HEPATITIS C DESDE EL DIAGNOSTICOEN UN DONANTE DE SANGRE AL

TRASPLANTE HEPATICO. NUEVAS TERAPEUTICAS

ALFREDO MARTINEZLABORATORIO DE VIROLOGIA CLINICA

CEMIC

Un BIOQUÍMICO dona sangre para un amigo y le llega la

siguiente carta...

SU MUESTRA PRESENTA SEROLOGÌA REACTIVA

El mensaje equivocadoEl mensaje equivocado

““Su muestra de sangre fue reactiva para phialophora Su muestra de sangre fue reactiva para phialophora richarsiae” richarsiae”

Tratemos de vivirlo en “carne propia”Tratemos de vivirlo en “carne propia”

Infectólogo amigo

Experto en micosis

¿Cómo creen que se sentirían entre las 2 consultas?¿Cómo creen que se sentirían entre las 2 consultas?

En ausencia de síntomas y signos, esta serología tiene 70% En ausencia de síntomas y signos, esta serología tiene 70% de falsos positivos. En el peor de los casos se cura con un de falsos positivos. En el peor de los casos se cura con un

antifúngico oral que además no es tóxicoantifúngico oral que además no es tóxico

Se trata de un hongo que produce pústulas, ulceras, Se trata de un hongo que produce pústulas, ulceras, ostiomielitis, artritis y meningitis. Las formas diseminadas ostiomielitis, artritis y meningitis. Las formas diseminadas

suelen ser muy serias y potencialmente fatalessuelen ser muy serias y potencialmente fatales

Pensemos ahora en el paciente con hepatitis C

Llega la carta: “Su sangre es reactiva.....”)

El paciente no está “preparado” para semejante noticia Desesperado, por fin

consigue el número de hospital

Sale a “buscar” al primer médico que encuentre

En la mayoría de los casos no tienen “suerte”

““El primer turno para el Dr. Smith es el 3 de El primer turno para el Dr. Smith es el 3 de diciembre. El Dr. García puede verlo en un mes”diciembre. El Dr. García puede verlo en un mes”

HCV

““El virus que creó a la Hepatología”El virus que creó a la Hepatología”

Paul Berk Seminars in Liver Disease

(2000)

“ES MEJOR SABER DESPUES DE HABER

PENSADO Y DISCUTIDO, QUE ACEPTAR

LOS SABERES QUE NADIE DISCUTE

PARA NO TENER QUE PENSAR”

FERNANDO SAVATER

AGENDA

1- CICLO DE VIDA DE LA HEPATITIS C – BLANCOS TERAPEUTICOS

2- DIAGNOSTICO DE HEPATITIS C

3- NUEVOS TRATAMIENTOS Y RESISTENCIA

Historia naturalCronicidad

Evolución

Hígado normal

Infección aguda

Infección crónica

Cirrosis en 20%

CHC 1-4% por año

progresión

Rápida

Lenta mayor de 30 años

menor de 20 años

Historia Natural de la Hepatitis C

Hepatitis Aguda C(100)

Fulminante CuraciónHepatitis Crónica C

30 70

<1

Muerte/TxH-4%

ALT normal ALT elevada

CIRROSIS

5 – 10a 11-30a > 30a

HepatoCa 2% Descompensación 5%

50

1/4 1/4 1/2

20

mujeres

EnfermedadesExtrahepáticas

?

niños jóvenes

INGRESO DEL VIRUS (FUSION)

REPLICACION DEL RNA HCV

TRADUCCION Y PROCESO DE LA POLIPROTEINA DE HCV

ENSAMBLE DE LA NUEVA PARTICULA DE HCV

DIAGNOSTICO DE HEPATITIS CMETODOS SEROLOGICOS Y MOLECULARES

SCREENING DE HCV: DETECCION DE ANTI HCV

ELISA: test de screening– Sensibilidad: 97%– Detección de anticuerpos circulantes

Valor predictivo positivo– 95% en pacientes pertenecientes a población deriesgo con ALT elevada– 50% en pacientes sin riesgo y ALT normal

SCREENING SEROLSCREENING SEROLÓÓGICOGICO

CORE E1 E2 NS1NS2 NS3 NS4 NS5ELISAELISA

c100-31º

S

80%

c200C22-32º 95%

c200 NS5C22-33º 97%

La Pregunta Inicial

Anti-Anti-HCV(+)HCV(+)

¿Falso positivo?

¿Verdadero positivo?

Pruebas Suplementarias:

RIBA-LIAHCV RNA Transfusiones o

drogas IV Incremento de ALT Enfermedad hepática

Pacientes sanos No antecedentes

parenterales ALT normal

Limitaciones del Anti-HCV

No mide la presencia de virus circulante

No distingue entre infección aguda, crónica o resuelta

No es útil para el diagnóstico de infección aguda (seroconversión en semanas)

En poblaciones de bajo riesgo la tasa de resultados falsos positivos es alta

SCREENING SEROLSCREENING SEROLÓÓGICOGICOC

on

cen

tració

n R

ela

tiva

Días

Infección

0 10 20 60 80 10030 40 50 70 90 110

Eclipse

Anti-HCV 3ra

Anti-HCV 2da

Anti-HCV 1ra

Ag/Ac 4ª

Período de Ventana Serológica

RIBA/LIA

Test suplementario que permite caracterizar los antígenos virales específicos contra los cuales están dirigidos los anticuerpos utilizados en el ELISA

ANTIGENOS VIRALES(ESTRUCTURALES Y NO ESTRUCTURALES)ADHERIDOS A UN SOPORTE SÓLIDO (NITROCELULOSA/NYLON)

•Su aplicación en la clínica es limitada.

•Permite confirmar resultados de ELISA de bajarelación de positividad o resultados discordantes ELISA positivos con PCR cualitativa no detectable.

•Un resultado por RIBA-LIA negativo en pacientes con ELISA positivo indicaría un resultado falso positivo de este último.

RIBA/LIA

HCV Ag CORE

Architect® HCV Ag assay (Abbott Diagnostics) 

Dynamic range of quantification is 3.0–20,000 fmol/LHCV Ag assay’s LLOD corresponds to HCV RNA

levels of 500–3000 IU/mL

Annals of Gastroenterology (2013) 26, 146-149

Annals of Gastroenterology (2013) 26, 146-149

ELISA ANTI HCV

MUESTRAS QUE PERMANECEN POSITIVAS Y QUE SONNEGATIVAS POR UN TEST CONFIRMATORIO

INESPECIFICA O FALSA REACTIVIDAD

FALSOS POSITIVOS O BFR

CAUSASDE FP

INMUNOENSAYOS

La causa primaria de BFR es la reactividad de anticuerpos No específicos ya sea contra epitopes virales o no viralescontaminantes

Vacunación contra FLU o RabiaInfecciones agudas recientes o AlergiasAgentes relacionados inmunologicamente

HCV-RNA PCRDetección CUALITATIVA de HCV-RNA (suero o plasma)

Determina la presencia de RNA del HCV en el suero o plasma (viremia) en pacientes infectados

El método es una transcripción reversa y Nested PCR de la región 5’ no codificante del genoma viral

El ensayo debe tener una sensibilidad adecuada y conocida contra el standart de OMS

Un límite de detección mayor a 50/100 UI/ml, informa como no detectables a pacientes en situaciones críticas como:

– Confirmación de la infección y definición de replicación viral.– Valoración de la respuesta virológica temprana intratramiento

Algoritmo Diagnóstico

ELISA HCV (+)

ANTICUERPOSRIBA/LIA

HCV RNA PCRCUALITATIVA

CARGA VIRALHCV

LIMITE DETECCIÓN10 UI/mL

DECISIÓN DE TRATAMIENTO

LIMITE DE DETECCIÓN 50 UI/ml

TERAPIA DE DE HEPATITIS C: PASADO, PRESENTE Y FUTURO

• Genotipo HCV

• HCV-RNA cuantitativo (Carga Viral)

• Polimorfismo de IL-28

ENSAYOS DE LABORATORIO APLICADOS AL TRATAMIENTO DE HCV

7 GENOTIPOS DIFERENTES, QUE DIFIEREN EN SU SECUENCIA NUCLEOTÍDICA EN UN 25-30%

EN UN GENOTIPO SE HAN ENCONTRADO DIFERENTES SUBTIPOS QUE SON IDENTIFICADOS CON LETRAS (a, b, c, ETC.)

MARCADA DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA: GENOTIPO 1,2,3 CONTINENTE AMERICANO Y EUROPEO GENOTIPO 2 EN JAPÓN Y CHINA GENOTIPO 4 EN EGIPTO GENOTIPO 5 ESTÁ CIRCUNSCRIPTO A SUDÁFRICA GENOTIPO 6 SUDESTE ASIÁTICO

FUERTE PREDICTOR DE RESPUESTA VIROLÓGICA SOSTENIDA (RVS) EN LOS DIFERENTES REGÍMENES DE TRATAMIENTO

ES IMPORTANTE LA DETERMINACIÓN DE SUBTIPOS YA QUE LA RSV ES DIFERENTE PARA CADA UNO DE ELLOS

DETECCION DEL GENOTIPO DE HCV

LA SECUENCIACIÓN DIRECTA DEL GENOMA: “GOLD STANDARD” PARA LA DETERMINACIÓN DEL GENOTIPO

LAS REGIONES DEL VIRUS QUE LAS DIFERENTES METODOLOGÍAS UTILIZAN PARA GENOTIPIFICAR SON 5’UTR, CORE Y NS5B

REGIÓN UTILIZADA PARA LA GENOTIPIFICACIÓN: 5’NC

METODOS COMERCIALES

ENSAYO PROVEEDOR MÉTODO APLICACIÓN REGIONVersant HCV genotype 2.0

assay

Siemens Hibridación Reversa

Genotipo y algunos

subtipos HCV

5’ UTR

Trugene genotyping

assay

Siemens Secuenciación directa (Sanger)

Genotipo y subtipo HCV

5´UTR

Real Time HCV genotype II

Abbott Real Time PCR Genotipo y subtipo HCV

5´UTRNS5B

Innolipa / Linear HCV Array

INNOGENETICS PCR + HIBRIDACIÓN

REVERSA

Genotipo y Subtipo

5´UTR

Innolipa

CONSIDERACIONES :

SE SUGIERE NO UTILIZAR RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH

POLYMORPHISMS)

EL INFORME DEL GENOTIPO DEBE INDICARSE DE ACUERDO A LA NOMENCLATURA INTERNACIONAL

MAYOR PREDICTOR DE RESPUESTA TERAPÉUTICA : GENOTIPO

Factores del paciente• Edad• Sexo• Raza• Peso• Resistencia a InsulinaHígado graso• Salud Mental• Uso de Drogas/alcohol• Cirrosis• Coinfección con HIV• IL28B status

Factores del Virus• Genotipo• Carga Viral de HCV RNA

ASPECTOS GENÉTICOS DEL HUÉSPED

GWAS : ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN GENETICA

GENOMA HUMANO 3000 MILLONES PB

SNPs CADA 300PB

10 MILLONES DE SNPs

GEN IL28B : 4 GRUPOS INDEPENDIENTES MOSTRARON EL ROL DE LA VARIACIÓN GENÉTICA DE UN SIMPLE POLIMORFISMO

Polimorfismos asociados a IL28B: GENOTIPOS

rs12979860: C/C C/T T/T

rs8099917: T/T T/G G/G

rs8099917 T/T • RVS PEG IFN/RB gen 1• FUERTE CORRELACIÓN ENTRE LOS PORTADORES DE ESTE POLIMORFISMO Y LA RVS EN DIFERENTES GRUPOS ÉTNICOS.

rs12979860 C/C

CLEARENCE VIRAL ESPONTÁNEO

DETERMINACION DEL GENOTIPO DE IL28B

MUESTRA : SANGRE ENTERA MÉTODO: EXTRACCIÓN DNA

PCR CON PRIMERS ESPECÍFICOS

SECUENCIACIÓN DIRECTA

MÉTODO COMERCIAL :

LIGHTMIX® KIT IL28B RS12979860 (TIB- MOL BIOL) COMERCIALIZADO POR ROCHE DIAGNOSTIC

FRAGMENTO DE 139 pb - ANÁLISIS POR CURVAS DE MELTING

ALELO T 51-53°C Y LA VARIANTE C 60°C

HCV RNA CUANTITATIVOCARGA VIRAL

FILIPPO ANSALDI et al.World J Gastroenterol 2014 August 7; 20(29): 9633-9652

LQ: LIMITE DE CUANTIFICACIÓN ES EL MAS BAJO NIVEL DE HCV RNA DETECTABLE Y CUANTIFICABLE

LD: LIMITE DE DETECCIÓN ES EL MAS BAJO NIVEL DE HCV RNA DETECTABLE

LQ < LD

LQ : 25 UI/mL < LD : 15 UI/mL

RESULTADO: 20 UI/mL DETECTABLE NO CUANTIFICABLE

TRATAMIENTOS ACTUALES DE HCV

1. Definir Genotipo: distinguir entre subtipos– Si Genotipo = 2 o 3, PEG-IFN-RBV– Si Genotipo = 1, hacer IL-28B

2. Polimorfismo IL-28B:– Si es favorable, arrancar con PEG-IFN-RBV, ver respuesta a S4 y luego decidir.– Si es desfavorable, Triple Terapia

Terapia guiada por la respuesta: enfermos que obtienen respuesta virológica adecuada tempranamente puede acortar su tratamiento sin comprometer la respuesta virológica sostenida (RVS)Reglas de utilidad: la no disminución de la carga viral en los tiempos de control intratratamiento, obligan a la suspensión de la terapia ya que no existen RVS en esos casos.

TRATAMIENTO - BOCEPREVIR

PEG IFN + RBV PEG IFN + RBV (Si S4 Ó S12 ETECTABLE)

S4 S12 S24

TVP

S48

PEG IFN + RBV

TVP

S4 S12 S48

DURACIÓN DEL TRATAMIENTO EN PACIENTES NAIVE

DURACIÓN DEL TRATAMIENTO EN PACIENTES TRATADOS, RESPUESTAPARCIAL , NULL RESPONSE

IP 2° GENERACION: SIMEPREVIRHCV G1

SOFOSBUVIR: PANGENOTIPO

SOFOSBUVIR: PANGENOTIPO vs DURACIÓN

EASL 2013Ivan Gardini

MY PERSONAL VIETNAM

MY PERSONAL VIETNAM

20 YEARS OF CHRONIC HEPATITS

5 TREATMENTS FAIELD

3 CIRRHOSIS

2 LIVER TRANSPLANT

A virus that has stolen 20 years of my life

Kidnapping mind, body and spirit

NO RE-TRANSPLANT= 24-36 MONTHS LEAVING

Post OLT diagnosis beginning 2011CHOLESTATIC AND AGGRESSIV HCV RECURRENCY

First transplant, cirrhosis due HCV: December 1997, 34 year old

Second transplant, due to HCV recurrency: July 2009, 46 years old

CLINICAL PROFILE beginning 2011

PARTIAL RESPONDER

IL28 CT

WIDESPREAD CIRRHOSIS

93.000 PLATELET (Limits for compassionate use: 90.000)

DIABETIC

IMMUNOSOPPRESSIVE TREATMENT

MAINTENANCE THERAPY INF PEG + RIBA

February 2011

INF PEG alfa + RBVC

opie

/mL

boceprevir

INF PEG alfa + RBV

Lead in: 18 weeks

February 11 May 11

Copie

/mL

boceprevir

Week 2 4 log decrease

INF PEG alfa + RBV + BOCEPREVIR

February 11 May 11

boceprevir

Copie

/mL

boceprevirboceprevir

INF PEG alfa + RBV + BOCEPREVIR

May 11

Week 45 log decrease

Copie

/mL

February 11

boceprevir

Week 6HCV RNA negative

INF PEG alfa + RBV + BOCEPREVIR

boceprevir

February 11 May 11

Copie

/mL

INF PEG alfa + RBV + BOCEPREVIR – 48 WEEKS

May 11 May 12

HCV RNA

negative

LAST HCV RNA (FEBRUARY 2013)

SVR 36 !

WAS IT EASY? Side effects

Anemia = Erithropoietina used

Neutropenia =growing factor used

Asthenia

Disguesya

Diarrhea

Pruritis

2 SYNCOPES

NO

WHICH SENSATION?

AFTER

186 interferon INJECTIONS

6.714 Ribavirin and other PILLS

AND MANY OTHER MEDICATIONS

PURCHASED THE

RETURN TICKET

FROM HELL

DAAs EARLY ACCESSwith compassionate use

may

SAVE LIFES

And patients areBack to life

Back to life: In a DISCO with my daughters