Identificación de dípteros de interés en la trasmisión de ...

Universidad Autónoma de Sinaloa Dirección General de Servicio Social

[Identificación de dípteros de interés en la trasmisión de la Leishmaniasis en el Estado de Sinaloa]

[Dr. Edith Hilario Torres Montoya]

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NOMBRE DEL PROYECTO:

Identificación de dípteros de interés en la trasmisión de la Leishmaniasis en el Estado de Sinaloa

CICLO: 2021-2022-1

MODALIDAD UNIDISCIPLINARIA

ELABORADO POR BRIGADISTA: Casillas Moreno Josué

ASESOR DE PROYECTO: Dr. Edith Hilario Torres Montoy

Fecha de autorización 22/09/2021




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I. Título del proyecto de servicio social Identificación de dípteros de interés en la trasmisión de la Leishmaniasis en el Estado de Sinaloa.

II. Antecedentes

Leishmaniasis

La leishmaniasis es una enfermedad zoonótica la cual se puede presentar en

animales como canidos, marsupiales, roedores, edentados e incluso al ser humano,

siendo las más comunes la leishmaniasis canina y la leishmaniasis humana

(Dirección General de Programas Preventivos., 2015). Esta patología se caracteriza

por la presencia de ulceras, en piel, mucosas y vísceras, transmitida por vectores

infectados con el parasito de Leishmania (The Center for Food Security & Public

Health., 2017).

Agente Etiológico

El parásito Leishmania es considerado un protozoario que pertenece al reino

Protista, subreino Protozoa, orden kinetoplastida y a la familia Trypanosomatidae,

en la que se encuentran 30 especies, de las cuales, 20 son considerados

organismos patógenos (The Center for Food Security & Public Health., 2017,

Sánchez-Saldaña et al., 2004). El género Leishmania se divide en dos subgéneros

según el sitio donde el parásito se desarrolle dentro del tubo digestivo del vector,

estos son, Leishmania, el cual se desarrolla en la parte anterior del píloro, en la




3

unión del intestino medio y posterior; Viannia se encuentra en el intestino medio

como posterior. En México se encuentran 3 especies de Leishmania, L. infantum, L.

mexicana y L. braziliensis. Esta enfermedad es considerada de declaración

obligatoria, por la Organización Mundial de la Salud (OMS), ya que, en su forma

visceral, puede llegar a ser mortal, por lo que cualquier caso debe ser reportado

(The Center for Food Security & Public Health., 2017, Dirección General de

Programas Preventivos., 2015).

Vectores

La Leishmaniasis se transmite a través de la picadura de pequeñas moscas,

llamadas flebótomos, las cuales son abundantes en las zonas tropicales, zonas

templadas y durante el verano. Hoy en día existen cinco géneros de flebótomos:

Phlebotomus, Sergentomya, Lutzomyia, Warileya y Brumptomya. Sin embargo, de

esas cinco especies, solo dos son reconocidas como vectores de Leishmania, el

género Phlebotomus en Europa, Asia y África (viejo mundo) y el género Lutzomyia

en América (nuevo mundo) (Sánchez-Saldaña et al., 2004). En México existen once

especies responsables de la transmisión del parásito, su importancia varía según la

especie de Leishmania que se le atribuye, la zona geográfica donde se encuentra y

la forma clínica que se asocia a su presencia; estos insectos suelen encontrarse

comúnmente en zonas selváticas, bosques tropicales, pero también hay especies

que pueden localizarse en zonas áridas y semi-desérticas (Dirección General de

Programas Preventivos., 2015).

Lutzomyia spp

Los flebótomos pertenecen al phylum Artropoda, clase Insecta, orden Díptera,

suborden Nematocera, familia Psychodidae, subfamilia Phlebotominae la cual se

divide en dos géneros, Phlebotomus en el viejo mundo y Lutzomyia en el nuevo

mundo. Se han reportado alrededor de 900 especies para los cinco géneros de

flebótomos, de las cuales 379 han sido reportadas para el género Lutzomyia y 30




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especies han sido catalogadas como vectores de Leishmania (Orellana., 2009,

Kwakye-Nuako., 2016). Los insectos del género Lutzomyia han sido descritos como

vectores para el parasito de Leishmania en América (Cuba Cuba., 2012). En México

se encuentran once especies responsables de la trasmisión del parasito, las cuales

se encuentran repartidas en diferentes zonas geográficas del país, por lo que su

importancia en salud publica depende de la especie que se encuentre en las

distintas regiones del mismo, debido a que existen algunas especies que son

vectores comprobados de Leishmania, como, Lutzomyia olmeca olmeca, Lutzomyia

diabólica, Lutzomyia cruciata, Lutzomyia shannoni, Lutzomyia longipalpis y

Lutzomyia evansi (Dirección General de Programas Preventivos., 2015).

Culicoides spp

Los miembros del orden Díptera, son insectos que se caracterizan por poseer solo

un par de alas membranosas funcionales para el vuelo, además de estar distribuidos

de manera mundial, por lo que se encuentran en cualquier zona terrestre

alcanzable. Estos insectos también reciben el nombre de “moscas”, “mosquitos”,

“jejenes” y “chaquistes”, dependiendo de la región en la que se encuentran. Dentro

del desarrollo de estos invertebrados se diferencian 4 estadios: huevo, larva, pupa

y adulto (Ibáñez-Bernal y Hernández-Ortiz., 2006). Dentro de la morfología de los

dípteros, se puede observar el cuerpo dividido en tres partes: cabeza, tórax y

abdomen (Carles y Hjorth., 2015). Este orden posee una variedad de familias de

entre las cuales se puede destacar la Cerotopogonidae, la cual comprende

alrededor de 6,089 especies distribuidas por todo el mundo. Los miembros de esta

familia se caracterizan por ser insectos que usualmente son depredadores de

insectos de menor tamaño o que se alimentan de néctar, sin embargo, existen

algunas especies que son consideradas hematófagas, siendo las hembras

portadoras de esta cualidad, estas se alimentan de sangre de algunos vertebrados,

incluyendo al hombre. Las especies consideradas hematófagas son de importancia




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médica y veterinaria, debido a que estos insectos son vectores y reservorios de

algunos agentes patógenos, por lo que esto contribuye a la transmisión de

enfermedades que afectan controversialmente al hombre y animales, entre los

cuales se encuentra el género Culicoides, entre otros. (Ibañez-Bernal y Hernández-

Ortiz., 2006, Gonzáles et al., 2012). Los insectos pertenecientes al género

Culicoides, se caracterizan por ser pequeños en tamaño, midiendo de 1 a 3 mm de

largo, siendo las hembras hematófagas, debido a que necesitan de la proteína

animal encontrada en la sangre para la maduración adecuada de sus huevos,

además de ser considerados de importancia médica y veterinaria, ya que, varias

especies son consideradas vectores de ciertos patógenos, como virus o parásitos

(Carles y Hjorth., 2015). Este género es el más diversificado de la familia

Ceratopogonidae, teniendo más de 1,400 especies registradas alrededor del

mundo, de las cuales el mayor porcentaje (96%), atacan comúnmente a los

vertebrados (Lopes y De Sousa., 2010). En México se han reportado alrededor de

49 especies de Culicoides de las cuales 3 han sido reconocidas para Sinaloa, las

cuales son C.blantoni, C. furens y C. phlebotomus (Huerta et al., 2012, Spinelli et

al., 2009).

III. Justificación La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria desatendida por parte del sector salud en México y el mundo. Siendo Sinaloa un estado endémico para la leishmaniasis cutánea en personas, aunado a la reciente identificación del primer caso de Leishmaniasis canina en el sur del Estado, la ubicación de los dípteros hematófagos con potencial carácter vectorial es sumamente pertinente para realizar las recomendaciones epidemiológicas que tengan lugar, en los municipios del centro de la entidad.

IV. Objetivos

- General

Determinar la prevalencia de Leishmania spp en dípteros del género




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Culicoides en el Estado de Sinaloa.

- Específicos

1. Caracterizar las especies del género Culicoides presentes en el área de

estudio.

2. Detectar a través de pruebas moleculares a Leishmania spp en Culicoides

spp.

3. Recomendar medidas preventivas a la población rural en las comunidades de estudio

V. Metas

Para este proyecto se proponen las siguientes metas:

Contar con el registro de organismos dípteros de interés en la trasmisión de

la Leishmaniasis en el estado de Sinaloa para

Estandarizar las pruebas de biología molecular necesarias tanto para la

detección de vectores como el reconocimiento de parásitos en la entidad.

Registrar los cambios espacio temporales en relación con la abundancia de

dípteros nematóceros de interés en la trasmisión de Leishmania sp

VI. Localización geográfica del proyecto

El siguiente proyecto se desarrollará en el Laboratorio de Conservación de Fauna

Silvestre y el Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Biología, ubicado

en la Ciudad Universitaria de la Universidad Autónoma de Sinaloa en Culiacán,

Sinaloa, (Fase de Laboratorio) y en 4 localidades: Imala y área suburbana de

Culiacán y Rosamorada y área suburbana de Navolato (Fase de Campo).




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VII. Actividades a realizar Para este proyecto se proponen un total de 10 actividades a realizar durante el

transcurso del año, dichas actividades se enlistan a continuación:

1. Búsqueda bibliográfica

2. Colecta de insectos

3. Conteo de insectos

4. Caracterización morfológica

5. Extracción de ADN

6. Ensayos moleculares (PCR, PCR-RFLP y electroforesis)

7. Secuenciación de ADN

8. Comparación del comportamiento de los insectos y el parasito durante el año

9. Comparación entre las localidades estudiadas

10. Interpretación de resultado

VIII. Recursos

Para este proyecto se necesitarán los siguientes recursos

- Humano:

Se Requiere un prestador de servicio social

- Material y Económico:

Cajas Petri (paquete 10 piezas $55.00 pesos)

Alcohol de 96° (20 L $1750.00 pesos)

Frascos para almacenar insectos (16 piezas $250 pesos)

Tubos Falcon (100 piezas $1200 pesos)




8

Hidróxido de Sodio ($665 pesos)

Tubos 2 ml (Bolsa con 500 tubos $277 pesos)

Sacos de malla para captura de Insectos (16 piezas $70 pesos)

IX. Financiamiento

Este proyecto está financiado por la Unidad Receptora, el Laboratorio de

Conservación de la Fauna Silvestre, cuyo responsable es el Dr. Edith Hilario Torres

Montoya.

Distribución espacio temporal de Culicoides spp

Se realizará una comparación entre las localidades a lo largo de toda la colecta de

insectos para establecer como se comportaron durante los meses de captura,

además de observar las cantidades de insectos atrapados, así como, verificar si las

variantes climáticas influyen en su comportamiento y en qué sitio se presentó

positividad ante Leishmania.

Análisis estadístico de los resultados

Todos los datos obtenidos en el área de estudio, serán anotados en la bitácora de

campo para después almacenarlos en una base de datos del programa Microsoft

Excel®. Para obtener las diferencias entre los datos de las localidades incluidas en

el estudio, así como de las diferencias entre las temporadas climáticas, el área de

captura de los vectores será analizadas mediante la prueba de análisis de varianza

de 3 vías (localidad de estudio, estación climática y el área de captura) con el

programa IBM SPSS Statistics v20.

Con la prueba de Chi-cuadrada se compararán las diferencias entre el espectro

trófico de los vectores según la temporada climática, el área de captura y el tipo de

hospedero. La positividad de Leishmania en los insectos capturados, así como los

hospederos analizados se obtendrá por conteo directo y cálculo de porcentajes.




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Todos los resultados se mostrarán con gráficos y tablas de frecuencia para su mejor

interpretación.

X. Metodología

Colecta de insectos.

Para la captura de los flebótomos se utilizarán trampas de luz tipo CDC las cuales

se colocan entre las 19:00 y las 20:00 horas, estas se ubican en sitios

peridomiciliarios/domiciliarios y en zona selvática. Los muestreos entomológicos se

realizarán bimensualmente durante un año a partir del mes de Agosto de 2021 y

terminarán en el mes de Julio de 2022 siguiendo la metodología descrita por

Sandoval et al en el 2006, asimismo durante los días de captura se tomarán datos

tales como: coordenadas del sitio de captura, fase lunar, vegetación autóctona,

condiciones orográficas, precipitación, temperatura, humedad, dirección y velocidad

del viento, entre otros. Los insectos capturados serán almacenados en frascos de

plástico con alcohol al 70% para la preservación de los mismos.

Identificación y caracterización morfológica

La identificación y caracterización de los dípteros capturados se realizará en el

laboratorio de Conservación de Fauna Silvestre de la Facultad de Biología siguiendo

la guía propuesta por Harrup et al en 2015

Identificación y caracterización molecular de los organismos

Extracción de ADN de los organismos

La extracción del ADN de los organismos colectados se realizará con el estuche

comercial Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega Corporation,

USA) ® para ellos se seguirán las instrucciones del fabricante.




10

Identificación molecular de los organismos

Para la identificación molecular de Culicoides sp. Se amplificará por PCR una

región de 710 pb del gen COI, para ello se utilizarán los iniciadores LCO1490: 5'

GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3' HC02198: 5'-TAA ACT TCA GGG

TGA CCA AAA AAT CA-3'). La reacción de PCR se llevará a cabo con el kit

comercial GoTaq Green Master Mix de la marca Promega y se seguirá las

indicaciones del fabricante.

La amplificación se realizará en un termociclador T100 de la marca BioRad con las

siguientes condiciones: 40 ciclos que comprenden desnaturalización a 95°C por

15’’, hibridación a 60°C por 30’’ y polimerización a 72°C por 30’’. Finalmente se

aplicará un paso de extensión a 72°C por 7´ (Moura-Rodrigues., 2016). Los

productos amplificados serán analizados por electroforesis en gel de agarosa al X%

previamente teñidos con colorante GelRed. Se empleará como marcador de peso

molecular DNA ladder de 100 pb de la marca Promega. El producto amplificado será

purificado mediante el estuche comercial Wizard DNA Purification System de la

marca comercial Promega. Una vez purificados serán enviados a secuenciación a

Macrogen Corp. Para después comparar las secuencias en la base de Gen Bank.

Identificación y caracterización molecular de organismos reservorios de

Leishmania.

Para la identificación de reservorios se empleará la técnica de PCR-RFLP, para ello

se amplificará un fragmento de 358 pares de bases (pb) del gen mitocondrial CYTB

mediante el uso de los iniciadores BM1 5’- CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC

A -3’ BM2 5’- CCA TCC AAC ATC TCA GCA TGA TGA AA -3’. Para la reacción de

PCR se utilizará el estuche comercial GoTaq Green master mix de la casa comercial

Promega Corporation y se seguirán las instrucciones del fabricante. La amplificación

se realizará en un termociclador T100 de la marca BioRad, con las siguientes

condiciones: 35 ciclos que consisten en un paso de desnaturalización a 94°C por 1

minuto, Hibridación a 65°C por 30 segundos y polimerización a 72°C por 30




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segundos y un paso final de extensión a 72°C por 7 minutos.

Para los RFLP, el fragmento amplificado será digerido con las enzimas de

restricción: Aci I, AluI, Hae III y Rsa I (Laison et al., 1994). Una alícuota de la

reacción de digestión será sometida a electroforesis en gel de agarosa o al X%

previamente teñida con GelRed y será analizado mediante un fotodocumentador

GelDoc. Se utilizará como marcador de peso molecular DNA ladder de 100 pb.

Identificación y caracterización molecular de especies de Leishmania

La identificación y caracterización molecular de Leishmania se realizará mediante

la técnica de PCR-RFLP para lo cual se amplificará un fragmento de entre 300 a

350 pb (dependiendo de la especie) del espaciador interno transcribible 1 (ITS1)

con los iniciadores LITSR (5´ CTG GAT CAT TTT CCG ATG-3’) y L5.8S (5´-TGA

TAC CAC TTA TCG CAC TT-3’). La reacción de PCR se montará utilizando el

estuche comercial GoTaq Green Master Mix de la marca Promega, Corp., y se

seguirán las instrucciones del fabricante.

La amplificación se realizará en un termociclador T100 de la marca BioRad, con las

siguientes condiciones: 35 ciclos consistentes en desnaturalización a 94°C por 40”,

hibridación a 53°C por 30’’ y polimerización a 72°C por 60’’. Adicionalmente a los 35

ciclos se agregará un paso de extensión a 72°C por 7 minutos. El producto de

amplificación será analizado mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%

previamente teñido con colorante GelRed y visualizado en un fotodocumentador

GelDoc de la marca BioRad. Una vez corroborado la amplificación, el producto será

analizado mediante la técnica de RFLP para lo cual será digerido con la

endonucleasa de restricción HaeIII siguiendo las especificaciones del fabricante.

Los productos de la digestión serán analizados por electroforesis en gel de agarosa

al 3%. Teñido con colorante GelRed y visualizado en un fotodocumentador GelDoc

de la marca BioRad. Como marcador de peso molecular se usará DNA ladder de la

marca Promega.




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XI. Supervisión y asesoría

Este Proyecto estará bajo la supervisión del asesor asignado por la coordinación de

servicio social de la Facultad de Biología, el Dr. Edith Hilario Torres Montoya y será

de tipo técnica.

XII. Evaluación

El asesor asignado deberá evaluar el desempeño de las actividades realizadas

según su criterio, tomando en cuenta los resultados obtenidos con respecto a los

objetivos planteados en este proyecto.

XIII. Resultados esperados

Al finalizar este proyecto se espera concluir exitosamente con los objetivos y metas

planeadas y obtener resultados que generen un nuevo conocimiento, así como,

impulsar a nuevas investigaciones a que estudien esta interacción, además de

ayudar a la población manteniendo actualizada la información con respecto a la

enfermedad generando nuevos mapas de riesgo e implementar nuevos programas

de control de vectores.

XIV. Fuentes

Dirección General de Programas Preventivos. 2015. Manual para el diagnóstico,

tratamiento y control de Leishmaniasis. Dirección electrónica:

https://www.gob.mx/cms/uploads/attachm

ent/file/323775/ManualLeishmaniasis2015.pdf (Fecha de Acceso: 14 de

noviembre de 2019 México. 38 pp.

http://www.gob.mx/cms/uploads/attachm




13

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Orellana H. G. M. 2009. Leishmaniasis canina. Tesis de licenciatura. Fac. de

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Kwakye-Nuako G. 2016. Investigation of a New Focus of Cutaneous Leishmaniasis

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Cuba Cuba C., Hidalgo S. E., Sinagra A., Salomon D. 2012. Curso sobre

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3-H-modulo-leishmaniasis.pdf (Fecha de Acceso: 17 de noviembre de 2019).

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16

XV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Objetivo Actividad Periodo en meses · Responsable

Identificación de dípteros: fase de campo

Colecta de material biológico

1 **

2 **

3 **

4 **

5 **

6 Brigadistas y asesor

Identificación de dípteros : fase de laboratorio

Procesos morfológicos y moleculares

** ** ** ** ** Brigadistas y asesor

Recomendaciones preventivas a la comunidad

Recomendaciones y acciones de prevención en la comunidad

** ** ** Brigadistas y asesor

Identificar probables reservorios

Identificación de perros y gatos con cuadro clínico compatible

** ** ** ** ** Brigadistas y asesor

Redactar informe final

* * Brigadistas




17

XVI. Programa de actividades/carta descriptiva

Cuadro de descripción de actividades

Proyecto Recursos

Objetivo

específico

Metas Actividades Humanos Materiales Económicos

1. Caracteri

zar las

especies

del

género

Culicoide

s

presentes

en el área

de

estudio

2. Detectar

a través

de

pruebas

molecular

es a

Leishman

ia spp en

Culicoide

s spp.

3. Establece

r la

distribució

n espacio

temporal

de

Culicoide

s spp en

el área de

1. Obtener los

insectos de

interés para

este proyecto.

2. Obtener

resultados

positivos al

finalizar las

pruebas

moleculares.

3. Generar

nuevo

conocimiento

respecto a

estos insectos

y parasito.

4. Establecer el

comportamien

to de los

insectos

durante todo

el año.

1. Búsqueda

bibliográfic

a

2. Colecta de

insectos

3. Conteo de

insectos

4. Caracteriza

ción

morfológic

a

5. Extracción

de ADN

6. Ensayos

moleculare

s (PCR.

PCR-RFLP

y

Electrofore

sis)

7. Secuencia

ción de

ADN

8. Comparaci

ón del

comportam

iento de los

insectos y

1. Un

prestador

de servicio

social

(Josue

Casillas

Moreno)

2. Asesor (Dr.

Edith

Hilario

Torres

Montoya

1. Cajas Petri

2. Alcohol de 96°

3. Frascos para

almacenar

insectos

4. Tubos Falcon

5. Hidróxido de

Sodio

6. Tubos 2 ml

7. Sacos de malla

para captura de

Insectos

1. $55.00

2. $1750.00

3. $250.00

4. $1200.00

5. $665.00

6. $277.00

7. $70.00

$4267.00




18

el parásito

durante el

año

9. Comparaci

ón entre

las

localidades

estudiadas

10. Interpretaci

ón de

resultados

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