I Curso sobre Bioindicación en EDARS de fango...

I Curso sobre Bioindicación en EDARS de fango activo.

ESTUDIO DE:

CARACTERÍSTICAS MACRO- Y MICROSCÓPICAS,

BACTERIAS FILAMENTOSAS Y

MICROFAUNA DE UN FANGO ACTIVO.

Laura Isac, Eva Rodríguez y Natividad Fernández

ESTUDIO DE LAS CARACTERÍSTICAS MACRO- Y MICROSCÓPICAS DE UN FANGO ACTIVO

Características macro- y microscópicas de un fango activo

1. Introducción a la microbiología en depuradoras de fangos activos

2. Evaluación de las características macroscópicas y microscópicas de un fango activo

2.1. Observación macroscópica del fango activo

2.2. Observación microscópica del fango activo

2.3. Preparación de muestras para observación microscópica

3. Relación entre el estado estructural de un fango activo y los rendimientos de depuración en planta

Bacterias filamentosas en el fango activo 4. Estudio de las claves de identificación de bacterias filamentosas: principales características taxonómicas

5. Técnicas de tinción de bacterias filamentosas

5.1. Tinción Gram (Método Hücker modificado)

5.2. Tinción Neisser (Método de Eikelboom y van Buijsen, 1981)

5.3. Procedimiento de observación de muestras fijadas y teñidas

6. Cuantificación de bacterias filamentosas en una muestra

7. Protocolo para la identificación de organismos filamentosos

Microfauna de un fango activo 8. Nociones básicas en bioindicación.

9. Conocimientos básicos sobre Protistas.

10. Índice biótico de fangos (SBI, Sludge Biotic Index) o Método Madoni.

11. Instrucciones para la observación microscópica.

12. Formatos de recogida de datos.

13. Bibliografía.

I CURSO SOBRE BIOINDICACIÓN EN EDARS DE FANGOS ACTIVOS

Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández.

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Características macro- y microscópicas de un fango activo

1. Introducción a la microbiología en depuradoras de fangos activos.

Tradicionalmente, las observaciones microscópicas se han centrado en el desarrollo de las técnicas de bioindicación, en las que los principales implicados son los protozoos ciliados, importantes indicadores del desarrollo, eficiencia y nivel de actividad del proceso de depuración. Sin embargo, otro importante campo de seguimiento de la marcha del proceso depurador es aquel que emplea técnicas de observación microscópica dirigidas a evaluar las propiedades estructurales del flóculo de fango activo (Jiménez et al., 2001).

El flóculo se define como un conglomerado de bacterias floculantes y bacterias filamentosas sobre el que se agregan diminutas partículas minerales, polímeros orgánicos e inorgánicos y excreciones metabólicas, en un proceso de asociación facilitado por una “matriz” mucilaginosa que es aportada por la propia secreción microbiana (Figura 1). Es decir, las células microbianas producen sustancias poliméricas extracelulares, los EPS (extracellular polymeric substances), que permiten la formación del flóculo al proporcionar una extensa superficie por unidad de volumen para que los microorganismos se adhieran, facilitando la agregación de las bacterias y presentando también importantes implicaciones en las características de sedimentabilidad del fango. En cualquier caso, la formación de estos agregados o flóculos permite un hecho indispensable en el proceso de depuración: el paso de los contaminantes de la forma suspendida no sedimentable a la suspendida sedimentable, circunstancia necesaria para que ocurra la separación sólido-líquido en el decantador secundario.

Zoogloea sp. Ciliado sésil

Figura 1. Flóculo de fango activo (100x) en cuya estructura se observa al

organismo floculante Zoogloea sp., ampliado a 400x en el recuadro. I CURSO SOBRE BIOINDICACIÓN EN EDARS DE FANGOS ACTIVOS


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Algunos autores han sugerido que el flóculo de fango activo presenta dos niveles de estructura denominados “microestructura” y “macroestructura” (Jenkins et al., 1993). La microestructura es el resultado de los procesos de adhesión microbiana, agregación y biofloculación, constituyendo la base para la formación del flóculo. La macroestructura está representada por los microorganismos filamentosos, que se agrupan formando un armazón sobre el que se dispone la microestructura. La presencia de organismos filamentosos en el flóculo confiere una cierta consistencia que evita la rotura a causa de la propia turbulencia en el tanque. Sin embargo, la presencia de filamentos condiciona la morfología del flóculo. Es decir, el flóculo de fango activo se desarrolla en la dirección de crecimiento de las bacterias filamentosas, haciendo que predomine la forma alargada sobre la forma esférica propia de la microestructura, condicionando en consecuencia las propiedades de sedimentabilidad. De hecho, los problemas de decantabilidad en el clarificador se considera que son debidos a alteraciones en la macro- o microestructura del flóculo de fango activo (Jenkins et al., 1993).

En esta sesión teórica abordaremos estos tres puntos claves en el estudio microbiológico de un fango activo:

- Características macro- y microscópicas, - Bacterias filamentosas en el fango activo y - Microfauna de un fango activo

2. Evaluación de las características macroscópicas y microscópicas de un fango activo. 2.1. Observación macroscópica del fango activo.

La valoración de las características macroscópicas del fango activado se realiza

principalmente a través del ensayo de la V30, que determina la cantidad de fango activado que decanta en una probeta o cono Imhoff, tras un periodo de 30 minutos. Este ensayo es rutinario en todos los laboratorios de aguas residuales para obtener el Índice de Mohlmann o Índice volumétrico de fangos (IVF), que básicamente resulta de dividir el valor obtenido en la V30 entre la concentración de sólidos en el reactor biológico (SSLM). El IVF se define como el volumen en mL ocupado por un gramo de sólidos en suspensión del licor mezcla e indica el grado de decantabilidad del fango. Valores superiores a 300-400 mL/g, indican alteraciones en la sedimentabilidad del lecho de fango de los decantadores secundarios.

En la sesión práctica comprobaremos que la V30 puede aportar información adicional al volumen ocupado por el fango decantado, al valorar otros parámetros como puedan ser la turbidez o los flóculos en suspensión del clarificado. Se trata de analizar las propiedades del proceso de decantación y las características del clarificado.



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Las características valoradas sobre este ensayo son:

Turbidez:

Alta: visibilidad clara a través de la probeta Media: situación intermedia entre las categorías "alta" y "baja" Baja: visibilidad muy baja a través de la probeta

Flóculos en suspensión:

Alta: abundancia de microflóculos Media: presencia de microflóculos Baja: prácticamente ausencia de microflóculos

Sedimentabilidad:

Alta: la mayor parte del fango decanta en los 10 primeros minutos del ensayo y el fango esta muy compactado

Media: la mayor parte del fango decanta entre 10-20 minutos y se observa un ligero esponjamiento

Baja: la mayor parte del fango decanta después de 20 minutos y se observa un claro esponjamiento

Olor: característica macroscópica del fango activado que se define como correcto o incorrecto, indicando este último situaciones como septicidad, presencia de vertidos, etc. 2.2. Observación microscópica del fango activo.

El informe biológico de una muestra de fango activo está dirigido a aportar la

información necesaria sobre la calidad del fango, entendida ésta como el compendio de las características macroscópicas deducidas de la V30 (apartado anterior) y el conjunto de características microscópicas recogidas durante la observación al microscopio óptico (presente apartado).

Tales características microscópicas se refieren al examen del estado morfológico y estructural del flóculo de fango activo (forma, tamaño, estructura, textura, cobertura, etc.) y al examen del componente biótico del "ecosistema fango activo", representado por las poblaciones de bacterias filamentosas y de protozoos (principalmente ciliados).

La evaluación de estas características proporciona información sobre las propiedades de decantación y compactación del fango activo durante la fase de clarificación del licor mezcla, así como del nivel y estado de colonización de la microfauna, aludiendo, indirectamente, al grado de actividad biológica del proceso de depuración.



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Los parámetros caracterizados a nivel microscópico son:

Forma: característica que define la morfología externa del flóculo como regular si aparece de forma redondeada e irregular si difiere de esta configuración.

Tamaño:

Pequeño: tamaño menor de 150 µm Medio: tamaño entre 150 y 500 µm Grande: tamaño mayor de 500 µm

Estructura:

Compacto: no existen prácticamente huecos en la estructura interna del flóculo

Medio: se detectan algunos huecos Abierta: existen bastantes huecos dentro del flóculo que rompen la unidad

interna Textura: característica que alude al grado de cohesión entre las partículas que

forman el flóculo, estableciéndose las categorías “fuerte” y “débil” en función a la ausencia o presencia de disgregación de los flóculos, respectivamente, tras punción sobre el cubreobjetos.

Cobertura: característica que valora si la unión de todos los flóculos presentes en el ocular de 10X cubren menos del 10% de su superficie, del 10-50% o más del 50%.

Filamentos en el flóculo:

Menos de 5 filamentos por flóculo Entre 5-20 filamentos por flóculo Más de 20 filamentos por flóculo

Filamentos en disolución: característica que cuantifica la existencia de filamentos libres entre los espacios interfloculares del licor mezcla. Si no son observables será “baja”, mientras que si se observan normalmente será “alta”.

Diversidad de protozoos:

Menos de 4 especies De 4-7 especies Más de 7 especies

Otras observaciones: presencia/ausencia de crecimiento disperso, presencia/ausencia de fibras orgánicas, presencia/ausencia de partículas inorgánicas, presencia/ausencia de bacterias helicoidales, presencia/ausencia de Zoogloea sp., etc.



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2.3. Preparación de muestras para observación microscópica: Observación microscópica de una muestra de fango activado a diferentes

aumentos (100x, 400x y 1.000x), empleando los dispositivos de contraste de fases y la iluminación en campo claro. Las observaciones a realizar se efectuarán sobre muestras in vivo.

1. Agitar con suavidad la muestra para homogeneizar. 2. Tomar una gota con pipeta Pateur de boca ancha o entre 25 y 50 µL con una

micropipeta y depositarlos en un portaobjetos (previamente limpiado y desengrasado). 3. Colocar encima de la gota un cubreobjetos. 4. Proceder al análisis microscópico de la preparación utilizando los distintos

objetivos. El de 100x u objetivo de inmersión emplea aceite y se utiliza para observar estructuras en detalle.

5. Observar, al menos, 2-3 preparaciones de la muestra. 6. Se recomienda, como complemento, el análisis de los MLSS, V30 e IVF. Para observar la muestra sin alterar la estructura flocular y la disposición del

entramado filamentoso, seguir el procedimiento anterior. Para inmovilizar organismos y observar estructuras visibles sin necesidad de

tinción, colocar el cubreobjetos y prensar suavemente. Especialmente indicado para la observación cualitativa de protozoos ciliados.



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3. Relación entre el estado estructural de un fango activo y los rendimientos de depuración en planta.

INTRODUCCIÓN. El agua se cuenta como uno de los recursos más preciados en el mundo, cuya

conservación debe implicarnos a todos. En la legislación medioambiental, un punto importantísimo es el control de los vertidos de las zonas con riesgo de eutrofia. La Urban Waste Water Treatment (organismo incluido en el Instituto Europeo de Policía Ambiental, IEEP) ha clasificado todas las áreas sensibles de los Estados miembros con riesgo de eutrofia que necesitan la eliminación de nitrógeno y fósforo (Mainstone y Parr, 2002), siendo las aglomeraciones urbanas, los usos agrícolas y la deforestación los principales causantes de este fenómeno.

La descomposición y el reciclado de la materia orgánica presentan comportamientos semejantes en toda clase de sistemas. Sin embargo, factores ambientales que han operado raramente y que no han sido internalizados por la evolución (metales pesados, plaguicidas, etc.) coinciden frecuentemente con la contaminación orgánica y complican la dinámica de los respectivos ecosistemas (Margalef, 1983).

Los vertidos incontrolados pueden provocar el desarrollo masivo de algas, lo que genera proliferaciones de organismos oportunistas que degradan el sistema. Cambios en la comunidad vegetal, a su vez, pueden ser causa de severos déficits de oxígeno disuelto que resultan mortales para los organismos más sensibles (Mainstone y Parr, 2002). Esta situación provoca problemas colaterales como pueden ser los malos olores y el deterioro sanitario y paisajístico de las aguas.

Desgraciadamente, la eutrofización de muchas zonas acuícolas es patente, presentando aumentos en los niveles de nutrientes consecuencia de la descarga de aguas residuales (Stapleton et al., 2000). Esta situación se está solventando con las medidas legislativas recogidas en la Directiva 271/91 y con su incorporación en España mediante el RDL 11/1995 y RD 509/1996 (Tabla I).

De hecho, en algunos estados de Europa dónde las medidas de saneamiento empezaron a implantarse en los años setenta, se ha producido la recuperación de la calidad físico-química de las aguas (Prat, 1997).

Si tenemos en cuenta los datos aportados por el Ministerio de Medio Ambiente (2001) sobre la depuración, Andalucía presenta una población equivalente de 13.694.385 con un porcentaje de depuración correcto del 37 %, un 20 % en construcción y un 43 % no depurado.

Las inversiones realizadas en Andalucía gracias a la financiación en un 80 % de los Fondos de Cohesión Europeos de las Obras de Saneamiento y Depuración de aguas residuales en núcleos de la red de Espacios Naturales de la Comunidad Autonómica de Andalucía, asciende a 25.993.431 euros (Leal et al., 2002).



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Tabla I. Límites de vertidos (limitaciones de nutrientes en zonas sensibles cuyas aguas sean eutróficas o tengan tendencia a serlo en un futuro próximo).

PARÁMETRO CONCENTRACIÓN % RED. MÍNIMO

DBO5 25 mg/L 70-90%

DQO 125 mg/L 75%

SS 35 mg/L (>10.000 h-eq)

60 mg/L (20.000-10.000 h-eq) 90%

FÓSFORO TOTAL 2 mg P/L (10.000-100.000 h-eq)

1 mg P/L (>100.000 h-eq) 80%

NITRÓGENO TOTAL 15 mg N/L (10.000-100.000 h-eq)

10 mg N/L (>100.000 h-eq) 70-80%

Esta favorable evolución choca en muchas ocasiones con procesos de

depuración inadecuados en muchas ciudades, supeditados a las condiciones socio-económicas, niveles de vida y rentas per cápita imperantes (Leal et al., 2002), que no permiten a los municipios el mantenimiento de la E.D.A.R. tras su puesta en marcha. Si a esto le añadimos que durante los meses de verano en muchos lugares de la costa mediterránea el flujo de los ríos consiste esencialmente en agua residual tratada o no (Angelakis et al., 1999), es obvia la necesidad de una gestión óptima, en la que el balance entre costes de mantenimiento y vertido depurado sea el menor posible.

Por ello es necesario disponer de medidas de control complementarias a los parámetros físico-químicos. Estas medidas, en parte, podrían estar representadas por el control de la formación flocular en el reactor biológico, el cual aporta información adicional sobre el proceso y permite con personal técnico especializado controlar varias estaciones depuradoras de fangos activos con una dotación extra de laboratorio escasa (microscopio óptico y material de tinciones). Sin embargo y como contrapartida, los estudios de formación flocular del fango activo requieren tiempo, personal especializado y una ardua tarea de identificación y análisis de los resultados que normalmente no están al alcance de todos los laboratorios.

En este trabajo, se plantea la posibilidad de realizar un estudio simplificado del fango activo que genere, en función de las características macroscópicas y microscópicas de éste, un valor de índice de fango que esté directamente relacionado con los porcentajes de reducción de SS, DQO, DBO, Nitrógeno y Fósforo en la E.D.A.R. Tal índice de fango (IF), además, proporciona la posibilidad de obtener un histórico de valores de calidad biológica de forma rápida, comparable y protocolo sencillo.

Este sistema de análisis, cuyo resultado final es la evaluación de la calidad de un fango biológico, en el desarrollo de su metodología ha tomado como base información especializada, de la que se destacaría el " Manual de Laboratorio para el análisis de las aguas residuales y lodos de depuración” (Departamento de Agua y



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Saneamiento del Ayuntamiento de Madrid, 1997). A partir de la puntuación de una serie de características macroscópicas del fango (observables a través de la V30) y microscópicas (observables a través de un objetivo de 10X), se obtiene un valor final comprendido entre 0-100 con el que quedaría definida la calidad de dicha suspensión biológica. Este valor se denomina Índice de Fango (IF) (Jiménez et al., 2001).

DESARROLLO INVESTIGADOR DEL “ÍNDICE DE FANGO” Y RESULTADOS

La selección de los parámetros que definen y valoran las características del

fango activo, constituyó uno de los pasos previos en la elaboración del índice. A continuación, se estableció un periodo de contraste de resultados de algo más de un año, en el que se estudiarón diversas muestras de fangos activos de toda Andalucía, lo que permitió someter a estudio el índice elaborado así como la unificación de criterios para los componentes del grupo de trabajo, requisitos indispensables para la obtención de resultados representativos del estado del sistema, a la vez que comparables.

Los parámetros seleccionados para constituir el IF, denominados características macro y microscópicas, se encuentran recogidos en la Tabla II junto con las distintas variantes con las que dichas características quedaron definidas. Como características macroscópicas se entienden aquellas observables a simple vista, extraídas del aspecto del fango activado y del clarificado de la V30. Como características microscópicas se definen aquellas otras observables a través del microscopio bajo un objetivo de 10x. Respecto a estas últimas, aclarar que las observaciones deben realizarse al menos por duplicado y con la muestra viva (sin teñir). Ésta, que ha de ser lo más fresca posible, es conveniente agitarla con suavidad previamente, para homogenizar evitando la rotura de los flóculos. Las identificaciones bacterianas se han realizado en base al manual Microorganismos filamentosos en el fango activo (EMASESA, 1997) y apoyadas en distintos artículos que tratan el tema (Eikelboom, 1975 y 1977; Rozhich, 1982; Suárez, 1993; Laboratorio Central del Dep. de Saneamiento del Ayto de Madrid, 1996; Moro, 1998).

La suma de puntuaciones para ambos grupos de características se traduce en

un valor final de índice de fango del que se definen cinco categorías, cada una de las cuales alude a una calidad distinta del fango (Tabla III). Mientras que las características macroscópicas presentan como valor máximo de puntuación 30 unidades sobre el valor del IF, las microscópicas presentan un máximo de puntuación de 70 puntos, al considerarse que son éstas las que definen con mayor exactitud el IF.



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Tabla II. Valoración del IF.

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Turbidez Alta

Media Baja

0 4,5 9

Flóculos en suspensión Alta Media Baja

0 4,5 9

Sedimentabilidad Alta Media Baja

9 4,5 0

Olor Agradable Desagradable

3 0

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS Forma Regular

Irregular 4 0

Tamaño Grande Medio Pequeño

4 7 0

Estructura Compacta Media Abierta

18 9 0

Textura Fuerte Débil

4 0

Cobertura < 10% 10-50% >50%

0 7 3,5

Filamentos en flóculos >20 5-20 <5

0 7 14

Filamentos en disolución Alta Baja

0 3

Diversidad de Protozoos >7 especies 4-7 especies <4 especies

13 7 0

ÍNDICE DE FANGO TOTAL



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Tabla III. Categorías de IF.

ÍNDICE DE FANGOS:

0-19 pésimo

20-39 malo

40-59 regular

60-79 bueno

80-100 óptimo

De los estudios realizados en distintas EDAR se obtuvieron distintos resultados

de IF que se relacionaron con los porcentajes de reducción de SS, DQO, DBO, N y P. Los análisis de estos últimos se realizaron según los Métodos Normalizados (APHA, AWWA y WPCF, 1992).

Del periodo de estudio se obtuvieron 109 datos, los cuales aparecen reflejados en la Tabla IV, y a los que se realizó un análisis estadístico de correlaciones. En tal estudio se pretendía buscar una posible relación entre el valor del IF y los parámetros que definen tanto el influente como la calidad del efluente (SS, DQO, DBO, N y P).

Tabla IV. Relación de datos obtenidos en el estudio de cada uno de los participantes.

Total datos

Participante 1 10

Participante 2 38

Participante 3 13

Participante 4 19

Participante 5 29

El análisis de los datos demostró la ausencia de una relación directa entre el

Índice de fango y los SS, DQO, DBO, N y P tanto del agua de entrada como de salida. Sin embargo, cuando los datos fueron agrupados según la categoría de IF, se encontró, tal y como se muestra en la Figura 1, una relación directa entre los porcentajes de reducción de SS y DQO respecto al IF, si bien esta relación es más clara para el caso de los sólidos en suspensión que para la DQO. Como se observa en esta misma figura, la relación establecida entre la DBO y el Índice de fango no es del todo clara, al no detectarse diferencias significativas entre los porcentajes de reducción una vez que los índices de fango superan la calidad “pésima”. No se ha encontrado explicación a esta falta de proporcionalidad entre la calidad del fango estimada mediante el IF y el porcentaje de reducción de DBO. No obstante, la extrema variabilidad y escasa reproducibilidad de esta determinación (APHA, AWWA y WPCF, 1992), junto con la inferioridad de datos aportados respecto a los SS y DQO, son razones suficientes para que este resultado sea tomado con precaución.



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Reflexiones similares se pueden hacer con respecto a los datos de reducción de Nitrógeno y Fósforo (Figura 2), en los que los resultados obtenidos están adscritos a tres categorías de fango (“malo”, “regular” y “bueno”). Por lo tanto, si bien la tendencia es a una mejora gradual de los porcentajes de reducción de ambos nutrientes frente al aumento de puntuación del índice, las diferencias más claras se encuentran entre la categoría “malo” y el resto. Estos resultados, por tanto, habrían de ser tomados con reservas, ya que parece conveniente ampliar el banco de datos antes de determinar la tendencia más clara posible.

CONCLUSIONES El parámetro IF ha resultado ser un buen sistema de control rápido con el que

obtener un índice de formación flocular, orientativo del estado del cultivo biológico, que nos aproxima a los rendimientos de depuración en las E.D.A.R.s de fangos activos. En general, podemos definir el Índice de Fango (IF) como un parámetro indicador del estado de floculación en el reactor biológico, que nos aporta información para modificar las condiciones del cultivo y de esta forma mejorar la eficacia de la reducción de la DQO y los SS en las E.D.A.R.s, tomándose con reserva las relaciones que mantiene con la DBO, Nitrógeno y Fósforo. Una observación general del fango activado que puede durar unos veinte minutos, nos proporcionará idea del estado de éste y de la respuesta esperable de la E.D.A.R. convencional.

70

75

80

85

90

95

100

% R

educ

ción

SS

, DQ

O y

DB

O

20-40 40-60 60-80 80-100

Rango de IF

SSDQODBO

Características macr

Figura 1. Relación entre el rango de IF y el porcentaje de

reducción de SS (n = 109), DQO (n = 109) y DBO (n =67).


o- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 13

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

% R

educ

ción

N y

P

20-40 40-60 60-80

Rango de IF

PN

Figura 2. Relación entre el rango de IF y el porcentaje de

reducción de nitrógeno y fósforo (n=67).

Es necesario aumentar el número de datos y proseguir con el estudio antes de poder definir claramente al IF respecto a los porcentajes de reducción de DBO, N y P, como un recurso para optimizar la reducción de la emisión de nutrientes y materia orgánica al cauce receptor.

El IF es un complemento analítico aplicable a plantas depuradoras de fangos activos de grandes núcleos de población, en las que a través de la observación del estado de floculación se podrá valorar la calidad del proceso de depuración, entendida ésta como rendimientos depuradores. En plantas pequeñas se presenta como un sistema idóneo, dónde con reducidos costes un mismo especialista puede controlar las condiciones de explotación de varias E.D.A.R.s. Si a esto último añadimos que muchas de estas plantas pequeñas se encuentran localizadas en zonas sensibles (Oron et al., 2002), la aplicación del IF como parámetro complementario sería muy deseable.

La valoración del estado de floculación de la materia orgánica permite tomar medidas encaminadas a la mejora de este proceso para así obtener buenos clarificados y reducir de esta forma la emisión de contaminantes. En determinadas situaciones, alteraciones en la línea de fango producen reboses a cabecera sépticos que generan una microfauna especializada para el metabolismo del azufre. Esta microfauna está normalmente asociada a alteraciones en la decantabilidad de los fangos y por lo tanto a la fuga de sólidos al cauce receptor, lo que lleva aparejado el escape de organismos (Bodo spp., Cercobodo spp., Sphaerotilus spp., Thiotrix spp....) que llegan al medio acuícola desarrollándose y alterando el ecosistema.

Por otra parte, es sabido que una gran proporción de la estructura del flóculo de fango activo está compuesta por polímeros extracelulares (EPS, extracellular exopolymers), los cuales son considerados como los principales responsables de la adhesión de las células microbianas a la estructura flocular y de la cohesión del conjunto. Las propiedades adsorbentes de los EPS han sido bien documentadas por distintos autores en términos de bioadsorción de contaminantes y tóxicos (iones



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metálicos, por ejemplo). Sin embargo, el papel de los EPS en la eliminación biológica de nutrientes como el nitrógeno o el fósforo no ha sido abordado hasta muy recientemente debido a la falta de herramientas adecuadas. Cloete y Oosthuizen (2001) haciendo uso del análisis mediante EDS (Energy Dispersive Spectrometry) y microanálisis con rayos X, han estimado que la proporción de fósforo en los cúmulos bacterianos de una muestra de fango activo procedente de una planta en la que existe eliminación biológica de fósforo, es de un 57-59% del total. Estos mismos autores encontraron que los EPS aislados de muestras biológicas de igual procedencia, retuvieron, por sí solos, entre el 27-30% del total del fósforo estimado. Estos resultados sugieren que la eliminación de fósforo en el fango activo podría ser debida no sólo a los organismos acumuladores de fosfato, sino también al EPS como reservorio de este elemento. Con esta explicación, lo que quiere significarse es que la detección precoz mediante el IF de alteraciones en el estado de floculación, evitará en buena proporción no sólo la liberación de sólidos con el efluente, sino también de nutrientes a los cauces receptores.

En definitiva, el IF se establece como un sistema práctico del control de la formación flocular en la E.D.A.R. y como un útil complemento en la determinación de las condiciones de explotación, repercutiendo positivamente sobre el medio ambiente. BIBLIOGRAFÍA

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AUTORES: Grupo Bioindicación Sevilla www.grupobioindicacionsevilla.com DOCUMENTACIÓN DISPONIBLE EN: http://www.ecoportal.net/content/view/full/32380



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http://www.ecoportal.net/content/view/full/32380

Bacterias filamentosas en el fango activo

4. Estudio de las claves de identificación de bacterias filamentosas: Principales características taxonómicas en bacterias filamentosas. Crecimiento epifítico: consiste en el crecimiento de células bacterianas sobre la superficie del filamento estudiado, utilizándolo como sustrato o soporte. Este tipo de crecimiento suele darse sobre bacterias filamentosas que poseen vaina o cubierta y normalmente ocurre de forma perpendicular al filamento utilizado como soporte.

Septos celulares: son los tabiques o separaciones que observables entre las células contiguas del filamento. En otrason observables con microscopía óptica.

SEPTOS CELULARES VISIBLES SEPTOS CE Constricciones celulares: implican la posibilidad de observfilamento. Consiste en una discontinuidad en los bordes del flos septos celulares.

I CURSO SOBRE BIOINDICACIÓN EN EDARS DE FANGO

Características macro- y microscópicas, bacterias filamentosas y microfauna de un fango activo. L

Crecimiento epifítico abundante Crecimiento epifítico moderado Ausencia de crecimiento epifítico

en algunas ocasiones son s ocasiones existen pero no

LULARES NO VISIBLES

ar los septos celulares en el ilamento, coincidiendo con

S ACTIVOS

. Isac, E. Rodríguez y N. Fernández. 17

Vaina o cubierta: es una estructura tubular que actúa como revestimiento del filamento y del conjunto de células individuales que lo constituyen. La presencia o ausencia de esta estructura puede observarse mediante la tinción específica de vainas. Sin embargo, en algunas ocasiones, la pérdida de algunas células en el filamento pone de manifiesto la presencia de vaina. El crecimiento epifítico abundante también es indicativo de la presencia de vaina.

Vaina

Rosetas: algunas bacterias filamentosas (Thiothrix spp. y Tipo 021N) presentan la capacidad de asociarse en estructuras llamadas rosetas, en las que se encuentran agrupadas y unidas por sus células basales, radiando hacia el exterior desde un punto común. Gonidios: son células ovales o bacilares localizadas en el extremo del filamento. La morfología de estas células se diferencia de las restantes. Se piensa que podrían estar relacionadas con la reproducción del filamento.



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Ramificaciones: se entiende como ramificación verdadera a la continuidad citoplasmática presente en los tricomas que se disponen formando una ramificación. Ramificación falsa es aquella en la que no existe continuidad citoplasmática, tan sólo una superposición de tricomas a la altura media del filamento.

RAMIFICACIÓN VERDADERA RAMIFICACIÓN FALSA

Morfología del tricoma:

TRICOMA ENRROLLADO CADENA LIBRE DE CÉLULAS

TRICOMA RECTO, LIGERAMENTE CURVO

Morfología celular:

ESFÉRICA, COCO-BACILAR

BACILAR



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En la siguiente tabla se presenta un resumen de las principales características observables mediante microscopía óptica, empleadas en la identificación de bacterias filamentosas de un fango (Tabla 1). Tabla 1. Características morfológicas y reactiva a tinciones de bacterias filamentosas.

No

Recto, ligeramente curvo, tricoma torcido, cadenairregular de células, tricoma enrrollado, tricomaramificado (micelial)

MORFOLOGÍA DEL FILAMENTO (TRICOMA)

SiPRESENCIA DE VAINA

Libre, extendiéndose del floculo, interior, todos sitiosLOCALIZACIÓN DEL TRICOMA

No Si INCLUSIONES CELULARES: GRÁNULOS DE “S” (in situ)

No Si INCLUSIONES CELULARES: GRÁNULOS DE “S” (in situ)

No SiSEPTOS CELULARES VISIBLES

Cuadrada, oval, rectangular, bacilar, discoidal, tonel,cocos

MORFOLOGÍA CELULAR

No SiCRECIMIENTO EPIFÍTICO

Neisser +/- y gránulo Neisser + REACCIÓN A NEISSER

Gram - Gram +REACCIÓN A GRAM

No Si INCLUSIONES CELULARES: GRÁNULOS DE “PHB”

No Si INCLUSIONES CELULARES: GRÁNULOS DE “S” (S-test)

No Si CONSTRICCIONES EN LOS SEPTOS CELULARES

Transparente, medio, oscuro COLORACIÓN IN VIVO DEL FILAMENTO

No Sí, verdadera Sí, falsa

PRESENCIA DE RAMIFICACIÓN

PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y REACTIVA A TINCIONES EN BACTERIAS FILAMENTOSAS DEL FANGO ACTIVO



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5. Técnicas de tinción de bacterias filamentosas.

Las tinciones que se exponen a continuación requieren de la preparación de frotis fijos en portaobjetos, en los que la muestra se ha distribuido homogéneamente dejándola caer cuidadosamente en forma de gotas sobre un portaobjetos. Una vez secos y sin necesidad de fijar a la llama, los frotis son sometidos al protocolo que determine la tinción.

5.1. Tinción Gram. Método Hücker modificado (En: Jenkins et al., 1993).

Se trata de una técnica de tinción diferencial que permite distinguir entre

bacterias Gram + y Gram -, en función del grado de permeabilidad de las paredes celulares al disolvente aplicado durante la tinción. Los filamentos Gram + se observarán de color azul y los Gram - de color rosado.

Reactivos Solución I (A+B) Las soluciones A y B se mezclan en el momento de ser utilizadas y se desechan

a las 24 h. Por separado, la duración máxima de cada una es de un mes. A. Solución de cristal violeta: 20 mL de cristal violeta al 10% (p/v) en etanol

95% (v/v). B. Oxalato amónico: 80 mL de oxalato amónico al 1% (p/v) en agua destilada. Solución II Preservar esta solución de la luz y desecharla al mes. Tomar 1 g de iodo y 2 g de ioduro potásico y enrasar hasta 300 mL con agua

destilada. Solución III Solución de safranina: 10 mL de safranina al 2,5% (p/v) en etanol 95% (v/v),

mezclados con 100 mL de agua destilada. Procedimiento Teñir durante 1 min con la Solución I y aclarar con agua destilada, goteando, en

ambos casos, desde un extremo del portaobjetos hacia el otro. Aplicar durante 1 min la Solución II y lavar con agua destilada. Decolorar con etanol 95% gota a gota durante 20-25 s y lavar posteriormente. Teñir durante 1 min con la Solución III, lavar y eliminar el exceso de agua con papel secante. Dejar secar y observar bajo objetivo 100x y campo claro.

Gram -

Gram +



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5.2. Tinción Neisser. Método de Eikelboom y van Buijsen, 1981 (En: Jenkins et al., 1993).

Esta tinción pone de manifiesto la presencia de gránulos de reserva de

polifosfato en el interior celular, observados con color negro-azulado. El azul de metileno es catiónico y se une a los sitios aniónicos de las cadenas de polímeros de polifosfato. En el caso de que todo el tricoma presente la coloración azulada, se considerará Neisser +. Si por el contrario el tricoma filamentoso presenta color marrón claro y ausencia de gránulos, se considerará Neisser -. Si el tricoma es Neisser – con presencia de gránulos, será gránulo Neisser +.

Reactivos

Solución I (A+B) Desechar al mes de ser preparada. Conservar A y B por separado.

A. Mezclar 0,2 g de azul de metileno con 10 mL de etanol 95% (v/v), 10 mL de ácido acético glacial y 100 mL de agua destilada.

B. Mezclar 3,3 mL de cristal violeta al 10% (p/v) en etanol 95% (v/v), con 6,7 mL de etanol 95% y 100 mL de agua destilada.

Solución II Tomar 33,3 mL de una solución de marrón de Bismark al 1% (p/v) en solución

acuosa y enrasar hasta 100 mL con agua destilada. Procedimiento

Teñir durante 30 s con la Solución I y lavar con agua destilada. Teñir durante 1 min con la Solución II, aclarar y escurrir el exceso de agua. Dejar secar y observar al microscopio óptico con el objetivo de 100x en campo claro.

Neisser - Neisser +

5.3. Procedimiento de observación de muestras fijadas y teñidas (frotis fijos).

La respuesta de los organismos filamentosos a las Tinciones Gram, Neisser, PHB,

etc., realizadas sobre frotis fijos de fango activo permiten, junto con las características morfológicas y estructurales deducidas de la observación in vivo, su identificación. Para la observación de una muestra fijada y teñida:

1. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el frotis, perfectamente seco, que ha sido teñido según el protocolo convenido.

2. Seleccionar el objetivo de inmersión o 100X y proceder a la observación.



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3. Una vez concluido el análisis microscópico, retirar el objetivo con cuidado y limpiarlo con un paño suave impregnado en la solución éter-etanol 3:1.

6. Cuantificación de bacterias filamentosas.

Un procedimiento útil y de aplicación sencilla en la cuantificación de bacterias filamentosas es el método cualitativo presentado en Jenkins et al. (1993), basado en la valoración del analista que, tras sucesivas observaciones y una vez adquirida una cierta práctica, establece su propio criterio de abundancia de los organismos filamentosos presentes en una suspensión biológica (Tabla 2). Tabla 2. Estimación cualitativa de la abundancia de bacterias filamentosas.

Filamentos presentes en todos los flóculos; hay más filamentos queflóculos

Excesivos 6

Hay filamentos en todos los flóculos y con densidad alta(>20/flóculo)

Abundantes 5

Se observan filamentos en todos los flóculos, pero con unadensidad media (5-20 por flóculo)

Muy comunes 4

Se observan filamentos en todos los flóculos pero en pequeñacantidad (1-5 filamentos por flóculo)

Comunes 3

Se ven filamentos en los flóculos, pero no en todos ellos Alguno 2

Hay filamentos pero se observan sólo en algunos flóculos Pocos 1

Ninguno 0

SIGNIFICADO ABUNDANCIA VALOR NUMÉRICO

VALORACIÓN DE FILAMENTOS EN FUNCIÓN DE LA ABUNDANCIA RELATIVA

Otros métodos tienen su base en el cómputo de intersecciones de los filamentos presentes en la suspensión biológica con la cuadrícula de una cámara de recuento, el contorno del ocular o del monitor de televisión conectado al microscopio, etc. Este es el planteamiento de autores como Pipes, 1979 (En: Jenkins et al., 1993) o Arnáiz et al. (2000), quienes emplearon la cámara de recuento Neubauer.



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7. Protocolo para la identificación de organismos filamentosos.

MUESTRA Nº: LOCALIZACIÓN DE LA MUESTRA: FECHA: OBSERVACIONES:

CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS

SSLM (mg/L)

SSVLM (mg/L)

V30 (mL/L)

IVF (mL/g)

FILAMENTO 1 2 3 4 5

Reacción a Gram

Reacción a Neisser (tricoma)

Reacción a Neisser (gránulos)

Reacción PHB

Gránulos de S in vivo

Gránulos de S (S-test)

Vaina

Morfología celular

Septos celulares

Constricciones en los septos celulares

Tamaño celular (ancho/largo en µm)

Morfología del tricoma

Crecimiento epifítico

Localización del filamento

Dimensiones del tricoma (ancho/largo en µm)

Otras observaciones (gonidos, rosetas)

IDENTIFICACIÓN

ABUNDANCIA

EFECTO SOBRE EL FLÓCULO

OTRAS OBSERVACIONES (FILAMENTOS EN

DISOLUCIÓN)



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