Cepa C

COCOS GRAM-POSITIVOS Staphylococcus aureus

FISIOLOGIA MICROBIANA

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD ASIGNATURA - FISIOLOGA MICROBIANA

DOCENTE-JUAN CARLOS PRADA HERRERA PROGRAMA MICROBIOLOGA

IDENTIFICACIN DE COCOS GRAM POSITIVOS A TRAVS DE PRUEBAS BIOQUIMICAS CONVENCIONALES

GRELYS JOHANA TERNERA MEJIA GINO FRANCHESCO OLIVIERI SALAS

KATHY GRISALES HERNANDEZ IVONN CAROLINA SIMANCA MEDINA

HERNILDA HOYOS ANGULO IDEZARETH HERNANDEZ MESTRE

VALLEDUPAR CESAR

2015

INTRODUCCIN

Los cocos Gram positivos son microorganismos que se aslan con ms frecuencia

en muestras de pacientes y se han involucrado como agentes importantes en

enfermedades infecciosas, estos microorganismos se encuentran ampliamente

distribuidos en la naturaleza y algunos hacen parte de la microbiota normal de la

piel y mucosas del hombre y de animales. Es de vital importancia identificarlos

puesto que de ello depende que se lleve a cabo un buen diagnstico y

procedimiento cuando se est frente a este tipo de patgenos.

OBJETIVOS

Estudiar las caractersticas macroscpicas, microscpicas y cambios

producidos por el microorganismo en los diferentes medios utilizados.

Conocer algunas de las pruebas bioqumicas de laboratorio utilizadas para la

identificacin de especies de cocos Gram-positivos.

Identificar gnero y especie de una cepa bacteriana que es totalmente

desconocida antes de aplicar las pruebas.

MARCO TERICO

En microbiologa, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram: de aqu el nombre de "Gram-positivas" o tambin "Gram positivas". Esta caracterstica Qumica est

ntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organizacin bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxn se utiliza tambin el nombre de pos

bacteria. Las restantes son las bacterias Gram negativas. La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmtica y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano, que rodea a la anterior.

La pared celular se une a la membrana citoplasmtica mediante molculas de cido lipoteicoico. La capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tincin de Gram.

A diferencia de las Gram-positivas, las Gram-negativas presentan una segunda membrana lipdica externa a la pared celular. Incluyen especies tanto mviles con va flagelos como inmviles con forma de bacilo (Bacillus, Clostridium,

Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria) o coco (Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas (Mycoplasma). Algunas especies son fotosintticas, pero la mayora son hetertrofas. Muchas de estas bacterias

forman endosporas en condiciones desfavorables.4 Realmente, no todas las bacterias del grupo son Gram-positivas (no se tien por la aplicacin de ese mtodo), pero se incluyen aqu por su similitud molecular con otras bacterias

Gram-positivas. (Koneman, 2006).

Los cocos Gram positivos son microorganismos unicelulares, caracterizados por presentar una forma esfrica, en la que algunas de sus especies se agrupan en diferentes patrones, de manera que son clasificados por su forma en diplococos, los cuales son cocos asociados en parejas como el Streptococcus Pneumoniae o neumococo; los tetracocos, ttradas o tetrgenos son cuatro micrococos dispuestos a manera de cuadro; la sarcina que adopta formaciones en paquete de ocho o ms micrococos.

A su vez, los Staphylococcus se presentan en esferas que forman racimos de uvas como el Staphylococcus aureus; y por ltimo los Streptococcus formados por esferas dispuestas en cadena, resultado de su divisin a lo largo de un eje, lo que lo diferencia del Staphylococcus que se divide en varios ejes formando racimos. Los Staphylococcus son microorganismos que presentan una colonizacin transitoria en el individuo como sucede con el S. aureus presente en la humedad de los pliegues de la piel, la orofaringe, tracto gastrointestinal, adems del urogenital, siendo considerado el causante de ciertas patologas a travs de sus toxinas o invasin directa lo que produce destruccin de los tejidos.

De la misma manera los Streptococcus presentan especies patgenas para el organismo humano, mientras que otros forman parte de la microbiota normal de la piel y las mucosas en individuos inmunocompetentes, siendo estos ltimos oportunistas en situaciones que presenten factores predisponentes como sucede con el estrs o enfermedades consuntivas. A su vez se encuentran los Enterococcus que son considerados, patgenos oportunistas, presentes en la microbiota normal del tracto gastrointestinal y son causantes de infecciones en heridas quirrgicas, infecciones urinarias, adems de abscesos intrabdominales.

Por sus parte y de acuerdo a los requerimientos atmosfricos se pueden clasificar en: aerobios y anaerobios facultativos, representados por la familia de Micrococacceae que comprende a los Staphylococcus, Micrococcus, Stomacoccus y Planococcus, adems de los gneros Streptococcus y Enterococcus; existiendo adema los anaerobios estrictos, representados por los Peptococcus y Peptoestreptococcus. (Evangelina Olivas).

http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&task=download&id=7611

MATERIALES

Cepa bacteriana.

Microscopio.

Agar Manitol al 7%

Agar nutritivo.

Agar sangre.

Agar DNasa.

Agar Mueller Hinton.

Tubo con EDTA 0.5

Caldo nitrato.

Fosfatasa Alcalina.

Oxidasa.

Novobiocina discos.

Escala de Macfarlan

Glucosa 5ml 0.5 al 1%

Maltosa 5ml 0.5 al 1%

Sacarosa 5ml 0.5 al 1%

Manitol 5ml 0.5 al 1%

Manosa 5ml 0.5 al 1%

Tubos estriles centrifuga

Alcohol

Algodn

Asas para siembra

Mechero

Fsforos

Gradilla

Reactivos para la tincin de Gram

Lminas

Cinta para rotular

PROCEDIMIENTO

Se toma una cepa bacteriana como parte del anlisis cuya finalidad es lograr

identificar que microorganismo est presente a travs del uso de una serie de

pruebas bioqumicas convencionales. La presente tcnica es para la deteccin de

Staphylococcus y ms que todo la especie aureus, la cual consiste en los

siguientes pasos:

Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo slido, el cual inhibe el

desarrollo de gneros diferentes al Staphylococcus, pero adems permite

reconocer el desarrollo caracterstico del microorganismo buscado.

Recuperacin de la cepa, este paso permite restaurar las clulas daadas

de Staphylococcus aureus.

Identificacin bioqumica, en este punto se identifica el gnero y especie

de Staphylococcus aureus. Estas pruebas bioqumicas (de acuerdo a la

Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa, catalasa y

presencia de la enzima termonucleasa.

La caracterizacin bioqumica de Staphylococcus aureus se obtiene a travs de

pruebas convencionales siguiendo estos pasos:

Se ingres al laboratorio de microbiologa manteniendo las normas de

bioseguridad.

Se procedi a escuchar una breve introduccin de lo que ser la prctica a

realizar (pruebas bioqumicas de identificacin).

Escuchar con atencin las pautas, recomendaciones y normas para realizar

la prctica (indicaciones) por parte del profesor.

Observar con detenimiento y anotar todos los pasos realizados por el

docente al realizar una demostracin rpida de lo que ser la prctica a

realizar (pruebas bioqumicas de identificacin).

Preparar el rtulo respectivo para las placas asignada (1 por grupo) (Fecha,

agar, tcnica, muestra, T, nombre, grupo).

Se realiz la identificacin de la morfologa colonial de la cepa tal y como

se percibe y se pudo observar que las colonias eran mediadas

blanquecinas, con una forma redonda u ovalada.

Luego se realiz la tincin de Gram con los respectivos reactivos y

respetando el tiempo para cada uno.

Se observ en el microscopio y se hizo una posible identificacin puesto

que se encontraron cocos en racimos de color morado.

Se tomaron fotografas y se anotaron los resultados.

Se procedi a inocular y a sembrar el microorganismo en las diferentes

pruebas bioqumicas y agares e incubar a 37C y as determinar el nombre

del microorganismo teniendo en cuenta los resultados al revelar.

Siembra en Agar Nutritivo

Se tom de la placa con el medio de cultivo una muestra del

microorganismo con el asa redonda, previamente flameada.

Luego en la placa con tapa previamente rotulado en donde se encuentra el

Agar Nutritivo.

Luego sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por

Agotamiento.

Cerramos hermticamente despus de sembrar y se coloc en la

incubadora a 37 durante 24 horas.

Presencia de catalasa

Se toma un portaobjetos nuevo

Con un asa se tom una colonia y se deposit en un portaobjetos

Luego se aadi una gota de perxido de hidrgeno al 30%

Y se observ la formacin de burbujas (resultado positivo)

Presencia de Coagulasa

Se mezcl con un asa cargada con el microorganismo obtenido de un

cultivo en medio slido,

Se agreg en 0,5 ml de plasma de humano, contenido en un tubo pequeo

de aproximadamente 7 mm de dimetro.

Se Incubo a 37C y se examin peridicamente durante 4 horas.

Siembra en agar BHI

Se tom de la placa con el medio de cultivo una muestra del

microorganismo con el asa de platino en forma de , previamente flameada.

Luego en la placa con tapa previamente rotulada en donde se encuentra el

Agar BHI.

Luego sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por

Agotamiento.

Cerramos hermticamente despus de sembrar y se coloc en la

incubadora a 37 durante 24 horas.

Presencia de DNasa

Se tom de la placa con el medio de cultivo una muestra del

microorganismo con el asa de platino en forma de aro, previamente

flameada.

Luego en la placa con tapa previamente rotulada en donde se encuentra el

Agar DNasa.

Luego sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por

Agotamiento.

Cerramos hermticamente despus de sembrar y se coloc en la

incubadora a 37 durante 24 horas.

Presencia de sensibilidad por Novobiocina en agar Mller Hinton

Se tom de la placa con el medio de cultivo una muestra del

microorganismo con el asa de platino en forma de aro, previamente

flameada.

Luego en la placa con tapa previamente rotulada en donde se encuentra el

Agar Mller Hinton.

Luego sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por

Agotamiento.

Se agregan 3 sencidisco de novobiocina con una pinsa esteril

Cerramos hermticamente despus de sembrar y se coloc en la

incubadora a 37 durante 24 horas.

Presencia de Hemolisis

Se tom de la placa con el medio de cultivo una muestra del

microorganismo con el asa de platino en forma de aro, previamente

flameada.

Luego en la placa con tapa previamente rotulada en donde se encuentra el

Agar Sangre.

Luego sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por

Agotamiento.

Cerramos hermticamente despus de sembrar y se coloc en la

incubadora a 37 durante 24 horas.

Crecimiento en Manitol Salado

Se tom de la placa con el medio de cultivo una muestra del

microorganismo con el asa de platino en forma de aro, previamente

flameada.

Luego en la placa con tapa previamente rotulada en donde se encuentra el

Agar Manitol Salado.

Luego sembramos con el asa utilizando el metodo de siembra por

Agotamiento.

Cerramos hermticamente despus de sembrar y se coloc en la

incubadora a 37 durante 24 horas.

Fermentacin de Manitol, Sacarosa, Maltosa y Glucosa

Se tomaron de la placa con el medio de cultivo dos muestra del

microorganismo con el asa de platino en forma de punta, previamente

flameada.

Se tomaron los tubos de ensayo con tapa previamente rotulado en donde se

encuentran las azucares con rojo de metilo y campana de durhan: (Manitol,

Sacarosa, Maltosa y Glucosa).

Luego se flamearon los tubos al abrir y se sembr con el asa utilizando el

metodo de siembra por resuspensin.

Se Cerr despus de sembrar y se coloc en una gradilla y en la incubadora a

37 durante 24 horas.

RESULTADOS

CEPA BACTERIANA

CEPA OBSERVADA AL MICROSCOPIO

REACCIN CATALASA

AGAR SANGRE DESPUS DE 24 HORAS

AGAR SANGRE DESPUS DE 72 HORAS

PRUEBAS FERMENTACION DE AZUCARES A 24 HORAS

A 48 HORAS

MANOSA GLUCOSA MALTOSA SACAROSA

PRUEBA NITRATO PRUEBA UREA PRUEBA COAGULASA

AGAR MUELLER HINTON CON SENCIDISCOS DE NOVOBIOCINA

AGAR BAIRD PARKER AGAR DNasa

ANALISIS DE RESULTADOS

PRUEBA RESULTADO POSIBLE MICROORGANISMO

TINCION DE GRAM

til para la identificacin de la morfologa microscpica de la especie bacteriana.

GRAM-POSITIVO: Cocos

agrupados en racimos S. epidermidis, S. aureus S. saprophyticus, S. pyogenes, S. agalactiae, S. pneumoniae, entre otros.

CATALASA Identificar si el microorganismo posee la enzima catalasa. til para la diferenciacin de microorganismos del genero Staphylococcus y Streptococcus

POSITIVO: El microorganismo posee la enzima catalasa y la utiliza para desdoblar el perxido de hidrogeno en agua y oxigeno.

Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus Staphylococcus saprophyticus

HEMOLISIS Detecta la presencia de hemolisina, enzima que permite la clasificacin de cocos en alfa, beta y gamma hemolticos.

BETA HEMOLITICO: hemolisis total o un halo grueso alrededor de la colonia.

Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalectiae, Staphylococcus aureus.

MANITOL- SALADO Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos.

POSITIVO: acidificacin del medio, el microorganismo es capaz de crecer en altas concentraciones de sal.

S. aureus y algunas cepas de S. saprophyticus

COAGULASA Enzima que estimula la conversin de fibringeno en fibrina, comprueba la capacidad de un microrganismo de coagular el plasma por accin de esta enzima.

POSITIVO: El microorganismo es capaz de coagular plasma a travs de la enzima coagulasa.

S. aureus

SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA Antibiotico que en agar Mueller -Hilton inhibe el crecimiento de algunos Staphylococcus.

SENSIBLE: El microorganismo no muestra resistencia ante el antibitico.

S. aureus y S. saprophyticus

FERMENTACION DE AZUCARES (Glucosa, Maltosa, Sacarosa, Manitol)

til para observar la capacidad

POSITIVO para todos los

azucares con formacin de gas en la campana de Durham

S. aureus

del microorganismo de fermentar estos azucares con produccin de gas en la campana de Durham

BAIRD PARKER Medio de alta especificidad diagnstica, selectivo y diferencial para el aislamiento y recuento de estafilococos en alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

Colonias negras brillantes debido a la reduccin del telurito a telurio.

S. aureus y S. epidermidis

DNasa

Determina la capacidad del microorganismo para desdoblar el ADN en sus nucletidos a partir de la enzima DNasa.

El resultado fue variable puesto que el microorganismo creci, pero al momento de revelarlo dio negativo y esto se debe a que el medio estaba vencido.

S. aureus

De acuerdo a lo anteriormente descrito podemos deducir que la cepa C que nos

fue entregada corresponde a Staphylococcus aureus ya que responde de

manera positiva a las pruebas catalasa, coagulasa y DNasa, adems fermenta los

azucares en su totalidad, caractersticas propias de esta especie. Cabe resaltar

que las dems pruebas fueron realizadas con el fin de tener un mayor

conocimiento en la diferenciacin de este gnero y aportar un reporte completo en

la presentacin de los resultados.

CONCLUSIN

En algunas infecciones graves es importarte determinar el patgeno o agente

infectante y para eso es necesario tener conocimiento de que pruebas son tiles

para la identificacin de dicho agente. En el caso de Staphylococcus aureus puede

encontrarse infecciones en casi todos los sitios anatmicos siendo ms frecuentes

en lesiones de la piel y partes blandas, esto obliga a realizar un diagnostico previo

para luego tratar la infeccin.

BIBLIOGRAFIAS

http://www.revistasbolivianas.org.bo/scielo.php?pid=S2304-

37682014001000004&script=sci_arttext

10/06/15

11:39am

Elmer W. Koneman, Stephen Allen. Diagnostico Microbiolgico. Capitulo 40

pg. 39. Editorial Mdica panamericana. Ao 2006. Argentina, Espaa,

Mxico, Venezuela.

Evangelina Olivas, Manual de prcticas de Microbiologa I, II y

parasitologa. Prctica 6. Pg. 25. Editorial Mdica panamericana. Ao

2004. Mxico.