla1 Condiciones y caracteriacutesticas de los primers utilizadoshelliphellip 23
Tabla 2 Organizacioacuten de los diferentes sistemashelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Tabla 3 Condiciones iniciales de la mezclas maestras de PCRhelliphellip 257
I
Tabla 4 Condiciones de corrido de PCRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4Chelliphellip 31
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4Bhelliphelliphellip 31
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3Bhelliphellip 32
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2Ahelliphelliphellip 33
Tabla 10 Comparacioacuten de la distribucioacuten de las delecioneshelliphelliphellip 41
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estandarizacioacuten de los primeros sistemas 5C y 3Bhelliphelliphellip 28
Figura 2 Secuencia del exon 65 (BLAST NCBI)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
Figura 3 Estandarizacioacuten inicial de los sistemas 4B y 4Chelliphelliphelliphellip 32
8
II
Figura 4 Resultados del sistema 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 5 Resultados del sistema 2Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 6 Resultados del sistema 3Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Figura 7 Resultados del sistema 4Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Figura 8 Resultados del sistema 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
Figura 9 Distribucioacuten de deleciones en el gen de la distrofina 42
RESUMEN
La distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB) es una enfermedad
muscular degenerativa causada por mutaciones en el gen de la distrofina el cual
se encuentra en el cromosoma X y presenta un patroacuten de herencia recesiva
ligada a este cromosoma Se analizaron deleciones de 15 exones del gen de la
distrofina en 36 pacientes afectados con diagnostico cliacutenico de distrofia
muscular de Duchenne o Becker 29 de los cuales con diagnostico cliacutenico de
Duchenne y 7 con diagnostico cliacutenico de Becker con el fin de analizar la
frecuencia de delecioacuten en una poblacioacuten colombiana afectada con distrofia 9
III
muscular El anaacutelisis de deleciones se realizo a traveacutes de PCR multiplex en 15
exones del gen de DMDDMB ubicados fuera de los puntos proclives a
mutaciones denominados hot spots reportados en la literatura mundial Solo en
un paciente de los 36 se encontroacute delecioacuten en un exon que corresponde al 27
de la poblacioacuten analizada en este estudio Asiacute mismo se establecioacute una
comparacioacuten con lo reportado para Colombia con respecto a lo descrito para
sitios fuera de los hot spots del gen de la distrofina en la literatura mundial Se
puede afirmar que la frecuencia de deleciones en el gen de la distrofina es muy
baja para Colombia con respecto a lo reportado para otras poblaciones y que
solo con el anaacutelisis de deleciones en los hot spots se puede hacer un correcto
diagnostico molecular para la DMDDMB
1 INTRODUCCIOacuteN
Las distrofias musculares (DM) tipo Duchenne y Becker son enfermedades de
caraacutecter hereditario ocasionadas por mutaciones presentes en un gen del
cromosoma X se caracterizan por presentar un patroacuten de herencia recesiva
ligada al X de tal forma que las madres portadoras de una mutacioacuten del gen
tendraacuten una posibilidad del 50 de tener hijos varones afectados y una
probabilidad del 50 de tener hijas portadoras Los pacientes que presentan
esta enfermedad tienen debilidad muscular progresiva lo cual conlleva a una
degeneracioacuten o atrofia completa del muacutesculo
10
El gen que produce la enfermedad de DMD y DMB se encuentra en el brazo
corto del cromosoma X en la banda Xp21 y codifica para la distrofina una
proteiacutena de 427 kD y 3685 aminoaacutecidos este gen es uno de los mas grandes
que se ha descrito hasta el momento La distrofina es una proteiacutena ubicada en la
membrana del sarcolema que interactuacutea con el complejo de sarcoglicanos y
distroglicanos ayudando en la contraccioacuten muscular al generar una interaccioacuten
entre el dominio intracelular y el complejo extracelular Las mutaciones en el
gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y mutaciones puntuales
de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a deleciones y
duplicaciones de uno o maacutes exones del gen mientras que el resto corresponde a
mutaciones puntuales e inserciones El 60 de los casos de DMDDMB se
presentan por mutaciones heredadas mientras que el 40 se deben a
mutaciones de novo durante la gametogenesis de la madre del afectado o del
abuelo por liacutenea materna
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de vida y muerte al finalizar
la segunda deacutecada
En Colombia se han realizado estudios previos por Silva et al en donde se han
analizado los 17 exones mas frecuentemente relacionados con DMBDMD en
estos se ha reportado una frecuencia de deleciones menor a la reportada en la
literatura mundial Por esta razoacuten en este trabajo se analizaron 15 exones
adicionales mediante PCR multiplex 11 de estos ubicados fuera de los 2 hot
spots mientras que los 4 restantes se ubican en los hot spots en 36 pacientes
con DMBDMD
11
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
NOTA DE ADVERTENCIA
Artiacuteculo 23 de la Resolucioacuten Ndeg 13 de Julio de 1946
ldquoLa Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis Solo velaraacute por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catoacutelica y por que las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna antes bien se vea en ellas el anhelo de
buscar la verdad y la justiciardquo
3
IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
APROBADO
------------------------------------- ----------------------------------- Claudia Silva Biol MSc Fernando Suaacuterez MD
DIRECTOR ASESOR
-------------------------------------- ----------------------------------- Dora Fonseca Biol MSc Juan Carlos Prieto MD MSc JURADO JURADO
4
IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
APROBADO
----------------------------------------- -----------------------------------------------
Aacutengela Umantildea Biol MPhill Carmen Cecilia Espiacutendola Biol MSc
DECANO ACADEMICO DIRECTOR DE CARRERA
AGRADECIMIENTOS
bull En primer lugar quiero dar las gracias a la Universidad Javeriana que me
abrioacute las puertas a la vida profesional por todo lo que he aprendido
5
durante estos maacutes de 5 antildeos por el apoyo y la aceptacioacuten de este
trabajo para obtener mi titulo profesional
bull La exitosa realizacioacuten de este estudio se dio gracias al apoyo de la
Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario tambieacuten en gran
parte a mis compantildeeros de laboratorio quienes compartieron ademaacutes de
su amistad el conocimiento y las habilidades que me permitieron lograr
correctamente los objetivos planteados Quiero dar un merecido
agradecimiento a Dora J Fonseca profesora de la materia de geneacutetica de
la Universidad del Rosario quien fue una persona fundamental quien
con su ayuda aprendiacute y adquiriacute los conocimientos y habilidades que
ahora manejo ademaacutes de todos los consejos que hicieron de mi un
mejor profesional Tambieacuten quiero agradecer por el tiempo la
dedicacioacuten y la confianza que tuvo en mi a la persona quien dirigioacute este
estudio Claudia T Silva tambieacuten profesora de la Unidad de Geneacutetica de
la Universidad del Rosario Al Instituto de Geneacutetica de la Universidad
Javeriana que sirvioacute de respaldo dentro de la facultad en la presentacioacuten
de este estudio a traveacutes de Fernando Suaacuterez quien muy gentilmente
acepto asesorar la realizacioacuten y presentacioacuten de este estudio a la
universidad
bull Un especial agradecimiento a todos mis compantildeeros de laboratorio en
especial a Nelson Rangel Milena Rondoacuten Paola Cruz Giovanni
Villalba y la persona que da lo mejor de si y ayuda a todos los
estudiantes en sus proyectos Lida Trivintildeo quien me ensentildeo a realizar la
teacutecnica de extraccioacuten de DNA y preparar los geles Por ultimo quiero
agradecer y desearle lo mejor a la directora del Instituto de Ciencias
Baacutesicas de la Universidad del Rosario Sandra Ramiacuterez a demaacutes de
aceptarme como un miembro maacutes del equipo del laboratorio
TABLA DE CONTENIDO
1 INTRODUCCIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
2 MARCO TEORICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
3 FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 18
6
31 Formulacioacuten del problema de investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphellip 18 32 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 18
4 OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 19
41 Objetivo Generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16 42 Objetivos Especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
5 MATERIALES Y METODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20
51 Disentildeo de la investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20 511 Poblacioacuten de estudio y muestrahelliphelliphelliphelliphellip 20
512 Variables del estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
52 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
521 Estandarizacioacuten de condicioneshelliphelliphellip 22
5211 Disentildeo de los sistemas multiplexhelliphellip 24
5212 Caracteriacutesticas molares de las soluciones 24
53 Recoleccioacuten de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26 54 Anaacutelisis de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
6 RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCRhelliphelliphellip 28
62 Anaacutelisis de delecioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
63 Anaacutelisis de comparacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
7 DISCUSIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 38
8 CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
9 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
10 REFERENCIAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 45
11 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 52
INDICE DE TABLAS
Tabla1 Condiciones y caracteriacutesticas de los primers utilizadoshelliphellip 23
Tabla 2 Organizacioacuten de los diferentes sistemashelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Tabla 3 Condiciones iniciales de la mezclas maestras de PCRhelliphellip 257
I
Tabla 4 Condiciones de corrido de PCRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4Chelliphellip 31
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4Bhelliphelliphellip 31
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3Bhelliphellip 32
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2Ahelliphelliphellip 33
Tabla 10 Comparacioacuten de la distribucioacuten de las delecioneshelliphelliphellip 41
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estandarizacioacuten de los primeros sistemas 5C y 3Bhelliphelliphellip 28
Figura 2 Secuencia del exon 65 (BLAST NCBI)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
Figura 3 Estandarizacioacuten inicial de los sistemas 4B y 4Chelliphelliphelliphellip 32
8
II
Figura 4 Resultados del sistema 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 5 Resultados del sistema 2Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 6 Resultados del sistema 3Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Figura 7 Resultados del sistema 4Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Figura 8 Resultados del sistema 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
Figura 9 Distribucioacuten de deleciones en el gen de la distrofina 42
RESUMEN
La distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB) es una enfermedad
muscular degenerativa causada por mutaciones en el gen de la distrofina el cual
se encuentra en el cromosoma X y presenta un patroacuten de herencia recesiva
ligada a este cromosoma Se analizaron deleciones de 15 exones del gen de la
distrofina en 36 pacientes afectados con diagnostico cliacutenico de distrofia
muscular de Duchenne o Becker 29 de los cuales con diagnostico cliacutenico de
Duchenne y 7 con diagnostico cliacutenico de Becker con el fin de analizar la
frecuencia de delecioacuten en una poblacioacuten colombiana afectada con distrofia 9
III
muscular El anaacutelisis de deleciones se realizo a traveacutes de PCR multiplex en 15
exones del gen de DMDDMB ubicados fuera de los puntos proclives a
mutaciones denominados hot spots reportados en la literatura mundial Solo en
un paciente de los 36 se encontroacute delecioacuten en un exon que corresponde al 27
de la poblacioacuten analizada en este estudio Asiacute mismo se establecioacute una
comparacioacuten con lo reportado para Colombia con respecto a lo descrito para
sitios fuera de los hot spots del gen de la distrofina en la literatura mundial Se
puede afirmar que la frecuencia de deleciones en el gen de la distrofina es muy
baja para Colombia con respecto a lo reportado para otras poblaciones y que
solo con el anaacutelisis de deleciones en los hot spots se puede hacer un correcto
diagnostico molecular para la DMDDMB
1 INTRODUCCIOacuteN
Las distrofias musculares (DM) tipo Duchenne y Becker son enfermedades de
caraacutecter hereditario ocasionadas por mutaciones presentes en un gen del
cromosoma X se caracterizan por presentar un patroacuten de herencia recesiva
ligada al X de tal forma que las madres portadoras de una mutacioacuten del gen
tendraacuten una posibilidad del 50 de tener hijos varones afectados y una
probabilidad del 50 de tener hijas portadoras Los pacientes que presentan
esta enfermedad tienen debilidad muscular progresiva lo cual conlleva a una
degeneracioacuten o atrofia completa del muacutesculo
10
El gen que produce la enfermedad de DMD y DMB se encuentra en el brazo
corto del cromosoma X en la banda Xp21 y codifica para la distrofina una
proteiacutena de 427 kD y 3685 aminoaacutecidos este gen es uno de los mas grandes
que se ha descrito hasta el momento La distrofina es una proteiacutena ubicada en la
membrana del sarcolema que interactuacutea con el complejo de sarcoglicanos y
distroglicanos ayudando en la contraccioacuten muscular al generar una interaccioacuten
entre el dominio intracelular y el complejo extracelular Las mutaciones en el
gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y mutaciones puntuales
de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a deleciones y
duplicaciones de uno o maacutes exones del gen mientras que el resto corresponde a
mutaciones puntuales e inserciones El 60 de los casos de DMDDMB se
presentan por mutaciones heredadas mientras que el 40 se deben a
mutaciones de novo durante la gametogenesis de la madre del afectado o del
abuelo por liacutenea materna
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de vida y muerte al finalizar
la segunda deacutecada
En Colombia se han realizado estudios previos por Silva et al en donde se han
analizado los 17 exones mas frecuentemente relacionados con DMBDMD en
estos se ha reportado una frecuencia de deleciones menor a la reportada en la
literatura mundial Por esta razoacuten en este trabajo se analizaron 15 exones
adicionales mediante PCR multiplex 11 de estos ubicados fuera de los 2 hot
spots mientras que los 4 restantes se ubican en los hot spots en 36 pacientes
con DMBDMD
11
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
APROBADO
------------------------------------- ----------------------------------- Claudia Silva Biol MSc Fernando Suaacuterez MD
DIRECTOR ASESOR
-------------------------------------- ----------------------------------- Dora Fonseca Biol MSc Juan Carlos Prieto MD MSc JURADO JURADO
4
IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
APROBADO
----------------------------------------- -----------------------------------------------
Aacutengela Umantildea Biol MPhill Carmen Cecilia Espiacutendola Biol MSc
DECANO ACADEMICO DIRECTOR DE CARRERA
AGRADECIMIENTOS
bull En primer lugar quiero dar las gracias a la Universidad Javeriana que me
abrioacute las puertas a la vida profesional por todo lo que he aprendido
5
durante estos maacutes de 5 antildeos por el apoyo y la aceptacioacuten de este
trabajo para obtener mi titulo profesional
bull La exitosa realizacioacuten de este estudio se dio gracias al apoyo de la
Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario tambieacuten en gran
parte a mis compantildeeros de laboratorio quienes compartieron ademaacutes de
su amistad el conocimiento y las habilidades que me permitieron lograr
correctamente los objetivos planteados Quiero dar un merecido
agradecimiento a Dora J Fonseca profesora de la materia de geneacutetica de
la Universidad del Rosario quien fue una persona fundamental quien
con su ayuda aprendiacute y adquiriacute los conocimientos y habilidades que
ahora manejo ademaacutes de todos los consejos que hicieron de mi un
mejor profesional Tambieacuten quiero agradecer por el tiempo la
dedicacioacuten y la confianza que tuvo en mi a la persona quien dirigioacute este
estudio Claudia T Silva tambieacuten profesora de la Unidad de Geneacutetica de
la Universidad del Rosario Al Instituto de Geneacutetica de la Universidad
Javeriana que sirvioacute de respaldo dentro de la facultad en la presentacioacuten
de este estudio a traveacutes de Fernando Suaacuterez quien muy gentilmente
acepto asesorar la realizacioacuten y presentacioacuten de este estudio a la
universidad
bull Un especial agradecimiento a todos mis compantildeeros de laboratorio en
especial a Nelson Rangel Milena Rondoacuten Paola Cruz Giovanni
Villalba y la persona que da lo mejor de si y ayuda a todos los
estudiantes en sus proyectos Lida Trivintildeo quien me ensentildeo a realizar la
teacutecnica de extraccioacuten de DNA y preparar los geles Por ultimo quiero
agradecer y desearle lo mejor a la directora del Instituto de Ciencias
Baacutesicas de la Universidad del Rosario Sandra Ramiacuterez a demaacutes de
aceptarme como un miembro maacutes del equipo del laboratorio
TABLA DE CONTENIDO
1 INTRODUCCIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
2 MARCO TEORICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
3 FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 18
6
31 Formulacioacuten del problema de investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphellip 18 32 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 18
4 OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 19
41 Objetivo Generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16 42 Objetivos Especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
5 MATERIALES Y METODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20
51 Disentildeo de la investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20 511 Poblacioacuten de estudio y muestrahelliphelliphelliphelliphellip 20
512 Variables del estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
52 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
521 Estandarizacioacuten de condicioneshelliphelliphellip 22
5211 Disentildeo de los sistemas multiplexhelliphellip 24
5212 Caracteriacutesticas molares de las soluciones 24
53 Recoleccioacuten de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26 54 Anaacutelisis de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
6 RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCRhelliphelliphellip 28
62 Anaacutelisis de delecioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
63 Anaacutelisis de comparacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
7 DISCUSIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 38
8 CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
9 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
10 REFERENCIAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 45
11 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 52
INDICE DE TABLAS
Tabla1 Condiciones y caracteriacutesticas de los primers utilizadoshelliphellip 23
Tabla 2 Organizacioacuten de los diferentes sistemashelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Tabla 3 Condiciones iniciales de la mezclas maestras de PCRhelliphellip 257
I
Tabla 4 Condiciones de corrido de PCRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4Chelliphellip 31
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4Bhelliphelliphellip 31
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3Bhelliphellip 32
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2Ahelliphelliphellip 33
Tabla 10 Comparacioacuten de la distribucioacuten de las delecioneshelliphelliphellip 41
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estandarizacioacuten de los primeros sistemas 5C y 3Bhelliphelliphellip 28
Figura 2 Secuencia del exon 65 (BLAST NCBI)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
Figura 3 Estandarizacioacuten inicial de los sistemas 4B y 4Chelliphelliphelliphellip 32
8
II
Figura 4 Resultados del sistema 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 5 Resultados del sistema 2Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 6 Resultados del sistema 3Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Figura 7 Resultados del sistema 4Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Figura 8 Resultados del sistema 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
Figura 9 Distribucioacuten de deleciones en el gen de la distrofina 42
RESUMEN
La distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB) es una enfermedad
muscular degenerativa causada por mutaciones en el gen de la distrofina el cual
se encuentra en el cromosoma X y presenta un patroacuten de herencia recesiva
ligada a este cromosoma Se analizaron deleciones de 15 exones del gen de la
distrofina en 36 pacientes afectados con diagnostico cliacutenico de distrofia
muscular de Duchenne o Becker 29 de los cuales con diagnostico cliacutenico de
Duchenne y 7 con diagnostico cliacutenico de Becker con el fin de analizar la
frecuencia de delecioacuten en una poblacioacuten colombiana afectada con distrofia 9
III
muscular El anaacutelisis de deleciones se realizo a traveacutes de PCR multiplex en 15
exones del gen de DMDDMB ubicados fuera de los puntos proclives a
mutaciones denominados hot spots reportados en la literatura mundial Solo en
un paciente de los 36 se encontroacute delecioacuten en un exon que corresponde al 27
de la poblacioacuten analizada en este estudio Asiacute mismo se establecioacute una
comparacioacuten con lo reportado para Colombia con respecto a lo descrito para
sitios fuera de los hot spots del gen de la distrofina en la literatura mundial Se
puede afirmar que la frecuencia de deleciones en el gen de la distrofina es muy
baja para Colombia con respecto a lo reportado para otras poblaciones y que
solo con el anaacutelisis de deleciones en los hot spots se puede hacer un correcto
diagnostico molecular para la DMDDMB
1 INTRODUCCIOacuteN
Las distrofias musculares (DM) tipo Duchenne y Becker son enfermedades de
caraacutecter hereditario ocasionadas por mutaciones presentes en un gen del
cromosoma X se caracterizan por presentar un patroacuten de herencia recesiva
ligada al X de tal forma que las madres portadoras de una mutacioacuten del gen
tendraacuten una posibilidad del 50 de tener hijos varones afectados y una
probabilidad del 50 de tener hijas portadoras Los pacientes que presentan
esta enfermedad tienen debilidad muscular progresiva lo cual conlleva a una
degeneracioacuten o atrofia completa del muacutesculo
10
El gen que produce la enfermedad de DMD y DMB se encuentra en el brazo
corto del cromosoma X en la banda Xp21 y codifica para la distrofina una
proteiacutena de 427 kD y 3685 aminoaacutecidos este gen es uno de los mas grandes
que se ha descrito hasta el momento La distrofina es una proteiacutena ubicada en la
membrana del sarcolema que interactuacutea con el complejo de sarcoglicanos y
distroglicanos ayudando en la contraccioacuten muscular al generar una interaccioacuten
entre el dominio intracelular y el complejo extracelular Las mutaciones en el
gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y mutaciones puntuales
de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a deleciones y
duplicaciones de uno o maacutes exones del gen mientras que el resto corresponde a
mutaciones puntuales e inserciones El 60 de los casos de DMDDMB se
presentan por mutaciones heredadas mientras que el 40 se deben a
mutaciones de novo durante la gametogenesis de la madre del afectado o del
abuelo por liacutenea materna
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de vida y muerte al finalizar
la segunda deacutecada
En Colombia se han realizado estudios previos por Silva et al en donde se han
analizado los 17 exones mas frecuentemente relacionados con DMBDMD en
estos se ha reportado una frecuencia de deleciones menor a la reportada en la
literatura mundial Por esta razoacuten en este trabajo se analizaron 15 exones
adicionales mediante PCR multiplex 11 de estos ubicados fuera de los 2 hot
spots mientras que los 4 restantes se ubican en los hot spots en 36 pacientes
con DMBDMD
11
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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Duchenne and Becker muscular dystrophy patients in Quebec Human
Genetics Vol 89 419-424
50 Singh V et al 1997 Proportion and Pattern of Dystrophin gene
deletions in North Indian Duchenne and Becker muscular dystrophy
patients Human Genetics Vol 99 206-208
51 Soong B-W et al 1991 DNA polymorphisms and deletion analysis of
the Duchenne-Becker muscular dystrophy gene in the Chinese
American Journal of Medical Genetics Vol 38 593-600
52 Shomrat R Gluck E Legum C Silo Y 1994 Relatively low proportion
of dystrophin gene deletions in Israeliacute Duchenne and Becker muscular
dystrophy patients American Journal of Medical Genetics Vol 4 369-
373
53 Tuffery S Demaille J Claustress 1992 A new intragenic
polymorphism detected by the single-strand conformation
polymorphism (SSCP) assay in the dystrophin gene Hum Mutat1221-
23
54 Werneck L et al 2001 Comparative analysis of PCR-deletion detection
and inmunohistochemestry in brazilian Duchenne and becker muscular
dystrophy patients Vol 103 115-120
52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
IDENTIFICACION DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA
DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE
DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
JAIME E SIMBAQUEBA GONZALEZ
APROBADO
----------------------------------------- -----------------------------------------------
Aacutengela Umantildea Biol MPhill Carmen Cecilia Espiacutendola Biol MSc
DECANO ACADEMICO DIRECTOR DE CARRERA
AGRADECIMIENTOS
bull En primer lugar quiero dar las gracias a la Universidad Javeriana que me
abrioacute las puertas a la vida profesional por todo lo que he aprendido
5
durante estos maacutes de 5 antildeos por el apoyo y la aceptacioacuten de este
trabajo para obtener mi titulo profesional
bull La exitosa realizacioacuten de este estudio se dio gracias al apoyo de la
Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario tambieacuten en gran
parte a mis compantildeeros de laboratorio quienes compartieron ademaacutes de
su amistad el conocimiento y las habilidades que me permitieron lograr
correctamente los objetivos planteados Quiero dar un merecido
agradecimiento a Dora J Fonseca profesora de la materia de geneacutetica de
la Universidad del Rosario quien fue una persona fundamental quien
con su ayuda aprendiacute y adquiriacute los conocimientos y habilidades que
ahora manejo ademaacutes de todos los consejos que hicieron de mi un
mejor profesional Tambieacuten quiero agradecer por el tiempo la
dedicacioacuten y la confianza que tuvo en mi a la persona quien dirigioacute este
estudio Claudia T Silva tambieacuten profesora de la Unidad de Geneacutetica de
la Universidad del Rosario Al Instituto de Geneacutetica de la Universidad
Javeriana que sirvioacute de respaldo dentro de la facultad en la presentacioacuten
de este estudio a traveacutes de Fernando Suaacuterez quien muy gentilmente
acepto asesorar la realizacioacuten y presentacioacuten de este estudio a la
universidad
bull Un especial agradecimiento a todos mis compantildeeros de laboratorio en
especial a Nelson Rangel Milena Rondoacuten Paola Cruz Giovanni
Villalba y la persona que da lo mejor de si y ayuda a todos los
estudiantes en sus proyectos Lida Trivintildeo quien me ensentildeo a realizar la
teacutecnica de extraccioacuten de DNA y preparar los geles Por ultimo quiero
agradecer y desearle lo mejor a la directora del Instituto de Ciencias
Baacutesicas de la Universidad del Rosario Sandra Ramiacuterez a demaacutes de
aceptarme como un miembro maacutes del equipo del laboratorio
TABLA DE CONTENIDO
1 INTRODUCCIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
2 MARCO TEORICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
3 FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 18
6
31 Formulacioacuten del problema de investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphellip 18 32 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 18
4 OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 19
41 Objetivo Generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16 42 Objetivos Especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
5 MATERIALES Y METODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20
51 Disentildeo de la investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20 511 Poblacioacuten de estudio y muestrahelliphelliphelliphelliphellip 20
512 Variables del estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
52 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
521 Estandarizacioacuten de condicioneshelliphelliphellip 22
5211 Disentildeo de los sistemas multiplexhelliphellip 24
5212 Caracteriacutesticas molares de las soluciones 24
53 Recoleccioacuten de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26 54 Anaacutelisis de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
6 RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCRhelliphelliphellip 28
62 Anaacutelisis de delecioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
63 Anaacutelisis de comparacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
7 DISCUSIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 38
8 CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
9 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
10 REFERENCIAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 45
11 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 52
INDICE DE TABLAS
Tabla1 Condiciones y caracteriacutesticas de los primers utilizadoshelliphellip 23
Tabla 2 Organizacioacuten de los diferentes sistemashelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Tabla 3 Condiciones iniciales de la mezclas maestras de PCRhelliphellip 257
I
Tabla 4 Condiciones de corrido de PCRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4Chelliphellip 31
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4Bhelliphelliphellip 31
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3Bhelliphellip 32
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2Ahelliphelliphellip 33
Tabla 10 Comparacioacuten de la distribucioacuten de las delecioneshelliphelliphellip 41
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estandarizacioacuten de los primeros sistemas 5C y 3Bhelliphelliphellip 28
Figura 2 Secuencia del exon 65 (BLAST NCBI)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
Figura 3 Estandarizacioacuten inicial de los sistemas 4B y 4Chelliphelliphelliphellip 32
8
II
Figura 4 Resultados del sistema 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 5 Resultados del sistema 2Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 6 Resultados del sistema 3Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Figura 7 Resultados del sistema 4Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Figura 8 Resultados del sistema 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
Figura 9 Distribucioacuten de deleciones en el gen de la distrofina 42
RESUMEN
La distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB) es una enfermedad
muscular degenerativa causada por mutaciones en el gen de la distrofina el cual
se encuentra en el cromosoma X y presenta un patroacuten de herencia recesiva
ligada a este cromosoma Se analizaron deleciones de 15 exones del gen de la
distrofina en 36 pacientes afectados con diagnostico cliacutenico de distrofia
muscular de Duchenne o Becker 29 de los cuales con diagnostico cliacutenico de
Duchenne y 7 con diagnostico cliacutenico de Becker con el fin de analizar la
frecuencia de delecioacuten en una poblacioacuten colombiana afectada con distrofia 9
III
muscular El anaacutelisis de deleciones se realizo a traveacutes de PCR multiplex en 15
exones del gen de DMDDMB ubicados fuera de los puntos proclives a
mutaciones denominados hot spots reportados en la literatura mundial Solo en
un paciente de los 36 se encontroacute delecioacuten en un exon que corresponde al 27
de la poblacioacuten analizada en este estudio Asiacute mismo se establecioacute una
comparacioacuten con lo reportado para Colombia con respecto a lo descrito para
sitios fuera de los hot spots del gen de la distrofina en la literatura mundial Se
puede afirmar que la frecuencia de deleciones en el gen de la distrofina es muy
baja para Colombia con respecto a lo reportado para otras poblaciones y que
solo con el anaacutelisis de deleciones en los hot spots se puede hacer un correcto
diagnostico molecular para la DMDDMB
1 INTRODUCCIOacuteN
Las distrofias musculares (DM) tipo Duchenne y Becker son enfermedades de
caraacutecter hereditario ocasionadas por mutaciones presentes en un gen del
cromosoma X se caracterizan por presentar un patroacuten de herencia recesiva
ligada al X de tal forma que las madres portadoras de una mutacioacuten del gen
tendraacuten una posibilidad del 50 de tener hijos varones afectados y una
probabilidad del 50 de tener hijas portadoras Los pacientes que presentan
esta enfermedad tienen debilidad muscular progresiva lo cual conlleva a una
degeneracioacuten o atrofia completa del muacutesculo
10
El gen que produce la enfermedad de DMD y DMB se encuentra en el brazo
corto del cromosoma X en la banda Xp21 y codifica para la distrofina una
proteiacutena de 427 kD y 3685 aminoaacutecidos este gen es uno de los mas grandes
que se ha descrito hasta el momento La distrofina es una proteiacutena ubicada en la
membrana del sarcolema que interactuacutea con el complejo de sarcoglicanos y
distroglicanos ayudando en la contraccioacuten muscular al generar una interaccioacuten
entre el dominio intracelular y el complejo extracelular Las mutaciones en el
gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y mutaciones puntuales
de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a deleciones y
duplicaciones de uno o maacutes exones del gen mientras que el resto corresponde a
mutaciones puntuales e inserciones El 60 de los casos de DMDDMB se
presentan por mutaciones heredadas mientras que el 40 se deben a
mutaciones de novo durante la gametogenesis de la madre del afectado o del
abuelo por liacutenea materna
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de vida y muerte al finalizar
la segunda deacutecada
En Colombia se han realizado estudios previos por Silva et al en donde se han
analizado los 17 exones mas frecuentemente relacionados con DMBDMD en
estos se ha reportado una frecuencia de deleciones menor a la reportada en la
literatura mundial Por esta razoacuten en este trabajo se analizaron 15 exones
adicionales mediante PCR multiplex 11 de estos ubicados fuera de los 2 hot
spots mientras que los 4 restantes se ubican en los hot spots en 36 pacientes
con DMBDMD
11
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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Duchenne muscular dystrophy patient Nat Genet Aug4(4)357-60
45 Ray P Vekemans M amp Munnich A 2001 Single cell multiplex PCR
amplification of five dystrophin gene exons combined with gender
determination Molecular Human Reproduction Vol 7 No 5 pp 489-
494
46 Roberts R 2001 Dystrophins and dystrobrevins Genome Biology
2(4) reviews 30061ndash30067
47 Sbiti A El KerchF amp Sefiani A 2002 Analysis of Dystrophin Gene
Deletions by Multiplex PCR in Moroccan Patients Journal of
Biomedicine and Biotechnology 23 158ndash160
48 Silva CT Fonseca D Restrepo C Contreras N Heidi E Mateus H
51
2004 Deleciones en el gen de la distrofina en 62 familias colombianas
correlacioacuten genotipofenotipo para la distrofia muscular de Duchenne y
Becker Colombia Meacutedica Vol 35 Nordm 4
49 Simard LR et al 1992 Deletions in the dystrophin gene Analysis of
Duchenne and Becker muscular dystrophy patients in Quebec Human
Genetics Vol 89 419-424
50 Singh V et al 1997 Proportion and Pattern of Dystrophin gene
deletions in North Indian Duchenne and Becker muscular dystrophy
patients Human Genetics Vol 99 206-208
51 Soong B-W et al 1991 DNA polymorphisms and deletion analysis of
the Duchenne-Becker muscular dystrophy gene in the Chinese
American Journal of Medical Genetics Vol 38 593-600
52 Shomrat R Gluck E Legum C Silo Y 1994 Relatively low proportion
of dystrophin gene deletions in Israeliacute Duchenne and Becker muscular
dystrophy patients American Journal of Medical Genetics Vol 4 369-
373
53 Tuffery S Demaille J Claustress 1992 A new intragenic
polymorphism detected by the single-strand conformation
polymorphism (SSCP) assay in the dystrophin gene Hum Mutat1221-
23
54 Werneck L et al 2001 Comparative analysis of PCR-deletion detection
and inmunohistochemestry in brazilian Duchenne and becker muscular
dystrophy patients Vol 103 115-120
52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
durante estos maacutes de 5 antildeos por el apoyo y la aceptacioacuten de este
trabajo para obtener mi titulo profesional
bull La exitosa realizacioacuten de este estudio se dio gracias al apoyo de la
Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario tambieacuten en gran
parte a mis compantildeeros de laboratorio quienes compartieron ademaacutes de
su amistad el conocimiento y las habilidades que me permitieron lograr
correctamente los objetivos planteados Quiero dar un merecido
agradecimiento a Dora J Fonseca profesora de la materia de geneacutetica de
la Universidad del Rosario quien fue una persona fundamental quien
con su ayuda aprendiacute y adquiriacute los conocimientos y habilidades que
ahora manejo ademaacutes de todos los consejos que hicieron de mi un
mejor profesional Tambieacuten quiero agradecer por el tiempo la
dedicacioacuten y la confianza que tuvo en mi a la persona quien dirigioacute este
estudio Claudia T Silva tambieacuten profesora de la Unidad de Geneacutetica de
la Universidad del Rosario Al Instituto de Geneacutetica de la Universidad
Javeriana que sirvioacute de respaldo dentro de la facultad en la presentacioacuten
de este estudio a traveacutes de Fernando Suaacuterez quien muy gentilmente
acepto asesorar la realizacioacuten y presentacioacuten de este estudio a la
universidad
bull Un especial agradecimiento a todos mis compantildeeros de laboratorio en
especial a Nelson Rangel Milena Rondoacuten Paola Cruz Giovanni
Villalba y la persona que da lo mejor de si y ayuda a todos los
estudiantes en sus proyectos Lida Trivintildeo quien me ensentildeo a realizar la
teacutecnica de extraccioacuten de DNA y preparar los geles Por ultimo quiero
agradecer y desearle lo mejor a la directora del Instituto de Ciencias
Baacutesicas de la Universidad del Rosario Sandra Ramiacuterez a demaacutes de
aceptarme como un miembro maacutes del equipo del laboratorio
TABLA DE CONTENIDO
1 INTRODUCCIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
2 MARCO TEORICOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 12
3 FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 18
6
31 Formulacioacuten del problema de investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphellip 18 32 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 18
4 OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 19
41 Objetivo Generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16 42 Objetivos Especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
5 MATERIALES Y METODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20
51 Disentildeo de la investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20 511 Poblacioacuten de estudio y muestrahelliphelliphelliphelliphellip 20
512 Variables del estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
52 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
521 Estandarizacioacuten de condicioneshelliphelliphellip 22
5211 Disentildeo de los sistemas multiplexhelliphellip 24
5212 Caracteriacutesticas molares de las soluciones 24
53 Recoleccioacuten de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26 54 Anaacutelisis de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
6 RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCRhelliphelliphellip 28
62 Anaacutelisis de delecioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
63 Anaacutelisis de comparacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
7 DISCUSIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 38
8 CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
9 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
10 REFERENCIAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 45
11 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 52
INDICE DE TABLAS
Tabla1 Condiciones y caracteriacutesticas de los primers utilizadoshelliphellip 23
Tabla 2 Organizacioacuten de los diferentes sistemashelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Tabla 3 Condiciones iniciales de la mezclas maestras de PCRhelliphellip 257
I
Tabla 4 Condiciones de corrido de PCRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4Chelliphellip 31
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4Bhelliphelliphellip 31
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3Bhelliphellip 32
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2Ahelliphelliphellip 33
Tabla 10 Comparacioacuten de la distribucioacuten de las delecioneshelliphelliphellip 41
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estandarizacioacuten de los primeros sistemas 5C y 3Bhelliphelliphellip 28
Figura 2 Secuencia del exon 65 (BLAST NCBI)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
Figura 3 Estandarizacioacuten inicial de los sistemas 4B y 4Chelliphelliphelliphellip 32
8
II
Figura 4 Resultados del sistema 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 5 Resultados del sistema 2Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 6 Resultados del sistema 3Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Figura 7 Resultados del sistema 4Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Figura 8 Resultados del sistema 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
Figura 9 Distribucioacuten de deleciones en el gen de la distrofina 42
RESUMEN
La distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB) es una enfermedad
muscular degenerativa causada por mutaciones en el gen de la distrofina el cual
se encuentra en el cromosoma X y presenta un patroacuten de herencia recesiva
ligada a este cromosoma Se analizaron deleciones de 15 exones del gen de la
distrofina en 36 pacientes afectados con diagnostico cliacutenico de distrofia
muscular de Duchenne o Becker 29 de los cuales con diagnostico cliacutenico de
Duchenne y 7 con diagnostico cliacutenico de Becker con el fin de analizar la
frecuencia de delecioacuten en una poblacioacuten colombiana afectada con distrofia 9
III
muscular El anaacutelisis de deleciones se realizo a traveacutes de PCR multiplex en 15
exones del gen de DMDDMB ubicados fuera de los puntos proclives a
mutaciones denominados hot spots reportados en la literatura mundial Solo en
un paciente de los 36 se encontroacute delecioacuten en un exon que corresponde al 27
de la poblacioacuten analizada en este estudio Asiacute mismo se establecioacute una
comparacioacuten con lo reportado para Colombia con respecto a lo descrito para
sitios fuera de los hot spots del gen de la distrofina en la literatura mundial Se
puede afirmar que la frecuencia de deleciones en el gen de la distrofina es muy
baja para Colombia con respecto a lo reportado para otras poblaciones y que
solo con el anaacutelisis de deleciones en los hot spots se puede hacer un correcto
diagnostico molecular para la DMDDMB
1 INTRODUCCIOacuteN
Las distrofias musculares (DM) tipo Duchenne y Becker son enfermedades de
caraacutecter hereditario ocasionadas por mutaciones presentes en un gen del
cromosoma X se caracterizan por presentar un patroacuten de herencia recesiva
ligada al X de tal forma que las madres portadoras de una mutacioacuten del gen
tendraacuten una posibilidad del 50 de tener hijos varones afectados y una
probabilidad del 50 de tener hijas portadoras Los pacientes que presentan
esta enfermedad tienen debilidad muscular progresiva lo cual conlleva a una
degeneracioacuten o atrofia completa del muacutesculo
10
El gen que produce la enfermedad de DMD y DMB se encuentra en el brazo
corto del cromosoma X en la banda Xp21 y codifica para la distrofina una
proteiacutena de 427 kD y 3685 aminoaacutecidos este gen es uno de los mas grandes
que se ha descrito hasta el momento La distrofina es una proteiacutena ubicada en la
membrana del sarcolema que interactuacutea con el complejo de sarcoglicanos y
distroglicanos ayudando en la contraccioacuten muscular al generar una interaccioacuten
entre el dominio intracelular y el complejo extracelular Las mutaciones en el
gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y mutaciones puntuales
de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a deleciones y
duplicaciones de uno o maacutes exones del gen mientras que el resto corresponde a
mutaciones puntuales e inserciones El 60 de los casos de DMDDMB se
presentan por mutaciones heredadas mientras que el 40 se deben a
mutaciones de novo durante la gametogenesis de la madre del afectado o del
abuelo por liacutenea materna
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de vida y muerte al finalizar
la segunda deacutecada
En Colombia se han realizado estudios previos por Silva et al en donde se han
analizado los 17 exones mas frecuentemente relacionados con DMBDMD en
estos se ha reportado una frecuencia de deleciones menor a la reportada en la
literatura mundial Por esta razoacuten en este trabajo se analizaron 15 exones
adicionales mediante PCR multiplex 11 de estos ubicados fuera de los 2 hot
spots mientras que los 4 restantes se ubican en los hot spots en 36 pacientes
con DMBDMD
11
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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detection and familial diagnosis American Journal of Medical
genetics Vol 59 182-187
43 Prieto J C amp Keyeux G 1997 Distrofia muscular de Duchenne y
Becker Aspectos Cliacutenicos Geneacuteticos y Diagnoacutesticos Universitas
Meacutedica Vol 38 No 2 pp 44-55
44 Prior TW et al 1993 A missense mutation in the dystrophin gene in a
Duchenne muscular dystrophy patient Nat Genet Aug4(4)357-60
45 Ray P Vekemans M amp Munnich A 2001 Single cell multiplex PCR
amplification of five dystrophin gene exons combined with gender
determination Molecular Human Reproduction Vol 7 No 5 pp 489-
494
46 Roberts R 2001 Dystrophins and dystrobrevins Genome Biology
2(4) reviews 30061ndash30067
47 Sbiti A El KerchF amp Sefiani A 2002 Analysis of Dystrophin Gene
Deletions by Multiplex PCR in Moroccan Patients Journal of
Biomedicine and Biotechnology 23 158ndash160
48 Silva CT Fonseca D Restrepo C Contreras N Heidi E Mateus H
51
2004 Deleciones en el gen de la distrofina en 62 familias colombianas
correlacioacuten genotipofenotipo para la distrofia muscular de Duchenne y
Becker Colombia Meacutedica Vol 35 Nordm 4
49 Simard LR et al 1992 Deletions in the dystrophin gene Analysis of
Duchenne and Becker muscular dystrophy patients in Quebec Human
Genetics Vol 89 419-424
50 Singh V et al 1997 Proportion and Pattern of Dystrophin gene
deletions in North Indian Duchenne and Becker muscular dystrophy
patients Human Genetics Vol 99 206-208
51 Soong B-W et al 1991 DNA polymorphisms and deletion analysis of
the Duchenne-Becker muscular dystrophy gene in the Chinese
American Journal of Medical Genetics Vol 38 593-600
52 Shomrat R Gluck E Legum C Silo Y 1994 Relatively low proportion
of dystrophin gene deletions in Israeliacute Duchenne and Becker muscular
dystrophy patients American Journal of Medical Genetics Vol 4 369-
373
53 Tuffery S Demaille J Claustress 1992 A new intragenic
polymorphism detected by the single-strand conformation
polymorphism (SSCP) assay in the dystrophin gene Hum Mutat1221-
23
54 Werneck L et al 2001 Comparative analysis of PCR-deletion detection
and inmunohistochemestry in brazilian Duchenne and becker muscular
dystrophy patients Vol 103 115-120
52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
31 Formulacioacuten del problema de investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphellip 18 32 Justificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 18
4 OBJETIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 19
41 Objetivo Generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16 42 Objetivos Especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 16
5 MATERIALES Y METODOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20
51 Disentildeo de la investigacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 20 511 Poblacioacuten de estudio y muestrahelliphelliphelliphelliphellip 20
512 Variables del estudiohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
52 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
521 Estandarizacioacuten de condicioneshelliphelliphellip 22
5211 Disentildeo de los sistemas multiplexhelliphellip 24
5212 Caracteriacutesticas molares de las soluciones 24
53 Recoleccioacuten de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 26 54 Anaacutelisis de la informacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
6 RESULTADOS helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCRhelliphelliphellip 28
62 Anaacutelisis de delecioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 33
63 Anaacutelisis de comparacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
7 DISCUSIONhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 38
8 CONCLUSIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
9 RECOMENDACIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
10 REFERENCIAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 45
11 ANEXOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 52
INDICE DE TABLAS
Tabla1 Condiciones y caracteriacutesticas de los primers utilizadoshelliphellip 23
Tabla 2 Organizacioacuten de los diferentes sistemashelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
Tabla 3 Condiciones iniciales de la mezclas maestras de PCRhelliphellip 257
I
Tabla 4 Condiciones de corrido de PCRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4Chelliphellip 31
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4Bhelliphelliphellip 31
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3Bhelliphellip 32
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2Ahelliphelliphellip 33
Tabla 10 Comparacioacuten de la distribucioacuten de las delecioneshelliphelliphellip 41
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estandarizacioacuten de los primeros sistemas 5C y 3Bhelliphelliphellip 28
Figura 2 Secuencia del exon 65 (BLAST NCBI)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
Figura 3 Estandarizacioacuten inicial de los sistemas 4B y 4Chelliphelliphelliphellip 32
8
II
Figura 4 Resultados del sistema 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 5 Resultados del sistema 2Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 6 Resultados del sistema 3Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Figura 7 Resultados del sistema 4Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Figura 8 Resultados del sistema 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
Figura 9 Distribucioacuten de deleciones en el gen de la distrofina 42
RESUMEN
La distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB) es una enfermedad
muscular degenerativa causada por mutaciones en el gen de la distrofina el cual
se encuentra en el cromosoma X y presenta un patroacuten de herencia recesiva
ligada a este cromosoma Se analizaron deleciones de 15 exones del gen de la
distrofina en 36 pacientes afectados con diagnostico cliacutenico de distrofia
muscular de Duchenne o Becker 29 de los cuales con diagnostico cliacutenico de
Duchenne y 7 con diagnostico cliacutenico de Becker con el fin de analizar la
frecuencia de delecioacuten en una poblacioacuten colombiana afectada con distrofia 9
III
muscular El anaacutelisis de deleciones se realizo a traveacutes de PCR multiplex en 15
exones del gen de DMDDMB ubicados fuera de los puntos proclives a
mutaciones denominados hot spots reportados en la literatura mundial Solo en
un paciente de los 36 se encontroacute delecioacuten en un exon que corresponde al 27
de la poblacioacuten analizada en este estudio Asiacute mismo se establecioacute una
comparacioacuten con lo reportado para Colombia con respecto a lo descrito para
sitios fuera de los hot spots del gen de la distrofina en la literatura mundial Se
puede afirmar que la frecuencia de deleciones en el gen de la distrofina es muy
baja para Colombia con respecto a lo reportado para otras poblaciones y que
solo con el anaacutelisis de deleciones en los hot spots se puede hacer un correcto
diagnostico molecular para la DMDDMB
1 INTRODUCCIOacuteN
Las distrofias musculares (DM) tipo Duchenne y Becker son enfermedades de
caraacutecter hereditario ocasionadas por mutaciones presentes en un gen del
cromosoma X se caracterizan por presentar un patroacuten de herencia recesiva
ligada al X de tal forma que las madres portadoras de una mutacioacuten del gen
tendraacuten una posibilidad del 50 de tener hijos varones afectados y una
probabilidad del 50 de tener hijas portadoras Los pacientes que presentan
esta enfermedad tienen debilidad muscular progresiva lo cual conlleva a una
degeneracioacuten o atrofia completa del muacutesculo
10
El gen que produce la enfermedad de DMD y DMB se encuentra en el brazo
corto del cromosoma X en la banda Xp21 y codifica para la distrofina una
proteiacutena de 427 kD y 3685 aminoaacutecidos este gen es uno de los mas grandes
que se ha descrito hasta el momento La distrofina es una proteiacutena ubicada en la
membrana del sarcolema que interactuacutea con el complejo de sarcoglicanos y
distroglicanos ayudando en la contraccioacuten muscular al generar una interaccioacuten
entre el dominio intracelular y el complejo extracelular Las mutaciones en el
gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y mutaciones puntuales
de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a deleciones y
duplicaciones de uno o maacutes exones del gen mientras que el resto corresponde a
mutaciones puntuales e inserciones El 60 de los casos de DMDDMB se
presentan por mutaciones heredadas mientras que el 40 se deben a
mutaciones de novo durante la gametogenesis de la madre del afectado o del
abuelo por liacutenea materna
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de vida y muerte al finalizar
la segunda deacutecada
En Colombia se han realizado estudios previos por Silva et al en donde se han
analizado los 17 exones mas frecuentemente relacionados con DMBDMD en
estos se ha reportado una frecuencia de deleciones menor a la reportada en la
literatura mundial Por esta razoacuten en este trabajo se analizaron 15 exones
adicionales mediante PCR multiplex 11 de estos ubicados fuera de los 2 hot
spots mientras que los 4 restantes se ubican en los hot spots en 36 pacientes
con DMBDMD
11
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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Duchenne and Becker muscular dystrophy patients in Quebec Human
Genetics Vol 89 419-424
50 Singh V et al 1997 Proportion and Pattern of Dystrophin gene
deletions in North Indian Duchenne and Becker muscular dystrophy
patients Human Genetics Vol 99 206-208
51 Soong B-W et al 1991 DNA polymorphisms and deletion analysis of
the Duchenne-Becker muscular dystrophy gene in the Chinese
American Journal of Medical Genetics Vol 38 593-600
52 Shomrat R Gluck E Legum C Silo Y 1994 Relatively low proportion
of dystrophin gene deletions in Israeliacute Duchenne and Becker muscular
dystrophy patients American Journal of Medical Genetics Vol 4 369-
373
53 Tuffery S Demaille J Claustress 1992 A new intragenic
polymorphism detected by the single-strand conformation
polymorphism (SSCP) assay in the dystrophin gene Hum Mutat1221-
23
54 Werneck L et al 2001 Comparative analysis of PCR-deletion detection
and inmunohistochemestry in brazilian Duchenne and becker muscular
dystrophy patients Vol 103 115-120
52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
Tabla 4 Condiciones de corrido de PCRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 25
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 30
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4Chelliphellip 31
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4Bhelliphelliphellip 31
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3Bhelliphellip 32
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2Ahelliphelliphellip 33
Tabla 10 Comparacioacuten de la distribucioacuten de las delecioneshelliphelliphellip 41
INDICE DE FIGURAS
Figura 1 Estandarizacioacuten de los primeros sistemas 5C y 3Bhelliphelliphellip 28
Figura 2 Secuencia del exon 65 (BLAST NCBI)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
Figura 3 Estandarizacioacuten inicial de los sistemas 4B y 4Chelliphelliphelliphellip 32
8
II
Figura 4 Resultados del sistema 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 5 Resultados del sistema 2Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 6 Resultados del sistema 3Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Figura 7 Resultados del sistema 4Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Figura 8 Resultados del sistema 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
Figura 9 Distribucioacuten de deleciones en el gen de la distrofina 42
RESUMEN
La distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB) es una enfermedad
muscular degenerativa causada por mutaciones en el gen de la distrofina el cual
se encuentra en el cromosoma X y presenta un patroacuten de herencia recesiva
ligada a este cromosoma Se analizaron deleciones de 15 exones del gen de la
distrofina en 36 pacientes afectados con diagnostico cliacutenico de distrofia
muscular de Duchenne o Becker 29 de los cuales con diagnostico cliacutenico de
Duchenne y 7 con diagnostico cliacutenico de Becker con el fin de analizar la
frecuencia de delecioacuten en una poblacioacuten colombiana afectada con distrofia 9
III
muscular El anaacutelisis de deleciones se realizo a traveacutes de PCR multiplex en 15
exones del gen de DMDDMB ubicados fuera de los puntos proclives a
mutaciones denominados hot spots reportados en la literatura mundial Solo en
un paciente de los 36 se encontroacute delecioacuten en un exon que corresponde al 27
de la poblacioacuten analizada en este estudio Asiacute mismo se establecioacute una
comparacioacuten con lo reportado para Colombia con respecto a lo descrito para
sitios fuera de los hot spots del gen de la distrofina en la literatura mundial Se
puede afirmar que la frecuencia de deleciones en el gen de la distrofina es muy
baja para Colombia con respecto a lo reportado para otras poblaciones y que
solo con el anaacutelisis de deleciones en los hot spots se puede hacer un correcto
diagnostico molecular para la DMDDMB
1 INTRODUCCIOacuteN
Las distrofias musculares (DM) tipo Duchenne y Becker son enfermedades de
caraacutecter hereditario ocasionadas por mutaciones presentes en un gen del
cromosoma X se caracterizan por presentar un patroacuten de herencia recesiva
ligada al X de tal forma que las madres portadoras de una mutacioacuten del gen
tendraacuten una posibilidad del 50 de tener hijos varones afectados y una
probabilidad del 50 de tener hijas portadoras Los pacientes que presentan
esta enfermedad tienen debilidad muscular progresiva lo cual conlleva a una
degeneracioacuten o atrofia completa del muacutesculo
10
El gen que produce la enfermedad de DMD y DMB se encuentra en el brazo
corto del cromosoma X en la banda Xp21 y codifica para la distrofina una
proteiacutena de 427 kD y 3685 aminoaacutecidos este gen es uno de los mas grandes
que se ha descrito hasta el momento La distrofina es una proteiacutena ubicada en la
membrana del sarcolema que interactuacutea con el complejo de sarcoglicanos y
distroglicanos ayudando en la contraccioacuten muscular al generar una interaccioacuten
entre el dominio intracelular y el complejo extracelular Las mutaciones en el
gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y mutaciones puntuales
de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a deleciones y
duplicaciones de uno o maacutes exones del gen mientras que el resto corresponde a
mutaciones puntuales e inserciones El 60 de los casos de DMDDMB se
presentan por mutaciones heredadas mientras que el 40 se deben a
mutaciones de novo durante la gametogenesis de la madre del afectado o del
abuelo por liacutenea materna
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de vida y muerte al finalizar
la segunda deacutecada
En Colombia se han realizado estudios previos por Silva et al en donde se han
analizado los 17 exones mas frecuentemente relacionados con DMBDMD en
estos se ha reportado una frecuencia de deleciones menor a la reportada en la
literatura mundial Por esta razoacuten en este trabajo se analizaron 15 exones
adicionales mediante PCR multiplex 11 de estos ubicados fuera de los 2 hot
spots mientras que los 4 restantes se ubican en los hot spots en 36 pacientes
con DMBDMD
11
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
Figura 4 Resultados del sistema 2helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 5 Resultados del sistema 2Ahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
Figura 6 Resultados del sistema 3Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 35
Figura 7 Resultados del sistema 4Bhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 36
Figura 8 Resultados del sistema 4Chelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
Figura 9 Distribucioacuten de deleciones en el gen de la distrofina 42
RESUMEN
La distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB) es una enfermedad
muscular degenerativa causada por mutaciones en el gen de la distrofina el cual
se encuentra en el cromosoma X y presenta un patroacuten de herencia recesiva
ligada a este cromosoma Se analizaron deleciones de 15 exones del gen de la
distrofina en 36 pacientes afectados con diagnostico cliacutenico de distrofia
muscular de Duchenne o Becker 29 de los cuales con diagnostico cliacutenico de
Duchenne y 7 con diagnostico cliacutenico de Becker con el fin de analizar la
frecuencia de delecioacuten en una poblacioacuten colombiana afectada con distrofia 9
III
muscular El anaacutelisis de deleciones se realizo a traveacutes de PCR multiplex en 15
exones del gen de DMDDMB ubicados fuera de los puntos proclives a
mutaciones denominados hot spots reportados en la literatura mundial Solo en
un paciente de los 36 se encontroacute delecioacuten en un exon que corresponde al 27
de la poblacioacuten analizada en este estudio Asiacute mismo se establecioacute una
comparacioacuten con lo reportado para Colombia con respecto a lo descrito para
sitios fuera de los hot spots del gen de la distrofina en la literatura mundial Se
puede afirmar que la frecuencia de deleciones en el gen de la distrofina es muy
baja para Colombia con respecto a lo reportado para otras poblaciones y que
solo con el anaacutelisis de deleciones en los hot spots se puede hacer un correcto
diagnostico molecular para la DMDDMB
1 INTRODUCCIOacuteN
Las distrofias musculares (DM) tipo Duchenne y Becker son enfermedades de
caraacutecter hereditario ocasionadas por mutaciones presentes en un gen del
cromosoma X se caracterizan por presentar un patroacuten de herencia recesiva
ligada al X de tal forma que las madres portadoras de una mutacioacuten del gen
tendraacuten una posibilidad del 50 de tener hijos varones afectados y una
probabilidad del 50 de tener hijas portadoras Los pacientes que presentan
esta enfermedad tienen debilidad muscular progresiva lo cual conlleva a una
degeneracioacuten o atrofia completa del muacutesculo
10
El gen que produce la enfermedad de DMD y DMB se encuentra en el brazo
corto del cromosoma X en la banda Xp21 y codifica para la distrofina una
proteiacutena de 427 kD y 3685 aminoaacutecidos este gen es uno de los mas grandes
que se ha descrito hasta el momento La distrofina es una proteiacutena ubicada en la
membrana del sarcolema que interactuacutea con el complejo de sarcoglicanos y
distroglicanos ayudando en la contraccioacuten muscular al generar una interaccioacuten
entre el dominio intracelular y el complejo extracelular Las mutaciones en el
gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y mutaciones puntuales
de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a deleciones y
duplicaciones de uno o maacutes exones del gen mientras que el resto corresponde a
mutaciones puntuales e inserciones El 60 de los casos de DMDDMB se
presentan por mutaciones heredadas mientras que el 40 se deben a
mutaciones de novo durante la gametogenesis de la madre del afectado o del
abuelo por liacutenea materna
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de vida y muerte al finalizar
la segunda deacutecada
En Colombia se han realizado estudios previos por Silva et al en donde se han
analizado los 17 exones mas frecuentemente relacionados con DMBDMD en
estos se ha reportado una frecuencia de deleciones menor a la reportada en la
literatura mundial Por esta razoacuten en este trabajo se analizaron 15 exones
adicionales mediante PCR multiplex 11 de estos ubicados fuera de los 2 hot
spots mientras que los 4 restantes se ubican en los hot spots en 36 pacientes
con DMBDMD
11
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
muscular El anaacutelisis de deleciones se realizo a traveacutes de PCR multiplex en 15
exones del gen de DMDDMB ubicados fuera de los puntos proclives a
mutaciones denominados hot spots reportados en la literatura mundial Solo en
un paciente de los 36 se encontroacute delecioacuten en un exon que corresponde al 27
de la poblacioacuten analizada en este estudio Asiacute mismo se establecioacute una
comparacioacuten con lo reportado para Colombia con respecto a lo descrito para
sitios fuera de los hot spots del gen de la distrofina en la literatura mundial Se
puede afirmar que la frecuencia de deleciones en el gen de la distrofina es muy
baja para Colombia con respecto a lo reportado para otras poblaciones y que
solo con el anaacutelisis de deleciones en los hot spots se puede hacer un correcto
diagnostico molecular para la DMDDMB
1 INTRODUCCIOacuteN
Las distrofias musculares (DM) tipo Duchenne y Becker son enfermedades de
caraacutecter hereditario ocasionadas por mutaciones presentes en un gen del
cromosoma X se caracterizan por presentar un patroacuten de herencia recesiva
ligada al X de tal forma que las madres portadoras de una mutacioacuten del gen
tendraacuten una posibilidad del 50 de tener hijos varones afectados y una
probabilidad del 50 de tener hijas portadoras Los pacientes que presentan
esta enfermedad tienen debilidad muscular progresiva lo cual conlleva a una
degeneracioacuten o atrofia completa del muacutesculo
10
El gen que produce la enfermedad de DMD y DMB se encuentra en el brazo
corto del cromosoma X en la banda Xp21 y codifica para la distrofina una
proteiacutena de 427 kD y 3685 aminoaacutecidos este gen es uno de los mas grandes
que se ha descrito hasta el momento La distrofina es una proteiacutena ubicada en la
membrana del sarcolema que interactuacutea con el complejo de sarcoglicanos y
distroglicanos ayudando en la contraccioacuten muscular al generar una interaccioacuten
entre el dominio intracelular y el complejo extracelular Las mutaciones en el
gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y mutaciones puntuales
de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a deleciones y
duplicaciones de uno o maacutes exones del gen mientras que el resto corresponde a
mutaciones puntuales e inserciones El 60 de los casos de DMDDMB se
presentan por mutaciones heredadas mientras que el 40 se deben a
mutaciones de novo durante la gametogenesis de la madre del afectado o del
abuelo por liacutenea materna
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de vida y muerte al finalizar
la segunda deacutecada
En Colombia se han realizado estudios previos por Silva et al en donde se han
analizado los 17 exones mas frecuentemente relacionados con DMBDMD en
estos se ha reportado una frecuencia de deleciones menor a la reportada en la
literatura mundial Por esta razoacuten en este trabajo se analizaron 15 exones
adicionales mediante PCR multiplex 11 de estos ubicados fuera de los 2 hot
spots mientras que los 4 restantes se ubican en los hot spots en 36 pacientes
con DMBDMD
11
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
12 REFERENCIAS
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23
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
El gen que produce la enfermedad de DMD y DMB se encuentra en el brazo
corto del cromosoma X en la banda Xp21 y codifica para la distrofina una
proteiacutena de 427 kD y 3685 aminoaacutecidos este gen es uno de los mas grandes
que se ha descrito hasta el momento La distrofina es una proteiacutena ubicada en la
membrana del sarcolema que interactuacutea con el complejo de sarcoglicanos y
distroglicanos ayudando en la contraccioacuten muscular al generar una interaccioacuten
entre el dominio intracelular y el complejo extracelular Las mutaciones en el
gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y mutaciones puntuales
de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a deleciones y
duplicaciones de uno o maacutes exones del gen mientras que el resto corresponde a
mutaciones puntuales e inserciones El 60 de los casos de DMDDMB se
presentan por mutaciones heredadas mientras que el 40 se deben a
mutaciones de novo durante la gametogenesis de la madre del afectado o del
abuelo por liacutenea materna
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de vida y muerte al finalizar
la segunda deacutecada
En Colombia se han realizado estudios previos por Silva et al en donde se han
analizado los 17 exones mas frecuentemente relacionados con DMBDMD en
estos se ha reportado una frecuencia de deleciones menor a la reportada en la
literatura mundial Por esta razoacuten en este trabajo se analizaron 15 exones
adicionales mediante PCR multiplex 11 de estos ubicados fuera de los 2 hot
spots mientras que los 4 restantes se ubican en los hot spots en 36 pacientes
con DMBDMD
11
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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12 Campbell KP 1995 Three muscular dystrophies loss of
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13 Clemens PR et al 1992 Premature chain termination mutation
causing Duchenne muscular dystrophy Neurology Sep42(9)1775-
82
14 Chamberlain JS Gibbs RA Ranier JE et al 1988 Deletion
screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex
DNA amplification Nucleic Acids Res 16 11141-11157
15 Chamberlain JS Et al 1990 Multiplex PCR for the diagnosis of
Duchenne Muscular Dystrophy PCR Protocols A Guide to
Methods and Applications 272-281p
47
16 Chaturvedi LS Mukherjee M Srivastava S Mittal R amp Mittal B
2001 Point mutation and polymorphism in DuchenneBecker
Muscular Dystrophy (DBMD) patients Experimental and
Molecular Medicine Vol 33 No 4 251- 256
17 Danieli GA Barbujani G 1984 Duchenne muscular dystrophy
Frequency of sporadic cases Hum Genet67(3)252-6
18 Emery AEH amp Skinner R 1976 Clinical studies in bening (Becker
type) X- linked muscular dystrophy Clin Genet 10189-201
19 Forrest SM et al 1987 Preferential deletion of exons in Duchenne
and Becker muscular dystrophies Nature 329 638-639
20 Flanigan KM von Niederhausern A Dunn DM Alder J Mendell
JR Weiss RB Rapid direct sequence analysis of the dystrophin
gene Am J Hum Genet 2003 Apr72(4)931-9 Epub 2003 Mar 11
21 Florentin L Mavrou A Kekou K amp Metaxotou C 1994 Deletion
patterns of Duchenne and Becker muscular dystrophies in Greece
Journal of medical Genetics Vol 32 48-51
22 Gallati S et al 1989 Molecular deletion patterns in Duchenne and
Becker type muscular dystrophy Human genetics Vol 81 343-
348
23 Gokgoz N et al 1993 Screening of deletions and RFLP analysis in
Turkish DMDDMB families by PCR Clinical Genetics Vol 43
261-266
48
24 Gustincich S Manfioletti G Del Sal G et al 1991 A fast method for
high-quality genomic DNA extraction from whole human blood
Biotechniques 18 298-300 302
25 Haider MZ Bastaki L Habib Y Moosa A 1997 Screnning 25
Dystrophin gene exons for deletions in Arab children with Duchenne
muscular dystrophy Human Heredity Vol 48 61-66
26 HenryMD amp CampbellKP 1996 Dystroglican an extracellular matrix
receptor linked to the cytoskeleton Curr Opin Cell Biol 8625-631
27 Hiraishi Y Kato S Ishihara T amp Takano T 1992 Quantitative Southern
blot Analysis in the dystrophin gene of Japanise patients with Duchenne
or Becker muscular dystrophy a high frequency of duplications Journal
of Medical Genetics Vol 29897-901
28 Hoffman EP et al 1987 Dystrophin the protein product of the
Duchenne muscular dystrophy locus Cell 51919-928
29 Ibraghimov-Beskrovnaya O et al 1992 Primary structure of
dystrophin-associated glycoproteins linking dystrophin to the
extracellular matriz Nature 335696-702
30 Kiliman MW Pizzuti A Grompe M Caskey CT 1992 Point mutations
and polymorphisms in the human dystrophin gene identified in genomic
DNA sequences amplified by m-PCRHum Genet89253-58
31 Koening M et al 1987 Complete cloning of the Duchenne muscular
dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the
DMD gene in mause and affected individuals Cell50509-517
49
32 Koening M et al 1988 The complete sequence of dystrophin predicts a
rod-shaped cytoskeletal protein Cell 53219-228
33 Kumari D Mital A Gupta M Goyle S 2003 Deletion analysis of the
dystrophin gene in Duchenne and Becker muscular dystrophy patients
Use in carrier diagnosis Neurol India 51223-226
34 Kunkel LM Snyder JR Beggs AH Boyce FM and Feener CA
(1991) Searching for dystrophin gene deletions in patients with atypical
presentations In Etiology of human diseases at the DNA level (J
Lindsten and U Petterson Eds) New York Raven Press pp 51-60
35 Lenk U Hanke R and Speer A (1994) Carrier detection in DMD
families with point mutations using PCR-SSCP and direct sequencing
Neuromusc Disord 4411-418
37 Medori R et al 1989 Genetic abnormalities in Duchenne an Becker
dystrophies cilinical correlations Neurology 39 461-465
38 Monaco AP et al 1989 Dystrophin the protein product of the
DuchenneBecker muscular dystrophy gene Trends in BiochemSci14
412- 415
39 Niemann S et al 1992 Molecular genetic analysis of 67 patients with
DuchenneBecker muscular dystrophy Human Genetics Vol90 65-70
40 Ohlendieck K 1995 Towards an understanding of the dystrophin-
glycoprotein complex linkage between the extracellular matrix and the
membrane cytoskeleton in muscule fibers European journal of cell
biology 69 1-1
50
41 Onengut S et al Deletion pattern in the dystrophin gene in Turks and a
comparison with Europeans and Indians 2000 Annals of Human
Genetics Vol 64 33-40
42 Patintildeo A Narbona J amp Garcia M 1995 Molecular analysis of the
Duchenne muscular dystrophy gene in Spain individuals Deletion
detection and familial diagnosis American Journal of Medical
genetics Vol 59 182-187
43 Prieto J C amp Keyeux G 1997 Distrofia muscular de Duchenne y
Becker Aspectos Cliacutenicos Geneacuteticos y Diagnoacutesticos Universitas
Meacutedica Vol 38 No 2 pp 44-55
44 Prior TW et al 1993 A missense mutation in the dystrophin gene in a
Duchenne muscular dystrophy patient Nat Genet Aug4(4)357-60
45 Ray P Vekemans M amp Munnich A 2001 Single cell multiplex PCR
amplification of five dystrophin gene exons combined with gender
determination Molecular Human Reproduction Vol 7 No 5 pp 489-
494
46 Roberts R 2001 Dystrophins and dystrobrevins Genome Biology
2(4) reviews 30061ndash30067
47 Sbiti A El KerchF amp Sefiani A 2002 Analysis of Dystrophin Gene
Deletions by Multiplex PCR in Moroccan Patients Journal of
Biomedicine and Biotechnology 23 158ndash160
48 Silva CT Fonseca D Restrepo C Contreras N Heidi E Mateus H
51
2004 Deleciones en el gen de la distrofina en 62 familias colombianas
correlacioacuten genotipofenotipo para la distrofia muscular de Duchenne y
Becker Colombia Meacutedica Vol 35 Nordm 4
49 Simard LR et al 1992 Deletions in the dystrophin gene Analysis of
Duchenne and Becker muscular dystrophy patients in Quebec Human
Genetics Vol 89 419-424
50 Singh V et al 1997 Proportion and Pattern of Dystrophin gene
deletions in North Indian Duchenne and Becker muscular dystrophy
patients Human Genetics Vol 99 206-208
51 Soong B-W et al 1991 DNA polymorphisms and deletion analysis of
the Duchenne-Becker muscular dystrophy gene in the Chinese
American Journal of Medical Genetics Vol 38 593-600
52 Shomrat R Gluck E Legum C Silo Y 1994 Relatively low proportion
of dystrophin gene deletions in Israeliacute Duchenne and Becker muscular
dystrophy patients American Journal of Medical Genetics Vol 4 369-
373
53 Tuffery S Demaille J Claustress 1992 A new intragenic
polymorphism detected by the single-strand conformation
polymorphism (SSCP) assay in the dystrophin gene Hum Mutat1221-
23
54 Werneck L et al 2001 Comparative analysis of PCR-deletion detection
and inmunohistochemestry in brazilian Duchenne and becker muscular
dystrophy patients Vol 103 115-120
52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
2 MARCO TEORICO
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular
progresiva similar a la distrofia muscular de Becker (DMB) entidades que se
consideraban diferentes por la presentacioacuten tardiacutea y mas benigna en esta uacuteltima
hasta que en la deacutecada de los ochenta fue identificado el gen causante de estas
enfermedades y reconocida la deficiencia de la distrofina una proteiacutena
citoesqueleacutetica en la fibra muscular El criterio para clasificar la DMBDMD es
la edad en que se presenta la incapacidad total para la marcha de acuerdo a lo
anterior el paciente confinado a una silla de ruedas antes de los 12 antildeos es
clasificado como DMD y la deambulacioacuten despueacutes de de los 16 antildeos es una
DMB (Emery AEH y Skinner R 1976 Prieto amp Keyeux 1997)
12
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
De todos los tipos de distrofias musculares la mas comuacuten es la distrofia
muscular pseudohipertrofica progresiva o tipo Duchenne (DMD) que afecta a
uno de cada 3500 nintildeos Se manifiesta a temprana edad con debilidad y atrofia
de los muacutesculos proximales de las extremidades y del tronco perdiendo la
capacidad de caminar al final de la primera deacutecada de la vida y muerte al
finalizar la segunda deacutecada La distrofia muscular tardiacutea o tipo Becker (DMB)
es menos frecuente que la anterior afectando a uno de cada 30000 nintildeos y se
caracteriza por una degeneracioacuten muscular mucho mas lenta daacutendole al
individuo la capacidad de movilizarse aun en la adultez y un promedio de vida
entre los 50 o 60 antildeos (Emery AEH y Skinner R 1976)
Los nintildeos con DMD son fenotipicamente normales al nacimiento Los primeros
siacutentomas aparecen durante el segundo antildeo de vida asociados a una leve
debilidad muscular al inicio de la bipedestacioacuten con caiacutedas frecuentes y la falta
de agilidad en comparacioacuten a otros nintildeos Entre los 4 y 5 antildeos se presenta
dificultad para subir escaleras y levantarse la marcha es inestable con peacuterdida
en la habilidad para saltar Antes de los 12 antildeos de edad el paciente pierde la
capacidad para caminar presentando contraccioacuten de los muacutesculos peacutelvicos con
retracciones de la articulacioacuten de la rodilla y el desarrollo de una escoliosis
severa Posteriormente se presentan signos de compromiso respiratorio y en la
mayoriacutea de los casos la causa de muerte es consecuencia de una falla
respiratoria yo cardiaca que se presenta en la mitad de la segunda deacutecada de
vida (Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Prieto amp
Keyeux 1997)
La DMDDMB se hereda con un patroacuten de herencia ligada al X recesiva en
donde las madres portadoras de una mutacioacuten del gen tienen un riesgo del 50
de tener hijos varones afectados y un 50 de tener hijas portadoras en el 60
de los casos se deben a mutaciones heredadas mientras que el 40 restante se
debe a mutaciones de novo en la madre o en el abuelo materno (Becker 1955
1957 Emery AEH y Skinner R 1976 Brooke MH et al 1989 Daniela GA amp
Barbujani G 1984)
El gen cuya forma mutada produce la enfermedad de DMD y DMB se
encuentra en el brazo corto del cromosoma X en la banda Xp21 Consta de
13
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
2400 kb 79 exones una cantidad considerable de splicing alternativos y por lo
menos 7 promotores especiacuteficos que generan un rango de transcritos los cuales
codifican para isoformas de la proteiacutena con diferente longitud o diferentes
secuencias aminoterminales (Kunkel LM et al 1986 Hoffman EP et al 1987
Koenig M et al 1987) En 1988 fue aislado y secuenciado el cDNA completo
del gen de la DMBDMB encontrando que el gen se transcriba en un mRNA de
14 kb y a su vez traduce en una proteiacutena de 3685 aminoaacutecidos con un peso
molecular de 427 kD (Koenig M et al 1988)
La distrofina es una proteiacutena que se asocia los sarcoglicanos y distroglicanos de
la membrana del sarcolema Ahn amp Kunkel 1993 Campbell KP et al 1989
comuacutenmente esta proteiacutena sirve como un modelo en bioquiacutemica debido a que
su ausencia o disfuncioacuten genera cambios notables en el fenotipo Esta proteiacutena
presenta 4 dominios el primer dominio (14-240 aminoaacutecidos) o aminoterminal
tiene una secuencia homoacuteloga a las proteiacutenas de unioacuten a la actina incluyendo la
beta espectrina y alfa actina (Ohlendieck K 1996 Roberts R 2001) Este
dominio esta asociado con el sitio de unioacuten al citoesqueleto El segundo
dominio (278-3080 aminoaacutecidos) presenta 24 repeticiones cada una de
aproximadamente 109 aminoaacutecidos Este segmento llamado regioacuten rod presenta
4 regiones (regioacuten de bisagra) que le dan flexibilidad a la proteiacutena Cada
repeticioacuten tiene una configuracioacuten de heacutelices alfa conteniendo 2 giros ricos en
prolina permitiendo formar una heacutelice triple El tercer dominio (3080-3360
aminoaacutecidos) es rico en cisteinas y presenta una homologiacutea con regiones de
unioacuten al calcio encontradas tambieacuten en la calmodulina alfa actina y beta
espectrina El cuarto domino (420 aminoaacutecidos) o dominio carboxilo terminal
se une a las proteiacutenas del sarcolema (Ahn amp Kunkel 1993)
La distrofina se encuentra localizada en la membrana plasmaacutetica de las ceacutelulas
del tejido muscular esqueleacutetico cardiaco y liso mas exactamente en la
superficie del sarcolema y en la unioacuten con neuronas motoras esta proteiacutena se
encuentra asociada a otras proteiacutenas de membrana como son los sarcoglicanos y
distroglicanos los cuales son tambieacuten receptores de la proteiacutena heterotrimerica
basal laminina-2 (Henry amp Campbell 1996) Estos forman un complejo
proteico llamado complejo de la distrofinoglicoproteina que al parecer tiene
14
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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muscular dystrophy Human Heredity Vol 48 61-66
26 HenryMD amp CampbellKP 1996 Dystroglican an extracellular matrix
receptor linked to the cytoskeleton Curr Opin Cell Biol 8625-631
27 Hiraishi Y Kato S Ishihara T amp Takano T 1992 Quantitative Southern
blot Analysis in the dystrophin gene of Japanise patients with Duchenne
or Becker muscular dystrophy a high frequency of duplications Journal
of Medical Genetics Vol 29897-901
28 Hoffman EP et al 1987 Dystrophin the protein product of the
Duchenne muscular dystrophy locus Cell 51919-928
29 Ibraghimov-Beskrovnaya O et al 1992 Primary structure of
dystrophin-associated glycoproteins linking dystrophin to the
extracellular matriz Nature 335696-702
30 Kiliman MW Pizzuti A Grompe M Caskey CT 1992 Point mutations
and polymorphisms in the human dystrophin gene identified in genomic
DNA sequences amplified by m-PCRHum Genet89253-58
31 Koening M et al 1987 Complete cloning of the Duchenne muscular
dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the
DMD gene in mause and affected individuals Cell50509-517
49
32 Koening M et al 1988 The complete sequence of dystrophin predicts a
rod-shaped cytoskeletal protein Cell 53219-228
33 Kumari D Mital A Gupta M Goyle S 2003 Deletion analysis of the
dystrophin gene in Duchenne and Becker muscular dystrophy patients
Use in carrier diagnosis Neurol India 51223-226
34 Kunkel LM Snyder JR Beggs AH Boyce FM and Feener CA
(1991) Searching for dystrophin gene deletions in patients with atypical
presentations In Etiology of human diseases at the DNA level (J
Lindsten and U Petterson Eds) New York Raven Press pp 51-60
35 Lenk U Hanke R and Speer A (1994) Carrier detection in DMD
families with point mutations using PCR-SSCP and direct sequencing
Neuromusc Disord 4411-418
37 Medori R et al 1989 Genetic abnormalities in Duchenne an Becker
dystrophies cilinical correlations Neurology 39 461-465
38 Monaco AP et al 1989 Dystrophin the protein product of the
DuchenneBecker muscular dystrophy gene Trends in BiochemSci14
412- 415
39 Niemann S et al 1992 Molecular genetic analysis of 67 patients with
DuchenneBecker muscular dystrophy Human Genetics Vol90 65-70
40 Ohlendieck K 1995 Towards an understanding of the dystrophin-
glycoprotein complex linkage between the extracellular matrix and the
membrane cytoskeleton in muscule fibers European journal of cell
biology 69 1-1
50
41 Onengut S et al Deletion pattern in the dystrophin gene in Turks and a
comparison with Europeans and Indians 2000 Annals of Human
Genetics Vol 64 33-40
42 Patintildeo A Narbona J amp Garcia M 1995 Molecular analysis of the
Duchenne muscular dystrophy gene in Spain individuals Deletion
detection and familial diagnosis American Journal of Medical
genetics Vol 59 182-187
43 Prieto J C amp Keyeux G 1997 Distrofia muscular de Duchenne y
Becker Aspectos Cliacutenicos Geneacuteticos y Diagnoacutesticos Universitas
Meacutedica Vol 38 No 2 pp 44-55
44 Prior TW et al 1993 A missense mutation in the dystrophin gene in a
Duchenne muscular dystrophy patient Nat Genet Aug4(4)357-60
45 Ray P Vekemans M amp Munnich A 2001 Single cell multiplex PCR
amplification of five dystrophin gene exons combined with gender
determination Molecular Human Reproduction Vol 7 No 5 pp 489-
494
46 Roberts R 2001 Dystrophins and dystrobrevins Genome Biology
2(4) reviews 30061ndash30067
47 Sbiti A El KerchF amp Sefiani A 2002 Analysis of Dystrophin Gene
Deletions by Multiplex PCR in Moroccan Patients Journal of
Biomedicine and Biotechnology 23 158ndash160
48 Silva CT Fonseca D Restrepo C Contreras N Heidi E Mateus H
51
2004 Deleciones en el gen de la distrofina en 62 familias colombianas
correlacioacuten genotipofenotipo para la distrofia muscular de Duchenne y
Becker Colombia Meacutedica Vol 35 Nordm 4
49 Simard LR et al 1992 Deletions in the dystrophin gene Analysis of
Duchenne and Becker muscular dystrophy patients in Quebec Human
Genetics Vol 89 419-424
50 Singh V et al 1997 Proportion and Pattern of Dystrophin gene
deletions in North Indian Duchenne and Becker muscular dystrophy
patients Human Genetics Vol 99 206-208
51 Soong B-W et al 1991 DNA polymorphisms and deletion analysis of
the Duchenne-Becker muscular dystrophy gene in the Chinese
American Journal of Medical Genetics Vol 38 593-600
52 Shomrat R Gluck E Legum C Silo Y 1994 Relatively low proportion
of dystrophin gene deletions in Israeliacute Duchenne and Becker muscular
dystrophy patients American Journal of Medical Genetics Vol 4 369-
373
53 Tuffery S Demaille J Claustress 1992 A new intragenic
polymorphism detected by the single-strand conformation
polymorphism (SSCP) assay in the dystrophin gene Hum Mutat1221-
23
54 Werneck L et al 2001 Comparative analysis of PCR-deletion detection
and inmunohistochemestry in brazilian Duchenne and becker muscular
dystrophy patients Vol 103 115-120
52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
funcioacuten de unir el citoesqueleto subsarcolemico al sarcolema por unioacuten de la F-
actina a traveacutes del dominio aminoterminal y al complejo de glicoproteina por
medio del dominio carboxilo terminal (Monaco AP et al 1985 Campbell
KP 1989 Campbell KP amp Kahl SD 1989)
El complejo distrofinoglicoproteina esta relacionado con la apertura de canales
Na+ en la superficie del sarcolema sin embargo la funcioacuten de la distrofina no
esta del todo clara hasta el momento La ausencia o disfuncioacuten de la distrofina
genera una interrupcioacuten de la unioacuten del citoesqueleto y el sarcolema alterando
a su vez la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular dantildeando las
fibras musculares con cada contraccioacuten o estiramiento causando DMD o DMB
La interrupcioacuten de la interaccioacuten entre el sarcolema y la matriz extracelular
incrementa tambieacuten la fragilidad osmoacutetica de las ceacutelulas o puede alterar los
mecanismos de regulacioacuten de los niveles de calcio presentes aumentando el
flujo de iones Ca++ al interior de la fibra (Roberts R 2001) La dramaacutetica
reduccioacuten de DAGs (Glicoproteiacutenas asociadas a la distrofina) en pacientes con
DMD conlleva a una perdida de la unioacuten entre el sarcolema y la matriz
extracelular lo que genera mayor susceptibilidad de sufrir necrosis por parte de
las fibras musculares (Ibraghimov-Beskrovnaya et al 1992)
Las mutaciones en el gen de la distrofina son de tipo delecion duplicacioacuten y
mutaciones puntuales de las cuales el 66 aproximadamente corresponden a
deleciones y duplicaciones de uno o maacutes exones del gen y el resto corresponde
a mutaciones puntuales e inserciones (Forrest SM et al 1987 Medori R et al
1989) Las deleciones tienen una distribucioacuten no azarosa y se ha encontrado que
cuando se producen estas mutaciones tienden a agruparse en dos regiones
distintas llamadas proclives o ldquohot spotsrdquo dentro del gen Un 80 de las
deleciones se ha encontrado entre los exones 44 a 52 de las cuales cerca de la
mitad se encuentran en el 44 y el otro 20 se encuentra entre los exones 1 a 19
Debido a esta caracteriacutestica se ha establecido que analizando 18 de los 79
exones se puede identificar el 98 de las deleciones para dicho gen (Beggs
1991)
Molecularmente se ha planteado la hipoacutetesis del corrimiento del marco de
lectura traduccional (CMLT) la cual propone que cuando ocurre una delecioacuten
15
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
el gen que resulta seraacute la unioacuten de los fragmentos proximales en donde pueden
ocurrir dos cosas una que se conserve el marco de lectura (in frame) debido a
la complementariedad de sus extremos lo cual permite que se de una proteiacutena
medianamente funcional pero con defectos en sus dominios internos causando
la forma leve de la enfermedad DMB La otra opcioacuten es que debido a la
ganancia o peacuterdida de nucleoacutetidos se produzca un cambio en el marco de
lectura (out frame) el corrimiento del marco de lectura altera el mRNA
cambiando los aminoaacutecidos lo cual genera una proteiacutena diferente que al estar
cambiada su estructura conformacional pierde su funcioacuten (Koening M et
al1989)
Los pacientes con diagnostico cliacutenico DMDDMB que no presentan deleciones
o duplicaciones presentan en su mayoriacutea mutaciones de tipo puntual
(Chaturvedi LS et al 2001) distribuidas a lo largo del gen de tal forma que no
se ha establecido hasta el momento ninguacuten ldquohot spotrdquo en cada familia se han
descrito nuevas y distintas mutaciones que se han denominado ldquomutaciones
privadasrdquo porque son particulares para cada caso (Flanigan KM 2003) Las
mutaciones puntuales conllevan a proteiacutenas donde se produce el cambio de un
aminoaacutecido por otro debido a mutaciones missense o a proteiacutenas truncadas
debidas a mutaciones nonsense (Bullman DE et al 1991 Clemens PR et al
1992 Prior TW et al 1993)
Estudios en diferentes paiacuteses han mostrado variacioacuten de la frecuencia de
deleciones como causa de la enfermedad DMDDMB con rangos que oscilan
entre el 50 y 60 con una distribucioacuten no al azar en los 2 hot spots del gen
Excepto en estudios como el de Haider MZ en 1997 en donde se reportaron
frecuencias de delecion fuera de los hot spots
Para Colombia solo se ha reportado un 31 de frecuencias de deleciones para
el gen de la distrofina por Silva et al 2004 Este estudio se realizo utilizando
los primers disentildeados por Chamberlain et al 1990 para exones dentro de los
hot spots encontrando diferencias altamente significativas con la mayoriacutea de
estudios a nivel mundial en especial en poblaciones europeas y
norteamericanas como se puede observar seguacuten lo reportado por Baumbach et
16
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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Duchenne muscular dystrophy patient Nat Genet Aug4(4)357-60
45 Ray P Vekemans M amp Munnich A 2001 Single cell multiplex PCR
amplification of five dystrophin gene exons combined with gender
determination Molecular Human Reproduction Vol 7 No 5 pp 489-
494
46 Roberts R 2001 Dystrophins and dystrobrevins Genome Biology
2(4) reviews 30061ndash30067
47 Sbiti A El KerchF amp Sefiani A 2002 Analysis of Dystrophin Gene
Deletions by Multiplex PCR in Moroccan Patients Journal of
Biomedicine and Biotechnology 23 158ndash160
48 Silva CT Fonseca D Restrepo C Contreras N Heidi E Mateus H
51
2004 Deleciones en el gen de la distrofina en 62 familias colombianas
correlacioacuten genotipofenotipo para la distrofia muscular de Duchenne y
Becker Colombia Meacutedica Vol 35 Nordm 4
49 Simard LR et al 1992 Deletions in the dystrophin gene Analysis of
Duchenne and Becker muscular dystrophy patients in Quebec Human
Genetics Vol 89 419-424
50 Singh V et al 1997 Proportion and Pattern of Dystrophin gene
deletions in North Indian Duchenne and Becker muscular dystrophy
patients Human Genetics Vol 99 206-208
51 Soong B-W et al 1991 DNA polymorphisms and deletion analysis of
the Duchenne-Becker muscular dystrophy gene in the Chinese
American Journal of Medical Genetics Vol 38 593-600
52 Shomrat R Gluck E Legum C Silo Y 1994 Relatively low proportion
of dystrophin gene deletions in Israeliacute Duchenne and Becker muscular
dystrophy patients American Journal of Medical Genetics Vol 4 369-
373
53 Tuffery S Demaille J Claustress 1992 A new intragenic
polymorphism detected by the single-strand conformation
polymorphism (SSCP) assay in the dystrophin gene Hum Mutat1221-
23
54 Werneck L et al 2001 Comparative analysis of PCR-deletion detection
and inmunohistochemestry in brazilian Duchenne and becker muscular
dystrophy patients Vol 103 115-120
52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
al 1989 Lietchi-Gallati et al 1989 Simard et al 1992 Niemann et al 1992
Florentin et al 1994 Gokgoz N et al 1993 Onengut et al 2000 Haider et al
1997 Singh et al 1997 Hiraishi et al 1992 Coral-Vazquez et al 1997
Werneck et al 2001 Por otra parte presenta algunas similitudes con lo
reportado para algunas poblaciones europeas no relacionadas directamente con
poblaciones latinas como Israel (Shomrat et al 1994) europeas como Rusia
(Baranov et al 1993) y poblaciones asiaacuteticas como estudios en China por
Soong et al 1991 y en Japon por Kioth et al 1992 Pero esta frecuencia de
deleciones comparada con estudios realizados en Hispanoameacuterica presenta
similitudes desde el punto de vista estadiacutestico especialmente en poblaciones
como Argentina (Baranzini et al 1998) Espantildea (Patintildeo et al 1995) y
Venezuela (Delgado et al 1994) Estas similitudes debidas entre otras al flujo
geneacutetico directo por parte de la poblacioacuten espantildeola a las poblaciones
latinoamericanas que tambieacuten sugieren el anaacutelisis de deleciones del gen de la
distrofina en sitios distintos a los hot spots debido a las bajas frecuencias de
delecioacuten presentes en estos puntos esto lleva a pensar en la heterogeneidad
mutacional en el gen de la distrofina
La mayoriacutea de los protocolos para el diagnostico de mutaciones han sido
disentildeados basaacutendose en la deteccioacuten de deleciones a partir de una reaccioacuten de
PCR multiplex la cual se fundamenta en la utilizacioacuten de varios pares de
iniciadores o primers en una misma reaccioacuten disentildeados para diferentes exones
dentro de los hot spots como es el caso del diagnostico molecular de
DMDDMB y que permite identificar raacutepidamente entre un 80 a 90 de todas
las deleciones en el gen de la distrofina (Chamberlain et al 1990 amp Ray P et
al 2001)
En la literatura mundial se encuentran estudios donde ademaacutes de identificar
deleciones han identificado mutaciones puntuales en 13 de la poblacioacuten en
mas de 400 pacientes Chaturvedi LS en el 2001 utilizaron la teacutecnica de
polimorfismos conformacionales de cadena sencilla SSCP (por sus siglas en
ingles) para 6 exones diferentes y luego las bandas con movilidad
electroforeacutetica diferente fueron secuenciadas con para determinar las
variaciones en secuencia encontrando que solo un exon tenia una movilidad
17
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
electroforeacutetica diferente el cual perteneciacutea a un paciente con diagnostico DMB
identificando una substitucioacuten (G-T) en la regioacuten intronica 37 Comparando
eacutesta con secuencias ya publicadas para dicha regioacuten intronica en la base de
datos del NCBI (National Center of Biotechnology) en donde se concluyoacute que
lo que encontraron fueron polimorfismos descritos previamente por otros
investigadores(Kiliman et al 1992 Tuffery et al 1992) pero no una mutacioacuten
puntual como causa de la DMB sin embargo concluyeron que las mutaciones
puntuales que causan DMBDMD estaacuten relacionadas con regiones no
codificantes del gen pero especiacuteficamente mutaciones en los sitios de splicing
(Chaturvedi LS et al 2001)
3 PROBLEMA DE INVESTIGACION Y JUSTIFICACION
31 Formulacioacuten del problema
En los anteriores estudios realizados en Colombia en donde se han analizado
mutaciones del tipo delecioacuten en 17 exones (3 4 6 8 12 13 17 19 43 44 45
47 48 50 51 52 y 60) ubicados en los dos puntos proclives del gen se ha
reportado una frecuencia de deleciones presentes del 31 en la poblacioacuten de
estudio Esto indica que muchos de los pacientes afectados quedan sin
diagnoacutestico molecular Debido a esto en el presente estudio se pretendioacute la
identificacioacuten de deleciones en diferentes exones a los anteriormente analizados
11 de estos fuera de los dos hot spots y los 4 restantes dentro de estos puntos
buscando con ello establecer las frecuencias de delecioacuten en exones no descritos
en la poblacioacuten de estudio
32 Justificacioacuten
La DMDDMB no es un problema de salud puacuteblica pero si es una enfermedad
de gran impacto socio-econoacutemico para los afectados y sus familias debido al
18
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
deterioro progresivo que imposibilita el desarrollo normal de los pacientes
Dado el tipo de herencia asociado a esta enfermedad es importante desarrollar
conocimiento acerca del espectro mutacional en Colombia con el fin de realizar
una correlacioacuten entre el fenotipo cliacutenico y el genotipo molecular de tal forma
que el personal meacutedico y parameacutedico tome las medidas terapeacuteuticas adecuadas
y disponibles para un tratamiento encaminado a mejorar la calidad de vida de
los afectados de acuerdo al diagnostico cliacutenico de DMDDMB Por otro lado el
conocimiento del dantildeo molecular en una familia en particular permite
determinar el estado de portadora en las mujeres por liacutenea materna a quienes se
les podraacute adecuado asesoramiento geneacutetico
Este trabajo que hace parte de la liacutenea de investigacioacuten en Distrofias
Musculares desarrollado por la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del
Rosario el cual complementoacute los anaacutelisis moleculares previamente descritos
por Silva et al 2004 en los que mediante el anaacutelisis de 17 exones del gen de la
distrofina se determino la frecuencia de deleciones (31) en 62 pacientes
afectados con DMDDMB
El presente estudio de anaacutelisis de deleciones en el gen de la distrofina mediante
PCR muacuteltiplex de 15 exones adicionales es un aporte relevante al conocimiento
del comportamiento molecular asiacute como la incidencia de deleciones en el gen
como causa de DMDDMB en nuestro paiacutes del mismo modo se pudo
responder asiacute la pregunta de si efectivamente en Colombia las deleciones no son
la causa molecular maacutes importante que conduce al desarrollo de DMDDMB el
cual ayuda a construir la base conceptual para la implementacioacuten de otras
alternativas que permitan la descripcioacuten de mutaciones diferentes
4 OBJETIVOS
41 Objetivo general
Determinar la frecuencia de deleciones en 15 exones en una poblacioacuten
colombiana afectado con DMDDMB
19
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
42 Objetivos especiacuteficos
421 Estandarizar las condiciones de la teacutecnica de PCR-Muacuteltiplex para
los 15 exones analizados
422 Identificar deleciones en 15 exones (416) dentro del hot spot
proximal (4953) dentro del hot spot distal y 11 exones fuera de
estos puntos (25 28 32 34 62 67 72 73 75 77 y 79) del gen de la
distrofina no descritos en nuestro paiacutes
423 Realizar comparaciones entre lo encontrado con respecto a lo
reportado por la literatura
5 MATERIALES Y MEacuteTODOS
51 Disentildeo de la investigacioacuten
El presente trabajo correspondioacute a un estudio de tipo observacional descriptivo
el factor de disentildeo fueron los 15 exones del gen de la distrofina presentes en 36
pacientes con diagnostico cliacutenico de DMBDMD Los pacientes fueron
atendidos en la unidad de geneacutetica de la Universidad del Rosario y los
correspondientes niveles del factor de disentildeo fueron cada uno de los 15 exones
a evaluar
La variable de respuesta del presente estudio fue la presencia o ausencia de
bandas para los diferentes exones observadas en un perfil electroforetico
determinado
La unidad de respuesta de la primera variable fueron cada una de las bandas
presentes en el perfil electroforetico para la segunda variable la unidad de
respuesta es el porcentaje de deleciones obtenido La unidad de muestreo fueron
los diferentes perfiles electroforeacuteticos de cada uno de los exones amplificados
en los 36 pacientes
511 Poblacioacuten de estudio y muestra
20
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
La poblacioacuten de estudio correspondioacute a pacientes atendidos en el Instituto
Franklin Delano Roosvelt y la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular
de Duchenne 35 de los cuales acudieron con su diagnoacutestico cliacutenico a la Unidad
de Geneacutetica de la Universidad del Rosario y uno fue un paciente diagnosticado
anteriormente en el Instituto de Geneacutetica de la Universidad Javeriana asiacute como
32 pacientes presentaban diagnostico cliacutenico DMD y 4 pacientes diagnostico
DMB
1 Tener Diagnoacutestico cliacutenico de DMDDMB y que deseen
voluntariamente participar en el estudio
2 No tener delecioacuten detectable para los 17 exones reportados por
Silva et al 2004
Como muestra se tomoacute el DNA previamente extraiacutedo de 29 pacientes utilizado
en estudios anteriores en la Unidad de Geneacutetica de la Universidad del Rosario
A los 7 pacientes restantes que hicieron parte de este estudio se tomo por
venopuncion una muestra de sangre perifeacuterica total en un tubo con capacidad de
5ml de la cual se extrajo DNA geonoacutemico por el meacutetodo de salting out el cual
se conservoacute a -20ordmC antes y despueacutes de ser manipulado Cada muestra se tomoacute
teniendo en cuenta un consentimiento previo por medio de un
diligenciamiento del consentimiento informado (Anexo 1)
512 Variables de estudio
Las variables definidas para este estudio fueron las deleciones presentes como
variable independiente y la frecuencia con que se presentaron las deleciones es
la variable dependiente
52 Meacutetodos
De los 36 pacientes analizados se registraron los datos personales y familiares
(ver anexo 1) (genealogiacutea) asiacute como los resultados de estudios de laboratorio
(CPK y electromiografiacutea) El diagnostico cliacutenico del paciente descrito
inicialmente por el neuroacutelogo pediatra fue confirmado por el medico genetista 21
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
en la Universidad del Rosario con base en el examen fiacutesico y los datos de
laboratorio
Despueacutes de obtener el consentimiento informado de 7 pacientes (ver anexo 1)
se obtuvo por venopuncioacuten 5ml de sangre perifeacuterica total en tubos
anticoagulados con EDTA de donde se extrajo el DNA genoacutemico por el
meacutetodo de Salting out (Anexo 3) Teacutecnica basada en la lisis de membranas
celulares de linfocitos con la posterior separacioacuten de las proteiacutenas asociadas al
DNA para facilitar su extraccioacuten mediante precipitacioacuten con NaCl [6M] y
Etanol al 70 (Gustincich Manfioletti et al 1991) El total de pacientes
analizados fueron 36 de los cuales 29 hicieron parte de estudios anteriores en la
Universidad del Rosario y los 7 restantes fueron pacientes contactados a traveacutes
de la Asociacioacuten Colombiana de Distrofia Muscular (ACDM) cada uno con su
debido consentimiento informado firmado por sus padres o acudientes
Pacientes en los cuales no se encontroacute delecioacuten para los 17 exones analizados
en el anterior estudio por Silva et al 2004
Los 29 pacientes del estudio anterior ya teniacutean el DNA extraiacutedo y conservado a
ndash20degC extraccioacuten que se realizo por el meacutetodo de salting out (anexo 3) Para
los otros 7 pacientes la teacutecnica de extraccioacuten de DNA se realizo por el mismo
procedimiento
521 Estandarizacioacuten de las condiciones de PCR muacuteltiplex
Para el anaacutelisis de los 15 exones de estudio se realizoacute la amplificacioacuten por
PCR muacuteltiplex para los exones 4 16 25 28 32 34 49 53 62 67 72 73 75
77 y 79 con los primers disentildeados por Chamberlain et al 1988 Abbs et al
1991 Beggs et al 1991 Kunkel et al 1991 amp Lenk et al 1994 (Tabla 1)
22
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
Tabla 1 Condiciones y caracteriacutesticas principales de los primers utilizados en este estudio Las siglas
(F) y (R) en la columna de temperatura hace referencia a las Tm de la cadena forward y reverse de DNA
PRIMER
(EXONES)
SECUENCIA TEMPERATURA
MEALTING (Tm degC)
PRODUCTO
(Pb)4 F 5acute TTGTCGGTCTCTCTGCTGGTCAGTG 3acute
R 5acute CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3acute
545 (F) y 54 (R) 196
16 F 5acute TCTATGCAAATGAGCAAATACACGC 3acute
R 5acute GGTATCACTAACCTGTGCTGTACTC 3acute
49 (F) y 47 (R) 290
25 F 5 acute TGTGGCAGTAATTTTTTTCAG 3acute
R 5acute AGGAAATCTTAGTTAAGTACG 3acute
562 (F) y 566 (R) 258
28 F5acuteGAAGTTTTAATAATGAAATGGCAAAA 3acute
R 5acuteGTACCTCTTTTAATACTGCATAT 3acute
497 (F) y 48 (R) 275
32 F 5acuteGACCAGTTATTGTTTGAAAGGCAAAA3acute
R 5acuteTTGCCACCAGAAATAGATACCACACAATG
3acute
546 (F) y 593 (R) 253
34 F5acuteGTAACAGAAAGAAAGCAACAGTTGGAGAA
3acute
R5acuteCTTTCCCCAGGCAACTTCAGAATCCAAA3acute
575 (F) y 61 (R) 171
49 F 5acuteGTGCCCTAATGTACCAGGCAGAAATTG 3acute
R 5acuteGCAATGACTCGTTAATAGCCTTAAGATC 3acute
598 (F) y 557 (R) 439
53 F5acute TTGAAAGAATTCAGAATCAGTGGGATG 3acute
R5 acuteCTTGGTTTCTGTGATTTTCTTTTGGATTG 3acute
556 (F) y 557 (R) 212
62 F 5acuteacuteTAATGTTGTCTTTCCTGTTTGGC 3
R 5acuteATACAGGTTAGTCACAATAAATGC 3acute
54 (F) y 512 (R) 185
67 F 5acuteAATTGCTACTGGAATTGAGTTGG 3acute
R 5acuteAAGAATAAATATGTTACCTAGAAGG 3
535 (F) y 484 (R) 286
72 F 5acuteGATGGTATCTGTGACTAATCA 3acute
R 5acuteAATTCAATCAATTGCCTGGC 3acute
503(F) y 524 (R) 144
73 F 5acuteAacuteCGTCACATAAGTTTTAATGAGC 3acute
R 5acuteATGCTAATTCCTATATCCTGTGC 3acute
515 (F) y 523 (R) 202
75 F 5acute TCTTTTTTACTTTTTTGATGC 3acute
R 5acute ATGGCTCTCTGAGGTTTAG 3acute
455 (F) y 512 (R) 270
77 F 5acute TAATCATGGCCCTTTAATATCTG 3acute
R 5acute GATACTGCGTGTTGGCTTCC 3acute
503 (F) y 563 (R) 344
79 F 5acute AGAGTGATGCTATCTATCTGCAC 3acute
R 5acute TGCATAGACGTGTAAAACGTCCC 3acute
539 (F) y 575 (R) 349
23
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
5211 Disentildeo de los sistemas muacuteltiplex
Para el agrupamiento de exones el criterio que en el cual se baso el estudio fue
la distancia de pares de bases entre los exones Inicialmente se agruparon
manteniendo una diferencia miacutenima de 30 a 40pb de producto final de cada par
de primers Teniendo en cuenta estas condiciones teoacutericas y experimentales
Los sistemas muacuteltiplex finalmente se organizaron de acuerdo a como se
muestran en la tabla 2
Tabla 2Organizacioacuten de los diferentes plex para los 15 exones analizados
2 2A 3B 4B 4CExon 25
(258pb)
Exon 4 (196pb) Exon 72
(144pb)
Exon 28
(275pb)
Exon 16
(290pb)Exon 75
(344pb)
Exon 67
(286pb)
Exon 73
(202pb)
Exon 49
(439pb)
Exon 32
(253pb)Exon 77
(270pb)
Exon 62
(185pb)
Exon 34
(171pb)Exon 79
(349pb)
Exon 53
(212pb)
5212 Caracteriacutesticas molares de primers y soluciones de trabajo
Los reactivos utilizados para las diferentes reacciones de estandarizacioacuten y
anaacutelisis fueron Buffer 10X NH4 libre de MgCl2 tambieacuten MgCl2 el cual se
utilizo en concentraciones iniciales de 50 mM y en el caso del plex 4B se utilizo
MgCl2 a una concentracioacuten inicial de 25mM Los dNTPacutes utilizados se
mezclaron en un solo stock a una concentracioacuten final de 10 mM
Para los diferentes stocks de primers se partiacutea de su concentracioacuten inicial de la
casa comercial y se llevaba a una concentracioacuten de 25 pmolmicrol de la cual se
partiacutea para hacer los diferentes sets de primers que se llevaban a una
concentracioacuten final de 10 mM La Taq fue diluida y llevada de una
24
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
concentracioacuten inicial de 5 umicrol a una concentracioacuten final de 12 umicrol con el fin
de obtener un mayor rendimiento
Tabla 3 condiciones iniciales de las mezclas maestras para los diferentes montajes de PCR
multiplex
Reactivosolucioacuten Concentracioacuten inicial Concentracioacuten final
20 microlBuffer 10X NH4 10X 1XPrimers 25 pmolmicrol cu 10 microM (mix) 1 microMdNTPacutes 25 mM cu 10 mM (mix) 1 mMMgCl2 50 o 25 mM 50 o 25 mM 5mM o 25mMTaq 12 umicrol 12 umicrol 12 umicrolDNA 100 ngmicrol 200 ngmicrolH2O 8 o 9 microl seguacuten el sistema
Las condiciones de corrido de PCR (tabla 4) para la estandarizacioacuten y los
diferentes anaacutelisis de los sistemas fueron condiciones descritas para otros
exones del gen de la distrofina por Silva et al 2004 Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un equipo automatizado marca MJ Research con
capacidad para 91 tubos
Tabla 4 Condiciones de PCR para los diferentes plex utilizados en este estudio
Paso Temperatura TiempoDESNATURALIZACION
INICAL94degC 6 minutos
DESNATURALIZACION 94degC 30 segundosANNEALING 52degC 30 segundosEXTENSION 65degC 4 minutos
30 CICLOS6 EXTENSION FINAL 65degC 7 minutos
53 Recoleccioacuten de la informacioacuten
Los productos amplificados fueron analizados en geles de agarosa al 12 para
los sistemas 2 2A 3B y 4B y al 15 para el sistema 4C Los geles fueron
corridos en Buffer TBE 1X a 120 voltios por 45 minutos para los sistemas 2
25
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
2A 3B y 4B para el sistema 4C se emplearon como condiciones de corrido 150
voltios por 50 minutos Todos los geles fueron tentildeidos con bromuro de etidio a
una concentracioacuten de 2microgml en cada gel se sembroacute un patroacuten de peso
molecular de 100pb para verificacioacuten de productos amplificados de los
primeros geles en la fase de estandarizacioacuten y de 50pb para el resto de
productos amplificados en este estudio La presencia o ausencia se analizoacute por
la visualizacioacuten directa de los productos sobre el transiluminador Se considero
como delecion la ausencia de una o mas bandas de los sistemas multiplex
utilizados para cada paciente
Para la recoleccioacuten de la informacioacuten obtenida de los geles se disentildeoacute una tabla
de resultados (anexo 3) en donde se consignaba la presencia o ausencia de las
bandas correspondientes a los sistemas multiplex para cada paciente En cada
corrido electroforetico se sembraba una muestra correspondiente a un control
normal que servia junto con el marcador de peso para verificar los productos de
amplificacioacuten obtenidos
Control de Calidad Para todos los procesos de laboratorio contemplados en la
metodologiacutea se usaraacuten protocolos que incluyeron el anaacutelisis paralelo de
controles normales positivos y negativos que corresponden a personas sin
ninguacuten antecedente de DMD-DMB en su familia pacientes afectados con
delecioacuten conocida Como control negativo de reaccioacuten de PCR y de extraccioacuten
de DNA se utilizoacute agua compuesto que permite verificar la ausencia de
contaminantes que puedan llevar a la emisioacuten de resultados falsos positivos
54 Anaacutelisis de la informacioacuten
La determinacioacuten de la frecuencia de deleciones en la poblacioacuten se realizoacute
mediante conteo del nuacutemero de exones ausentes en el total de la poblacioacuten
analizada observado sobre el transiluminador En el caso de tener delecioacuten de
uno o maacutes exones se realizaba la amplificacioacuten individual de ellos para
26
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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32 Koening M et al 1988 The complete sequence of dystrophin predicts a
rod-shaped cytoskeletal protein Cell 53219-228
33 Kumari D Mital A Gupta M Goyle S 2003 Deletion analysis of the
dystrophin gene in Duchenne and Becker muscular dystrophy patients
Use in carrier diagnosis Neurol India 51223-226
34 Kunkel LM Snyder JR Beggs AH Boyce FM and Feener CA
(1991) Searching for dystrophin gene deletions in patients with atypical
presentations In Etiology of human diseases at the DNA level (J
Lindsten and U Petterson Eds) New York Raven Press pp 51-60
35 Lenk U Hanke R and Speer A (1994) Carrier detection in DMD
families with point mutations using PCR-SSCP and direct sequencing
Neuromusc Disord 4411-418
37 Medori R et al 1989 Genetic abnormalities in Duchenne an Becker
dystrophies cilinical correlations Neurology 39 461-465
38 Monaco AP et al 1989 Dystrophin the protein product of the
DuchenneBecker muscular dystrophy gene Trends in BiochemSci14
412- 415
39 Niemann S et al 1992 Molecular genetic analysis of 67 patients with
DuchenneBecker muscular dystrophy Human Genetics Vol90 65-70
40 Ohlendieck K 1995 Towards an understanding of the dystrophin-
glycoprotein complex linkage between the extracellular matrix and the
membrane cytoskeleton in muscule fibers European journal of cell
biology 69 1-1
50
41 Onengut S et al Deletion pattern in the dystrophin gene in Turks and a
comparison with Europeans and Indians 2000 Annals of Human
Genetics Vol 64 33-40
42 Patintildeo A Narbona J amp Garcia M 1995 Molecular analysis of the
Duchenne muscular dystrophy gene in Spain individuals Deletion
detection and familial diagnosis American Journal of Medical
genetics Vol 59 182-187
43 Prieto J C amp Keyeux G 1997 Distrofia muscular de Duchenne y
Becker Aspectos Cliacutenicos Geneacuteticos y Diagnoacutesticos Universitas
Meacutedica Vol 38 No 2 pp 44-55
44 Prior TW et al 1993 A missense mutation in the dystrophin gene in a
Duchenne muscular dystrophy patient Nat Genet Aug4(4)357-60
45 Ray P Vekemans M amp Munnich A 2001 Single cell multiplex PCR
amplification of five dystrophin gene exons combined with gender
determination Molecular Human Reproduction Vol 7 No 5 pp 489-
494
46 Roberts R 2001 Dystrophins and dystrobrevins Genome Biology
2(4) reviews 30061ndash30067
47 Sbiti A El KerchF amp Sefiani A 2002 Analysis of Dystrophin Gene
Deletions by Multiplex PCR in Moroccan Patients Journal of
Biomedicine and Biotechnology 23 158ndash160
48 Silva CT Fonseca D Restrepo C Contreras N Heidi E Mateus H
51
2004 Deleciones en el gen de la distrofina en 62 familias colombianas
correlacioacuten genotipofenotipo para la distrofia muscular de Duchenne y
Becker Colombia Meacutedica Vol 35 Nordm 4
49 Simard LR et al 1992 Deletions in the dystrophin gene Analysis of
Duchenne and Becker muscular dystrophy patients in Quebec Human
Genetics Vol 89 419-424
50 Singh V et al 1997 Proportion and Pattern of Dystrophin gene
deletions in North Indian Duchenne and Becker muscular dystrophy
patients Human Genetics Vol 99 206-208
51 Soong B-W et al 1991 DNA polymorphisms and deletion analysis of
the Duchenne-Becker muscular dystrophy gene in the Chinese
American Journal of Medical Genetics Vol 38 593-600
52 Shomrat R Gluck E Legum C Silo Y 1994 Relatively low proportion
of dystrophin gene deletions in Israeliacute Duchenne and Becker muscular
dystrophy patients American Journal of Medical Genetics Vol 4 369-
373
53 Tuffery S Demaille J Claustress 1992 A new intragenic
polymorphism detected by the single-strand conformation
polymorphism (SSCP) assay in the dystrophin gene Hum Mutat1221-
23
54 Werneck L et al 2001 Comparative analysis of PCR-deletion detection
and inmunohistochemestry in brazilian Duchenne and becker muscular
dystrophy patients Vol 103 115-120
52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
56
corroborar la delecioacuten Si en este anaacutelisis individual seguiacutea estando ausente la
banda se concluiacutea ausencia del exon
Para el anaacutelisis de la informacioacuten obtenida no se necesito de un anaacutelisis
estadiacutestico para observar las diferencias significativas de las frecuencias de
delecion entre las distintas poblaciones debido a que los exones analizados en
este estudio han sido estudiados por pocos autores que sin embargo tambieacuten
analizan exones dentro de los hot spots Por esta razoacuten los datos reportados por
la literatura mundial no son comparables con los datos obtenidos en el presente
estudio sin embargo se analizaron las frecuencias de distribucioacuten de deleciones
presentes en ambos hot spots y fuera de ellos en estudios donde se utilizaron
algunos primers utilizados en este estudio como es el caso de Turquiacutea y Arabia
Saudi Onengut et al 2000 y Haider et al 1997
6 RESULTADOS
61 Estandarizacioacuten de condiciones de PCR
La estandarizacioacuten de las condiciones para las diferentes de reacciones de PCR
muacuteltiplex se empezoacute organizando 16 pares de primers resultando teoacutericamente
cuatro sistemas o plex de amplificacioacuten conjunta organizados en un sistema de
27
5 exones llamado 5C dos de 4 exones cada uno llamados 4B y 4C
respectivamente y por ultimo un sistema de 3 exones llamado 3B
El sistema 5C el cual se encontraba conformado por los exones 32677273 y
75 despueacutes de muchos ensayos y de reducir muchas inespecificidades producto
de la concentracioacuten final de MgCl2 tambieacuten debido a que dos productos el exon
32 (253pb) y el exon 67 (286pb) se sobrelapaban y ademaacutes habiacutea amplificacioacuten
preferencial de unos productos sobre otros se concluyo que no era reproducible
debido a la proximidad en tamantildeo que teniacutean los exones 32 y 67 (ver tabla 1)
los cuales no amplificaban en conjunto (figura 1a)
Figura 1 primeras condiciones de estandarizacioacuten A carriles con controles normales para el
plex 5C B carriles con controles normales para el plex 3B iniciales
En cuanto al sistema 3B (figura1b) el cual estaba conformado por los exones
465 y 77 se observo que amplificaban normalmente las bandas de 196 y 270pb 28
5C 5C 5C 3B 3B 3B 1 2 3 4 5 6
MP100 pb
(A) (B)
de los exones 4 y 77 respectivamente pero la banda de 347pb del exon 65 no se
observaba por lo cual se decidioacute amplificarla sola con el fin de observar si las
condiciones del sistema estaban afectando su amplificacioacuten La conclusioacuten a la
que se llego a traveacutes de este experimento fue que los primers pertenecientes al
exon 65 estaban fallando ya que en geles de agarosa al 12 (datos sin
publicar) no se observo la amplificacioacuten de un producto de dicho peso
molecular Despueacutes de correr esta secuencia de los primers por el BLAST del
NCBI (figura 2) con el fin de observar si dicha secuencia perteneciacutea a dicho
exon o por el contrario habiacutea alguacuten error en su disentildeo se concluyo que la
secuencia estaba disentildeada correctamente pero que cuando se experimentaba con
ella no generaba ninguacuten resultado por lo que se decidioacute excluir dicho exon del
estudio y trabajar solo con 15 pares de primers
Figura 2 Secuencia exon 65 del gen de la distrofina humana GenBank Access M86889 (GI
181867)
GGTATGAGAGAGTCCTAGCTAGGATTCTCAGAGGAAAAAGGACACTGAAAGGAAGGTTTTACTCTTTGAGTCATTTGTGATTTTATTTGTTTTTTGCAGTGGATCTCTTGAGCCTGTCAGCTGCATGTGATGCCTTGGACCAGCACAACCTCAAGCAAAATGACCAGCCCATGGATATCCTGCAGATTATTAATTGTTTGACCACTATTTATGACCGCCTGGAGCAAGAGCACAACAATTTGGTCAACGTCCCTCTCTGCGTGGATATGTGTCTGAACTGGCTGCTGAATGTTTATGATACGTACGTATGGCATGTTTTTATTTCCCGGGCTCTGTCACAGGAGGCTTAGC
DIRECTO TATGAGAGAGTCCTAGCTAGGREVERSO TTAGCCTCCTGTGACAGAGCANTISENTIDO GCTCTGTCACAGGAGGCTTALa secuencia antisentido corresponde a la cadena complementaria de la secuencia reversa
El sistema 4C tambieacuten presentoacute problemas al principio de productos
inespeciacuteficos lo cual se logro solucionar a traveacutes de variaciones en las
concentraciones de cloruro haciendo una escalera de MgCl2 como se muestra en
la tabla 5 en donde la concentracioacuten final fue 5mM Escogida debido a que no
se presentaban productos inespeciacuteficos y las 4 bandas se observaban
claramente Ademaacutes de esto el sistema tambieacuten presentoacute complicaciones con la
29
amplificacioacuten del exon 16 generaacutendose una amplificacioacuten preferencial por los
demaacutes tres exones que por el momento eran el 53 34 y 25 (figura 3c)
Lo primero que se decidioacute fue probar el primer amplificaacutendolo individualmente
con el fin de probar si el primer amplificaba
Tabla 5 Modificaciones de MgCl2 para el plex 4C en donde la concentracioacuten final
elegida fue 5mM4C [5mM] 4C [6mM] 4C [7mM] 4C [8mM] 4C [12mM]
Buffer 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlPrimers 2microl 2microl 2microl 2microl 2microldNTPacutes 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlMgCl2 [50mM] 2microl 24microl 28microl 32microl 48microlTaq 1microl 1microl 1microl 1microl 1microlDNA 2microl 2microl 2microl 2microl 2microlH2O 9microl 86microl 82microl 78microl 62microl
Una vez corroborada la amplificacioacuten normal del primer del exon 16 se decidioacute
aumentar la concentracioacuten del primer del exon 16 en relacioacuten 21 con respecto a
los demaacutes primers obteniendo ya una amplificacioacuten del sistema pero en los
productos de mayor tamantildeo exon 16 (290pb) y 25 (258pb) se observaba un
sobrelapamiento y solo se alcanzaba a distinguir una banda en geles de agarosa
al 12 Por lo cual se decidioacute cambiar el producto de 258pb (exon 25) por el
exon 32 de 253pb que presentaban 5pb de diferencia con lo cual se logro
evidenciar la presencia de 4 bandas en un sistema de 4 exones llamado 4C en el
cual se logro la estandarizacioacuten completa (Tabla 6) Esta vez se utilizaron geles
al 15 con el fin de obtener una mayor separacioacuten de productos entre 100 y
500pb (figura 7) Todas las reacciones se llevaron a un volumen final de 20microl
Tabla 6 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 4C
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microl
30
Buffer 10X 1X 2microlPrimers 10microM 1microM [21] E-16 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
El sistema 4B (figuras 3a y 3b) fue el que presento menos problemas para
estandarizar las condiciones normales de amplificacioacuten (Tabla 7) la uacutenica
modificacioacuten que presento fue la utilizacioacuten de un MgCl2 a una concentracioacuten
inicial de 25mM las diferentes reacciones se hicieron en un VF de 20microl
siempre utilizando 2microl de DNA de una concentracioacuten inicial de 1000ngmicrol
Tabla 7 Condiciones finales de estandarizacioacuten del plex 4B
REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 25mM 25mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 2microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Figura 3 Condiciones iniciales de estandarizacioacuten para los plex 4B y 4C A Plex 4B con
MgCl2 50mM B Plex 4B con MgCl2 25mM y C Plex 4C MgCl2 50mM
31
Lo siguiente fue replantear la organizacioacuten del los plex 5C y 3B eliminando del
estudio el exon 65 y generando a partir de 7 exones un nuevo sistema de 3 pares
de primers llamado 3B conformado por los exones 72 73 y 77 se escogioacute esta
combinacioacuten debido a las diferencias en tamantildeo que presentaban entre siacute y que
en la practica presento una alta resolucioacuten (figura 5) Utilizado finalmente en
este estudio bajo las condiciones presentadas en la tabla 8
Tabla 8 Condiciones finales de la estandarizacioacuten del plex 3B REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINAL 20microlBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
Por otro lado quedaban 4 pares de primers dos de los cuales teniacutean pesos
moleculares muy similares entre siacute 258 y 286pb de los exones 25 y 67 32
C4C4
B4B3
A4B1
MP100pb
respectivamente con una diferencia de apenas 28pb por lo cual si se uniacutean en
un solo sistema se tuviese una alta posibilidad de sobrelapamiento entonces se
decidioacute hacer dos sistemas duplex uno con los exones 25 y 75 llamado plex 2 y
el otro sistema conformado por los exones 4 y 67 los cuales quedaron
estandarizados bajo las condiciones presentadas en la tabla 9 para un volumen
de reaccioacuten de 20microl
Tabla 9 Condiciones finales de reaccioacuten para los plex 2 y 2A REACTIVO SLN
CONCENTRADA
CONCENTRACION
FINAL
VOLUMEN
FINALBuffer 10X 1X 2microl
Primers 10microM 1microM 2microlMgCl2 50mM 5mM 2microldNTPs 10mM 1mM 2microl
Taq Pol 12umicrol 12umicrol 1microlH2O miliQ 9microl
DNA 100ngmicrol 200ngmicrol 2microlVol Total 20microl 20microl 20microl
62 ANAacuteLISIS DE DELECIONES
Anaacutelisis del sistema 2
Para el plex 2 (figura 4) conformado por los exones 25 y 75 se encontroacute que en
4 de los 36 pacientes analizados solo amplificaba una banda 3 en los cuales se
evidencio la ausencia de la banda correspondiente al exon 75 (344pb) y un
paciente en donde no se evidencio la presencia del exon 25 (258pb) por lo cual
a estos cuatro pacientes se confirmo su resultado amplificando solo la banda
que se presento ausente Cuando se amplificaron los exones que presentaban
ausencia en el sistema se logro corroborar que para el plex 2 ninguacuten paciente
presenta delecioacuten para los exones 27 y 75
Figura 4 resultados del plex 2 Exones 25 (258 pb) y 75 (344 pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
33
Anaacutelisis del sistema 2A
El anaacutelisis del plex 2A fue el mismo que se hizo para el 2 plex solo que esta
vez fueron 4 pacientes distintos a los anteriores que presentaron ausencia de la
banda del exon 67 (286pb) lo cual posteriormente fue confirmado por la
amplificacioacuten individual del anterior exon confirmando que ninguacuten paciente
presenta delecioacuten de los exones 4 (196pb) y 67 (figura 5)
Figura 5 Resultados del plex 2A Exones 4 (196pb) y 67 (286pb) carriles 1 y 2 controles
negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con DMD o DMB
34
MP50pbNNNB 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 3B
El sistema 3B (exones 7273 y 77) fue en el que todos los productos
amplificados se pudieron evidenciar en cada uno de los pacientes por lo cual
ninguacuten paciente para el sistema 3B presentoacute delecioacuten de ninguno de los exones
que lo conformaban(figura 6)
Figura 6 Resultados del sistema 3B Exones 72 ( 144pb) 73 (202pb) y 77(270pb) carriles 1 y
2 controles normal (N) y negativo (B) carriles 4 a 8 y 10 pacientes con diagnostico de DMD o
DMB
35
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4B
Para el plex 4B (exones 284962 y 79) (figura 7) tampoco se observo ninguna
delecion sin embargo en 3 pacientes presentaron ausencia en una banda del
sistema 2 en los cuales no se evidencio la banda del exon 28 (275pb) y uno en
el cual no se evidencioacute la banda del exon 62 (185pb) los cuales se confirmaron
como completos por medio de su amplificacioacuten individual (sin delecioacuten) para el
plex 4B
Figura 7 Resultados del sistema 4B Exones 28 (275pb) 49 (493pb) 62 (185pb) 79 (349pb)
carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8 pacientes con
DMD o DMB
36
N B
MP50pb
3 4 5 6 7 8
Anaacutelisis del sistema 4C
En el plex 4C (exones 16 32 34 y 53) fue donde se evidencioacute el mayor numero
de pacientes con ausencia de bandas en el sistema en donde 6 pacientes
presentaban ausencia en uno de los 4 productos amplificados 2 pacientes
presentaron ausencia del exon 16 (290pb) un paciente presentoacute ausencia del
exon 32 (253pb) y los 3 restantes presentaron ausencia del exon 34 (171pb) En
el posterior anaacutelisis de estas ausencias se pudo confirmar que 5 de los anteriores
pacientes no presentaban delecioacuten para el exon a confirmar excepto uno al que
despueacutes de la amplificacioacuten individual en este caso del exon 16 se confirmo
como delecioacuten en una nueva amplificacioacuten del sistema completo resultando otra
vez ausencia de una banda de 290pb del exon 16 (Figura 8)
37
B N MP 50pb 4 5 6 7 8
Figura 8 Resultados del sistema 4C Exones 16 (290pb) 32 (253pb) 34 (171pb) y 53
(212pb) carriles 1 y 2 controles negativo (B) y normal (N) de amplificacioacuten carriles 4 a 8
pacientes con DMD o DMB
63 Anaacutelisis de comparacioacuten
Las comparaciones realizadas corresponden a los resultados obtenidos en este
estudio en donde se puede observar que de los 36 pacientes que conforman la
poblacioacuten de muestra solo a uno se le detecto delecioacuten generando una
frecuencia de delecion del 27 Por otro lado la delecioacuten encontrada en este
estudio se encuentra dentro del hot spot proximal en donde se han reportado
menores frecuencias de deleciones en la literatura con respecto al dista pero 38
B N MP 50pb
4 5 6 7 8
que sin embargo en este estudio por presentar una frecuencia tan baja de
deleciones y ademaacutes porque es el uacutenico estudio enfocado en la buacutesqueda de
deleciones fuera de los hot spots no se pueden comparar las frecuencias de los
diferentes estudios reportados en la literatura debido entre otros a que la
mayoriacutea de autores solo explora los hot spots del gen por lo cual solo estudios
como el realizado por Haider et al 1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al
2001 pueden ser comparados con este que sin embargo tampoco es pertinente
ya que en el presente estudio no se reportaron frecuencias de delecioacuten para
puntos intermedios de los hot spots del gen de la distrofina por esta razoacuten las
diferencias en cuanto a las frecuencias de distribucioacuten para Colombia en el
presente estudio y los anteriormente mencionados resultan altamente
significativas aun sin un sustento estadiacutestico
7 DISCUSIOacuteN
En cuanto a la estandarizacioacuten de los diferentes sistemas de PCR multiplex se
puede decir que la organizacioacuten fue adecuada para su corrido y que para
diagnoacutesticos moleculares de esta enfermedad pueden ayudar a encontrar el
dantildeo molecular claro esta en compantildeiacutea de los diferentes sistemas de PCR
multiplex utilizados normalmente en este tipo de pruebas y junto con los 17
exones analizados anteriormente por Silva et al 2004
En este estudio en el 27 de los pacientes analizados se encontroacute delecioacuten
aumentando asiacute la frecuencia reportada para Colombia en estudios previos a
este pero que aun asiacute contrasta todaviacutea con las frecuencias reportadas por la
literatura mundial
La delecioacuten reportada en este estudio se encuentra en el ldquohot spotrdquo proacuteximo a la
regioacuten 5acutedel gen El cual fue estudiado para el paiacutes por Silva et al 2004 y en la
literatura mundial por Forrest et al 1987 Koening et al 1987 Darras et al
1988 Baumbach et al 1988 Esta delecioacuten se ubica en el punto de menor
incidencia de deleciones reportado Sin embargo casos como en la poblacioacuten
brasilentildea se encontroacute una mayor frecuencia de delecioacuten en el hot spot proximal
que en el distal (Werneck et al 2001)
39
En un 97 de los pacientes no se encontroacute delecioacuten para los 15 exones
analizados debido seguramente a que el dantildeo molecular de estos no se
encontraba dentro de los ldquohot spotsrdquo reportados o corresponde a mutaciones
puntuales o duplicaciones con respecto a la literatura citada se puede decir que
algunos de los 15 exones utilizados en el presente estudio han sido analizados
por otros autores tales como Haider MZ et al 1997 Onengut et al 2000
Vaacutezquez et al 1997 Singh et al 1997 y Werneck et al 2001 con el fin de tener
una mayor cobertura a lo largo del gen e identificar un mayor numero de
deleciones pero en su mayoriacutea se han reportado frecuencias muy bajas o nulas
como es el caso de este estudio
Es importante tener en cuenta que el punto donde se encuentran alrededor del
80 a 90 de las deleciones se encuentra entre los exones 44-54 solo uno de
estos (exon 53) analizado en este estudio mientras que los demaacutes si se
analizaron y reportaron para Colombia por Silva et al 2004 en poblaciones
mexicanas por Vaacutezquez et al 1997 en el noreste italiano por Siciliano et al
1999 y en la mayoriacutea de estudios a nivel mundial Para la poblacioacuten colombiana
estudiada hasta el momento se podriacutea decir que se necesita un anaacutelisis en los
dos ldquohot spotsrdquo con un tamantildeo de muestra mayor en concordancia con lo
descrito por Werneck et al 2001 quien propone que las diferencias en las
frecuencias de delecioacuten entre poblaciones pueden ser debido al tamantildeo de la
muestra En la literatura algunos autores donde ademaacutes de analizar exones en
los hot spots reportados analizan tambieacuten exones fuera de ellos como es el caso
del presente estudio y de autores como Haider MZ et al 1997 quien encontroacute
frecuencias de delecioacuten para sitios fuera de estos hot spots Esta fue una de las
razones por lo cual se escogieron estos exones para el presente estudio que a
diferencia con los demaacutes no se reporto ninguna frecuencia para los exones
analizados y que ademaacutes presenta bajas frecuencias de delecioacuten en los hot spots
lo cual quiere decir que la poblacioacuten colombiana de estudio presenta
caracteriacutesticas mutacionales geneacuteticoraciales muy distintas en comparacioacuten con
lo reportado en la literatura mundial y seguacuten lo analizado en el presente estudio
asiacute como lo reportado anteriormente por Silva et al 2004 Baranzini et al 1998
y Delgado et al 1994 Tambieacuten se debe hacer eacutenfasis en el correcto diagnostico
40
de los pacientes ya que ninguno de los pacientes analizados en este estudio
tenia un reporte de biopsia muscular ni tampoco de un anaacutelisis de
inmunohistoquiacutemica con lo cual se tendriacutea un diagnostico mas acertado de el
tipo de distrofia muscular que se presentaba en cada caso
Por otro lado tambieacuten se deben analizar los demaacutes tipos de mutaciones como
las duplicaciones y las mutaciones puntuales siendo el abordaje de las
duplicaciones maacutes faacutecil que el abordaje de las mutaciones puntuales debido al
gran tamantildeo del gen datos que hasta el momento se desconocen en la poblacioacuten
colombiana afectada con DMDDMB de tal forma que se puedan ofrecer
estudios a las familiares por liacutenea materna de los afectados determinando el
estado de portadora de deleciones y duplicaciones a traveacutes de anaacutelisis de dosis
geacutenica e indirectos a traveacutes del anaacutelisis por medio de marcadores moleculares o
STRacutes
Comparando la distribucioacuten de las frecuencias de de deleciones entre lo
reportado en este estudio para Colombia con lo reportado anteriormente por
Silva et al 2004 y en las poblaciones brasilera por Werneck et al 2001
Turquiacutea por Onengut et al 2001 y Arabia Saudi por Haider et al 1997 (tabla
10) ademaacutes de las diferencias que se presentan con Colombia se puede
observar que estas frecuencias de delecion dependen directamente del tamantildeo
de muestra y del numero de exones analizados por otra parte se puede observar
que Colombia en general presenta frecuencias de delecion muy bajas y que los
exones intermedios analizados no presentan frecuencias de delecion como
ocurrioacute en los 11 exones analizados en el presente estudio
41
Tabla 10 Comparacioacuten entre la distribucioacuten de las frecuencias de deleciones de
este estudio con lo reportado por la literaturaMuestra proximal intermedio distal No (P)
delecion
No
Del
Referencia
Colombia 36 1 (100) 0 0 1 (27) 1 Este
estudioColombia 62 8 (32) 2 (10) 13 (58) 19
(31)
23 Silva et al 2004
Brasil 48 93
(477)
25
(127)
78
(3970)
42
(875)
196 Werneck et al 2001
Arabia S 42 41 (25) 25 (15) 99 (60) 36
(86)
165 Haider et al 1997
Turquiacutea 242 42
(146)
2 (069) 242
(846)
146
(60)
286 Onengut et al 2000
No Nuacutemero (P) Pacientes
En la figura 9 se puede observar como se comportan las deleciones en el gen de
la distrofina a traveacutes de los diferentes estudios realizados en donde se puede
observar que la mayoriacutea de las deleciones recaen sobre los hot spots lo que
quiere decir que un analisis de deleciones fuera de estos puntos no es necesario
como complemento para el diagnostico molecular de DMDDMB lo cual se
evidencia debido a que seguacuten lo reportado por Silva et al 2004 Haider et al
1997 Onengut et al 2000 y Werneck et al 2001 en ninguacuten paciente se hallo
delecioacuten solo en los puntos intermedios por el contrario aquellos pacientes que
evidenciaron delecioacuten en estos puntos presentaban deleciones muy largas que
en algunos casos comprendiacutean desde el hot spot proximal hasta el distal Por
esta razoacuten con solo el analisis de exones dentro de los hot spots se puede llegar
a un correcto analisis molecular de DMDDMB
Figura 9 Distribucioacuten de las deleciones reportadas para algunas poblaciones en donde se
estudiaron los hot spots y puntos intermedios42
Distribucion de deleciones en el gen DMD
0
50
100
150
200
250
300
Colombia Colombia B rasil Arabia S audi TurquiaP obl a c i oacuten
Proximal
Intermedio
Distal
Hot spots
43
8 CONCLUSIONES
El presente estudio sirvioacute como una fase piloto para la estandarizacioacuten e
implementacioacuten de nuevos primers para el diagnostico molecular del gen de la
distrofina con el fin de complementar el diagnostico cliacutenico dictaminado por
ortopedistas neuroacutelogos fisiatras y genetistas Sin embargo su implementacioacuten
en el diagnostico molecular no es necesario debido a que para la poblacioacuten
colombiana estudiada no se encontroacute ninguna frecuencia de delecioacuten para
puntos intermedios y fuera de los hot spots del gen de la distrofina
Por otra parte se puede concluir que la poblacioacuten colombiana de estudio
afectada con distrofia muscular de Duchenne o Becker sigue presentando bajas
frecuencias de delecion como causa del dantildeo molecular De esta forma se puede
afirmar que los dantildeos moleculares mas frecuentes en poblaciones con bajas
frecuencias de delecion para el gen de la distrofina se pueden dar por
duplicaciones y mutaciones puntuales de las cuales no se tiene ninguacuten reporte
en la poblacioacuten colombiana hasta el momento Tambieacuten se puede decir que en
las poblaciones donde se realizan estudios con grandes tamantildeos de muestra se
describen frecuencias de mas de un 50 de deleciones presentes en afectados
como es el caso de paiacuteses como Turquiacutea USA Brasil y algunas poblaciones
europeas las cuales corroboran lo descrito por autores como Beggs et al 1991
quien describe que con 18 pares de primers correspondientes a exones dentro de
los dos hot spots se pueden identificar hasta un 98 de las deleciones presentes
en el afectado sin embargo para las poblaciones latinoamericanas y en especial
la colombiana las frecuencias de delecioacuten se mantienen constantes con el
aumento del tamantildeo de la muestra
Por consiguiente este estudio sirve para corroborar que Colombia presenta bajas
frecuencias de delecion con respecto a lo reportado por la literatura mundial
pero que con respecto a algunas poblaciones latinoamericanas presentan
frecuencias similares por lo cual los estudios en estas se deben enfocar a
44
describir frecuencias a nivel poblacional de otro tipo de mutacioacuten como causa
del dantildeo molecular en pacientes afectados con distrofia muscular
9 RECOMENDACIONES
En el presente estudio se logro la estandarizacioacuten de condiciones de PCR para
15 exones del gen de la distrofina los cuales se encuentran fuera de los dos hot
spots los cuales no son necesarios como una alternativa de complemento para el
diagnostico molecular de la distrofia muscular de Duchenne y Becker en
pacientes en los que no se ha encontrado delecioacuten para los 17 exones
comuacutenmente analizados De esta manera un correcto anaacutelisis molecular como
complemento para el diagnostico de DMDDMB es empleando la teacutecnica de
PCR multiplex con primers dirigidos a exones presentes en los hot spots y si se
quiere un mayor grado de certreza se podria pensar en el anaacutelisis del cDNA por
southern blot
Respecto al anaacutelisis de deleciones se pudo concluir que Colombia presenta
frecuencias de delecion muy bajas con respecto a lo reportado en la literatura
por lo cual los estudios futuros deben estar enfocados en identificar otro tipo de
mutaciones como las de tipo puntual y en describir frecuencias de duplicaciones
en el gen de la distrofina y en un nivel mas especifico se necesitan hacer
estudios tambieacuten utilizado otro tipo de metodologiacuteas como la
inmunohistoquiacutemica que es la teacutecnica que mejores resultados aporta al
diagnostico de DMDDMB
45
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52
11 ANEXO 1
COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SENtildeORA DEL ROSARIOFACULTAD DE MEDICINA
INSTITUTO DE CIENCIASBASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIacuteA CELULAR Y MOLECULAR
CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLOacuteGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIOacuteNIDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN
PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Usted (o su pariente) estaacute invitado a participar en un estudio de investigacioacuten propuesto por el instituto de Ciencias Baacutesicas laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la Universidad del Rosario con la participacioacuten deClaudia T Silva Biol MSc amp Dora Fonseca BiolMScEs muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realizacioacuten de este estudio
(a) La participacioacuten en este estudio es totalmente voluntaria(b) La naturaleza de esta investigacioacuten su propoacutesito sus limitaciones sus riesgos sus inconvenientes
incomodidades y cualquier informacioacuten pertinente al resultado de este le seraacute explicada por el equipo de atencioacuten cliacutenica
(c) Si tiene alguacuten interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores quien con mucho gusto le contestaraacute sus preguntas
(d) CONFIDENCIALIDAD Los registros meacutedicos de cada individuo permaneceraacuten archivados en el Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular de la universidad del Rosario Las historias meacutedicas los resultados de exaacutemenes y la informacioacuten que usted nos ha dado son de caraacutecter absolutamente confidencial de manera que solamente usted y el equipo de atencioacuten cliacutenica tendraacute acceso a estos datos Por ninguacuten motivo se divulgaraacute esta informacioacuten sin su consentimiento
(e) De acuerdo con lo establecido en la resolucioacuten 008430 de 1993 (ldquoNormas cientiacuteficas teacutecnicas y administrativas para la investigacioacuten en saludrdquo) este estudio puede ser clasificado como una ldquoInvestigacioacuten con riesgo miacutenimordquo Se cumpliraacute con lo establecido por el Ministerio de Proteccioacuten Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud) la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993
Cualquier informacioacuten adicional usted puede obtenerla directamente con Claudia T Silva y Dora Fonseca Laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular Instituto de Ciencias Baacutesicas Facultad de Medicina Universidad del Rosario Tel (57-1)3474570 (Ext340- 246411)
52
A EXPLICACIOacuteN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIOacuteN AL INDIVIDUOOBJETIVOIdentificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB a partir de una muestra de DNA obtenida de sangre perifeacuterica la cual es obtenida por venopuncioacuten del paciente PROCEDIMIENTOSe realizaraacute una entrevista cliacutenica con usted y se tomaraacute una muestra de aproximadamente 10 ml de sangre mediante puncioacuten en vena perifeacuterica respectivamente En caso de que sea necesario repetir los exaacutemenes usted seraacute notificado para tomar las muestras nuevamente Estas muestras seraacuten manejadas y analizadas uacutenicamente por personas involucradas directamente en este proyecto y almacenadas en nuestro laboratorio de Biologiacutea Celular y Molecular
RIESGOS E INCOMODIDADES La participacioacuten en este estudio representa riesgo miacutenimo para su salud e integridad y las molestias y efectos adversos estaraacuten representadas exclusivamente por la toma de muestra referida en el procedimiento algunas molestias pueden ser hematomas enrojecimiento yo sensibilidad al tacto en el lugar de donde se extrae la muestra sin embargo estas seraacuten de manera transitoriaBENEFICIOS ADICIONALESEste estudio nos ayudara a entender las causas y los mecanismos del dantildeo molecular presente en los pacientes con distrofia muscular de Duchenne y Becker (DMDDMB)RESPONSABILIDAD DEL PACIENTE Y PRECAUCIONESAl tomar parte de este estudio es importante que usted contemple las siguientes responsabilidades y precaucionesEl riesgo existente en una toma de muestra de sangre en vena perifeacuterica es muy bajo y por lo tanto no reviste riesgo en la salud del paciente MANEJO DE RESULTADOS Los resultados que se obtengan de la investigacioacuten soacutelo tendraacuten sentido si son tomados en forma conjunta y no tendraacuten validez en forma individual por lo tanto se entregaran en una charla informativa al final del estudioAUTORIZACIONLa utilizacioacuten de la muestra en estudios posteriores nos podriacutea ayudar en el futuro a entender las causas yo el comportamiento de la(s) entidad(es) anteriormente mencionada(s) Se puede dar el caso en donde usted y su familia no se beneficien directamente de estos estudios pero tanto su familia como otros individuos afectados podriacutean beneficiarse Por lo tanto por favor marque su decisioacuten con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilizacioacuten en estudios de investigacioacuten posteriores Deseo que la muestra que me fue extraiacuteda sea DESECHADA una vez completado el estudio Autorizo conservar la muestra que me fue extraiacuteda con la posibilidad de emplearla junto con el
resultado del estudio en las situaciones sentildealadas a continuacioacuteno En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones
nacionales yo internacionales enviando la muestra al exterior a el(los) laboratorio(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s)
Si No
o En estudios complementarios de diagnoacutestico para mi o alguacuten miembro de mi familia
Si No
o En estudios de investigacioacuten especiacuteficos para la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten de entidades distintas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de muestra siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
o En estudios de investigacioacuten colaborativos con otras instituciones nacionales yo internacionales siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo aprobacioacuten del comiteacute de eacutetica y se conserve en anonimato mis datos de identificacioacuten
Si No
AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION VOLUNTARIA EN EL ESTUDIO
IDENTIFICACIOacuteN DE DELECIONES Y MUTACIONES EN EL GEN DE LA DISTROFINA EN PACIENTES CON DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Y BECKER (DMDDMB)
Habiendo sido enterada(o) del contenido del presente estudio informada(o) que no tendreacute ninguacuten beneficio 54
directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigacioacuten Yo________________________________________ con documento de identificacioacuten nuacutemero _____________________ de ________________ acepto voluntariamente que se me tome una muestra de sangre o al menor _______________________ del que soy responsable con el fin de realizar anaacutelisis de DNA con el fin de identificar deleciones y mutaciones puntuales como causa de la enfermedad de DMDDMB Asiacute mismo declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo que se le daraacute al material de muestra
Fecha ________________________________
Nombre_____________________________________
_____________________________________________Firma Paciente o Acudiente Representante legal
Iacutendice derecho
Nombre___________________________ Nombre _________________________
Direccioacuten__________________________ Direccioacuten ________________________
Teleacutefono__________________________ Teleacutefono _________________________
Parentesco________________________ Parentesco_______________________
Firma____________________________ Firma___________________________CC CC Testigo 1 Testigo 2
__________________Investigador
Bogotaacute DC Fecha___________________________________________
ANEXO 2
Protocolo de extraccioacuten de DNA de Salting out
1 Antildeadir 500 microl de sangre a un tubo de capacidad para 2microl
2 Adicionar 900 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos rojos
55
3 Introducir al congelador por 10 minutos
4 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
5 Descartar el sobrenadante
6 Repetir desde el paso 2 por 3 veces
7 Adicionar 500 microl de solucioacuten de lisis de gloacutebulos blancos 10 microl de SDS y 500
microl NaCl 6M
8 someter a agitacioacuten por vortex
9 Introducir al congelador por 10 minutos
10 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
11 tomar el sobrenadante y pasar con 500 microl de isopropanol a otro tubo y mezclar
por inversion
12 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
13 Descartar el sobrenadante
14 Adicionar 500 microl etanol al 70
15 Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
16 Descartar el sobrenadante
17 secar el pellet 10 minutos
18 resuspender en 100 microl de agua MQ
19 incubar a 37ordmC por 2 horas o mas
20 Guardar a -20ordfC
56
ANEXO 3
Tabla de recoleccioacuten de la informacioacuten de los 5 sistemas de PCR multiplex
utilizadosDMD No 2 2A 3B 4B 4C OBSERV
461116192022232628303136375053636468707376777880818287929394969799
100
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![Ciclo celular y Cáncer - [DePa] Departamento de …depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/UNIDAD_8_REGULACION...Se requieren dos mutaciones sobre el gen supresor para eliminar su actividad](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/5bb70a0a09d3f20c668d26c3/ciclo-celular-y-cancer-depa-departamento-de-depafquimunammxamydarchiverounidad8regulacionse.jpg)
