Nota2

Diagnstico Bioqumico

Hemoglobina Glicosilada por HPLC

Dr. Gabriel Agratti Jefe Divisin Qumica Clnica y Endocrinologa Laboratorio de Anlisis Clnicos Dr. Stamboulian gagratti@cei.com.ar

La diabetes mellitus constituye un grupo de trastornos caracterizado por niveles elevados de glucosa en sangre debido a una deficiente secrecin de insulina y/o a un funcionamiento anormal de la hormona, siendo la enfermedad ms comn del grupo de patologas relacionadas con el metabolismo de los hidratos de carbono.

La hemoglobina glicosilada es una heteroprotena de la sangre que resulta de la unin de la hemoglobina con carbohidratos libres unidos a cadenas carbonadas con funciones cidas en el carbono 3 y 4.

La prueba de la hemoglobina glicosilada brinda informacin acerca de la media de los niveles de glucosa plasmticos durante los dos o tres meses anteriores a su realizacin.

La mejora en el control de la glucemia se ha asociado con la prevencin o retraso en la progresin de complicaciones microvasculares en la diabetes: el DCCT (Diabetes Control and Complications Trial Research Group ) ha demostrado que el mantenimiento de valores bajos de glucosa en pacientes con diabetes tipo I, disminuye o previene el desarrollo de retinopatas, neuropatas y nefropatas segn el siguiente detalle:

Resultados reportados del DCCT (1993)

-Retinopata del 34% al 76%

-Microalbuminuria en 35%

-Albuminuria Clnica en 56%

-Neuropata Clnica en 60%

La hemoglobina glicosilada (HBA1C) se forma de modo no enzimtico mediante una reaccin de dos pasos: la primera, es rpida y produce una aldimina lbil o base de Schiff; a continuacin, la aldimina experimenta lentamente una reorganizacin de Amadori y se convierte en una cetoamina mas estable, dando lugar a la hemoglobina glicosilada. La mayora de pruebas de HBA1C miden la cetoamina estable y no el producto ms labil, que es ms propenso a estar influenciado por la dieta ingerida recientemente.(Fig. 1).

de glucosa en sangre es la siguiente:

Hemoglobina A1C (%) Glucosa en sangre (mg/dL)

6 120 7 150 8 180 9 210 10 240 11 270 12 300 13 330 14 360

La vida media de los glbulos rojos es de unos 120 das aproximadamente, por tanto, los ensayos de HBA1C se correlacionan con el control de la glucemia durante los dos o tres meses anteriores. Por el contrario, el tiempo de renovacin de las protenas sricas, principalmente de la albmina, es bastante ms corto (15-20 das), as su glicosilacin refleja un control de la glucemia durante un menor perodo de tiempo.

Generalmente, los sujetos no diabticos tienen niveles de HBA1C comprendidos entre el 4-6%. Segn datos del DCCT, la correlacin entre las HBA1C y los niveles promedio

El Estudio DCCT estableci las metas especficas para el tratamiento de la diabetes utilizando la Hemoglobina Glicosilada como ndice de la media de glucosa sangunea.

En el mismo sentido, la Asociacin Americana de Diabetes (ADA) considera como meta principal mantener los niveles de HBA1C en rangos inferiores a 7%, mientras que concentraciones superiores a 8% implican reevaluar el rgimen teraputico (Clinical Chemistry 48, No3, 2002; 452453).

Con anterioridad, un estudio prospectivo de Diabetes en el Reino Unido (UKPDS) demostr que en un grupo de pacientes tratados exhaustivamente (reduccin de HBA1C de un 7,9% a 7%), las complicaciones microvasculares diminuyeron un 25% (UKPDS Group. Lancet 1998; 352:83753).

Se dispone de numerosos mtodos para la determinacin de HBA1C:

-Inmunoturbidimetria (inmunolgica)

-Cromatografa de Intercambio catinico

-Concentracin isoelctrica

-Electroforesis

-Colorimetra (cido tiobarbitrico)

-HPLC (Cromatografa lquida de alta peroformance), tcnica de referencia para NGSP (Nacional Glycohemoglobin Standadization Program)

Estos ensayos varan en fiabilidad, interferencia mediante compuestos carbamilados y acetilados, y en exactitud por presencia de uremia, salicilatos, hemoglobinopatas, uso crnico de alcohol, deficiencia en hierro, hiperbilirrubinemia, intoxicacin por plomo y esplenectoma. Pueden verse afectados tambin por un almacenamiento prolongado de la muestra. Cualquier situacin que suponga una disminucin en la supervivencia de los glbulos rojos, como una hemlisis o una prdida aguda de sangre, disminuye los niveles de HBA1C.

El NGSP se inici en 1996, con el objetivo de estandarizar las pruebas de HBA1C frente a la Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), mtodo utilizado en DCCT. Para obtener un certificado de trazabilidad con el mtodo de

12 Bioanlisis

referencia del DCCT se realiza una evaluacin de la precisin solucin tampn conduce la muestra por el cartucho analtico, y una comparacin de muestras con estimacin del error donde la divide en sus componentes individuales. A sistemtico. El Collage of American Pathologists (CAP) tiene continuacin, los componentes separados pasan por el tambin un programa de ensayo de aptitud que utiliza sangre detector de longitud de onda doble, donde se mide la total y muestras liofilizadas. absorbancia de los componentes de la muestra a 415 nm. El ruido de fondo se reduce con la utilizacin de una longitud de Las recomendaciones preanalticas publicadas por onda secundaria a 690 nm. Los datos de absorbancia se CAP para el ensayo de HBA1C son: transmiten del detector al software que los muestra en forma de cromatograma en tiempo real (grfico de tiempo vs.

-muestras obtenidas por puncin venosa o capilar, absorbancia).

-utilizar EDTAcomo anticoagulante de eleccin - almacenar no ms de una semana a 4C o 1 ao a

Los datos procesados se incorporan en un informe 70C impreso que contiene los siguientes elementos: -procesar muestras de sangre entera.

I. resumen completo de los componentes detectados Existen recomendaciones respecto a la etapa en la muestra (identificacin del pico, tiempo de retencin, analtica que incluyen utilizar ensayos cuyo Coeficiente de porcentaje relativo, rea ) Variacin Interensayo (CVi) sea inferior a 5% (idealmente II. cromatograma de la muestra 3%); debern incluirse al menos dos niveles control con

III. fecha y hora del anlisis diferentes concentraciones en rangos bajos y altos. Todos los IV. nmero de vial e identificacin de la muestra resultados obtenidos que estn por debajo del lmite inferior

del intervalo de referencia, as como los que superen una concentracin de 15% de HBA1C, debern ser reensayados.

El mtodo utilizado en nuestro laboratorio para medir las concentraciones de HBA1C en muestras de sangre total, utiliza los principios de la cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC) para la separacin y determinacin del porcentaje relativo de hemoglobinas normales y anormales.

El sistema VARIANT II (BIO-RAD) consta de dos mdulos, la estacin cromatogrfica (VCS) y la estacin de muestreo (VSS); est provisto, adems, de un ordenador personal en el que se instala el software para la administracin de datos clnicos.

Los picos resueltos por esta metodologa por orden

Dos bombas de pistn doble situadas en la VCS, decreciente en tiempo de retencin son: HbAo, HBA1c, HbF, suministran una solucin tampn al cartucho analtico y al HbA1b, HbA1a. detector. Los tubos de muestra primarios se mezclan en la

Los criterios utilizados para la aceptacin de una

estacin de muestreo, luego se extrae una muestra que se corrida analtica son:

diluye y se introduce en la va de flujo analtico mediante inyeccin automtica. Entre las distintas inyecciones de a) Conteo de Area Total entre 1.000.000 y 4.000.000

muestra, la aguja de muestras se enjuaga con una solucin de b) Presencia de HBA1C y HB Ao (Ao) lavado para reducir el arrastre de la muestra por contacto. La c) Adecuada construccin de la Lnea-Base

d) Sin picos desconocidos antes de Ao e) El pico de LA1C (calibrador de menor concentracin) menor al 4.8% f) Tiempo de retencin de A1C (Aprox. 0.91), tiempo de retencin de Ao (Aprox. 1.83) g) A1C dentro de la linealidad establecida h) HB F (hemoglobina fetal) si est presente, menor al 30%

El sistema utiliza una calibracin de 2 puntos.

Cuenta con la ventaja de que no interfiere ningn otro tipo de hemoglobina (F,S,C,D,E) ni los procesos de carbamilacin.

El Laboratorio Stamboulian participa anualmente del Nacional Glycohemoglobin Standarization Program (NGSP), el cual consiste en una evaluacin de la precisin y el Bias del laboratorio, segn los requisitos de dicho organismo.

Nuestro laboratorio ha sido certificado en diciembre del 2007, de acuerdo al criterio de aceptacin establecido para Laboratorios Nivel II, el cual establece que la diferencia entre los mtodos de referencia y el mtodo en estudio, no debe ser mayor a +/- 1,0% de HBA1C; as mismo, el porcentaje de imprecisin no debe superar el 4%.

La incorporacin de esta tecnologa apunta no solo a trabajar bajo estrictos estndares de calidad internacional, sino tambin a dotar al cuerpo mdico de una herramienta confiable para el seguimiento y teraputica del paciente diabtico.