Biologa Celular y Embriologa -HistologaFacultad de Odontologa USM 1er Ao Prof. Milagros ToroOctubre, 2011

Tema 1: Introduccin a la Histologa y Tcnicas HistolgicasObjetivos: 1. Definir Histologa 2. Conocer las tcnicas histolgicas bsicas y las mas actuales 3. Manejar los trminos basfilo y acidfilo 4. Reconocer estructuras basfilas y acidfilas

HistologaEs el estudio de la anatoma microscpica de las clulas/tejidos de animales y plantas. El conocimiento de la histologa es esencial para el entendimiento de la fisiologa y la patologa.

La Clula

Clula: Unidad estructural y funcional en personas y todos los organismos vivos.

Clulas y TejidosTejido: Cualquier grupo de clulas que realiza una funcin especifica. No necesariamente forma una capa. Son tejidos: La medula sea el tejido conjuntivo que forma las fibras que soporta otros tejidos el tejido linfoide que es parte del sistema inmune y nos protege de bacterias y otros agentes

Clasificacin histolgica tejidos animalesHay 4 tipos bsicos de tejidos: Tejido Epitelial Tejido Conjuntivo Tejido Muscular Tejido Nervioso

Tejidos (Sub-tipos)Endotelio: recubre vasos sanguneos y linfticos Mesotelio: recubre espacios pleurales y pericardiacos Mesenquima: clulas que llenan espacios entre los rganos. Incluye: tejido adiposo, msculo, hueso, cartlago y tendones Clulas sanguneas y linfaticas: Son T. conjuntivo por su origen en medula sea

Tejidos (Sub-tipos)Clulas germinales: clulas reproductivas (espermatozoides y, oocitos) Placenta: rgano exclusivo de mamferos durante embarazo

Clulas Madres: clulas capaces de convertirse en una o varios de las anteriores.

Tejidos Bsicos14 2

3

1.EPITELIO, 2. CONJUNTIVO, 3. MUSCULAR, 4. NERVIOSO

Preparacin histolgicaLa mayora de los tejidos son muy gruesos y no permiten que la luz se transmita a travs de ellos. La habilidad de visualizar o identificar estructuras microscpicas se realza mediante el uso de coloraciones histolgicas.

Preparacin histolgica1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Fijacin Deshidratacin Aclarado Inclusin Seccin con un micrtomo Montaje Coloracin Cobertura

1.1. FijacinLos fijadores previenen la descomposicin (preservar los tejidos de la degradacin y para mantener la estructura celular y subcelular) Este proceso puede daar la funcionalidad de proteinas, especialmente las enzimas y puede denaturalizarlas. Mecanismo de Accin: Los fijadores preservan clulas y tejidos mediante entrelazado irreversible de protenas

1. 2. Fijadores ComunesMicroscopia de luz: solucin de formalina (formaldehdo) al 10%. Microscopia electrnica: solucin de glutaraldehido al 2.5%. Otros: tetraoxido de osmio o acetato de uranilo

1. 3. Proceso ( Fijacin)Bloques de tejido de ~1cm se remueven del organismo (biopsia vs. Necropsia) y colocados en fijador un mnimo de 4 h. El tejido puede conservarse por varios aos pero resulta frgil y difcil de seccionar. Lavado: luego de fijados los tejidos, son lavados con agua de un dia para otro o cambiando el agua o buffer.

1.4. Fijacin de Secciones Congeladas (Crioseccin)Forma rpida de fijar y montar secciones histolgicas. Es usado en remocin quirrgica de tumores Permite la determinacin rpida de los mrgenes (indica que el tumor fue removido completamente). Se usa un aparato de refrigeracin llamado criostato. El tejido congelado se secciona usando un micrtomo y se monta en laminillas y luego se tie. Se usa en mtodos como las de anticuerpos ligado a inmunofluorescencia

2. DeshidratacinPropsito:

Remover agua de los tejidos para reemplazarla por un medio slido (ej. Parafina) y permitir el corte de secciones. Luego de deshidratadas, las muestras son pasadas sequencialmente a travs de baos de mayores concentraciones de alcohol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, y 100% ) por aproximadamente 2 horas en cada concentracin para remover el agua.

3. AclaradoPropsito: Facilitar el paso posterior (inclusin en parafina) Se usa un fluido intermedio que se mezcle tanto con el alcohol (etanol) como con la parafina porque estos dos materiales no se mezclan. El tolueno, xylol, benceno, y el cloroformo, son los agentes de aclarado mas usados. Otros: mezclas de varios aceites ( aceite de cedro, de clavos, salicilato de metilo, creosota etc.)

4.1. InclusinSe realiza usando un material liquido (agar, gelatina o cera), nitrocelulosa o resinas epxicas.

La parafina es el material mas barato y mas usado. Recientemente, se han usado plsticos porque permite secciones mas delgadasLuego que los tejidos han sido aclarados se pone en moldes, se realiza la inclusin con parafina y se dejan endurecer

Inclusin

4.2. InclusinEndurecimiento (fraguado):enfriando el liquido o mediante el curado de la resina (calor, luz ultravioleta o catlisis qumica). Los tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina pueden ser guardados indefinidamente a temperatura ambiente. El ADN y ARN puede ser recobrado.

Para tejidos pre-congelados se llenan moldes con un medio basado en agua (ej. Glycol)

4.3 InclusinResinas Plsticas Ventajas: Permite obtener secciones ultra delgadas. Se coloca la muestra deshidratada en 1 mm3 de plstico liquido el cual polimeriza para formar un bloque duro para luego ser seccionado. Para microscopia de luz rutinaria, pueden usarse plsticos mas suaves

Preparacin de Muestras Microscopio de Luz y ElectrnicoLuz Tamao muestra Fijador Post-Fijacin Deshidratacin1 cm3 Formaldehydo Ninguno Alcohol graduado Xylol/Tolueno

Electrnico1 mm3 Glutaradehydo Tetraoxido de Osmio Alcohol o Acetona

Agente clarificanteGrosor seccin Tincin

Oxido de PropylenoVarios Plsticos 60-90 nm Metales Pesados

Material Inclusin Parafina5-10 Colorantes

5.1.SeccinPara microscopia de luz, se monta una hojilla de vidrio en un micrtomo y se corta una seccin de 5-10 (micras) de espesorPara microscopio electrnico: secciones de 50-90 nanometros con Ultra microtomo Para electro microscopio de transmisin: ultra micrtomo con hojilla de diamante secciones 50-90 nm que son montadas en una rejilla de cobre de 3 mm de dimetro. Los tejidos congelado se embeben en un medio refrigerante y se corta en el micrtomo en un criostato.

5.2. SeccinMicrotomo para secciones de parafina Consiste en una hojilla estacionaria y un mantenedor de muestra el cual avanza con intervalos preseleccionados con cada rotacin.

Seccin

5.3. SeccinUltamicrotomo: Similar al anterior pero avanza en nanometros en lugar de en micrones. Requiere un microscopio de diseccin montado sobre la hojilla de diamante.

5.4.SeccinMicrtomo montado sobre un congelador (criostato) Indicaciones: 1.muestras congeladas para estudio de molculas sensibles a temperatura o lipo-solubles. 2.cuando se desean resultados rpidos (biopsia durante intervencin quirrgica). Ventaja: rapidez y mantenimiento de funciones enzimticas e inmunolgicas. Desventaja: artefactos

6.1. MontajeMontaje: Para fijar las secciones a un portaobjetos para observarlas en microscopio ptico El mtodo usado con mayor frecuencia es el bao termostatizado

6.2.MontajeBao termostatizado:

Al seccionar, obtenemos una tira con los cortes. Esta flota sobre la solucin de montaje: gelatina 1% a 38C (adhesivo) o agua.El corte se estira para eliminar arrugas.

Luego, con un portaobjetos se toman las muestras

6.2.Montaje

7. ColoracinLos tejidos biolgicos no tienen contraste. Las coloraciones se usan para dar contraste y para resaltar alguna caracterstica de inters. Cuando se conoce el mecanismo de accin qumico de las coloraciones se habla de histoqumica.

7. ColoracinAntes de colorear, la parafina de las muestras debe eliminarse para que los colorantes solubles en agua puedan penetrar con: xilol alcohol agua

Coloracin

Basofilia, Acidofilia y MetacromasiaEl termino basofilo indica que tiene atraccin por o interacta con colorantes bsicos (cationicos). Incluye hematoxilina, carmina, y Hematoxilina de hierro.El termino acidofilo indica que tiene atraccin por o interacta con colorantes cidos (aninicos).Incluye eosina, orange G, azafran, etc. Metacromasia: Alteracin del color (espectro de absorcin) de un colorante al tener interaccin con celula o tejido. Un colorante azul (ej. Azul de Tolouidina) colorea los mastoicitos de color rosado.

Estructuras histolgicas basofilas y acidofilasNucleos: basfilos (azul oscuro/morado) Citoplasma, Generalmente acidofilo (Rosado) Algunos constituyentes citoplasmaticos pueden ser basofilicos, acidoflicos o neutrofilicos Fibras del Tejido Conjuntivo: rosadas o incoloras Clulas Musculares: Rosado

Coloraciones ComunesHematoxilina y Eosina:

Uso generalHematoxilina: tie los ncleos de azul

Eosina: tie el citoplasma, proteinas extra- o intra-celulares, las fibras colgenas, elsticas y reticulares y los eritrocitos de color rosado, naranja o rojo

Hematoxilina y EosinaEste mtodo consiste en la aplicacin de hemalum, el cual es un complejo formado por sales de aluminio y hematoxilina oxidada. Este colorea de azul los ncleos de las clulas y unos pocos componentes celulares La tincin del ncleo es seguida por la tincin con solucin acuosa o alcohlica de eosina, los cuales colorean otras estructuras eosinofilicas en varios tonos de rojo, rosado o naranja.

Hematoxilina y EosinaLa coloracin del ncleo por hemalum no requiere la presencia de ADN y probablemente es debida a la unin del complejo colorante-metal a nucleoproteinas bsicas ricas en arginina, como las histonas Las tinciones con colorantes bsicos o cationicos como el azul de toluidina requieren la presencia de cidos nucleicos. La extraccin qumica o enzimtica de los cidos nucleicos no permite la tincin con colorantes bsicos Las estructuras no tienen que ser acidicos o bsicos para ser llamados basofilicos o acidofilicos. La terminologa es basada en la afinidad a los colorantes.

Coloraciones ComunesHematoxilina y Eosina:

Coloraciones ComunesTricromica de Masson:

Uso Frecuente para Tejido Conjuntivo.Permite diferenciar colgeno de otras fibras (msculo liso y elastina).

Ncleos: negro,Citoplasma: rosado/rojo Fibras colgenas y cartlago: azul/verde Fibras musculares: rojo

Tricromica de Masson

Coloraciones ComunesColoracin de Plata: Especifica para fibras reticulares y nerviosas

Coloraciones ComunesPeriodic acid-Schiff (PAS) Membrana Basal, localiza carbohidratos Nucleo: azul Fibras colagenas: rosadoCandidiasis pulmonar

glomeruloestenosis

Coloraciones Comunes

Van Gieson: Fibras colgenas: rosado a rojo, musculo: amarillo

8. CoberturaUna vez colorada la seccin debe ser cubierta con una cubierta plstica o de vidrio delgada

AutomatizacinEn laboratorios con grandes volmenes de muestras los procesos son automatizados Un instrumento mueve los tejidos alrededor de las sustancias con una duracin determinada. El procesador de tejido "technicon" es uno de los mas comunes (esta discontinuado). Los procesadores mas modernos son computarizados.

Procesadores de Tejido

Procesador de tejido.

Procesador de tejido automatizado

Tcnicas ActualesTcnicas Actuales:

Histoqumica: se refiere al uso de reacciones qumicas entre qumicos de laboratorio y componentes dentro del tejido. Historadiografia: Las muestras son examinadas mediante tcnicas radioactivas. Con frecuencia, son tratadas histoquimicamente y radiografiadas. Inmunohistoquimica: Se usan anticuerpos para localizar protenas, carbohidratos y lpidos Si el colorante es una molcula fluorescente se denomina inmunofluorescencia.