Histo Sem 01 (Técnica histológica)

Algunas definiciones previas:

Célula: es la mínima porción de materia que posee vida independiente.

Tejido: es el conjunto de las células y sus materiales extracelulares que contribuyen a cumplir una(s) función(es) común(es).

Órgano: es el conjunto de tejidos que comparten una forma y un grupo de funciones comunes y más o menos independientes.

Aparato: es el conjunto de órganos que contribuye a un grupo de funciones comunes y que es anatómicamente aislable.

Sistema: el es el conjunto de órganos que contribuye a un grupo de funciones comunes y que NO es anatómicamente aislable.

Células

Tejidos

Órganos

Aparatos

Sistemas

BIOLOGÍA CELULAR (citología)

HISTOLOGÍA (anatomía microscópica o microanatomía)

ANATOMÍA

¿Cómo son?

¿Cómo llegan a ser?

EMBRIOLOGÍA GENÉTICA

¿Por qué los tejidos de los seres vivos se llaman así: tejidos?

Constitución del cuerpo humano

HUMORES (bilis, sangre, flema, linfa)

Desde los griegos y durante la Edad Media

FIBRAS

En el RENACIMIENTO (antes del microscopio)

Jean François FERNEL (1497-1558)

Gabrielle FALLOPIA (1523-1562)

Universa Medicina (1554): las partes sólidas del cuerpo animal están constituidas por “hilillos” o “fibras” elementales (villi seu stamina).

Lectiones de partibus similaribus et selectorum explicationes (1575): las partes del cuerpo se componen por “fibras”

(fibrae) de 3 tipos encargadas de sendas funciones: movimiento voluntario (fibra carnea), movimiento involuntario

(fibra cartilaginea y en arterias), y función mixta (fibras del tubo digestivo).

Los tejidos del cuerpo se hallan constituidos por una trama lineal, superficial o tridimensional de fibras

elementales.

Fibrae (fibra) Texturae (tejido) HISTOLOGÍA

En HISTOLOGÍA se estudian las células, los tejidos y órganos

que componen al cuerpo

Se pueden estudiar células y tejidos vivos: por medio de

- Cultivos:

· Celulares (primarios, líneas celulares, etc)

· Organotípicos (explantos)

· de Órganos.

- Manipulación experimental:

· Micromanipulación mecánica

· Microelectrodos

· Microinyectores

· Microirradiación

· Microcinematografía

Cultivo celular

Microinyección (ovocito)

Microinyección en células individuales (neuronas, amarillo Lucifer y sulforodamina)

MicrocinematografíaLab. Dr. Gabriel Scicolone (IBCN)

¿Les gustó?

Se pueden estudiar células y tejidos muertos:

- Componentes celulares por medio de su fraccionamiento por:· Centrifugación diferencial· Centrifugación en gradiente

de densidad

- Cortes histológicos

Fracción mitocondrial

Fracción nuclear

Fracción microsomal

Estudio de CORTES HISTOLÓGICOS

Como los tejidos animales contienen mucha agua, en cortes delgados, translúcidos, tienen poco contraste. Sólo se ven las estructuras que tienen color de por sí.

Hay que crear contraste donde no lo hay para poder distinguir estructuras. Por eso se colorean los tejidos.

Puesto este órgano en un microscopio, ¿veríamos algo?... ¿lo atraviesa la luz?...

…entonces hay que seccionarlo en rebanadas delgadas, muy delgadas (5-10

milésimas de milímetro)… para poder observarlo a trasluz con un microscopio…

Pero un órgano blando, ¿se puede cortar en rebanadas muy, muy delgadas?...

No se puede… prueben hacerlo con una nalga…

Hay que indurar al órgano con sus tejidos, incluyéndolo en un material más duro que se pueda cortar más delgado

Pasos de la técnica histológica de rutina:

1) Obtención de la muestra

2) Fijación

3) Inclusión:

a) Deshidratación

b) Aclaración

c) Inclusión propiamente dicha

4) Corte

5) Montaje preliminar

6) Coloración:

a) Aclaración

b) Rehidratación

c) Coloración propiamente dicha

7) Montaje final

a) Deshiddratación

b) Aclaración

c) Montaje final propiamente dicho

Obtención de la muestra

Para observación mediata (post-mortem) = AUTOPSIA

Para observación inmediata (in vivo) = BIOPSIA

Obtención de la muestra

Observación del material coloreado

Coloración supravital (se administra el colorante a partes o células del animal que aún conservan la vida, después de la toma de la muestra)

Reticulocitos (violeta de cresilo)

Coloración intravital (se administra el colorante al animal vivo, antes de la toma de la muestra)

Macrófagos (tinta china)

Feto de ratón, matriz ósea (rojo alizarina y alcian blue)

Observación inmediata (in vivo) = BIOPSIA

Observación del material fresco, sin colorear

Epitelio vaginal, células descamadas

Fijación

Objetivos de la fijación:

- Fijar estructuras biológicas como son in vivo

- Impedir/detener autólisis y procesos vitales

- Impedir desaparición de elementos solubles (insolubilización por enlaces cruzados)

- Evitar acción de bacterias/hongos (antisepsia)

Características de un buen fijador:

- Rápida acción fijadora

- Alta penetración

- Indura a los tejidos

- No crear artificios

Fijación

Tipos de agentes fijadores:

- Físicos:

Calor

Frío (congelación-desecación)

Microondas

- Químicos:

Simples:

agentes Oxidantes: ácido crómico, tetróxido de osmio, bicromato de potasio, bicromato de mercurio, ácido acético, ácido

pícrico

agentes Reductores: etanol, metanol, formaldehído, glutaraldehído

Compuestos o mezclas fijadoras:

Líquido de Zenker (bicloruro de Hg, bicromato de K- ác. acético)

Líquido de Helly (bicloruro de Hg-bicromato de K-formaldehído)

Líquido de Bouin (ác. pícrico-formaldehído-ác. acético)

Líquido de Dubosque-Brasil (ác. pícrico-ác. acético-formaldehído-etanol)

Fijación

Métodos de fijación

por Inmersión

por Perfusión

Inclusión

50% 70% 96% 100%

Post-fijación por inmersión

Deshidratación en concentraciones crecientes de ETANOL

Aclaración con XILOL

Etanol 100%XILOL

Inclusión

Distintos tipos de parafinas se funden (son líquidas) a 45º-58º…

…se sumerge la muestra de tejido en

parafina líquida…

…se incuba en estufa a 60º para que la parafina impregne todo el tejido

Inclusión propiamente dicha

Moldes de inclusión

Taco de inclusión

Se obtiene un taco de inclusión, sólido, con el tejido incluido en parafina. El taco se talla y se pasa al…

Charles Sedgwick Minot (1852-1914)

Corte

¿Con qué se corta el taco de inclusión?...

…con un MICRÓTOMO

Corte

Micrótomo rotatorio tipo Minot

Taco

Platina

Taco

Cuchilla Tira de cortes Grosor: 5-10 μm

Montaje preliminar

Portaobjetos de vidrio Corte de tejido

Coloración

Aclaración (desparafinización) con XILOL

Rehidratación en concentraciones decrecientes de ETANOL

Coloración propiamente dicha HEMATOXILINA + virado + EOSINA

Deshidratación en concentraciones crecientes de ETANOL

Aclaración con XILOLMontaje final propiamente dicho con Bálsamo de Canadá o similar

Montaje final

Corte sin colorear

Corte coloreado sólo con EOSINA

Corte coloreado con EOSINA y HEMATOXILINA

CONCEPTOS

ACIDOFILIA: es la capacidad que poseen ciertos componentes celulares y extracelulares básicos o catiónicos (con carga eléctrica neta positiva) para formar uniones salinas o electrostáticas con colorantes ácidos o aniónicos (con carga eléctrica negativa).

BASOFILIA: es la capacidad que poseen ciertos componentes celulares y extracelulares ácidos o aniónicos (con carga eléctrica negativa)para formar uniones salinas o electrostáticas con colorantes básicos o catiónicos (con carga eléctrica neta positiva).

Acidofilia y Basofilia con H-E

Coloraciones tricrómicas:Tricrómico de Mallory (azul de anilina

+ naranja G + fucsina ácida; todos ácidos; se desconoce el fundamento)

Frank Burr Mallory (1862-1941)

Cirrosis

Coloraciones tricrómicas:

Tricrómico de van Giesson (ácido pícrico + fucsina ácida + hematoxilina férrica de Weigert)

Tricrómico de Masson-Lillie (fucsina Ponceau + verde luz + hematoxilina de Mayer)

Tricrómico de Masson (fucsina Ponceau + azul de anilina + hematoxilina de Mayer)

Técnicas de impregnación argéntica:Depósito de sales de plata metálica

Método de del Río Hortega (microgliocito)

Método de Cajal para neurofibrillas (neurona)

Impregnación argéntica de Gomori para fibras reticulares (hígado)

Método de Golgi (neurona)

Técnica de de Olmos (amino-cupro-argéntica;

neuronas en degeneración)Aparato de Golgi (enterocitos)

CONCEPTOS

ORTOCROMASIA: es la capacidad que tienen los colorantes básicos o ácidos de mantener invariable su espectro de absorción electromagnética al formar uniones salinas o electrostáticas con los componentes celulares y extracelulares.

METACROMASIA: es la capacidad que tienen ciertos colorantes básicos o catiónicos derivados de las tiazinas de virar su espectro de absorción electromagnética al formar uniones salinas o electrostáticas con ciertos componentes celulares y extracelulares que son polímeros polianiónicos.

Colorantes metacromáticos: azul de metileno, azul de toluidina, violeta de metilo, azul de tionina, azur A

Metacromasia

(matriz cartilaginosa; cartílago hialino)H&E Azul de toluidina

Metacromasia (mastocitos; oreja de ratón)H&E Azul de toluidina

Técnicas histoquímicas: Localización de polisacáridos Técnica de PAS (peryodic acid-Schiff)

1) El ácido peryódico (HIO4) oxida a los glúcidos (sobre grupos 1-2 glicol de las hexosas) y expone grupos aldehídos.

2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la unión del reactivo de Schiff (fucsina ácida decolorada por anhídrido sulfuroso)

H&E PAS Alcian blue

Células caliciformes

Técnicas histoquímicas: Localización de ácidos nucleicos Técnica de Feulgen

1) Hidrólisis ácida débil con HCl que elimina bases purínicas del ADN (A y G) y expone grupos aldehído.

2) Los grupos aldehídos formados se ponen en evidencia por la unión del reactivo de Schiff (fucsina ácida decolorada por anhídrido sulfuroso)

Ácidos nucleicos (raíz de cebolla)

H&EFeulgen

Técnicas histoquímicas: Localización de lípidos

Nervio, mielina (OsO4)

Tinción por solubilidad diferencial (método físico, no químico)

Sudán III grasas (naranja)

Sudán IV (rojo escarlata) grasas neutras (rojo vivo), ést. de colest. (rosa)

Sudán negro B fosfolípidos

Aceite rojo O triacilglicéridos

Azul de Nilo fosfolípidos

Tetróxido de osmio (OsO4) mielina (marrón o negro)

Adipocitos (H&E) Adipocitos (Sudán rojo)

Glándula mamaria (OsO4-verde de metilo)

Técnicas histoquímicas: Localización de enzimas

Fosfatasa alcalina (bazo; técnia de Gomori)

Demostración de lectina PNA que se une a galactosil-N-acetilgalactosamina de glucoproteínas por reacción de la

peroxidasa-DAB (epitelio respiratorio)

Fundamento: localización de la reacción enzimática por demostración del lugar en el que se encuentra una enzima que transforma un sustrato en un producto; el producto, con una reactivo agregado, forma un compuesto insoluble y coloreado

Demostración de NADPH-diaforasa (deshidrogenasa; corteza frontal, neuronas nitrérgicas) (Boccoli, Loidl, López-Costa, Pistone Creydt, Ibarra, Goldstein (2008) Brain Res)

Reacción de Pearls: hierro en hemosiderina (precipitado azul-turquesa; bazo de rata)

Técnicas histoquímicas: Localización de iones

Reacción de von Kossa: para calcio; (precipitado negro; hueso en osificación)

Azul de Prusia: hierro en hemosiderina (precipitado azul-turquesa; pulpa roja en bazo; tubulos renales)

Inmunohistoquímica:Se basa en: la detección de reacciones controladas antígeno-anticuerpo por medio de la marcación de los anticuerpos.

Sirve para: detectar sustancias (principalmente proteínas), muy específicamente, que pueden estar en muy bajas concentracioens en el tejido en estudio.

Métodos: existen dos grupos, el directo y el indirecto.

Tipos de anticuerpos: policlonales (desarrollados en conejo), monoclonales (desarrollados en ratón).

Ludwig A. Sternberger

Albert H. Coons (1912-1978)

Ac. con fluoresceína (1941) Técnica de PAP (1970)

César MilsteinCésar Milstein (1927-2002)(1927-2002)

Georges J. F. KöhlerGeorges J. F. Köhler (1946-1995)(1946-1995)

Ac. monoclonales (1975)

Inmunohistoquímica:


Vimentina (céls. de Sertoli, testículo)

BrDU (céls. postmitóticas, yeyuno-íleon)

S-100B (astrocito, hipocampo; Evrard, Duhalde-Vega, Ramos, Tagliaferro, Brusco

(2003) Dev Brain Res)Nf-200 (neurona, c.

frontal; Evrard, Duhalde-Vega, Tagliaferro,

Mirochnic, Caltana, Brusco (2006) Exp Neurol)

MTCO2, marcador de mitocondrias humanas (glioblastoma humano)

Células en cultivo marcadas para actina, tubulina y núcleo


Marca Nuclear (Hoescht 33342)

Lic. Guadagnoli (cultivo celular; Lab. Dra. Brusco)


Marca Glial (GFAP)

Lic. Guadagnoli (cultivo celular, Lab. Dra. Brusco)


Marca Neuronal (MAP-2)



Marca Glial y Neuronal (GFAP; MAP-2)



Marca Nuclear, Glial y Neuronal (Hoescht 33342; GFAP; MAP-2)


Hibridización in situ:

ARNm de la subunidad NR3B del receptor glutamatérgico (motoneuronas, méd. espinal)

Nissl NR3B

Se basa en: hibridización ADN-ADN, ADN-ARN o ARN-ARN.

Se utilizan sondas marcadas (radiactivas, fluorescentes, con cromógenos) complementarias de lo que se desea encontrar y se visualiza por IHQ o radioautografía.

Tipos: FISH: fluorescente; CISH: cromógeno

Sirve para: detectar la presencia de secuencias de ADN/ARN (expresión de genes durante el desarrollo, ARNm de proteínas, genomas virales, etc.)

Citomegalovirus en submucosa de colon

Factores de transcripción delta-1 y hairy-2a; embrión de Xenopus (López, Rosato-Siri, Franco, Paganelli, Carrasco (2005) Development).

Radioautografía:

Charles Philippe Leblond (1910-2007)

Se basa en: los isótopos radiactivos (3H, 32P, 99Tc, 131I, 14C, 35S) de un elemento se comportan igual que los no radioactivos.

Se administra una sustancia radiactiva a una animal y “se rastrea” su utilización metabólica por las células.

Se expone el tejido con el material radiactivo a una película fotográfica y se revela de igual modo.

Sirve para: detectar y seguir vías metabólicas (síntesis y catabolismo de proteínas, por ejemplo), localización espacial precisa de determinadas moléculas, estudios de unión ligando-receptor (binding), etc.

Síntesis de glúcidos complejos en el Golgi ([3H]-glucosa; células caliciformes

al MO; Neutra y Leblond, 1966)Receptor A1 de adenosina, en cerebro de rata, marcado con [3H]-

CCPA (Giraldez, Zanetti, Antonelli, Rodríguez de Lores Arnais, Girardi -1998-)

Síntesis de glúcidos complejos en el Golgi ([3H]-glucosa; células caliciformes al MET; Neutra y Leblond, 1966)

Criofractura:

Se basa en: se congela el tejido (-150º C); se lo fractura con una navaja dentro de un aparato especial al vacío; se sublima el hielo; se realiza una réplica (etching) sombreando con Pt (1) y contrastando con C evaporado (2); se eliminan los tejidos por digestión química; se examina la réplica al MET.

Resolución: 3 nm.

Sirve para: estudiar membranas biológicas y procesos celulares que involucran membranas.

Microscopía óptica y electrónica: diferencias en la técnica

DiferenciasDiferencias MO MET

Fijador más usadoFijador más usado FormaldehídoFormaldehído Glutaraldehído, OsOGlutaraldehído, OsO44

Medio de inclusiónMedio de inclusión Parafina, gelatinas, resinas Parafina, gelatinas, resinas epoxiepoxi

Resinas epóxicas o Resinas epóxicas o acrílicas (araldita, epón, acrílicas (araldita, epón,

metacrilato)metacrilato)

Formación del tacoFormación del taco Moldes de papel, plástico o Moldes de papel, plástico o metalmetal

Cápsulas de gelatina o Cápsulas de gelatina o plásticas de Beemplásticas de Beem

Instrumento de corteInstrumento de corte Micrótomo, vibrátomo, Micrótomo, vibrátomo, crióstatocrióstato UltramicrótomoUltramicrótomo

Cuchillas de corteCuchillas de corte AceroAcero VidrioVidrio

Grosor del corteGrosor del corte 5-10 5-10 μμmm 10-100 nm10-100 nm

PortaobjetosPortaobjetos VidrioVidrio Grilla de cobre, niquel, Grilla de cobre, niquel, titanio, carbono, u orotitanio, carbono, u oro

Elemento contrastanteElemento contrastante Colorantes hidro- o Colorantes hidro- o liposolublesliposolubles

Sales de metales pesados Sales de metales pesados (U, Pb, La, W, Fe, Pd, Ir)(U, Pb, La, W, Fe, Pd, Ir)

Microscopía óptica Microscopía electrónica

Moldes de papel, plástico o metal

Cápsulas de gelatina o de plástico (de Beem)


Taco

Cuchilla de vidrio

Ultramicrótomo

Micrótomo rotatorio tipo Minot


Vibrátomo

Crióstato

Taco

Cuchilla de vidrio

Ultramicrótomo


Portaobjetos de vidrio

Grillas de cobre

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