Guias_bq_veg_1-2015

Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE FACULTAD DE QUIMICA Y BIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

BIOQUIMICA VEGETAL LICENCIATURA EN BIOQUIMICA

Guia de trabajos prcticos 1-2015

Profesores: Dr. Rodrigo A. Contreras. [email protected]

Dra. (c) Marisol Pizarro.

[email protected]

Laboratorio de Fisiologa y Biotecnologa Vegetal

Ayudante: Sr. Gustavo Ziga L. [email protected]


Prctico n1. Clula vegetal. Parte 1. Clula e histologa. Microscopa moderna. Desde 1660 hasta la actualidad el microscopio ptico ha sido el pilar fundamental en el conocimiento de lo invisible. Aunque su poder de resolucin aument a travs del tiempo (con la mejora en la calidad de las lentes) al igual que el poder de magnificacin, su factor limitante fue la longitud de onda de la luz. En 1930 el mundo submicroscpico se ampli con la aparicin del microscopio electrnico cuya ventaja principal con respecto al microscopio ptico es un aumento de 1000 veces en la magnificacin del material observado acompaado de una mayor capacidad de resolucin generando una mejor definicin y una ampliacin del mundo microscpico. DNA, virus y pequeos organelos fueron observadas por primera vez con este microscopio. La mayora de los pioneros en la microscopa electrnica en biologa siguen vivos y los ms importantes son: Albert Claude, Don Fawcett, Earnest Fullam, Charles Leblond, John Luft, George Palade, Daniel Pease y Keith Porter. Claude y Palade recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1974 por sus logros en biologa celular utilizando el microscopio electrnico. Existen dos tipos bsicos de microscopios electrnicos los cuales fueron inventados al mismo tiempo pero tienen diferentes usos. El microscopio electrnico de transmisin (MET) proyecta electrones a travs de una fina capa de tejido o material a observar produciendo una imagen en dos dimensiones sobre una pantalla fosforescente. El brillo en un rea particular de la imagen es proporcional al nmero de electrones que son transmitidos a travs del material. El microscopio electrnico de barrido (MEB) produce una imagen que da la impresin de ser en tres dimensiones. Este microscopio utiliza dos o tres puntos de la muestra donde llegan los electrones que escanean la superficie del espcimen a observar y salen del espcimen como electrones secundarios siendo detectados por un sensor. La imagen se produce como el espcimen entero, a diferencia del MET donde la imagen corresponde slo a los electrones transmitidos. La clula vegetal. Este tipo celular se diferencia de la clula animal por la presencia de pared celular, grandes vacuolas, plastidios y ausencia de centrolos. Cada una de estas estructuras cumplen una funcin biolgica especfica, por ejemplo, la pared celular le confiere a la clula rigidez y funciona como una barrera entre el citoplasma y el medio circundante. Estas estructuras pueden ser observadas mediante el microscopio ptico. Este instrumento que est constituido bsicamente por 2 lentes convergentes, el objetivo que se coloca cerca del objeto y el ocular por el cual se observa; la combinacin de ambos permite obtener una imagen virtual del objeto, de mayor tamao e invertido.


Una herramienta muy til es el uso de sustancias coloreadas, tales como hematoxilina, eosina, azul de toluidina, las que permiten una tincin diferenciada de estructuras celulares.

Mediante la observacin al microscopio ptico es posible observar clulas vegetales especializadas, como las clulas guardianas y los tricomas. Las clulas guardianas rodean el poro estomtico, se originan de una clula epidrmica troncal las que por mecanismos an desconocidos se diferencian y cumplen una funcin determinada. Los estomas son los encargados del intercambio gaseoso entre el espacio areo interno y la atmsfera que rodea a la hoja (principalmente dixido de carbono, oxigeno y vapor de agua). Las clulas guardianas funcionan como vlvulas operadas hidrulicamente y controlan el tamao del poro. A los tricomas, por otro lado, se les ha asignado una funcin protectora contra patgenos e insectos y un papel en el control de prdida de agua.

Actividades prcticas. Obejtivo. Identificar estructuras de la clula vegetal mediante el uso de microscopa ptica y tinciones histolgicas.

1. Observacin de catafilo de Allium cepa. Separe un catafilo de un bulbo de cebolla y mantngalo en una placa con agua destilada, corte en dos el catafilo. El primer catafilo transfiralo directamente a un portaobjetos, observe la organizacin celular a 10x y 40x; dibuje lo observado a escala, reconociendo el mayor nmero de estructuras posibles. El segundo trozo somtalo a tincin con


hematoxilina/eosina, para ello cubra el catafilo con hematoxilina durante 10 minutos, lave repetidamente con agua hasta eliminar el exceso de tincin, luego trate 30 segundos con HCl 0.2% y lave con agua abundante, finalmente cubra con eosina durante 5 minutos y elimine el exceso de tincin, observe al microscopio a 10x y 40x, reconozca estructuras y dibuje a escala.

2. Observacin de cloroplastos en Elodea. Exponga una hoja de Elodea sumergida en

agua a luz durante 15 minutos, con un control en oscuridad durante el mismo tiempo. Transfiera ambas muestras a portaobjetos, observe y compare (realice rpido el procedimiento ya que la luz del microscopio podra influir en sus resultados. Identifique cloroplastos (forma, color y movimiento). Realice un diagrama a escala.

3. Observacin de muestras preparadas. En este caso el profesor le proveera de

muestras de tallo y raiz, las que deber dibujar a escala, reconociendo las estructuras.

Cada dibujo debe estar debidamente rotulado. Parte 2. Relaciones hdricas El potencial hdrico () mide la tendencia del agua para moverse a travs de un sistema, tal como el suelo, atmsfera y clulas. Mide la tendencia del agua para moverse desde un sistema hacia el exterior, o viceversa. Si existe un equilibrio osmtico, la variacin el potencia hdrico es cero (d = 0), y por ende, no hay presin de turgencia en el tejido (p = 0), por lo que el potencial osmtico del lquido intracelular puede ser igual a la presin osmtica de la solucin en que est contenida. Pese a que la definicin termodinmica puede ser bastante obvia, es difcil determinar el potencial pues los mtodos se basan en poner tejidos en diferentes soluciones para obtener la que est en equilibrio, tal como se realiza en el mtodo de Chardakov. Objetivo: Evaluar las propiedades hdricas de las plantas, comprender los conceptos de osmosis, plasmlisis y presin de turgencia. Evaluar teora tensin-adhesin-cohesin. 1.- Mtodo de Chardakov en tubrculos de papa.

1. Medicin del potencial osmtico mediante el mtodo de Chardakov.


El potencial hdrico = potencial de solutos + potencial de presin. En una solucin que est a presin atmosfrica, como es el caso de una disolucin contenida en un tubo de ensayo destapado, el potencial de presin = 0 y por tanto, potencial hdrico = potencial de solutos.

s = -CiRT donde: C = Concentracin molal (n de moles /Kg de agua) i = Constante, que para solutos no ionizables es igual a 1 R = Constante de los gases. Su valor es 0,00831 (Kg * MPa) / (mol * K) T = Temperatura en grados Kelvin. Se le entregarn dos series de 5 tubos de ensayo con diferentes concentraciones de sacarosa, de modo que tengan distinto potencial hdrico (-0.1; -0.3; -0.5; -0.7 y -0.8 MPa). A cada uno de los tubos gruesos se les aaden 15 ml de solucin de sacarosa sin teir. A cada uno de los 5 tubos de ensayo normales se les adicionan 3 ml de las diferentes soluciones, en este caso teidas con azul de metileno. Adems se le entregarn 5 discos de tubrculo de Solanum tuberosum lavados y secados, los cuales se distribuyen en los tubos que no poseen azul de metileno, transcurridas 1.5 horas retirar los discos de papa de los tubos y aadir 50 L de la solucin de sacarosa que contiene de azul de metileno en el medio del tubo y observar el movimiento. Aquella solucin en donde la gota no suba, ni baje tendr un potencial osmtico e hdrico equivalente al potencial del tejido. Indique el potencial del tubrculo de papa. 2.- Efecto de soluciones con potencial hdrico diferente en catafilos de cebolla. Se le entregar un set de soluciones con las siguientes concentraciones de sacarosa y NaCl, de forma independiente:


Solucin de Sacarosa Solucin de NaCl 0 (agua) 0 (agua) 0.2 M 0.1 M 0.4 M 0.5 M 0.6 M 1.0 M 0.8 M 2.5 M 1.0 M 5.0 M

Ponga trozos de catafilo de cebolla en las diferentes soluciones durante 15 minutos con azul de metileno, enjuague el exceso de tincin (tenga cuidado de hacerlo con una solucin de la misma concentracin de sacarosa o NaCl en donde estaba contenido el catafilo). Mire al microscopio y dibuje sus observaciones. Indique el fenmeno observado. 3.- Teora tensin-adhesin-cohesin. Ponga un trozo de apio cortado bajo agua en una solucin al 5% de rojo neutro en diferentes soluciones de sacarosa (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 M). Cada 2 minutos, durante 20 minutos realice una medicin de cuanto ha subido el colorante por los haces vasculares. Grafique el movimiento por capilaridad en funcin del tiempo. Calcule la ecuacin que describe la curva y explquela.


Prctico n2. Fotosntesis: eficiencia fotosinttica, contenido de clorofila y de hidratos de carbono en plantas de trigo etioladas, no etioladas y tratadas con paraquat. La fotosntesis es un proceso por el cul los organismos auttrofos, que poseen clorofila, son capaces de transformar la energa lumnica en energa qumica. Algunos ejemplos de ste tipo de organismos son las algas, las cianobacterias y las plantas. Se ha descrito que la mayor parte de la energia que se consume durante la vida procede en de la energa lumnica que fue transformada ene energa qumica por el proceso de fotosntesis. La fotosntesis es un proceso bioqumico que se puede dividir en dos etapas principales: las reacciones dependientes de la luz (fase fotoqumica) y las independientes de la luz (fase bioqumica). En la primera etapa la velocidad depende netamente de la intensidad lumnica y la segunda depende de la temperatura, siendo los ptimos en el perodo de primavera. Fase fotoqumica. En esta fase la luz proveniente del sol es captada por las molculas de clorofila, esto provoca la fotlisis del agua; en el proceso se genera una molcula de oxgeno que es liberada al ambiente; esto provoca el inicio del transporte electrnico en la membrana tilacoidal, llevando a la sntesis de NADPH y ATP.

Fase bioqumica. En esta etapa el poder reductor generado en la fase fotoqumica, es utilizada para fijar el carbono de la forma inorgnica (CO2) a forma orgnica (glucosa).


Metodologa. Se le entregar tres sets de trigo etiolado, no etiloado y tratado con paraquat (0.5%).

1) En primer lugar medir la eficiencia fotosinttica (relacin Fv/Fm) con el aparato de medicin de eficiencia fotosinttica (PEA, Hansatech). Coloque los clamps cerrados sobre hojas al azar, mantnga por 15 minutos y luego con la supervisin del profesor y/o ayudante coloque la fuente de iluminacin e irradie. Registre los datos entregados por el equipo.

2) Luego tome muestras de 100 mg y macerelas en mortero fro con acetona 80%, centrifugue y recupere el sobrenadante. Diluyala 25 veces en acetona 80% (en una cubeta) y mida la absorbancia a 665 y 649 nm.

Clorofila a (g/ml)= 13.96 x A (665)- 6.88 x A (649) Clorofila b (g/ml)= 24.96 x A (649)- 7.32 x A (665) Grafique la relacin Chl-a/Chl-b

3) Tome muestras de 1 g y extrigalas en 1 mL de etanol 80% mediante maceracin en mortero fro. Luego centrifugue y mida del sobrenadante lo siguiente: Contenido de azcares totales: utilice el reactivo de antrona sulfurica, para ello mezcle 3 mL de reactivo de antrona sulfrica (150 mg de antrona en 100 mL de


cido sulfrico 70% v/v) y 100 L de extracto etanlico, deje reaccionar por 15 minutos y mida la absorbancia a 620 nm.

4) Tome muestras de 1 g y extraigalas en 1 mL de agua desionizada mediante maceracin en mortero fro. Luego centrifugue y mida del sobrenadante lo siguiente: Contenido de almidn: tome 50 L de extracto acuoso y mezcle con 950 L de solucin de lugol (0.1X) , deje reaccionar 1 min y mida la abosrbancia a 583 nm.


Prctico n3. Hormonas vegetales. Las hormonas vegetales son aquellas molculas sintetizadas por las plantas en compartimentos especficos y son traslocadas a diferentes zonas de la planta en muy baja concentracin a travs de los haces vasculares, en sus dianas actan regulando el crecimiento, desarrollo metabolismo. Se distinguen 6 clases de hormonas vegetales principales:

1. Auxinas: estimulan el crecimiento vegetal, especialmente del tallo e inhiben el desarrollo de ramas laterales. El representante ms comn es cido indol-3-actico (IAA), un derivado del triptfano (W).

2. Citoquininas: estimulan o promueven la divisin y diferenciacin celular. Sus

estructuras moleculares son un ncleo de adenina sustituido, sus representantes ms conocidos son la cinetina (K) y la zeatina.

3. Giberelinas: estimulan el crecimiento de las plantas, actuando sinrgicamente con las auxinas, adems participan activamente en el proceso germinativo, en la salida del estado de dormancia. Son sesquiterpenos y su representante ms conocido es el cido giberlico (GA3).

4. Etileno: estimula el crecimiento lateral de clulas, induce la maduracin organolptica de frutos, la senescencia de flores e inhibe la salida de dormancia.

5. cido abscico: tiene una funcin antagnica con otras hormonas, inhibe el crecimiento de las plntulas y la germinacin de semillas y estimula la senescencia foliar. Son sesquiterpenos, y se conoce tambin como ABA.

6. Brasinosteroides: este tipo hormonal aparentemente actuara promoviendo la expansin y elongacin celular de forma sinrgica con auxinas, no se ha determinado el rol en las situaciones de estrs. Su estructura es un terpeno del tipo esteroidal.


Actividades prcticas. Objetivo. Evaluar el efecto de hormonas en el crecimiento, germinacin y maduracin. Sesin 1.

1. Participacin de giberelinas en la salida de la dormancia.

a. Desinfecte y active las semillas de acuerdo al siguiente protocolo: - Tome 10 semillas de cebada (Hordeum vulgare) y crtelas transversalmente. La

mitad que contiene el embrin deschela y la otra mitad que contiene el endosperma esterilcela incubando por 10 min en 1% de NaClO. Lave con agua (x 5).

- Tome otro grupo de 10 semillas y esterilcelas de igual forma. - Luego ambos grupos de semillas se embeben en H2O por 1 hora. Compare la

actividad -amilasa de ambos lotes de semillas, siguiendo el protocolo que se indica a continuacin:

- Se utilizarn placas petri que contienen agar al 1% y almidn al 1%. Las semillas con y sin embrin se colocan en las placas en forma vertical y se dejan por 48 hrs. Al trmino de la incubacin, las placas se revelan con lugol y se mide el halo de actividad en torno a los grupos de semillas. Se correlaciona el dimetro del halo con la presencia o ausencia de embrin.

Qu otros mtodos podran entregar informacin cuantitativa de la actividad -amilasa? Cmo podra actuar el GA3 estimulando la actividad -amilasa? Proponga un modelo y disctalo. Qu otro mecanismo de regulacin de la actividad -amilasa conoce?

2. Participacin de ABA en la germinacin. Desinfecte un grupo de semillas de trigo de acuerdo al protocolo anterior. Luego un grupo actvelo con 200 mL de agua destilada durante 1 hora y otro grupo actvelo en 200 mL de agua destilada y agregue 200 L de solucin de ABA 5 mg/mL. Tome registro cada 48 horas del porcentaje de germinacin durante una semana.


3. Efecto de auxinas y citoquininas en el crecimiento de coloptilos de trigo. El ayudante le entregar una serie de coloptilos, usted separar 15 y los colocar en tres grupos de 5 cada uno en placas separadas y cortar tips de 1 cm, la placa 1 ser control, la placa 2 ser efecto de auxinas y la placa 3 efecto de citoquininas, cada placa tendr 10 mL de agua destilada, a la placa 2 le agregar 100 L de solucin 0.1 mg /mL de IAA, a la placa 3 le agregar 100 L de solucin 0.1 mg/ mL de cinetina, roce y riegue durante una semana cada 48 horas. 4. Efecto del etileno en la germinacin y en la abscisin. Para el efecto en la germinacin usted utilizar semillas de cebada, las cuales deber desinfectar y activar con los protocolos anteriores, luego siembre sobre papel en 4 vasos de precipitado de 250 mL 10 semillas de cebada, 2 sern su control y los otros 2 tratamiento, en donde colocar un trozo de un fruto climatrico. Coloque sobre los vasos papel aluminio y observe el porcentaje de germinacin durante 1 semana. Para el efecto en la abscisin, el ayudante le entregar una serie de plntulas de Pea sativa, realice el mismo procedimiento anterior en vasos de precipitado, colocando 5 plntulas en cada vaso, 2 vasos control y dos vasos de tratamiento, en donde se colocar una mitad de frutilla.

*En el caso del grupo 1 se extendern las mediciones a dos semanas.


Prctico n4. Estrs abitico.

Las plantas se ven expuestas en forma natural a diversas condiciones ambientales que

afectan su desarrollo normal. Entre estos factores se encuentra la falta de agua ya sea

condiciones de sequa o suelos con baja disponibilidad de agua. La sequa es un fenmeno

natural que puede producirse en el ciclo de vida de cualquier cultivo. Parsons (1982)

seal que entre las variables ambientales que afectan el crecimiento y desarrollo de las

plantas, el estrs hdrico es uno de los ms importantes y que todas las plantas superiores

estn expuestas a la desecacin al menos una vez durante su ciclo de vida a medida que la

semilla madura y se seca. Comnmente, las plantas estn expuestas a periodos de sequa

leves o severos durante las fases de crecimiento vegetativo y reproductivo. Por lo tanto,

es necesario contar con mtodos efectivos para evaluar la resistencia y/o tolerancia al

estrs hdrico. El cultivo de plantas tolerantes a la sequa, es una alternativa de gran valor

para la explotacin de reas propensas a la sequa.

En plantas, el estrs produce un estallido oxidativo que puede presentarse como un pico

monofsico o bifsico y se debe principalmente a la activacin de enzimas como la

NADPH oxidasa de la membrana plasmtica. La NADPH oxidasa, as como la disipasin de

electrones desde los fotosistemas, sintetiza aniones superxido los cuales son dismutados

a perxido de hidrgeno por una superxido dismutasa (SOD). El perxido de hidrgeno

puede ser producido exgenamente y entra en la clula por difusin y/o a travs de

canales inicos de agua o acuaporinas y se acumula en el citoplasma, tambin puede ser

sintetizado internamente por los procesos de fotosntesis, respiracin y fotorrespiracin.

La acumulacin transiente de perxido de hidrgeno, y probablemente tambin aquella

de iones superxido, activa el sistema de transduccin de seales que conduce finalmente

a la activacin de genes de defensa. Entre los genes de defensa se encuentran los que

codifican para enzimas antioxidantes tales como la superxido dismutasa (SOD), catalasa

(CAT), glutatin peroxidasa (GP), ascorbato peroxidasa (AP), dehidroascorbato reductasa

(DHAR) y glutatin reductasa (GR), para enzimas que sintetizan compuestos antioxidantes


como ascorbato y glutatin (GSH), para enzimas de detoxificacin como la glutatin-S-

transferasas (GST) y citocromos P450.

Trabajo prctico. Se le entregar un set de plantas de tabaco, una control y sometida a estrs salino (300 mM de NaCl)


Parte 1. Medicin de parmetros antioxidantes. Extraccin de protenas.

1. Tome 100 mg de tejido y muello en mortero con nitrgeno lquido hasta formar un polvo fino.

2. Resuspenda en 1 mL de buffer Tris-HCl (50 mM, pH 8) hasta formar una pasta y

luego un homogenizado.

3. Tome el homogenizado y traspaselo a un tubo eppendorf.

4. Centrifugue a 10000 rpm durante 10 minutos.

5. Tome el sobrenadante en un tubo nuevo.

6. Determine la concentracin de protenas mediante la reaccin de Bradford.

7. Utilice este extracto para medir las siguientes enzimas: Catalasa (CAT): i. Preparar la siguiente mezcla de reaccin:

a. 1 mL de buffer de extraccin b. 20 L de extracto proteico

ii. Realizar blanco iii. Agregar 3 L de perxido de hidrgeno iv. Medir la descomposicin a 240 nm por 60 segundos v. Calcular usando el coeficiente de extincin 39.4 mM-1cm-1

Ascorbato peroxidasa (APX):

i. Preparar la siguiente mezcla de reaccin: a. 1 mL de buffer de extraccin b. 20 L de extracto proteico

ii. Realizar blanco iii. Agregar 5 L de perxido de hidrgeno y 40 L de ascorbato 10 mM iv. Medir la descomposicin a 290 nm por 60 segundos v. Calcular usando el coeficiente de extincin 2.8 mM-1cm-1


Peroxidasas totales (guaiacol peroxidasa, POD)

i. Preparar la siguiente mezcla de reaccin: a. 1 mL de buffer de extraccin b. 5 L de guaiacol c. 10 L de extracto proteico

ii. Realizar un blanco iii. Agregar 5 L de perxido de hidrgeno iv. Medir la aparicin de tetrahidroguaiacol a 470 nm durante 1 minuto v. Realizar los clculos usando el coeficiente de extincin 26.6 mM-1cm-1

Extraccin de metabolitos antioxidantes.

1. Tome 100 mg de tejido.

2. Homogenice en mortero utilizando 1 mL de etanol 85%.

3. Traspase a un tubo eppendorf.

4. Centrifugue a 10000 rpm y traspase el sobrenadante a un tubo nuevo.

Medicin de la capacidad de atrapamiento del radical libre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH):

i. Preparar solucin de DPPH de absorbancia 0.75 aproximadamente. ii. Tomar un volumen de 0.98 mL de DPPH iii. Agregar 20 L volumen de extracto iv. Medir una cintica de 4 min a 517 nm v. Calcular el % de DPPH consumido

Medicin de dao en membranas (lipoperoxidacin de membranas) por el mtodo de las sustancias reactivas al cido tiobarbitrico (TBARS):

1. Tome 100 mg de tejido.

2. Homogenice en mortero utilizando 2 mL de TCA (1%).


3. Centrifugar a 12000 rpm durante 5 min.

4. Tomar 250 L de sobrenadante y agregarlos sobre 1mL de TBA (0.5%) en TCA (20%

5. Hervir durante 30 minutos

6. Enfriar a temperatura ambiente

7. Medir la absorbancia a 532 y 600 nm

8. Realizar los clculos con el coeficiente de extincin molar 155 mM-1cm-1 usando A532-A600

Parte 2. Zimografa de la actividad POD

Prepare un gel de poliacrilamida (acrilamida:bis-acrilamida) al 10% segn el siguiente protocolo, para 6 mL de solucin utilice:

3.8 mL de agua miliQ

3.4 mL de solucin acrilamida:bis-acrilamida 30%

2.6 mL de buffer tris-HCl 1.5 M (pH= 8.8)

0.1 mL de SDS 10%

0.1 mL de persulfato de amonio 10%

Homogenice por inversin y agregue 20 L de TEMED

Rpidamente deposite en los vidrios para formar el gel, utilice una peineta de 12 pocillos

Una vez gelificado, cargue utilizando un tampn de carga SIN SDS y SIN b-MERCAPTOETANOL

Coloque los vidrios en el sistema de electrolisis (cmara electrofortica) y corra 2 horas a 100 V, utilizando tampn tris-glicina 1X (3.0285 g tris, 14.4 g de glicina, pH= 8.3).

Luego saque el gel de los vidrios y colque el gel en 100 mL en tampn tris-HCl (50 mM, pH= 8.0)

Incube 1 minuto con 100 L de H2O2


Agregue 20 L de guaiacol, incube y espere a la aparicin de la(s) banda(s)

Registre fotogrficamente el gel

Parte 3. Extraccin de RNA total y cuantificacin de le expresin del gen de deshidrina.

Procedimiento:

Se le entregar a cada grupo se le entregar un set de 100 mg de tejido.

Limpie muy bien el mesn y encienda el mechero. Todo el material que utilice debe ser RNA free.

Se utilizar el kit Total Plant RNA kit Favorgen.

1. Muela el tejido en nitrgeno lquido hasta formar un polvo fino 2. Agregue 495 L de tampn FARB y 5 L de b-mercaptoetanol, homogenice hasta

formar un lquido viscoso 3. Coloque todo el volumen en una columna de filtracin y centrifugue al mximo de

velocidad durante 1 minuto 4. Lleve el filtrado a un tubo Eppendorf nuevo y ajustar a 500 L con buffer FARB,

agregar 500 L de etanol 70% y vortear para homogenizar (en caso de no haber vrtex, mezclar por pipeteo)

5. Transferir el volumen a una columna FARB y centrifugar al mximo por un minuto, descarte el sobrenadante. Repita el paso.

6. Agregar 500 L de buffer de lavado 1 a la columna y centrifugue al mximo por 1 min, descarte el filtrado.

7. Agregue 750 L de buffer de lavado 2 a la columna y centrifugue al mximo por 1 min, descarte el filtrado. Repita el paso.

8. Centrifugue al mximo por 3 min, descarte el filtrado. 9. Ponga la columna en un tubo nuevo 10. Agregue 50 L de agua lire de RNasa en la columna y deje por un minuto 11. Centrifugue al mximo durante 2 minutos 12. Ponga inmediatamente en hielo 13. Cuantifique utilizando nanoquant de acuerdo a las instrucciones del profesor y

ayudante

qRT-PCR.

Se utilizar el kit SensiMix one-step

Realice la siguiente mezcla de reaccin:


12.5 L de SensiMix

2 L de mezcla de primers

5 L de agua DEPC

5 L de solucin de RNA

0.5 L de solucin de inhibidor de RNasa

Centrifuge 1 min a mxima velocidad y programe el equipo:

RT tradicional (30 min a 72 C) y 50 ciclos de PCR, utilizando 58 C de annealing

Los sets de primers sern:

rna18S

dhn

CTTAGCAGAACGACCAGCGA TCTTCATCGATGCGAGAGCC

GCCAGAGATTAAGGAGCGGG ATCGGTGGAGTTTGTCGAGG

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