Herramientas bioquímicas para la taxonomía

integrativa de Meloidogyne spp.

XVI Congreso Internacional y XLI Congreso Nacional de

Fitopatología

María Gabriela Medina Canales

México, D.F, a 20 de julio de 2014

Identificación

MÉTODOS

Morfológico y morfométrico

Hospedantes diferenciales

Caracterización molecular

Caracterización enzimática

•Patrones perineales•Estiletes de machos , hembras y J2•Cabeza de los machos y J2

•Algodón “Deltapine 61”•Tabaco ”NC 95”•Pimienta “California Wonder”•Sandía “Charleston Gray”•Cacahuate “Florunner” •Tomate “Rutgers”

•Amplificación por PCR y RFLP de los ITS •Amplificación de los IGS de DNAr

Eisenback, 1991; Karssen y Moens,2006

Identificación

MÉTODOS

Morfológico y morfométrico

Hospedantes diferenciales

Caracterización molecular

Caracterización enzimática

•Patrones perineales•Estiletes de machos , hembras y J2•Cabeza de los machos y J2

•Algodón “Deltapine 61”•Tabaco ”NC 95”•Pimienta “California Wonder”•Sandía “Charleston Gray”•Cacahuate “Florunner” •Tomate “Rutgers”

•Amplificación por PCR y RFLP de los ITS •Amplificación de los IGS de DNAr

Eisenback, 1991; Karssen y Moens,2006

Caracterización enzimática

Sensible Estabilidad Esterasa

mayor valor diagnóstico

Fenotipos isoenzimáticos, de malato deshidrogenasa y esterasa, de diferentes especies de Meloidogyne.

Karssen y Moens,2006; Brito et al., 2010

Antecedentes

1985

2001

2003

1994

Uso de fenotipos enzimáticos para la identificación de

especies de Meloidogyne. Esbenshade y Triantaphyllou.

Polimorfismo de isoenzimas de esterasa en zimogramas de

poblaciones de Meloidogyne detectadas por el Phastsystem.

Molinari

Variabilidad isoenzimática de poblaciones de Meloidogyne spp.

provenientes de regiones brasileñas productoras de soya. Da

Cunha

Meloidogyne javanica parasito de cacahuate. Tomaszewski et al.

Antecedentes

2004

2011

2010

2005

2013

Caracterización de especies de Meloidogyne de China usando fenotipos

isoenzimáticos y RFLP de DNA mitocondrial amplificado. Jianhua et al.

Patrones isoenzimáticos de poblaciones venezolanas de Meloidogyne spp.

Crozzoli et al.

Plantas ornamentales infectadas con Meloidogyne spp. en Florida. Brito et al.

Diversidad de Meloidogyne spp. parasitando en plantas de la Isla de

Martinica. Quénéhervé et al.

Caracterización morfológica, enzimática y molecular de M. arenaria de Anubias

barteri var. caladiitolia en China. Huang et al.

MuestreoMuestreo

Extracción

Extracción

Electroforesis

Electroforesis

TinciónTinción

A B C

Metodología

Esbenshade y Triantaphyllou, 1985

Extracción de proteínas

1 Hembra + 10mL de regulador de

extracción

1 Hembra + 10mL de regulador de

extracción

Esterasa. 20 g de sacarosa o glicerol + 2 mL de tritón X-100.

Mdh y Sod. 20 g de sacarosa o glicerol + 0.1 g de TRIS + 0.1 g de ascorbato + 0.1 g cisteína. Ajustar pH a 8.0 con

HCl Esbenshade y Triantaphyllou, 1985

Electroforesis

Gel concentrador• 0.5 mL de sol. B• 1 mL sol. D• 0.5 mL sol. E• 2 mL sol. FGel

separador• 4 mL de sol. G• 1 mL agua• 2 mL sol. C• 1 mL sol. A o A2

Buffer• TRIS 6 g• Glicina 28 g• Agua 1 L• pH=8.3• Diluir 1:9

Corrimiento 30 min 80 volts + 70 min 250 volts

Esbenshade y Triantaphyllou, 1985

Revelado

Solución para teñir Esterasa•100 mL regulador fosfatos•30 mg EDTA•60 mg fast blue RR•40 mg a-naftilacetato/2 mL acetona

Solución para teñir Mdh / Sod

•10 mL sol. A•15 mL sol B•50 mg NAD•30 mg NBT•50 mL agua

•2 mg PMS en 26 mL agua

Incubar 1 hora a 37ºC

-Sol. A10.6 g Na2CO3 + 13.4 g malato

-Sol. B

6.06 g TRIS pH = 7.1

Esbenshade y Triantaphyllou, 1985

Interpretación de resultados

ab

Rm = Migración de la banda proteica (a) longitud total recorrida del gel (b)

x100

a

Banda

1

Banda

2

Rm banda 1= 3.8 x 100 = 46.3

8.2

Rm banda 2= 3.2 x 100 = 39

8.2

Fenotipo de esterasa H1 correspondiente a M. hapla.

Fenotipo de esterasa S1 correspondiente a M.chitwodii.

Esbenshade y Triantaphyllou, 1985; Alquicira-Jímenez, 2014

Ejemplos de fenotipos de EST

Fenotipo de esterasa y patron perineal de Meloidogyne incognita. Se observa el fenotipo I1 que presenta un Rm = 43,0

Fenotipo de esterasa para Meloidogyne sp. Se observa el fenotipo que presenta un Rm = 10,1 y 52. 9

Alquicira-Jímenez, 2014

Resultados

Representación esquemática de los fenotipos isoenzimáticos de esterasa observados en Meloidogyne spp. J2a = M. javanica, S1 = M. chitwoodi, H1 = M. hapla, Sp 1 = Especie no identificada, G1 = M. graminis, M2 = M. enterolobii, I1 = M. incognita, A1 , A2a, A3= M. arenaria.

; Alquicira-Jímenez, 2014

Fenotipos de esterasa observado en 291 poblaciones en estudio de 16 especies de Meloidogyne. Cada fenotipo es designado por letras que sugieren la especie a la que pertenece (A = arenaria, H = hapla, I = incognita, J =javanica) o por la velocidad de migración (VS = muy lento, S = lento, M = medio, F = rápido, VF = muy rápido) y el número indica el número de bandas presentes (Esbenshade y Triantaphyllou, 1985).

VS1 = M. graminicola, VS1-S1a = M. carolinensis, VS1-M2 = Meloidogyne sp. S1= M. chitwoodi, S1-M1 = M. arenaria, S2-M1 = M. hispanica, M1 = M. microtyla, M3 = Meloidogyne sp. M3a = M. cruciana, M3F1= M. arenaria, F1 = M. querciana, VF1 = M. naasi

(Esbenshade y Triantaphyllou, 1985)

Fenotipo de esterasa identificado de hembras observadas en geles de poliacrilamida. Se muestras tres bandas de actividad enzimática características de M. javanica y dos bandas de actividad enzimática características de M. arenaria (flecha) (Tomaszewsk et al., 1994).

Fenotipos de esterasa (EST) y malato deshidrogenasa (MDH) observados en 96 poblaciones de Meloidogyne spp. de platano (Musa sp.) (Cofcewicz et al., 2005).

Representación esquemática de los fenotipos de esterase de Meloidogyne spp. que infectan a ornamentales en Florida. A2 = M. arenaria, Mf3 = M. floridensis, Mg1 = M. graminis, I1 and I2 = M. incognita, J3 and J2 = M. javanica, VS1-S1 = M. mayaguensis, Ep2 = M. sp.1, Mc1 = M. sp.2, Vo1 = M. sp.3, Vo2 = M. sp.4, Gj2 = M. sp.5 y Cv2 = M. sp. 6. Rm = Movilidad relativa (Brito et al., 2010).

Fenotipos de esterasa (EST) y malato deshidrogenasa (MDH) obtenidos por electroforesis de 96 raíces y suelo de varias plantas en Martinica (Quénéhervé et al., 2011).

Fenotipos isoenzimáticos de esterasa y malato deshidrogenasa de M. arenaria proveniente de Anubias barteri var. caladiitolia. Líneas 1 y 3: M. javanica; Línea 2: M. arenaria de Anubias barteri var. caladiitolia (Huang et al., 2013).

Caso de estudio

M. enterolobii M. mayaguensis

Xu et al., 2004 se dan cuenta de que son los mismos ya que tienen el mismo fenotipo de EST

(VS1-S1) y lo corroboraron con métodos moleculares.

Xu et al., 2004 se dan cuenta de que son los mismos ya que tienen el mismo fenotipo de EST

(VS1-S1) y lo corroboraron con métodos moleculares.

Yang y Eisenback, 1983 Rammah y Hirschmann, 1988

Fenotipo EST = VS1-S1

Fenotipo EST = VS1-S1

GRACIAS