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FACULTAD DE CIENCIAS POSGRADO EN INGENIERÍA ELECTRÓNICA

MÉTODO ÓPTICO PARA DETECCIÓN DE BIOMARCADORES

EN PIEL DE PACIENTES CON ENFERMEDADES

NEURODEGENERATIVAS

SEGUNDO AVANCE DE TESIS: ABRIL 2016

ALUMNA: MARITZA FABIOLA LEÓN BEJARANO

ASESORES:

DR. MIGUEL GHEBRÉ RAMÍREZ ELÍAS DR. MARTÍN OSWALDO MÉNDEZ GARCÍA

I. Introducción

Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la pérdida progresiva e imparable de neuronas en determinadas zonas del cerebro. Como consecuencia de esta pérdida existe un deterioro de la funcionalidad asociada a las partes afectadas [1] [2] [3]. Generalmente, las enfermedades neurodegenerativas se presentan en personas que pertenecen al grupo de la tercera edad y se estima que la prevalencia de estas patologías se duplique [1]. Las enfermedades de Alzheimer y Parkinson son las de mayor incidencia en la lista de enfermedades de este tipo, ocupando los tres primeros lugares de ocurrencia en México. El diagnóstico de estas enfermedades se realiza mediante criterios clínicos y estudios de gabinete [4] [5]. Sin embargo, el diagnóstico generalmente se realiza ya cuando la enfermedad está en un estado muy avanzado, por lo que, uno de los grandes problemas es encontrar metodologías que permitan la detección de marcadores biológicos no invasivos para el diagnóstico temprano [3]. Métodos derivados de óptica y computación han sido incorporados como herramientas para facilitar el análisis de muestras provenientes de tejido biológico y están siendo explorados como métodos de apoyo al diagnóstico de ciertas enfermedades. La espectroscopía Raman es una técnica interesante dado que proporciona información bioquímica de la muestra en poco tiempo, es una técnica no invasiva, no es necesario realizar un tipo de preparación especial a la muestra que se desea analizar, es una técnica segura, así como es certera y fácil de adquirir [6] [7] [8]. Sin embargo, la espectroscopía Raman también presenta algunos inconvenientes. El principal inconveniente es el efecto de fluorescencia que se agrega al espectro al tomar la muestra del tejido biológico y el cual puede llegar a enmascarar las intensidades de las bandas Raman. Por lo que es necesario aplicar técnicas de procesamiento de señales para extraer la información que caracteriza al tejido [9] [10]. Esta tesis se centra en la identificación de biomarcadores en piel de pacientes con

enfermedades neurodegenerativas mediante el uso de espectroscopía Raman. El objetivo

es evaluar la factibilidad de la espectrometría Raman como un método de diagnóstico

temprano para enfermedades neurodegenerativas.

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II. Objetivo general (2º. semestre)

Analizar e identificar diferencias en espectros Raman de biopsias de piel con diferentes

concentraciones de alfa-sinucleína.

III. Objetivos específicos

Adquirir espectros Raman provenientes de biopsias de piel, para identificar la

proteína alfa-sinucleína.

Eliminar la fluorescencia de espectros Raman.

IV. Actividades realizadas durante el periodo Agosto-Enero 2015

Durante el periodo Enero-Junio 2016, se realizaron las siguientes actividades:

Materias cursadas actualmente: Óptica médica y seminario de comunicación oral.

Recolección de información bibliográfica: Marco teórico y estado del arte.

Adquisición de espectros Raman de biopsias de piel para caracterizar la proteína

alfa-sinucleína.

Implementación y evaluación de dos técnicas para eliminar fluorescencia en

espectros Raman: Algoritmo de Vancouver y descomposición empírica de modos.

V. Adquisición de espectros Raman de biopsias de piel de personas con Parkinson

Cuatro biopsias de piel de voluntarios fueron sometidas a inmunohistoquímica para

identificar la presencia de la proteína alfa-sinucleína, dos pertenecientes a personas sanas

(con menor concentración de alfa-sinucleína) y dos más adquiridas de un nevus

melanocítico (mayor cantidad de alfa-sinucleína). Los espectros Raman de las biopsias de

piel fueron tomados con un espectrómetro Xplora Raman, con el cual se realizó un mapeo

a lo largo de una sección de la biopsia para obtener espectros cada 5 micras. Las

características del espectrómetro son: láser de 532𝑛𝑚, rango espectral de 1000 𝑐𝑚−1 a

2040 𝑐𝑚−1. Posteriormente fueron sometidos a los dos métodos para eliminación de

fluorescencia.

La figura 1 muestra el resultado promedio de aplicar c) descomposición empírica de modos

(EMD por sus siglas en inglés) y d) el algoritmo de Vancouver.

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Figura 1. Espectros Raman promedio de biopsias de piel con menor y mayor concentración de alfa-sinucleína sin fluorescencia: a)

Espectro Raman de piel con baja concentración de alfa-sinucleína b) Espectro Raman de piel con alta concentración de alfa-sinucleína

c) Eliminación de fluorescencia con EMD y b) Eliminación de fluorescencia con Vancouver

i. Métodos de eliminación de fluorescencia de espectros Raman

Al realizar la medición de espectros Raman estos van acompañados de ruido, el cual se debe

a distintos factores como la luz o las misma fluorescencia del tejido. Por lo que es necesario

procesar los espectros Raman [9].

Para este proyecto se implementaron: Algoritmo de Vancouver (método estándar para la

corrección de la línea base) y se propuso el uso de la descomposición empírica de modos.

Estas técnicas fueron evaluadas y se comparó el rendimiento de ambos métodos. A

continuación se describen brevemente ambos algoritmos.

ii. Algoritmo de Vancouver

Es uno de los métodos más usados para remover fluorescencia de espectros Raman en

aplicaciones biomédicas in vivo. La fluorescencia es modelada como una función polinomial

de grado cuatro a seis. Este algoritmo considera dos etapas [10]:

1) En la primera iteración los picos con intensidad mayor al polinomio de ajuste son

considerados como picos Raman y se eliminan, para no ser considerados en las

siguientes iteraciones de ajuste.

2) La segunda etapa consiste en ajustar el espectro que se obtiene de la primera

iteración como a continuación se indica: los valores mayores al polinomio de ajuste

serán reemplazados en el nuevo espectro por el polinomio más la desviación

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estándar del espectro, considerándose esta desviación como una aproximación del

nivel de ruido, cuando la señal Raman sea menor que el polinomio entonces será

asignado como nuevo espectro el valor de la señal original.

El algoritmo termina cuando |(𝐷𝐸𝑉𝑖 − 𝐷𝐸𝑉𝑖−1) 𝐷𝐸𝑉𝑖⁄ | < 5%, siendo 𝐷𝐸𝑉𝑖 la desviación

estándar del espectro en la iteración 𝑖 y 𝐷𝐸𝑉𝑖−1 la desviación estándar en la iteración 𝑖 − 1.

El espectro final sin fluorescencia se obtiene de la diferencia del polinomio ajustado y la

señal Raman original.

iii. Descomposición empírica de modos

EMD es un método de análisis de datos adaptativo en tiempo-frecuencia. La

descomposición empírica de modos considera que toda señal es una fusión de cierto

número de elementos más ruido. La señal puede descomponerse en un número finito de

componentes (funciones de modo intrínseco o IMF por sus siglas en inglés) más un residuo

(Ecuación 1) [11].

𝑥(𝑡) = ∑ 𝑐𝑗 + 𝑟𝑛

𝑛

𝑗=1

(1)

En donde 𝑛 es el total de modos extraídos, 𝑐𝑗 es cada una de las componentes o IMF en la

señal y 𝑟𝑛 el residuo de los datos 𝑥(𝑡).

El procedimiento del EMD se lleva a cabo de forma iterativa de la siguiente manera [11]

[12]:

1) Identificar los extremos de la función (máximos y mínimos) y se conectan con un

spline cúbico, para obtener una envolvente superior y una inferior.

2) Posteriormente se obtendrá la primera componente mediante la diferencia de la

señal y el promedio de las envolventes obtenidas en el paso número uno.

3) El resultado del paso anterior se considerara como la nueva señal que será sometida

nuevamente a los pasos uno y dos hasta que la señal se convierte en una función

monótona.

El espectro Raman sin fluorescencia se obtiene de restar el residuo y la última función de

modo intrínseco a la señal original.

iv. Evaluación de los métodos de eliminación de fluorescencia

El algoritmo de Vancouver y la descomposición empírica de modos fueron implementados

en R-Project, posteriormente se utilizó una base de datos que consistió en:

1. Espectros Raman artificiales con intensidad de ruido de: 0.5, 1, 1.5 y 2 veces la

intensidad del pico máximo (Figura 2 a)).

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2. Espectros Raman de piel: Se tomaron 20 espectros Raman del antebrazo derecho de

una persona sin ninguna enfermedad en cuatro ocasiones, con un espectrómetro

Raman portátil R3000, con un diodo laser de 785 𝑛𝑚, resolución espectral de 8

𝑐𝑚−1, con una potencia de 90 𝑚𝑊, en el rango espectral de 800 𝑐𝑚−1 a 1800 𝑐𝑚−1

(Figura 2 b)).

3. Espectros Raman de Vitamina E: Se tomaron 20 espectros Raman de tabletas de

vitamina E de 400 𝑚𝑔, con un espectrómetro Raman Peakseeker, con un diodo laser

de 785 𝑛𝑚, resolución espectral de 12 𝑐𝑚−1, una potencia laser de 90 𝑚𝑊, en el

rango espectral de 200 𝑐𝑚−1 a 3000 𝑐𝑚−1 (Figura 2 c)).

Figura 2. Base de datos de espectros Raman utilizados para medir el rendimiento del Algoritmo de Vancouver y descomposición

empírica de modos: a) Espectro Raman sintético, b) Espectro Raman de piel y c) Espectro Raman de vitamina E

Los tres tipos de espectros Raman fueron sometidos al algoritmo de Vancouver y a la

descomposición empírica de modos. Posteriormente para los espectros Raman sintéticos

se calculó el coeficiente de correlación y la raíz del error cuadrático medio (RMSE por sus

siglas en inglés), de los espectros artificiales sin fluorescencia y el resultado de aplicar cada

uno de los métodos, así como después de aplicar cada técnica se calculó la relación

señal/ruido (SNR por sus siglas en inglés). Para los espectros reales (piel y vitaminas) se

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calculó el coeficiente de correlación a cada conjunto de espectros una vez que se aplicaron

los métodos, también se calculó la raíz del error cuadrático medio y el SNR.

v. Resultados

La siguiente tabla 1.1 muestra el resultado de aplicar el algoritmo de Vancouver y EMD a

los espectros sintéticos.

Tabla 1.1 Comparación entre Vancouver y EMD para espectros sintéticos

Vancouver EMD

Coeficiente de correlación

0.9437386 0.9105205

RMSE 10.34423 10.34321

SNR 2.483104 2.75947

La tabla 1.2 muestra el resultado de aplicar EMD y Vancouver a los espectros de piel.

Tabla 1.2 Comparación entre Vancouver y EMD para espectros Raman de piel

Señal original Vancouver EMD

Coeficiente de correlación

0.9930783 0.8719471 0.6124524

RMSE 2.097176 0.2521531 0.1901965

SNR 13.0531 2.235765 2.623293

La tabla 1.3 muestra el resultado de aplicar los dos métodos ya mencionados a los espectros

de vitamina E.

Tabla 1.3 Comparación entre Vancouver y EMD para espectros Raman de vitamina E

Señal original Vancouver EMD

Coeficiente de correlación

0.9973219 0.9928153 0.9223262

RMSE 0.1183331 0.4167924 0.6135352

SNR 1.456222 1.691258 2.039795

En la tabla 1.1 se puede observar que el promedio del coeficiente de correlación alcanzado

por Vancouver y EMD respecto a la señal artificial creada es siempre mayor a 0.90, siendo

mejor en este caso aproximadamente por 0.03 el de Vancouver respecto a EMD. La raíz del

error cuadrático medio es muy similar en ambos casos y el SNR es mejor por 0.3 en EMD

que al aplicar Vancouver, lo que nos indica que la potencia de la señal respecto al ruido

mejora al aplicar EMD. Por otra parte, los resultados de la tabla 1.2 indican que al aplicar

Vancouver se tienen resultados más uniformes del grupo de 20 espectros de piel corregidos

con este método, para el resultado de aplicar EMD se tiene una correlación de 0.60 menor

a la de Vancouver. Las diferencias entre la uniformidad entre Vancouver y EMD son debido

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a que el método de descomposición empírica de modos ajusta cada señal Raman de

acuerdo a sus niveles de intensidad y a las señales que componen al espectro, es decir se

ajusta para cada caso. El resultado de la señal/ruido (SNR) es mayor al aplicar EMD. En la

tabla 1.3 se puede observar que al aplicar la correlación entre cada uno de los resultados

para espectros Raman de vitamina E se tiene una correlación mayor a 0.90 entre cada

conjunto de espectros después de aplicar EMD y Vancouver. Para este caso el valor de SNR

es mayor para los resultados proporcionados por EMD que de Vancouver.

A continuación la figura 3 a la figura 5 muestran el resultado de aplicar EMD y Vancouver a:

un espectro sintético (figura 3), un espectro Raman de piel (figura 4) y un espectro Raman

de vitamina E (figura 5).

Figura 3. Eliminación de fluorescencia de un espectro sintético con intensidad de ruido igual a 2 veces la intensidad del pico máximo:

a) Descomposición empírica de modos y b) Algoritmo de Vancouver

Figura 4. Eliminación de fluorescencia de un espectro de piel con: a) Descomposición empírica de modos y b) Algoritmo de Vancouver

Figura 5. Eliminación de fluorescencia de un espectro de vitamina E con: a) Descomposición empírica de modos y b) Algoritmo de

Vancouver

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VI. Conclusiones

El método de descomposición empírica de modos resultó ser una buena técnica que puede

utilizarse para la eliminación de fluorescencia de espectros Raman. Los resultados son muy

parecidos entre ambas técnicas, pero el EMD presenta ventajas ya que no es necesario

ajustar parámetros por lo que la intervención del usuario es mínima. Si bien el EMD no logró

superar a Vancouver, se puede considerar como una opción dado que los resultados

difieren poco. Posteriormente se realizó la prueba de Bland-Altman con la que se llega a la

conclusión de que EMD es un buen método para eliminar fluorescencia en espectros

Raman, el cual puede usarse obteniendo resultados similares al algoritmo de Vancouver,

siendo la diferencia entre aplicar EMD y/o Vancouver de acuerdo a Bland-Altman mínima

con una diferencia media menor a 0.1.

Así como después de aplicar estos algoritmos a los espectros de biopsias de piel se

identificaron ciertas bandas Raman que se encontraban ocultas debido al efecto de

fluorescencia.

VII. Trabajo para el tercer avance

Una vez aplicados estos métodos a los espectros Raman de biopsias de piel se utilizaran

distintas técnicas para poder identificar diferentes concentraciones de la proteína alfa-

sinucleína en la piel.

VIII. Cronograma de actividades

Actividades

Periodo

Agosto Enero 2015

Febrero Julio 2016

Agosto 2016 Enero 2017

Febrero Julio 2017

Agosto 2017 Enero 2018

Febrero Julio 2018

Agosto 2018 Enero 2019

Febrero Julio 2019

1) Clases X X

2) Seminario del PIE X X X X

3) Fundamentación y documentación bibliográfica

X X X X X X X X

4) Construcción y calibración del sistema

X

5) Prueba piloto X

6) Preprocesamiento de muestras

X X

7) Escritura y publicación de artículo

X X X X X

9

8) Extracción de características

X X X

9) Estancia de investigación

X X

10) Validación del sistema

X X

11) Redacción y corrección de tesis

X X X X X X

Actividades realizadas.

Actividades programadas para el siguiente semestre.

IX. Referencias

[1] R.-Antigüedad Zarranz Alfredo. Enfermedades neurodegenerativas. Dossier Trastornos

neurodegenerativos (pp 17-19).

[2] Navarrete Evelia, Prospéro Oscar, Hudson Robyn, Guevara Rosalinda. (2001).

Enfermedades neurodegenerativas que cursan con demencia. Academia nacional de

medicina de México (Vol. 137. No 2, pp 189-200).

[3] Carreres M.a. Abril, Falguera N. Ticó y Garreta Figuera R. (2004). Enfermedades

neurodegenerativas. Servicio de Rehabilitación. Hospital Mútua de Terrassa. Barcelona

(Vol. 38:6, pp 18-24).

[4] Llibre Rodríguez Juan de J. y Guerra Hernández Milagros A. (1999). Enfermedad de Alzheimer, situación actual y estrategias terapéuticas. Rev Cubana Med (Vol. 38:2, pp 134-42). [5] González-Torres Laura Clementina y Armendáriz-Borunda Juan. (2005). Aspectos inmunológicos en la enfermedad de Parkinson. Arch neurociencia (mex) (Vol. 10:3, pp168-169). [6] Cox Rick. (2010). Qualitative analysis and the answer box: A prespective on portable raman spectroscopy. Analytical chemistry feature (Vol. 82:9, pp 3419–3425). [7] Naglic Peter. (2012). Raman spectrocopy for medical diagnostics. University of Ljubljana Faculty of Mathematics and Physics. Department of Physics. [8] Wehrens Ron. (2011). Chemometrics with R. Multivariate Data Analysis in the Natural Sciences and Life Sciences. Editorial Springer. [9] Ferraro John R. et al. (2003). Introductory Raman Spectroscopy. Elsevier.

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[10] Zhao Jianhua, Lui Harvey, Mclean David y Zeng Haishan. (2007). Automated Autofluorescence Background Subtraction Algorithm for Biomedical Raman Spectroscopy. Applied Spectroscopy (vol. 61:11, pp 1225-1232). [11] Wu Zhaohua y Huang Norden E. (2009). Ensemble empirical mode decomposition: A noise-assisted data analysis method. World scientific publishing company (Vol. 1:1, pp 1–41). [12] Wu Zhaohua y Huang Norden E. Ensemble Empirical Mode Decomposition: A Noise Assisted Data Analysis Method. Center for Ocean-Land-Atmosphere Studies 4041 Powder Mill Road, Suite 302 Calverton, MD 20705, USA y Laboratory for Hydrospheric and Biospheric Processes NASA Goddard Space Flight Center Greenbelt, MD 20771, USA. Agosto 2015. Disponible en: ftp://www.iges.org/pub/ctr/ctr_193.pdf.