Guias de Fundamentos

Guía Unificada de LaboratoriosFundamentos de Microbiología de alimentos

Código FLA-23 V. 00

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1. Titulo: MUESTREO, DILUCIONES Y RECUENTO MICROBIANO

2. Objetivos

2.1 Familiarizar al estudiante en el tratamiento adecuado de una muestra para análisis microbiológico.

2.2 Conocer las técnicas utilizadas en la preparación de diluciones.2.3 Identificar la manera correcta de reportar y registrar los resultados de los análisis

microbiológicos.

3. Marco Teórico

Muestreo: Es la operación que consiste en separar un determinado numero de muestras de un lote con el fin de obtener resultados analíticos confiables.

Número de Muestras: Para que el muestreo tenga utilidad estadística, se debe realizar sobre un número apreciable de unidades de un lote. El numero de muestras esta en relación con la precisión que se desee obtener de los resultados.

El número de muestras es el igual a la raíz cuadrada del número total de unidades que conforman el lote, o tomando el 1 %, del total cuando este es grande y el 10%, cuando el lote es pequeño. Cuando los productos se controlan con regularidad, es suficiente analizar de 5 a 10 muestras de cada lote.

Parámetros a tener en cuenta en un programa de Muestreo:

- Inspección- Tamaño del lote (N)- Tamaño de la muestra(n)- Muestra- Toma de muestra- Muestra defectuosa- Riesgo del comprador- Riesgo del vendedor- Nivel de calidad Aceptable (NCA): Es el porcentaje máximo de unidades defectuosas

(número máximo de unidades defectuosas por cada 100), que se considera satisfactorio o que se admite en un lote.

Condiciones para el muestreo:

Para obtener una muestra representativa se deben cumplir las siguientes condiciones:

- La persona responsable del muestreo debe conocer perfectamente su finalidad e importancia, debe estar bien entrenada.

- En lo posible la muestra se tomara en sus envases originales.



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- El muestreo sobre lotes o remesas, se puede hacer, usando la técnica del muestreo aleatorio, aplicando la tabla de números al azar.

- Cuando los envases son muy grandes y difíciles de transportar, se toman, asépticamente, muestras representativas y se pasan a envases estériles más pequeños.

Envío de la muestra al laboratorio:

Una vez tomadas las muestras, se empaquetan de forma adecuada según su naturaleza, para evitar las roturas y el deterioro; estos recipientes se maraca correctamente así:

- Nombre y dirección de la persona que ha tomado la muestra- Nombre y dirección de la persona, empresa donde se han tomado las muestras- Fecha, lugar y hora de la toma de muestras- Clase de alimentos que integran las muestras- Nombre del fabricante, importador, vendedor, comprador- Razón del muestreo- Número, tamaño y marca de las unidades que forman el lote- Forma de transporte, punto de origen y lugar de destino- Método de muestreo utilizado- Temperatura del producto en el momento del muestreo- Temperatura ambiental de almacenamiento- Condiciones de envío

Tipos de Muestreo:

Los muestreos se pueden clasificar de acuerdo a los siguientes criterios:

Según la calidad prejuzgada:

- Muestreo Normal: No existe evidencia de desviación de las condiciones- Muestreo reducido: El margen de calidad es superior al normal y la muestra se divide

en dos- Muestreo riguroso: Hay indicios de calidad inferior a lo normal

Según la intencionalidad:

- Muestreo Aleatorio: Se lleva a cabo mediante planes establecidos al azar- Muestreo Intencional: Hay indicios de fraude y por tanto, puede existir una distribución

intencionada del lote.



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Según el número de Muestras:

- Muestreo simple: Se analiza un único grupo de unidades extraídas del lote- Muestreo Doble: Se selecciona una muestra inicial, que se somete a inspección, que

se acepta o se rechaza según la cantidad de unidades defectuosas sea pequeña o grande. Si los resultados no son decisivos se toma otra muestra.

- Muestreo Múltiple: Se escogen varias muestras formadas por un numero pequeño de unidades, hasta decidir su aceptación o rechazo.

Muestreo Aleatorio:

Consiste en elegir las unidades al azar, utilizando tablas matemáticas calculadas para este fin. Estas tablas se manejan de la siguiente manera:

Se procede a enumerar cada unidad del lote (paquetes, contenedores, unidades del producto), si el lote esta integrado por 200 unidades, su numeración se marcara de 1 al 200. Con un lápiz se señala un lugar cualquiera en la tabla de números al azar, coincidiendo con un digito o su proximidad, este dígito sirve de punto de partida para la separación del número de muestras destinadas al análisis. Supongamos que se ha punteado con el lápiz un lugar que corresponde a la fila 15 y la columna 10, este numero es el 1 (uno) y los que le siguen en las columnas 11 y 12, son el 4 y el 6;, en este caso la unidad que se debe separar del lote esta marcada con el numero 146. A continuación se pasa a la fila 16 y a las mismas columnas 10,11,y 12, a las que corresponde el numero 078, una nueva unidad que se separa del lote, pasando a la fila 17, columnas 10,11,y 12 figura el numero 152,que debe ser también separado del lote. Se procede de la misma forma hasta obtener el número de muestras señalado previamente.

Preparación de las muestras y proceso de dilución:

La Porción del alimento destinada al análisis microbiológico debe ser representativo de toda la muestra y constituida normalmente por 200 gramos o mililitros. Para la puesta en marcha, se utilizan 100 g o ml, el resto se almacena como contramuestra.Si el alimento esta integrado por distintos componentes, se toman fracciones representativas de cada uno de ellos.

Pesada de la muestra:

- Tarar el recipiente estéril que se va a usar para triturar la muestra.- Introducir, asépticamente, la porción de un volumen adecuado en dicho recipiente.- Pesar de nuevo para determinar el peso neto del alimento.- Con una probeta graduada estéril, se añadirá la cantidad de diluyente estéril, para

obtener la dilución deseada.



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Casi todos los análisis se realizan a partir de una suspensión liquida de concentración conocida, que se denomina suspensión madre y que tiene una dilución 1:10. Para conseguir este factor de dilución, se pesa una cantidad de muestra y la pesada que resulte, se multiplica por 9 (nueve), este nuevo resultado serán los mililitros de diluyente que se debe añadir a la muestra pesada. A partir de esta dilución se preparan las siguientes (1:100,1:1000, así sucesivamente....) hasta el factor requerido y establecido por el laboratorio que realiza el análisis.

Un buen diluyente, no debe producir modificaciones cualitativas ni cuantitativas en la microbiota de los alimentos que van a ser analizados, sin suprimir ni favorecer su desarrollo. Los diluyentes más utilizados en microbiología alimentarla son: Agua de triptona con sal, solución Ringer Y* y/o Agua de peptona tamponada.

Triturado y homogenizado de la muestra:

Para obtener resultados confiables en un recuento o número mas probable es primordial obtener muestras bien homogenizadas, para ello existen diversos equipos, el más conocido es el Stomacher, creado en 1971 por Stomacher Colweil. Dentro de sus ventajas se encuentran:

- Se suprime la necesidad de limpiar y guardar tos recipientes de la mezcladora.- Durante los tiempos normales de funcionamiento (generalmente dos minutos) no se

produce aumento de calor.- Los homogeneizados se pueden guardar en refrigeración en las bolsas del Stomacher

para ser utilizadas posteriormente.- La intensidad del ruido no es tan desagradable como el de las mezcladoras

mecánicas.

Cuando no se cuenta con el Stomacher puede utilizarse un homogeneizador o licuadora con una velocidad de hasta 8.000 rpm que permita una buena homogeneización del producto.

RECUENTO MICROBIANO:

RECUENTO EN PLACA DE MICROORGANISMOS. Método ICONTEC

El presente método esta basado en los lineamientos de la Norma Técnica Colombiana NTC-4092, que establece directrices generales para realizar análisis microbiológicos de conformidad con las normas internacionales (ISO 7218 DE 1997).

Para la correcta aplicación de esta norma, la preparación de la muestra es fundamental, por lo tanto se requiere que la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutivas y por duplicado, a demás de Inocular correctamente los volúmenes, 0.1 ml, para superficie y bajo ciertas condiciones 1ml, como cuando se sospecha baja carga microbiana y 1ml, para análisis en profundidad.



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Rangos para el Recuento:

Bacterias: Después del periodo especificado de incubación, se cuentan las unidades formadoras de colonias (ufc), presentes en las cajas que contengan entre 15 y 300 ufc; los análisis que aplican para dicho rango son: Aerobios mesófilos, Coliformes, Bacterias termófilas, proteolíticas, lipolíticas, Clostridium sulfito reductores, S. aureus, entre otros excepto para aquellas bacterias cuya norma exige presencia o ausencia o cuando se deban realizar análisis especiales que requieren de una identificación posterior, como la confirmación de S. aureus coagulasa positivo.Hongos: Después del periodo especificado de incubación, se cuentan las ufc presentes en las cajas que contengan entre 15 y 150 ufc, para Mohos y levaduras y levaduras osmófilas.

Recuento y expresión de los resultados:

Se calcula el número de microorganismos presentes en la muestra, a partir del recuento de dos diluciones consecutivas; se requiere, que al menos una de las dos cajas de cada dilución

Esté dentro del rango, aplicando la siguiente formula:

Se redondea el resultado a dos cifras significativas; para esto, si la última cifra es inferior a 5, la unidad anterior no se modifica; si la ultima cifra es 5 o mayor, la unidad anterior no se modifica; si la última cifra es 5 o mayor, la unidad anterior se incrementa en una unidad. De esta forma se prosigue hasta obtener dos cifras significativas. Los resultados se expresan en ufc por gramo o mililitro, del producto, según la naturaleza del mismo (sólido o líquido), expresado como un numero entre 1.0 y 9.9 (dos cifras significativas, un entero y un decimal), multiplicado por lux, donde x es la potencia apropiada de 10.



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Ejemplo: A partir de un análisis de Aerobios mesófilos para un jugo de papaya, se obtuvieron los siguientes resultados:Primera dilución retenida 10-2: 168 y 215Segunda dilución retenida 10-3:14 y 25

168+ 215+25N = ________________

1 (2+(0.1x1))0.01

408N = ___________________

0.021

N = 19428

Al redondear la cifra como se especifico anteriormente, se obtiene como resultado 19000, que egresado en dos cifras significativas es igual a 1,9 X 104 ufc/ml.

Casos Especiales:

CASO 1: Cuando el numero de ufc se encuentra por debajo del rango mínimo en ambas cajas de una o de las dos diluciones consecutivas, se informará de la siguiente manera: Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilución y se calcula la media aritmética de las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilución, multiplicándose por el inverso de la dilución, e informando el resultado así:

Conteo Estimado de ufc /g o ml, expresado con las dos cifras significativas por la potencia adecuada de 10.Ejemplo: A partir de un análisis de Aerobios mesófilos en una muestra de agua, se obtuvo este resultado:

Primera dilución retenida: 10-1: 45 y 10Segunda dilución retenida: 10-2:4 y 3

Se descarta el recuento obtenido en la dilución más alta (10-2) y se calcula la media aritmética de la dilución más baja (10-1), y se multiplica por el inverso de la dilución respectiva:

N = 45+10/2x10N = C.E.3,3x102 ufc/ml.



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CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las dos cajas correspondientes a la primera dilución no presentan crecimiento, se informa el resultado como sigue, reportando el factor de dilución de la más concentrada

< 1 x 10x ufc /g o ml, según corresponda.

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos en una muestra de jugo, se obtuvo este resultado:

Primera dilución retenida 10-2: 0 y 0 ufcSegunda dilución retenida 10-3 0 y 0 ufc

Se informa de la siguiente manera, utilizando el factor de dilución de las cajas más concentradas:

< 1x102 ufc/ml

Nota: Cuando el conteo de colonias excede al máximo rango, se recomienda repetir el análisis empleando diluciones mayores, con el fin de obtener resultados más confiables.

RECUENTO EN PLACA DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS MÉTODO Ministerio de Salud

Para la correcta aplicación de esta norma, la preparación de la muestra es fundamental, por lo tanto se requiere que la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutivas y por duplicado, además de inocular correctamente los volúmenes, 0.1ml, para superficie y bajo ciertas circunstancias 1 ml, como cuando se sospecha baja carga microbiana y 1 ml para análisis en profundidad.

RANGOS PARA EL RECUENTO:

Bacterias: Después del periodo especificado de incubación, se cuentan las unidades for-madoras de colonias presentes en las cajas que contengan entre 30 a 300 ufc; los análisis que aplican a dicho rango son: Aerobios mesófilos, Coliformes, Bacterias termófilas y en general para el análisis de microorganismos donde no se observan reacciones enzimáti-cos ni de crecimiento sobre la superficie del Agar.

Bacterias (patógenos o identificación enzimático posterior al recuento): Para el recuento de estos últimos microorganismos se emplea el rango 20 a 200 ufc, como para el análisis de S. aureus, B. cereus.

Mohos y Levaduras: Para el recuento de mohos y levaduras y levaduras osmófilas se debe utilizar el rango comprendido entre 10 y 100 ufc.

RECUENTO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS:



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Caso General:

Se calcula el promedio de colonias para cada una de las diluciones a examinar, multipli-cando el resultado por el inverso de la dilución respectiva, a partir del recuento de dos di-luciones consecutivas. A continuación se divide el resultado obtenido en la mayor dilución por el obtenido en la menor dilución (dividir la menos concentrada por la mas concentra-da).

Si el cociente de esta división es mayor a 2, se reporta el resultado obtenido en la dilución más concentrada, pero, si el cociente es menor o igual a 2, se reporta la media aritmética de los recuentos de las dos diluciones utilizadas para el cálculo.

El resultado obtenido se redondea a dos cifras significativas. Para esto, si la última cifra es inferior a 5, la cifra anterior no se modifica, pero, si la ultima cifra es mayor o igual a 5, la cifra anterior se incrementa en una unidad y se prosigue así hasta obtener las dos cifras significativas.

Los resultados se expresan en ufc/g o ml, de producto, según la naturaleza del mismo y expresado como un número entre 10 y 99 (dos cifras significativas enteras), multiplicado por 10x donde x es la potencia apropiada de 10.

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos, para un agua embotellada, se ob-tuvieron los siguientes resultados:

Primera dilución retenida 10-2 168 y 215 ufcSegunda dilución retenida 10-3 35 y 45 ufc

N = 168+215/2 x100

N = 19150

N = 35+45/2 x 1000

N = 40000

N = 40000/19150 = 2.087 >2

Como el cociente es mayor a dos, se reporta el resultado de la menor dilución, 10-2:19150 ufc/ml. Al redondear la cifra a dos enteros, como se especifico anteriormente, se obtiene 19000, que expresado con dos cifras significativas es 19 x 103 ufc/ml.

Casos especiales:

CASO 1: Cuando el numero de ufc se encuentra por debajo del rango mínimo en ambas cajas de una o de las dos diluciones consecutivas, se informará de la siguiente manera: Se descarta el recuento obtenido en la mayor di-lución y se calcula la media aritmética de



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las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilución, multiplicándose por el inver-so de la dilución, e informando el resultado así:

Conteo Estimado de ufc/g o ml, expresado con las dos cifras significativas enteras.

CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las dos cajas correspondientes a la primera dilución no presentan crecimiento, se reporta como negativo y se informa el resultado como sigue, utilizando para el reporte el factor de dilución mas concentrado.

Conteo Estimado < 1 x 10x ufc /g o ml, según corresponda

CASO 3: Crecimiento abundante; si las dos cajas correspondientes a la primera dilución presentan crecimiento mayor de 300, 200 o 100, según sea el análisis, se divide la caja en 4,6, u 8 cuadrantes, se cuenta el numero de colonias presentes en un cuadrante y se mul-tiplica por el total de cuadrantes hechos en la caja. Se realiza el mismo procedimiento con la otra caja correspondiente a la misma dilución y posterior a ello se saca la media aritmé-tica de cada dilución, multiplicando por el inverso de la dilución respectiva. Se continúa el recuento como en el caso general, pero se informa el resultado como conteo estimado de ufc/g o ml, (es decir, dividir el resultado de la mayor dilución por el de las menores y ver si el resultado es menor o igual o mayor a 2 y proseguir como los casos generales.

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos en una muestra de jugo se obtuvie-ron los siguientes resultados, para una leche pasteurizada:Primera dilución retenida 10-2: > 300 ufc en las dos cajasSegunda dilución retenida 10-3 > 300 ufc en las dos cajasAl dividir las cajas de 10-2 en 4, se contó en un solo cuadrante 180 y 150 colonias respecti-vamente. Y al dividir las cajas de 10-3 en 4, se contó en un solo cuadrante 100 y 120 colo-nias respectivamente.

10-2 (caja 1) ((180 X 4) X 100)) 10-2 (caja 2) ((150 X 4) X 100))10-3 (caia1) ((100 X 4 ) X1000)) 10-3 (caia2) ((120 X 4) X1000))

10-2 = 720+600 X 100/2 = 66000

10-3 = 400+480 X1000 12 = 440000

440000/66000= 6,66 > 2

Como el cociente es > a 2, se reporta el resultado de la menor dilución 10'10-2:66000ufc/ml. Al redondear la cifra a dos enteros, como se especificó anteriormente, se obtiene 66000, que expresado con dos cifras significativas es igual al Conteo Estimado de 66 X 103 ufc/ml.

NOTA: Cuando el conteo de colonias exceda de 200 en 1/8 de la caja, se reportará como Conteo Estimado > 1600 ufc/g o ml, multiplicado por el inverso de la mayor dilución.



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4. Materiales, Equipos e Insumos

- Agar OGY fundido 40 ml- Agar SPC fundido 40 ml - 1 Frasco de dilución o Fiola con capacidad de 250 ml con 90 ml de agua pepto-

nada 0.1%- 3 tubos taparrosca con 9 ml de agua peptonada cada uno- 3 Pipetas de 1 ml estériles- 1 Pipeta de 10 ml estéril- 2 Asas de Hockey estériles- 1 Vaso de licuadora con cuchillas estériles y su correspondiente motor.- 1 Balanza de precisión 0.1g.- 4 Cajas de petri estériles.

5. Reactivos

- Cristal violeta- Fuschina- Lugol- Alcohol Acetona- α-Naftol

6. Procedimiento

El trabajo de las muestras debe iniciarse lo antes posible después de su recolección, si no se puede, se debe mantener en refrigeración sin exceder las 24 horas. Si la muestra está congelada, descongelarla en el envase original.

En muestras líquidas la dilución 10-1 se prepara midiendo 11 ml o 10 ml de la muestra en un frasco de dilución que contenga 99 ml o 90 ml de diluyente, sosteniendo la pipeta en un ángulo de 45 grados sobre la parte interior del cuello del frasco.

Para muestras sólidas pesar 11 g o 10 g del total del alimento, en un frasco de dilución que contenga 99 ml o 90 ml de diluyente, tratando de coger de la superficie e interior del alimento (no debe olvidar que este procedimiento se debe hacer en condiciones de esteri-lidad). Guardar una contramuestra para eventuales verificaciones, en condiciones de refri-geración, congelación o medio ambiento de acuerdo con las características de almacena-miento del producto.

Agitar el frasco vigorosamente, dejar en reposo de 2 a 5 minutos.

- Transferir un mililitro de la dilución 10-1 a un tubo que contenga 9 ml de diluyente para obtener la dilución 10-2 homogenizar cuidadosamente la dilución, y transferir un mililitro a otro tubo que contenga 9 ml del diluyente para obtener la dilución 10 -3. Repetir estos



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- pasos hasta obtener el número de diluciones deseadas, cada dilución sucesiva dismi-nuirá 10 veces la concentración.

- Siembre en profundidad y por duplicado, Inoculando 1 ml de la(s) diluciones seleccio-nadas encajas De Petri estériles.

- Vierta el Agar SPC fundido y mantenido a 45° C.(15 a 20 ml)- Mezcle inmediatamente las cajas con el medio, moviendo estas a la derecha, izquier-

da, arriba y abajo, mínimo 5 veces.- Deje solidificar, e incube las cajas invertidas a 37° C ± 2° C.- Pasadas 24 horas de incubación, revise las cajas y realice el recuento de colonias visi-

bles, incube nuevamente y revise a las 48 horas, realice el recuento.- Criterio de selección: Cuando se va a realizar el recuento, debe seleccionar las dilucio-

nes para bacterias mesófilas aerobias, en el rango de 30 a 300 colonias.- Para el recuento de mohos y levaduras, inocule 0.1 ml, de la dilución correspondiente

sobre la superficie de una caja de Agar OGY, deje absorber e incube invertidas las ca-jas a 25° C por 3 a 5 días.

- Seleccione las cajas que estén entre 15 y 150 colonias, cuente las colonias que pre-senten las características de hongos y levaduras, informe el resultado de mohos y le-vaduras por g o ml.

- Con los datos obtenidos en los dos casos, proceda a realizar los cálculos por los mé-todos de ICONTEC y Ministerio de Salud.

- Reporte los resultados correctamente.

7. Nivel de Riesgo

2. (bata de laboratorio manga larga, guantes, cofia, zapato cerrado, tacón bajo, pantalón largo)

8. Bibliografía

- Albarracin, F. Y.; Herrera, F. C. Texto de Laboratorio de Microbiología de Alimentos.1995

- Alaert, C. , Escola. M. Métodos de Análisis Microbiológicos de Alimentos .Madrid: Edi-torial Díaz de Santos. 2002.

- Doyle, M. P. Beuchat, L R. Microbiología de Alimentos. Fundamentos y Fronteras. Za-ragoza: Editorial Acribia, 2001.

- Pascual, M.R. Microbiología Alimentaría: Metodología Analítica para Alimentos y Bebi-das. Segunda Edición. Editorial Díaz de Santos. 2000

- Forsythe, S.J., Hayos, P.R. Higiene de los Alimentos, Microbiología y HACCP. Segun-da Edición. Zaragoza: Editorial Acribia 2002.

- Rojas, A. Recopilación Guías de Microbiología de Alimentos. Universidad de Pamplo-na. 2003.

- Carrascal, A.K.; Paez,A.y Burbano, Mariela. Manual de Laboratorio Microbiología de Alimentos.1á ed._ Bogota: CEJA,2003.

9. Anexos



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1. Titulo: RECUENTO DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS

2. Objetivos:

2.1 Conocer las técnicas empleadas para el recuento de bacterias Mesófilas Aerobias en alimentos.

2.2 Interpretar los resultados obtenidos y repórtanos correctamente.2.3 Determinar las implicaciones que para los alimentos tiene un recuento alto de este

tipo de bacterias.

3. Marco teórico:

La mayoría de los alimentos industrializados (excepto, los productos fermentados), deben ser considerados como inadecuados para el consumo, cuando contienen un gran número de microorganismos, aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como pató-genos y no hayan alterado de forma inapreciable las características organolépticas del ali-mento.

Las bacterias mesófilas aerobias son un grupo heterogéneo de bacterias capaces de cre-cer entre 15 y 45 °C, con un rango óptimo de 35 °C, en la industria de alimentos es consi-derado como el grupo indicador más grande que existe. En productos terminados es utili-zado como indicador de vida útil.

Para su recuento se utilizan medios de cultivo que no tengan inhibidores para permitir el crecimiento de los microorganismos. Este recuento no se hace en productos enlatados ni fermentados, ya que por la naturaleza de estos alimentos, el recuento no sería represen-tativo.

Recuentos altos en alimentos estables indican materias primas contaminadas o tratamien-to no satisfactorio, en productos perecederos, pueden indicar condiciones inadecuadas de tiempo y temperatura durante su almacenamiento. La presencia de un número elevado de bacterias aerobias mesófilas que crecen bien a temperatura corporal o próxima a ella, sig-nifica que puede haberse dado condiciones favorables a la multiplicación de microorganis-mos patógenos de origen humano o animal.

En alimentos deshidratados y en los congelados, siempre se obtienen recuentos de bacte-rias viables más bajos. Así un recuento en placa no puede reflejar la calidad microbiológi-ca de la materia prima, antes de los procesos o tratamientos correspondientes, y por ello, es necesario llevar un examen microscópico directo para comprobar si efectivamente, en un principio existían o no abundantes microorganismos.

Los recuentos de bacterias mesófilas son de poco valor a la hora de predecir la vida útil de un alimento conservado en refrigeración, ya que muchos microorganismos mesófilos no crecen a temperaturas por debajo de los 5 °C.



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Los recuentos elevados de bacterias mesófilas en productos crudos o no tratados, a me-nudo están constituidos por microflora normal o pueden indicar alteraciones incipientes del alimento y no un peligro potencial para la salud del consumidor.


- 1 Frasco de dilución o Erlenmeyer capacidad de 250 ml con 90 de agua peptonada 0.1%.- 3 Tubos taparrosca que contengan 9 ml de agua peptonada cada uno- 6 Cajas de petri estériles.- 1 Pipetas de 10 ml estéril- 3 Pipetas de 1 ml estériles.- 120 ml Agar Plate Count fundido- 1 Vaso de licuadora con cuchillas estériles y su correspondiente motor.- Balanza- Incubadora a 35ºC

5. Reactivos

6. Procedimiento

- Prepare las diluciones 10-1,10-2 y 10-3 en agua de peptona al 0.1 % a partir de las muestras de alimentos.

- Siembre en profundidad por duplicado, 1 ml de cada una de las diluciones selecciona-das.

- Adicione 20 ml de Agar Plate Count (debe estar a una temperatura de aproximada-mente 45ºC).

- Mezcle inmediatamente las cajas con el medio, de acuerdo con los movimientos de las agujas del reloj, mínimo 5 veces.

- Deje solidificar y adicione una capa sellante sobre la caja, deje solidificar nuevamente.- Incube a 35 °C durante 48 horas.- Saque de la incubadora y realice el recuento en cada caso.- Cuando se va a realizar el recuento seleccione las diluciones para bacterias mesófi-

las aerobias, que contengan entre 30 a 300 colonias.

7. Nivel de Riesgo

- 2 bata manga larga, guantes, cofia, zapato cerrado de tacón bajo, pantalón largo.- Material biológico para descartar se empaca en bolsa, se marca y entrega al auxi-

liar.



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8. Bibliografía



- Doyle, M. P. Beuchat, L.R. Microbiología de Alimentos. Fundamentos y Fronteras. Za-ragoza: Editorial Acribia, 2001.




- Carrascal,A.K.;Paez,A.y Burbano, Mariela. Manual de Laboratorio Microbiología de Ali-mentos.1á ed._ Bogota: CEJA,2003.

9. Anexos



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1. Titulo: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS POTABLES, TRATADAS Y ENVASADAS

2. Objetivos:

2.1 Capacitar a los estudiantes con las diferentes metodologías empleadas para el análisis microbiológico de aguas potables de acuerdo a los requerimientos del Decreto 475/98

2.2 Identificar la flora contaminante de los tipos de aguas2.3 Adquirir destrezas en el adecuado manejo de las tablas utilizadas para hacer los

recuentos

3. Marco teórico:

El agua destinada a la alimentación como agua de bebida, así como la utilizada en el tratamiento de los alimentos o la industria alimentaría debe presentar una gran pureza, dependiendo esta de su procedencia. Las aguas subterráneas, si proceden de capas profundas, están mejor protegidas que las aguas superficiales, por cuanto la contaminación es más difícil en las aguas subterráneas y la filtración a través de las capas sedimentarias limita el número de microorganismos.

La microbiota del agua es muy variada, encontrándose en general: Microorganismos habituales del agua, Microorganismos de origen telúrico y de origen humano y animal.

Los microorganismos típicamente acuáticos son: algas microscópicas y bacterias pertenecientes a los géneros vibrio spp, Pseudomonas spp, Chromobacterium spp, Achromobacter spp, Corynebacterium spp, entre otros. Habitualmente microorganismos de origen telúrico como: bacterias esporuladas (Bacillus spp, clostridium spp), Streptomyces spp, esporas fúngicas. Los microorganismos de origen humano y animal con frecuencia son patógenos y esencialmente Enterobacterias, como: Escherichia coli y otros coliformes, Salmonella spp, Streptococcus fecales, Clostridium perfringes, Vibrio Cholerae.

En climas tropicales se pueden encontrar en el agua protozoos y otros parásitos animales. También se pueden encontrar virus, como el causante de poliomielitis y hepatitis.

En el caso de aguas envasadas, los microorganismos pueden proceder de la microbiota autóctona, registrando crecimiento pos-embotellado. Durante el procesamiento muchos de los microorganismos pueden desprenderse de las superficies de los equipos, paredes de tuberías, deduciéndose que la contaminación procede del ambiente de la planta de proceso y del personal encargado de (Staphylococcus epidermidis y S. hominis se han aislado del agua mineral envasada).



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Las aguas no carbonatadas presentan un recuento viable total que va desde 103 hasta más de 105 ufc/ml. Los recuentos en aguas carbonatadas son generalmente más bajos, debido a su pH y al efecto antimicrobiano directo del CO2.


- 1 Frasco de dilución o fiola de 250ml .con 90 ml de agua de peptona- 3 tubos taparrosca con 9ml de agua de peptona - Incubadora a 35 ºC ± 2 ºC y 44.5 ºC ± 0.5 ºC- 3 Pipetas estériles de 1 ml - 3 pipetas estériles de 10 ml- 1 Asa bacteriológica de argolla- 1 Gradilla- 3 tubos con 10 ml de caldo lactosado doble concentración- 6 tubos con 10 ml de Caldo Lactosado simple concentración- 6 tubos con 10 ml de Caldo LMX- Fluorocult simple concentración y 3 tubos con 10

ml de Caldo LMX-Fluorocult doble concentración- Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante al 2% (6 tubos con 9ml)- Equipo completo para análisis de agua por el método Miliporo o (MF)- 4 Cajas de Petri pequeñas servidas con EMB-Agar- 4 Filtros Miliporo- 1 par de Pinzas - Lámpara UV

5. Reactivos

- Reactivo de Kovacs- Indol, Rojo de metilo,vogues Proskauer, Citrato

6. Procedimiento

Análisis Microbiológicos

NMP para coliformes Totales y FecalesDeterminación de Coliformes en agua Tratada envasada

Prueba Presuntiva

- Pipetear 10 ml de la muestra a tres tubos, conteniendo cada uno 10 ml de Caldo Lactosado doble concentración.

- Pipetear 1 ml de la muestra a tres tubos, conteniendo cada uno 10 ml de Caldo Lactosado simple concentración.

- Pipetear 0.1 ml de la muestra a tres tubos, conteniendo cada uno 10 ml de Caldo Lactosado simple concentración.



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- Incubar los tubos a 35 ºC ± 2 ºC por 48 horas.- Pasado el tiempo de incubación, examinar los tubos y registrar los tubos que

presenten producción de gas (en la campana de Durham). Si a las 24 horas todos los tubos presentan gas, se puede continuar con la prueba confirmativa.

Prueba Confirmativa

- Confirmar los tubos de Caldo Lactosado positivos, transfiriendo 0.1 ml o una asada de cada tubo positivo a un tubo con 10 ml de Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante o caldo lactosado.

- Incubar los tubos a 35 ºC ± 2 ºC por 24 – 48 horas.- Pasado el tiempo de incubación, examinar y registrar los tubos que presenten

fermentación con producción de gas (positivos).- Buscar en la tabla del NMP y anotar el resultado correspondiente al número de tubos

positivos de cada dilución.- Informar el valor correspondiente como NMP DE Coliformes totales en 100 ml.

NMP de Coliformes de Origen Fecal en agua envasada (Test de Mac-Kenzie)

- A partir de los tubos positivos del aprueba presuntiva para Coliformes, transferir a cada tubo una asada de cultivo en:

Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante al 2% con campana de Durham.

Caldo Triptófano.- Mezclar suavemente los tubos e incubarlos a 44.5 ºC ± 0.5 ºC por 48 horas, en

baño de agua teniendo cuidado que el nivel de agua sobrepase el nivel de caldo en los tubos.

- Leer la prueba de Mac-kenzie de la siguiente forma:- Observar la producción de gas en caldo Lactosado bilis verde brillante al 2%- Revelar en cada Triptófano la formación de Indol, adicionando unas gotas de

Reactivo Kovac’s- Considerar como Coliformes Fecales, los que demuestren positividad en ambas

pruebas.- Confrontar los resultados con la tabla NMP y expresar los resultados como

Coliformes Fecales / gr. ml.

NMP de Coliformes Totales y Escherechia coli

- Incube de 10 ml de la muestra a una serie de tres tubos con 10 ml de Caldo LMX-Fluorocult doble concentración (a cada tubo). Para la siguiente serie de tubos con 10 ml de caldo simple concentración, adicione 1 ml de la muestra; y para la tercera serie de tubos con 10 ml de caldo simple concentración, adicione, 0.1 ml de la muestra a cada uno de ellos (total de tubos 9).

- Incube a 35 ºC ± 2 ºC por 24 horas.- Pasado el tiempo de incubación, proceda a hacer la lectura de los tubos de la

siguiente forma:



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Coliformes Totales: Viraje del color del caldo a verde-azulado. Escherechia coli: Viraje del color del caldo a verde-azulado, fluorescencia a

la luz UV de 366 nm, y reacción de indol positiva al adicionar el reactivo de kovac’s.

- Confronte los resultados con la tabla del NMP y reporte como CT y E.coli / 100 ml. Recuerde que el medio de cultivo tiene la capacidad de detectar específicamente E.coli (sustrato específico).

NMP de Coliformes totales y Escherichia coli

- Realice las diluciones decimales de la muestra del alimento hasta 10-3

- En 9 tubos con 10 mililitros de caldo LMX – Fluorocult, provistos de campana de Durham, siembre un mililitro de cada dilución en cada serie de tres tubos.

- Incubar todos los tubos a 35ºC ± 2ºC/24 horas- Observar los tubos y tomar nota de producción de gas en la campana de Durham,

turbidez, coloración azul, flouresencia azul verdosa, al revelar con la lámpara – UV y producción de Indol al revelar con el reactivo de Kovacs.

- Calcular el NMP de coliformes / ml o g. de alimento.

Método Filtración por Membrana o Miliporo

El método se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a través de un filtro de membrana microporosa, en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos.

Se utilizan membranas milipore tipo HA, que tiene un tamaño de poro de 0.45µm(micras), ya que la mayoría de los microorganismos a analizar tienen un diámetro superior a 0.45µm.

Posteriormente, se incuba la membrana, sobre un medio de cultivo adecuado, a la temperatura y durante el tiempo necesario, para luego recontar directamente las colonias sobre la superficie de la membrana. Para el procedimiento adecuado en el laboratorio, seguir las instrucciones dadas por el profesor.

Nota: Consultar el Decreto No. 1575 de 2007

7. Nivel de Riesgo:

-2 bata de laboratorio manga larga, cofia, zapato cerrado, tacón bajo, pantalón largo.- El materia biológico para descartar se empaca en bolsa, se marca y entrega al

auxiliar



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8. Bibliografía

- Albarracin, F. Y. ; Herrera, F.C. Texto de laboratorio de Microbiología de Alimentos. 1995

- Alaert, C. , Escolá. M. Métodos de Análisis Microbiológicos de Alimentos. Madrid Editorial Diaz de Santos, 2002

- Doyle, M.P Beuchat, L.R. Microbiología de Alimentos. Fundamentos y Fronteras. Zaragoza: Editorial Acribia, 2001

- Pascual, M.R. Microbiología de Alimentaria: Metodología Analítica para alimentos y Bebidas Segunda Edición. Editorial Diaz de Santos. 2000

- Forsythe, S.J. Hayes, P.R. Higiene de los alimentos, Microbiología y HACCP. Segunda Edición. Zaragoza: Editorial Acribia 2002

- Rojas, A. Recopilación guías de Microbiología de Alimentos. Universidad de Pamplona 2003.



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9. Anexos



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1. Titulo: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE BEBIDAS REFRESCANTES, HIDRATANTES Y CARBONATADAS

2. Objetivos:

2.1 Conocer las técnicas utilizadas para el análisis microbiológico de bebidas refrescantes

2.2 Identificar la microbiota que puede estar presente en las bebidas refrescantes2.3 Interpretar los resultados obtenidos y comprobarlos con las normas vigentes para

este tipo de productos

3. Marco teórico:

Las bebidas refrescantes derivan de dos fuentes principales, de las aguas minerales con gas y aromatizadas con frutas, como: los zumos de frutas, concentrados de zumos de frutas, bebidas a base de zumos de frutas son las más expuestas a contaminación, en la mayoría de las veces el azúcar es el portador de flora fúngica y bacteriana (Leuconostoc).

La limpieza del ambiente, influye notablemente en la contaminación de los productos, así como también las malas manipulaciones de la materia prima pueden incorporar Micrococcus, Estafilococos, y flora de origen fecal.

La flora presente en los zumos recién extraídos es muy elevada, predominando las levaduras, que son las que en un 90% de los casos, alteran las bebidas refrescantes, por cuanto sus características como: soportar pH bajos y altas concentraciones de azúcar, tolerar tasas elevadas de CO2 utilizar Nitrógeno inorgánico para su desarrollo favorecen el crecimiento y multiplicación de este tipo de microorganismos.

Las levaduras aisladas con más frecuencia pertenecen a los géneros: Cándida spp y Saccharomyces spp. Los mohos por ser aerobios no se desarrollan en las bebidas gaseosas, pero si se pueden hallar en las bebidas de frutas.

Las bacterias no soportan las condiciones propias de las bebidas gaseosas anteriormente expuestas. En los zumos de frutas los géneros bacterianos más frecuentes son: Achromobacter, Pseudomonas, Bacillus, Flavobacterium, Lactobacillus. La flora acidófila y osmófila puede causar: fermentaciones alcohólicas originadas por Sacharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis, S. acidifaciens; produciendo sabor alcohol y desprendimiento de gas.

Las bacterias lácticas, homo y heterofermentativas (Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides), al fermentar los azucares producen olores y sabores anormales así como desprendimiento de gas.



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- 1 Stomacher o licuadora que permita una buena homogenización.- 1 Recipiente de vidrio esterilizable (o bolsas de polietileno para Stomacher).- 1 Balanza (precisión 0.1 gr.)- Para preparación de muestras: cuchilla y tijeras previamente esterilizadas.- 3 Pipetas de 1ml y 1 pipeta de 10 ml, estériles.- 1 Frasco de dilución capacidad de 250 ml con el diluyente (90 ml de agua peptona

0.1% estéril).- 6 Cajas de petri estériles - Baño de agua (45 ºC – 50 ºC).- Incubadora.- Contador de colonias.- 40 ml de Agar Plate count fundido para recuento en placa.- 40 ml Agar OGY .fundido- 40 ml Agar SPS (Sulfito Polimixina Sulfadiazina) o Agar TSN (TRIPTONA- Sulfito –

Neomicina) - 9Tubos con 10 ml de caldo caldo LMX Fluorocult.- Jarras de anaerobiosis con sus indicadores de la atmósfera- 1 Tubo de bioquímicas con 5ml de caldo tioglicolato- 4 tubos de bioquímicas: con 5ml de gelatina, 5ml de lactosa, 5 ml de caldo nitratos

y SIM- Una caja de Agar BHI.- 3 tubos tapa rosca con 9ml de agua de peptona

5. Reactivos

6. Procedimiento

- Prepare la muestra para su respectivo análisis siguiendo las pautas dadas por el profesor.

- Realice diluciones iguales a 10-1, 10-2, 10-3, o de acuerdo al criterio o necesidad del producto.

- Realice los análisis de acuerdo al producto (guíese por la tabla 3, de criterios microbiológicos).

- Siembre por duplicado, en profundidad 1ml de las diluciones seleccionadas- Agregar 40 ml agar SPS o TSN fundido previamente atemperado.- Mezcle las cajas con el medio haciendo movimientos lentos arriba – abajo –

derecha e izquierda.- Deje solidificar y aplique una capa sellante de 5ml- Coloque las cajas con la tapa hacia arriba en la campana de anaerobiosis (colocar

el sobre de anaerobiosis y el indicador de oxido – reducción).- Incube a 35ºC de 48 a 72 horas. - Seleccione las cajas que contengan entre 20 y 200 colonias color negro.-



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- Para confirmar, seleccione 3 o más colonias y realice las bioquímicas como se indica en el protocolo anexo. (Clostridium sulfito reductor)

- De acuerdo a los resultados obtenidos, proceda a realizar los cálculos tabule e informe correctamente, tomando como valor de comparación los criterios microbiológicos de la tabla 3.

- De acuerdo a sus resultados concluya acerca de la calidad microbiológica del producto.

NOTA: No olvide que para el análisis de E.C.S.R., debe contar con las jarras de anaerobiosis, los sistemas de anaerobiosis y los indicadores de la atmósfera; así como los reactivos reveladores de las pruebas que se presenten en los medios de cultivo utilizados.

7. Nivel de Riesgo:


auxiliar

8. Bibliografía

- Albarracin, F. Y. ; Herrera, F.C. Texto de laboratorio de Microbiología de Alimentos. 1995

- Alaert, C. , Escolá. M. Métodos de Análisis Microbiológicos de Alimentos. Madrid Editorial Diaz de Santos, 2002

- Doyle, M.P Beuchat, L.R. Microbiología de Alimentos. Fundamentos y Fronteras. Zaragoza: Editorial Acribia, 2001

- Pascual, M.R. Microbiología de Alimentaria: Metodología Analítica para alimentos y Bebidas Segunda Edición. Editorial Diaz de Santos. 2000

- Forsythe, S.J. Hayes, P.R. Higiene de los alimentos, Microbiología y HACCP. Segunda Edición. Zaragoza: Editorial Acribia 2002

- Rojas, A. Recopilación guías de Microbiología de Alimentos. Universidad de Pamplona 2003.

9. Anexos

NORMAS MICROBIOLÓGICAS

PRODUCTO NORMA

ANÁLISIS DE RUTINA ANÁLISIS ESPECIALES Y/O ESPORÁDICOS

AEROBIOS

MESÓFILOS

COLIFORMES E. coli

MOHOS Y LEVADUR

AS

S. aureus COAG(

+)

E..C.S.R.

Salmonella sp OTROS

Bebida dietética a base de jugo de frutas

MS. Res. 11488/84 <3 <3 100 – 200 -- <10 -- --

Bebida dietética carbonatada

MS. Res. 11488/84 <3 <3 <10 -- <10 -- --

Bebida hidratante energética MS. Res. 02229/94 <3 <3 <10 -- <10 -- --

Bebida hidratante energética en polvo

MS. Res. 02229/94 <3 <3 <10 -- <10 -- --

Néctares y refrescos de > 30 días de duración

MS. Res. 07992/91 100 – 300 <3 <3 10 – 100 -- <10 -- --

Néctares y refrescos de 30 días máx. de duración

MS. Res. 07992/91

1000 – 3000 9 – 29 <3 100 – 200 -- <10 -- --

Refrescos INS <30000 11 <3 <300 -- <10 -- --

Gaseosas INS 100 <3 <3 <10 -- <10 --v.

cholerae”O”

Jugo de tomate MS. Res. 15789/84 100 – 300 3 <3 20 – 50 -- <10 -- --

Jugos y pulpas y pasterizados

MS. Res. 07992/91

1000 – 3000 <3 <3 100 – 200 -- <10 -- --

Jugos y pulpas Ultra pasterizados

MS. Res. 07992/91 100 – 300 <3 <3 <10 -- <10 -- --

Jugos-pulpas concentrados congelados no pasterizados

MS. Res. 07992/91

20000/50000 9 -29 <3 1000 - 3000 -- <10 -- --

Tabla 3. Criterios microbiológicos para algunas bebidas refrescantes



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Clostridium sp Profesora:Fanny Yolanda Albarracin C.

MÉTODO A MÉTODO B

10 -¹ 10-² 10-³

1 ml de cada dilución 1 ml de cada dilución 80ºC/15min + Agua fría Agar SPS Adicionar 35+/-2ºC/24-48h

En anaerobiosis

10 ml Agar SPS

Observar cajas con Dejar secar y adicionar colonias típicasOtra capa de medio. (20-200).

Incubar 35+/-2ºC/24h



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PRUEBAS CONFIRMATIVAS Seleccionar 3 colonias y sembrar en Caldo Tioglicolato

5 ml 35+/-2ºC/4-6h

CATALASA NITRATOS MOTILIDAD

Sembrar en Adicionar al tubo de Tomar una asadaAgar BHI Tioglicolato, Reactivo de Griess.37ºC24 hh

Adicionar 1 o 2 ml Color rojo indica prueba Sembrar en un tubo con SIMDe Peróxido de Hidrogeno positiva.

35+/-2ºC24 h

Observar burbujas Si no hay cambio de color Catalasa (-). Agregar pizca de Zinc. Obser-var crecimiento

a través de la es-tría.(-).o crecimiento difuso en todo el medio.

FERMENTACIÓN DE LA LICUEFACCIÓN DE LA LACTOSA GELATINA

Pasar una asada 37ºC/24h

Tomar una asada del m.o. Sembrar en medio con elAzúcar a investigar. Color amarillo (+). Sembrar en Agar Gelatina(+).



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1. Titulo: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LECHES Y DERIVADOS LÁCTEOS

2. Objetivos:

2.1 Capacitar al estudiante en las diferentes técnicas utilizadas para el análisis de leche y sus derivados.

2.2 Identificar la flora contaminante de cada tipo de leche y sus derivados2.3 Analizar los resultados obtenidos en los recuentos, de los productos examinados

3. Marco teórico:

La leche se define como el producto integro, no alterado ni adulterado y sin calostros producto del ordeño higiénico, regular, completo e interrumpido de vacas sanas y bien alimentadas. Es el alimento completo para el hombre. Su valor nutritivo se debe a los componentes esenciales como: proteínas, carbohidratos, grasas, minerales, vitaminas, agua; enzimas como: Lactenina, Lactoperoxidasa, Catalasa, reductasa. lipasa, fosfatasa, proteasa, amilasa y lisozima. La lactenina, lactoperoxidasa y lisozima tienen actividad inhibidora, por tanto, la composición y pH: 6.5-6.7 de la leche la constituye un ideal medio de cultivo para el crecimiento y proliferación de numerosos microorganismos, (bacterias, mohos y levaduras).

La leche constituye un producto altamente perecedero, que además puede ser vehículo de bacterias patógenas para el hombre (Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp, Salmonella spp, Escherichia coli. Listeria monocytogenes). En la leche también pueden estar presentes Micotoxinas procedentes de vacas que han consumido alimentos contaminados (aflatoxina M segregada por Aspergillus flavus), o del desarrollo directo de mohos como el Penicillium cyclopium, P. viridicatum o P. stoloniferu, en las leches en polvo.

Los derivados lácteos, por ser productos obtenidos en algunos casos a partir de leche cruda, si no se realizan tratamientos adecuados para la reducción o eliminación de microorganismos patógenos, se pueden encontrar remanentes de microorganismos asociados a la alteración de estos productos.

Entre los microorganismos asociados al agriado y otros tipos de alteraciones se encuentran Streptococcusthermophilus, S. lactis, Lactobacillus bulgaricus, entre otros. Los géneros Bacillus spp y Clostridiumspp son productores de agriado y gas, mientras que Enterococcus faecalis y Proteus spp son causantes de la proteólisis y su sabor amargo.



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La mantequilla por su baja humedad (15%) puede ser alterada por bacterias psicrotroficas como Pseudomonas fragi y Pseudomona putrefaciens, causantes de enranciamiento y superficie pútrida, los mohos principalmente son pertenecientes a los géneros Altemarias

spp, Aspergillus spp, Rhizopus spp,Geotrichum spp, Penicillum spp, Cladosporium spp y Mucor spp, así como algunas levaduras del genero Torulopsis spp, producen lipólisis y coloraciones verdes, azules, blancas o grises, dependiendo del color de sus esporas.

En los derivados con altos contenidos de azúcar como la leche condensada y el arequipe, los microorganismos no tienen un medio fácil de crecimiento y solo cuando las condiciones de envase y la manipulación no son adecuadas se puede presentar la entrada y crecimiento de hongos y levaduras osmófilas especialmente en la superficie, como: Torulopsis lactis- condensi, Torulopsis globula y mohos como Aspergillus spp y Penicillium spp.

La mayoría de los derivados lácteos se fabrican con leche tratada térmicamente, pero este proceso de destrucción de microorganismos algunas veces no es eficiente, ya que existen microorganismos resistentes a estos procesos (microorganismos termodúricos), como Streptococcus thermophilus, Micrococcus lacteus, Corynebacterium lacticum, junto con esporas de Bacillus spp y Clostridium spp.

En los tratamientos UHT, puede presentarse la sobrevivencia de esporas de Bacillus stearothermohillus y Bacillus subtillis


- Stomacher o licuadora que permita una buena homogenización.- Recipiente de vidrio esterilizable (o bolsas de polietileno para Stomacher).- Balanza (precisión 0.1 gr.).- Para preparación de muestras: cuchilla, tijeras, cuchillo y tenedor previamente

esterilizados.- 3 Pipetas de 1 ml y 1 pipeta de 10 ml, estériles.- 2 Pipetas de 0.1ml estériles- 1 Frasco para dilución con capacidad de 250 ml ,con 90 ml de agua peptona

0.1% estéril).- 8 Cajas de petri estériles.- Asa bacteriológica de argolla y recta.- Baño de agua (45 ºC – 50 ºC).- Incubadora.- Contador de colonias.- 40 ml de Agar SPC fundido para recuento en placa - 40 ml de Agar OGY .fundido- 40 ml Agar OPSP o Sulfito Polimixina Sulfadiazina.- 2 Cajas e petri servidas con agar Mossel o Selectivo para B. cereus.- 5 Tubos de bioquímicas: con 5ml de gelatina, caldo nitratos, glucosa, caldo voges

proskauer



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- Agar almidón- 2 cajas de petri servidas con Baird Parker Agar - 1 Tubo bioquímicas con 5ml de BHI

- 1 Tubo con 0.3 ml de plasma humano- 1 caja de petri servida con Agar DNASA - 9 Tubos taparrosca con 10 ml de caldo LMX Fluorocult.

5. Reactivos

- Reactivo de Kovacs- Reactivo de greiss , polvo de zinc - Alfa-naftol, KOH

6. Procedimiento

- Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados, como se ha venido haciendo en las prácticas anteriores.

- De acuerdo al producto a analizar, realizar los análisis correspondientes citados en la tabla de Criterios Microbiológicos (tabla 4) para leche y sus derivados. Ver protocolos anexos Staphylococcus aureus, Clostridium sulfito reductor, Bacillus cereus y Listeria monocytogenes.

- Pipetear por duplicado en cajas de petri alícuotas de las diluciones seleccionadas para realizar los análisis. El inóculo dependerá de si la técnica aplicada es en superficie o en placa profunda (0.1 y 1ml respectivamente). Recuerde homogenizar correctamente las cajas, cuando se aplique placa profunda y extender el inóculo con el asa de vidrio cuando se inocula la superficie del agar.

- Invierta las placas e incúbelas a la temperatura adecuada de acuerdo al análisis realizad (ver protocolos anexos)

- Pasado el tiempo de incubación, en cada caso, proceda a realizar las confirmaciones de los análisis que lo ameriten, e incube estas pruebas a la temperatura y por el tiempo apropiado.

NOTA: el tiempo transcurrido entre el momento de depositar las distintas diluciones en las placas y verter sobre ellas el medio de cultivo no debe ser superior a 10 minutos, así como la extensión de los inóculos con el asa de vidrio en la superficie de los agares debe ser inmediata. Del mismo modo, no se superarán los 20 minutos desde que se prepara la primera dilución en la “serie de diluciones decimales”, hasta que se vierte el agar en la última placa.



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7. Nivel de Riesgo:


auxiliar

8. Bibliografía



- Doyle, M. P. Beuchat, L R. Microbiología de Alimentos. Fundamentos y Fronteras. Za-ragoza: Editorial Acribia, 2001.






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9. Anexos

NORMAS MICROBIOLÓGICASPRODUCTO NORMA ANÁLISIS DE RUTINA ANÁLISIS ESPECIALES

Y/O ESPORÁDICOS

AEROBIOS

MESÓFILOS

COLIFORMES

E. coli

MOHOS Y

LEVADURAS

S. aureusCOAG(

+)

E..C.S.R.

Bacillus

cereus

Salmonella sp

OTROS

Leche con sabores pasteurizada

MS. Res. 02310/86

50000 – 10000 11 – 40 <3 -- -- -- -- -- --

Leche condensada MS. Res. 02310/86

10000 – 30000 <3 <3 200 –

500100 – 200 -- -- -- --

Leche en polvo MS. Dec. 2437/83

10000 – 30000 <3 <3 200 –

1000< 100 –

200100 – 1000

100 – 1000 0 --

Leche pasteurizada MS. Dec. 2437/83

50000 – 100000 11 – 93 <3 -- -- -- -- -- --

Leche UHT envasada e higienizada

MS. Dec. 476/98

20000 – 30000 < 10 – 23 <3 -- -- -- -- --

Ea/an < 10 -

20

Leche UHT larga vida y mediana

MS. Dec. 476/98 100 – 200 < 3 – 11 <3 -- -- -- -- --

Ea/an < 10 -

20

Queso fresco MS. Res. 01804/89 -- * <3 100 –

5001000 – 3000 -- -- 0 --

Queso fundido MS. Res. 01804/89

30000 – 50000 20 – 93 <3 100 –

200100 – 200

100 – 500

100 – 500 0 --

Queso semimadurado. Madurado

MS. Res. 01804/89 -- -- <3 -- 500 –

1000 -- -- 0 --

Yogurt / kumis MS. Res. 02310/83 -- 20 – 93 <3 200 –

500 -- -- -- -- --

Postre de leche pasteurizado

MS. Res. 02310/89

5000 – 10000 20 – 50 <3 200 –

500100 – 200

100 – 1000

100 – 1000 0 --

Crema de leche pasteurizada

MS. Res. 02310/86 -- 75 – 150 <3 100 –

200100 – 200 -- -- 0 --

Mantequilla MS. Res. 02310/86 -- 75 – 150 <3 500 –

1000100 – 200 -- -- 0 --

Arequipe MS. Res. 02310/86 500 – 2000 11 – 40 <3 10 – 100 100 –

200 -- -- -- --

Helados (con leche) MS. Res. 01804/84

100000 – 150000 93 – 150 <3 -- 100 –

200 -- -- 0 --



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Staphylococcus aureus Profesora: Fanny Yolanda Albarracin C.

10 -¹ 10-² 10-³

0.1 ml 0.1 ml

Baird Parker óSalado Manitol 35º+/-2ºC/24h

Seleccionar colonias típicas entre 20-200 ufc

1-3 ufc

5 ml de Caldo BH 35º+/-2ºC/24 h

0.1 ml cultivo +0.3 ml plasma

35º+/-2ºC

Observar coagulación cada 4 horas/24horas



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PRUEBA DE LA TERMONUCLEASA

Calentar tubos coagualasa (+) a 80ºC/15 min

0.1ml

Agar DNAsa

35+/-2ºC/4horas

Aparición de halo rosado prueba positivaSi a las 4 horas no aparece dejar incubado por 24 horas y realizar la lectura.

Aplicar factor de correcciónRecuento colonias* Colonias positivas/Colonias examinadas

Informar por la fórmula de ICONTEC o MinSalud.



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Bacillus cereus

10 -¹ 10-² 10-³

0.1 ml 0.1 ml

Agar Mossell óSelectivo para B.cereus

35º+/-2ºC/24-48 h Seleccionar colonias típicas entre

20-200 ufc Realizar Bioquímicas

GELATINA NITRATOS FERMENTACIÓNGLUCOSA

Sembrar en Agar Tomar una colonia y sembrar en To-mar una coloniaGelatina una asada Caldo Nitratos. Y sembrar en un tubo

Que contenga el azú-car.37ºC/ 37ºC/24h 24h

Hidrólisis de la Adicionar gotas de Reactivo de GriessGelatina. Color amarillo, prueba

(+). B.cereus acidifica el medio sin gas.

Color rojo indica prueba. Si no hay viraje Adicionar polvo de Zinc. Si no hay cambio de Color, prueba (+). B.cereus reduce nitratos.

Guía Unificada de LaboratoriosFundamentos de Microbiología de alimentos Código FLA-23 V. 00

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MÉTODO A MÉTODO B

10 -¹ 10-² 10-³

1 ml de cada dilución 1 ml de cada dilución

80ºC/15min + Agua fría Agar SPS Adicionar 35+/-2ºC/24-48h

En anaerobiosis

10 ml Agar SPS





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PRUEBAS CONFIRMATIVAS Seleccionar 3 colonias y sembrar en Caldo Tioglicolato

5 ml 35+/- 2ºC/4-6h


Sembrar en Adicionar al tubo de Tomar una asadaAgar BHI Tioglicolato, Reactivo de Griess.37ºC24 h

Adicionar 1 o 2 ml Color rojo indica prueba Sembrar en un tubo con SIMDe Peróxido de Hidrogeno positiva.

35+/-2ºC24 h

Observar burbujas Si no hay cambio de color Catalasa (-). Agregar pizca de Zinc. Obser-var crecimiento


FERMENTACIÓN DE LA LICUEFACCIÓN DE LA LACTOSA GELATINA





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Listeria monocytógenes

Enriquecimiento Selectivo

25 gr+ 0.1 ml 225 ml 30ºC/24 hCaldo Agar Mac-Bride, Oxford o PalcamPalcam 30ºC/48 horas

Realizar bioquímicas aquellas colonias que presenten hidrólisis de la esculina.

COLORACION DE CATALASA PRUEBA DE HENRYGRAM

Bacilos Gram(+) Adicionar un as Colocar una caja con colonias

gotas de Peróxido presuntivas en un ángulo de de Hidrógeno sobre 45º frente a la luz blanca

una colonia

MOVILIDAD Listeria sp es catalasa positivo Listeria sp presenta colonias

(aparición de burbujas). Color azul-cie-lo.

Sembrar en SIM Una asada

Incubar 22ºC Profesora: Fanny Yolanda Albarracin ContrerasListeria sp es móvil



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HIDRÓLISIS DEL VOGES-PROSKAUER ALMIDÓN

Tomar una asada del m.o. y sembrar Tomar una asada del m.o. y sembraren agar Almidón. En un tubo con VP

37ºC/ 37ºC/24h 24h

Adicionar lugol y observar Adicionar alfa-naftol y KOH. B.cereus Hidrólisis. Es VP (+).

Profesora: Fanny Yolanda Albarracin Contreras



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1. Titulo: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE CARNES Y DERIVADOS CÁRNICOS

2. Objetivos:

2.1 Determinar los análisis microbiológicos que se realizan a las carnes crudas: rojas y blancas y sus derivados.

2.2 Identificar la flora microbiana contaminante de cada tipo de carnes2.3 Conocer las diferentes técnicas empleadas para el aislamiento de Salmonella spp.2.4 Interpretar los resultados de los análisis y compararlos con las normas vigentes

para este tipo de productos

3. Marco teórico:

La carne de los animales constituye la base de la alimentación humana y su industria es de gran importancia en el ámbito de la alimentación. La carne es uno de tos alimentos más perecederos debido a sus características de composición: pH y actividad acuosa: constituye un medio muy favorable para el crecimiento y proliferación de la mayor parte de los microorganismos. La profundidad del músculo de un animal recién sacrificado contiene una microbiota muy escasa, del orden de un germen por gramo aproximadamente; esta microbiota procede generalmente, del intestino y es transportada al músculo por la sangre.

La parte superficial de la carne, especialmente en la canal esta mucho más contaminada por una diversidad de microorganismos, que dependen de las condiciones higiénicas de manipulación, así como del ambiente del matadero. Esta contaminación empieza durante el sacrificio del animal, continúa en otras dependencias del matadero y lugares de venta, para terminar en el hogar del consumidor. En el momento del sacrificio, algunos gérmenes pueden atravesar la barrera intestinal, (por falta de un ayuno previo a la matanza, en el caso de los animales fatigados o cuando se trata de animales enfermos) para llegar a tos músculos por vía sanguínea.

Durante el desuello, evisceracion y despiece, resulta fácil la contaminación de las canales con gérmenes procedentes del intestino, suelo, ambiente o personas que manipulan las canales o las piezas de la carne.

La canal preparada adecuadamente también esta sujeta a nuevas contaminaciones por tos instrumentos utilizados en el despiece y posteriores manipulaciones.

La contaminación en el frigorífico es muy importante, pues allí entran en contacto unas carnes con otras de diferente procedencia, y por las condiciones de manipulación, son varias las vías de contaminación durante todo el proceso de faenado. En el caso de largos periodos de almacenamiento en frío, puede presentarse la proliferación de microorganismos psicrófilos. Durante el transporte, la contaminación de las canales o piezas puede potenciarse, así como en los lugares de venta, donde puede seguir este



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proceso, cuando esta es nuevamente almacenada en algunos casos por corto tiempo si las condiciones higiénicas no son apropiadas. 4. Materiales, Equipos e Insumos

Muestras: carne fresca de vacuno, porcino, aves, y/o animales de abasto; chorizo, salchichón, pasta de hamburguesa, cábanos, mortadela, morcilla, salchichas, queso de cabeza.

- Stomacher o licuadora que permita una buena homogenización.- Recipiente de vidrio esterilizable (o bolsas de polietileno para Stomacher).- Balanza (precisión 0.1 gr.).- Para preparación de muestras: cuchilla, tijeras, cuchillo y tenedor previamente

esterilizados.- 3 Pipetas de 1 ml y 2 pipetas de 10 ml, estériles.- Frascos de 250 ml con 90 ml de agua peptona 0.1% estéril- 3 tubos taparrosca con 9 ml de agua de peptona estéril- 6 Cajas de petri estériles.- Asa bacteriológica de argolla y recta.- Baño de agua (45 ºC – 50 ºC).- Incubadora.- Contador de colonias.- Agar SPC fundido 40 ml - Agar OPSP o Sulfito Polimixina Sulfadiazina.fundido 40 ml- 2 Cajas con agar Baird Parker servido- 1 Erlenmeyer con 225 ml de agua peptona.- 1 Erlenmeyer con 225 ml de Caldo de Enriquecimiento para Listeria spp. - 1Tubo de bioquímicas con 10 ml de caldo Rapapport y 1 tubo bioquímicas con 10

ml de caldo Selenito Cistina o tetrationate.- 1 Caja con XLD servido y 1 caja con Rambach servido- 1 Cajas con Agar Triptosa- ácido nalidixíco ATN- 1Tubo con agar LIA, 1 de TSI en bisel, 1 tubo con 5ml de caldo urea, 1 de SIM en

tubo recto, 1 tubo con caldo Rojo de Fenol + 0.5% de Ramnosa, Xilosa y Manosa, 1 tubo con caldo BHI con 0.5 ml y plasma.

- 9 tubos con 10 ml de caldo LMX Fluorocult.

5. Reactivos

- Coloración de Gram.: Cristal violeta, lugol,alcohol acetona,fuscina básica, azul de metileno.



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6. Procedimiento

- Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados, como se han realizado en prácticas anteriores.

- De acuerdo al producto a analizar, realizar los análisis correspondientes citados en la Tabla de Criterios Microbiológicos (tabla 5), para cárnicos y sus derivados y los protocolos anexos de s. aureus, Clostridium sulfito reductor, Salmonella spp.

- Pipetear por duplicado en cajas de petri alícuotas de las diluciones seleccionadas para realizar los análisis. El inóculo dependerá de su la técnica aplicada es en superficie o en placa profunda (0.1 y 1 ml, respectivamente). Recuerde homogenizar correctamente las cajas, cuando se aplique placa profunda y extender inmediatamente la alícuota con el asa de vidrio, cuando se inocula la superficie del agar.

- Invierta las placas e incúbelas a la temperatura adecuada de acuerdo al análisis realizado. (ver protocolos anexos)

- Pasado el tiempo de incubación, proceda a realizar el conteo de las colonias presentes en cada una de las placas cuando el análisis así lo requiera.

- Proceda a realizar confirmaciones pruebas bioquímicas de los análisis que lo ameriten, e incube estas pruebas a la temperatura y por el tiempo apropiado. (ver protocolos anexos en cada caso)

- Reporte resultados correctamente.

7. Nivel de Riesgo:


auxiliar

8. Bibliografía



- Doyle, M. P. Beuchat, LR. Microbiología de Alimentos. Fundamentos y Fronteras. Za-ragoza: Editorial Acribia, 2001.






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9. Anexos


PRODUCTO NORMA


AEROBIOS

MESÓFILOS

COLIFORMES

E. coli

MOHOS Y

LEVADURAS

S. aureus E..C.S.

R.

Bacillus

cereus

Salmonella spp OTROS

Cárnicos cocidos o ecaldados NTC 1325 200000 –

300000 120 – 1100 <3 -- <100 100 – 1000 -- 0 --

Cárnicos crudos NTC 1325 -- --120 –

1100-- 100 –

1000100 – 1000 -- 0 --

Cárnico crudo – pollo NTC 36442 -- --

100 –

1100-- 100 –

500100 – 1000 -- 0

Listeria monocytig

enes 0

Cárnicos crudos madurados NTC 1325 -- < 3 – 93 <3 -- <100 10 – 100 -- 0

Listeria monocytig

enes 0

Pollo – carne cruda adobada INS -- *

120 –

1100-- 100 –

1000100 – 1000 -- 0 --

Tabla 5. Criterios Microbiológicos para algunas Carnes y Derivados cárnicos



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Staphylococcus aureus Profesora: Fanny Yolanda Albarracin C.

10 -¹ 10-² 10-³

0.1 ml 0.1 ml

Baird Parker óSalado Manitol 35º+/-2ºC/24h

Seleccionar colonias típicas entre 20-200 ufc

1-3 ufc

5 ml de Caldo BH

35º+/-2ºC/24h

0.1 ml cultivo +0.3 ml plasma

35º+/-2ºC

Observar coagulación cada 4 horas/24horas



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PRUEBA DE LA TERMONUCLEASA

Calentar tubos coagualasa (+) a 80ºC/15 min

0.1ml

Agar DNAsa

35+/-2ºC/4horas

Aparición de halo rosado prueba positivaSi a las 4 horas no aparece dejar incubado por 24 horas y realizar la lectura.

Aplicar factor de correcciónRecuento colonias* Colonias positivas/Colonias examinadas

Informar por la fórmula de ICONTEC o MinSalud.



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Escherichia coli

SIEMBRA EN PLACA PROFUNDA

10 -¹ 10-² 10-³

1 ml 1 ml

Agar EMBMac Conkeyó Endo 44ºC/24-48 h

Seleccionar colonias típicas entre En agar EMB y ENDO colonias con brillo metálico

En Agar Mac Conkey colonias rojas

Realizar Bioquímicas

INDOL RM VP CITRATO

(+) (+) (-) (-)

Fanny Yolanda Albarracin Contreras



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Escherichia coliSIEMBRA POR NMP EN LMX-F

1 ml 9ml A.P.E.

10 -¹ 10-² 10-³10 gr/ml deMuestra +90 ml A.P.E.

1 ml 1 ml 1 ml

37ºC/24h

Observar cambio de color en los tubos(verde-azuloso)

Positivo para Coliformes Totales

De los positivos para C.T. realizar confirmativo para Fecales y E.coli Exponiendo a luz ultravioleta a 360nm

Si se presenta Fluorescencia, adicionar Indol, aparición de un halo rojo indica prueba positiva para E.coli y coliformes fecales. Informar se-gún la tabla de NMP/gr ó ml.



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Salmonella sp

Pre-enriquecimiento EnriquecimientoNo Selectivo Selectivo

25 gr+ 225 ml 1 ml 10 ml CaldoA.P.E. Rapport ó Incubar

37ºC/24 horas Tetrationate 37ºC/24 horas

0.1 ml

XLD RAM BACH I M V I C

(-) (+) (-) (+) 35º+/-2ºC/24-48 h

Selecionar colonias típicas

Realizar Bioquímicas.

TSI UREA LÍA

Sembrar en Agar Tomar una colonia y sembrar en To-mar una coloniaTSI por estria. Agar Urea una asada. Y sembrar en un tubo

Que contenga agar LÍA37ºC/ 37ºC/24 h 24 h 37ºC/

24 h Salmonella sp es urea (-). Acido con o sin Descarboxila-ción de la Producción de H2S. Lisina con o sin

Producción de H2S.Profesora:Fanny Yolanda Albarracin Contreras



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MÉTODO A MÉTODO B

10 -¹ 10-² 10-³

1 ml de cada dilución 1 ml de cada di-lución

80ºC/15min + Agua fría Agar SPS Adicionar 35+/-2ºC/24-48h

En anaerobiosis

10 ml Agar SPS




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PRUEBAS CONFIRMATIVAS

Seleccionar 3 colonias y sembrar en Caldo Tioglicolato

5 ml 35+/-2ºC/4-6 h


Sembrar en Adicionar al tubo de Tomar una asadaAgar BHI Tioglicolato, Reactivo de Griess.37ºC24 hAdicionar 1 o 2 ml Color rojo indica prueba Sembrar en un tubo con SIMDe Peróxido de Hidrogeno positiva.

35+/-2ºC

24hObservar burbujas Si no hay cambio de color Catalasa (-). Agregar pizca de Zinc. Obser-var crecimiento


FERMENTACIÓN DE LA LICUEFACCION DE LA LACTOSA GELATINA




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1. Titulo: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE CONSERVAS - TEST DE ESTERILIDAD COMERCIAL

2. Objetivos:

2.1 Conocerlas técnicas empleadas para realizar el Test de esterilidad comercial de las conservas.

2.2 Identificar los diferentes tipos de microorganismos asociados a los procesos de alteración de este tipo de productos.

3. Marco teórico:

Las conservas son productos alimenticios preparados en recipientes metálicos, de vidrio, plástico u hojalata que tiene cierre hermético y han sido sometidos a un tratamiento que garantiza la destrucción de todas las formas bacterianas vegetativas o esporuladas y de cualquier enzima.

Son aquellos productos que permanecen sin contaminar a temperatura ambiente, durante largos periodos de tiempo y tienen una vida útil que puede variar desde 6 meses a varios años.

Las principales características exigibles en una conserva son:

- Inocuidad para el consumidor- Mantenimiento inalterable de sus características organolépticas durante largos

periodos de tiempo.

Para lograr la inocuidad de una conserva, sería suficiente con utilizar un tratamiento térmico elevado, lo que por otra parte, dará lugar a que los caracteres organolépticos del producto envasado sufrieran una modificación sensible. Por esta causa, se suelen tener en cuenta dos conceptos, respecto a la esterilidad de las conservas:

Esterilidad BiológicaEsterilidad Comercial

En la esterilidad biológica, existe una ausencia total de microorganismos y sus toxinas, así como la inactivación absoluta de enzimas celulares y microbianas.

En la esterilidad comercial, no deben existir formas vegetativas, esporas de bacterias patógenas o toxinas de microorganismos capaces de alterar el producto. Las enzimas celulares y microbianas deberán estar inactivas. En las conservas de esterilidad comercial se toleran esporas de microorganismos pertenecientes a la familia Bacillaceae no patógenos, no toxigénicos e inertes, es decir, incapaces de germinar.



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Definición NTC 4433

Esterilidad comercial de un alimento tratado térmicamente es: el estado que se consigue aplicando el calor suficiente, solo o en combinación con otros tratamientos apropiados con el objeto de liberar a ese alimento de microorganismos patógenos y de otros microorganismos capaces de reproducirse en el, en unas condiciones normales no refrigeradas en las que se mantendrá probablemente el alimento durante su distribución y almacenamiento.

CLASIFICACIÓN:

Las conservas según su tecnología y con fines de control, las conservas se suelen clasificar: Según el pH y según el envase.

Según el pH del producto envasado, las conservas se clasifican en:

- Conservas no ácidas, de pH superior a 4.5- Conservas ácidas, de pH inferior a 4.5

Las conservas no ácidas, exigen un tratamiento térmico elevado, de acuerdo con un baremo de esterilización adecuado, previamente estudiado.

Las conservas ácidas, se someten generalmente, a un tratamiento térmico que gira alrededor de los 100°C, temperatura suficiente para destruir la microbiota acidofila (bacterias, levaduras y mohos).

Según el pH del contenido:

Poco ácidas, con pH superior a 5.3: como las conservas de carne y pescadoDe acidez media, con pH entre 5.3 y 4.5: como las conservas de legumbres y verdurasÁcidas, con pH entre 4.3 y 3.7Muy ácidas, con pH inferior a 3.7: como el choucroute (o col fermentada).

Según el envase:Teniendo en cuenta el envase que las contiene, las conservas se pueden clasificar en:

- Conservas en envases metálicos herméticamente cerrados- Conservas en envase de vidrio, cerrados con cápsulas metálicas o de plástico, al

vacío.- Conservas en envase de plástico flexible o duro, cerradas por termosellado o

cápsula.- Conservas en envase de cartón parafinado o de plástico, estériles, donde se

introduce asépticamente el producto previamente esterilizado. El envase se cierra mediante cápsula o termosellado.



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Procedencia de la Microbiota:

Las conservas pueden contener, microorganismos revivificables debido a causas diversas, principalmente:

- Por tratamiento térmico insuficiente- Por microfugas en los envases.

En el caso de tratamiento térmico insuficiente, puede ocurrir que:- El tratamiento térmico fuera correcto pero, si se ha partido de materias primas

excesivamente contaminadas, se encuentren en la conserva esporas de Bacillus termorresistentes.

- Tratamiento térmico insuficiente, por lo que se podrían encontrar Bacillus termorresistentes, y otros microorganismos termosensibles.

El mayor riesgo esta en el primer caso, pues existe la posibilidad de persistencia de esporas pertenecientes a Clostridium botulinum.

El crecimiento microbiano del segundo caso se descubre por el abombamiento del envase.

Cuando se trata de microfugas, se considera que la conserva ha sido esterilizada correctamente, pero defectos del envase facilitan la penetración de microorganismos desde el exterior, especialmente cuando se utilizan aguas contaminadas para el enfriamiento de conservas una vez esterilizadas.

Alteración por bacterias esporuladas:

Acidificación: Se presenta en conservas de legumbres, por la presencia de Bacilos termófilos y algunas veces por mesófilos que han resistido el tratamiento térmico. El agente causal en legumbres, suele serBacillus stearothermophilus y B. thermoacidurans y B. themioaceticum, son bacilos esporulados termófilos con metabolismo muy activo.

Abombamiento: Consiste en la sobreprotección interna del envase, como consecuencia de la producción de gas que puede incluso originar explosión. El agente causal suele ser Clostridium thermosaccharlyticum, bacilo esporulado anaerobio estricto.

Ennegrecimiento: Se debe al crecimiento de Clostridium nigríficans, esporulado anaerobio termófilo, productor de SH2. El envase se presenta mas o menos abombado y el contenido de color negro, desprende olor pútrido.

Abombamiento por bacterias esporuladas mesófilas:

Acidificación: Provocad por presencia de B. subtilis, B. lícheniformis.

Abombamiento por fermentación butírica: Producida por Clostridium butyricum, Clostridium



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pasteurianum, se fermenta el alimento, con acidificación y desprendimiento de gas, causante del abombamiento del envase.

Abombamiento con putrefacción: Producido por Clostridium sporogenes, produce la descomposición de las proteínas con liberación de compuestos de la putrefacción.

Abombamiento por desprendimiento de nitrógeno: Ocasionado por bacilos desnitrificantes, al trasformar los nitratos en nitritos Ejemplo: Bacillus circulans.

Alteración de la calidad Higiénico sanitaria: Existe riesgo de toxi-infección alimentaria en aquellas conservas de pH mayor de 4.5. Las de pH menor de 4.5 solo permite el crecimiento de bacterias patógenas.

El crecimiento de microorganismos patógenos altera las características organolépticas de la conserva, por lo que causa rechazo, esto no siempre es así puesto que, a veces, aunque el producto no este alterado aparentemente, contiene flora patógena, hecho que supone un enorme riesgo. Es el caso de Clostridium botulinum, tipos A-B-E, así como S. aureus, microorganismos capaces de producir toxinas.

CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LAS CONSERVAS

Este control se establece en dos niveles:

- Control de rutina: comprueba que las conservas no han sufrido modificaciones, después de haber sido sometidas a una esterilización previa: Control de estabilidad

- Control completo: cuando existen problemas de alteración o si se desea poner a punto un baremo de esterilización: Control de esterilidad.

El control de estabilidad se puede realizar en fábrica, mientras que el control de esterilidad requiere un examen delicado y minucioso por parte del Laboratorio de Microbiología.

Control de estabilidad: Se logra analizar un considerable número de muestras, consiste en someter a incubación parte de las muestras del mismo lote que se va a controlar, con el fin de comprobar posteriormente, si se han producido modificaciones sensibles cuando se comparan con una muestra del mismo lote no incubada y que sirve como testigo.

Pasado el tiempo de incubación se procede a:

- Estudiar el aspecto del envase incubado, comparando con el testigo.- Comprobar la variación del pH con el testigo.- Realizar examen bacterioscópico del alimento, con recuento de microorganismos,

comparando la microbiota de los envases incubados y el testigo.



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Control de esterilidad (Esterilidad comercial): Constituye un análisis completo, reservado habitualmente, a laboratorios especializados. Esta indicado, cuando después del control de estabilidad, se ha manifestado una alteración positiva o dudosa, o cuando se trate de conservas alteradas espontáneamente.

El control consiste en comprobar si el alimentos, alberga microorganismos revivificables y, en caso positivo, determinar su naturaleza para poder explicar la falta de estabilidad. En este examen se comprueba:

- Morfología de la microbiota revivificable- Termorresistencia de la microbiota- Temperatura óptima de crecimiento.

Este análisis exige las siguientes etapas:

Muestreo: Consiste en separar cierto numero de unidades del lote que sean representativas de este. Se deben dejar contramuestras (mínimo dos recipientes del mismo lote).

Lavado de Envases: Antes de proceder a su análisis se deben lavar cada una de las unidades muestreadas, con agua jabonosa y aclarar con agua potable.

Examen macroscópico preliminar de los envases: Comprobar el estado de los envases, para descubrir posibles defectos o alteraciones tales como: abombamiento, oxidación, microfugas, deformaciones.

Incubación: Una vez realizado el examen externo de los envases, se someten a incubación, para comprobar la estabilidad del producto envasado.(los detectados alterados no se incuban).

Examen externo del envase después de la incubación: Transcurrido el tiempo de incubación, es necesario que las conservas se estabilicen, a temperatura ambiente entre 1 a 4 horas, antes de ser examinadas.Luego de este tiempo, se examina la conserva para detectar posibles alteraciones como:

- Abombamiento físico- Oxidación- Deformación

Abombamiento: Según su resistencia a la presión, la presión del envase puede ser reductible o no reductible.

El abombamiento de origen físico: se debe a diversas causas, como el exceso de llenado o la deformación del envase, como consecuencia de golpes. En este tipo de abombamiento, el producto es estéril y sus características organolépticas normales.



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El abombamiento de origen químico: deriva de la reacción química entre envase y contenido, con desprendimiento de H2 y corrosión del metal. El contenido puede ser normal o estar ligeramente alterado.

El abombamiento biológico: De origen microbiano se produce como consecuencia del crecimiento de determinados microorganismos en el interior de la conserva. En este tipo de abombamiento se alteran el envase y el contenido.

La oxidación, es una alteración propia de las conservas, mantenidas en lugares húmedos, no implica necesariamente el deterioro del alimento envasado, pero, como puede ser causa de rotura del envase, existe peligro de contaminación por parte de microorganismos procedentes del exterior.

La deformación, es causada por golpes: es posible encontrar microfugas, en el envase deformado, que permitan la entrada de microorganismos. No deben existir diferencias en el aspecto del envase cuando se comparan las conservas incubadas y la testigo.

Apertura del envase y toma de muestra para análisis:

Con el fin de evitar contaminaciones externas, que pueden falsear los resultados, se recomienda el uso de cámaras de flujo laminar, por cuanto, en el interior de la conserva existe un vacío que, al abrir el envase, da lugar a una aspiración de aire exterior, por lo que, para impedir poluciones, el aire circulante debe ser estéril.

Apertura del envase: La tapa de la conserva que se va a abrir, se lava enérgicamente con algodón empapado con alcohol de 70°, se vierte una pequeña cantidad de alcohol que debe actuar durante algunos minutos y desecharse después. La película de alcohol que permanece se flamea de forma rápida. Este flameado se omite cuando los envases están abombados.

Cuando se trata de envases abombados, como su apertura puede generar peligro para el manipulador, se toman precauciones para protegerse de la salida violenta del contenido, Se recomienda en este caso, usar un embudo de vidrio invertido sobre la conserva, que a su vez debe estar sobre una bandeja metálica, la tapa de la conserva se perfora con un punzón metálico estéril, a través del vástago del embudo. Los gases que salen por el orificio de apertura, se recogen en un tubo de ensayo o en una probeta colocada en posición invertida sobre el vástago del embudo.

Para detectar la presencia de H;, se aplica una llama a la boca del tubo donde se han recogido los gases, en caso positivo se producirá una pequeña explosión, La presencia de CO2, se detecta añadiendo 3ml de KOH al tubo y agitando , previa obturación del tubo con el dedo.

Cuando se crea un vacío se succiona el dedo, la prueba es positiva. En el mismo tubo se puede comprobar la presencia de H2S, que se manifiesta por el ennegrecimiento de una tira de acetato de ploma.



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Medida del pH:

Separada la muestra para el análisis microbiológico, se mide le pH, utilizando peachimetro con electrodo de vidrio, la medida se hace directamente sobre el producto, si es homogéneo y sobre u triturado si el producto es heterogéneo, utilizando como diluyente un tampón cuyo pH se aproxime al del alimento.

Examen del contenido de la conserva:

Consiste en observar la posible modificación de las características organolépticas, del producto conservado, comparando las conservas incubadas, con las testigos, sin incubar.

Olor putrefacto: propio de microorganismos esporulados anaerobios, mesófilos como: CL. Sporogenes, Cl. Perfringes, Cl. Putrefaciens, Cl. Nigrificans.

Olor fecal: Por coniformes procedentes del exterior que indican fisuras del envase.

Olor H2S: suele ir acompañado de ennegrecimiento (CI. Nigrificans)

Olor a queso: Por algunas especies de Clostridium

Olor a ácido butírico: Por algunas especies de Clostridium spp: Cl. Thermosaccharolyticum, Cl. Butyricum,Cl. Perfringes y Cl. Pasteurianum.

Aspecto: Textura blanda, digeridaAspecto: Consistencia líquida, viscosa, filante.Aspecto: Elementos extraños

Sabor: No se debe comprobar esta característica.

Examen interna del envase:

Se extrae el producto para hacer un examen minucioso del interior del envase, con el fin de descubrir posibles alteraciones del color de las paredes, debidas generalmente, a reacciones químicas, así como lesiones de oxidación y desprendimiento del esmalte protector.

Examen bacterioscopico:

Se examina microscópicamente el contenido de las muestras incubadas y la testigo. Con este examen se pon e de manifiesto la calidad bacteriológica del producto. Se pueden encontrar formas vegetativas, esporuladas y muertas.

En productos sometidos a esterilización, la forma común es la de células vegetativas muertas y esporas inertes. La cifra de estos microorganismos se pone en evidencia mediante el examen microscópico directo.



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Si esta cifra es alta (>107), significa que la materia prima es microbiológica mente deficiente. Una buena conserva no debe tener de 2 a 3 bacterias muertas por campo microscópico, excepto en alimentos cuya elaboración es consecuencia de fermentación biológica.

El examen microscópico directo, es en ocasiones el único medio de detectar el flan sour, ya que los Bacillusspp termófilos causantes de esta alteración, al multiplicarse en la conserva, dan lugar al fenómeno de auto esterilización, por lo que no se produce el crecimiento de colonias de microorganismos revivificables sobre los medios de cultivo y, en cambio aparecen multitud de microorganismos muertos por examen bacterioscopico.

La presencia de formas microbianas variadas (cocos, bacilos, levaduras), y esporangios, indican microfugas o deficiente proceso de esterilización. Si se observan bacilos con esporas subterminales o esporas libres se puede a procederá hacer bioensayos con ratones blancos para la investigación de la toxina botulínica.

La técnica para el examen microscópico, consiste en hacer una extensión fina del alimento y teñida por tinciones simples o de Gram. y observada bajo el objetivo se inmersión, se examinan 10-20 campos distintos al azar. Se cuentan las agrupaciones encontradas (parejas, racimos, cadenas, aislados), Gram positivas y Gram negativas.

En la agrupación microscópica, se cuentan como un solo microorganismo las agrupaciones microbianas encontradas, así como cada célula aislada que esta separada del grupo a una distancia superior al eje mayor de dicha bacteria.

Interpretación del control de estabilidad:

De acuerdo con tos exámenes efectuados, para que la estabilidad de una conserva sea correcta, debe ocurrir:

- Que después de la fase de incubación no existan modificaciones en el envase- Que después de la incubación no se observen modificaciones en el contenido- Que la validación del pH entre la conserva incubada y la testigo, sea igual o

inferior a 0.5 unidades- Que la variación del número y naturaleza de los elementos microbianos

observados al microscopio en la conserva incubada con respecto a la testigo sea inferior a 100.


- 1Pipeteador- 1 pH - metro- 1 Abrelatas o punzón de acero inoxidable estériles- 2 Pipetas de 1 ml estériles- Incubadoras a 35º C Y 55ºC



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- 12 Tubos de ensayo con 10 ml de caldo BHI con almidón- Portaobjetos- Agua clorada con 100 mg/kg – 300 mg*kg de Cloro libre o solución de yodo y alcohol

(2.5% m/v de Yodo de etanol).- Caldo BHI con 0.1% de almidón soluble- Asas bacteriológicas - Muestras de conservas de origen animal o vegetal (mínimo 2 iguales y del mismo lote)- 1 Embudo de vidrio estéril y 1 probeta- Algodón- 1 microscopio

5. Reactivos

- Cristal violeta - Azul De metileno- Fascina básica- Alcohol acetona

6. Procedimiento

- Proceda a realizar la inspección externa de los envases.- Posterior a la inspección, tome dos envases y envuélvalos en papel absorbente.

Incube uno de ellos a 35 ºC ± 2 ºC y el otro a 55 ºC ± 2 ºC durante 10 días. Examine todos los días los envases para ver si el papel está manchado o los envases estén abombados. En malquiera de los dos casos, se procede a retirar la muestra y se abre y examina el contenido.

- Pasado el tiempo de incubación, proceda a limpiar, desinfectar y abrir el envase guiándose por las indicaciones dadas en la fundamentación teórica de la guía. Los envases hinchados se atemperan durante 1 ó más horas antes de abrirlos, con el fin de disminuir la presión interna y el esparcimiento del contenido. Estos envases hinchados se manipulan como si tuviesen toxinas o patógenos, evitando cámaras de flujo horizontal que despidan aire sobre el manipulador (usar cámara de flujo vertical). Registrar olores extraños evitando olfatear directamente el envase.

- A continuación, tome 1 ó 2 ml ó gr de producto homogéneo e inocule esta cantidad en cada uno de los 12 tubos de caldo BHI con almidón (10 ml cada tubo). A seis de los tubos, adicione parafina estéril para conseguir anaerobiosis. Incube tres tubos aerobios y tres anaerobios a 35 ºC ± 2 ºC e igual número de tubos en las mismas condiciones atmosféricas a 55 ºC ± 2 ºC durante 72 horas.

- Realice el análisis microscópico directo, coloreando las placas con Gram. o tinción simple.

- Interpretación de resultados: Sí máximo en 1 (uno), tubo de los seis aerobios da positivo y ninguno anaerobio registra crecimiento, se reportará el informe como: Prueba de esterilidad comercial satisfactoria”. Si no se cumple la condición anterior se reportará como: “Prueba de esterilidad comercial insatisfactoria”.



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- Las muestras también pueden ser sembradas en otros medios líquidos o sólidos, con el fin de establecer la naturaleza de los microorganismos; el medio de cultivo debe ser muy nutritivo para que los microorganismos se desarrollen bien; el pH debe ajustarse al del alimento analizado.

Medios para el crecimiento de aerobios y que favorezcan el crecimiento de Bacillus spp.

Medios para crecimiento de anaerobios y que favorezcan el crecimiento de Clostridium spp.

Medios específicos para gérmenes de la familia Bacillaceae. Medios para mohos y levaduras, sobretodo en conservas de frutas y conservas

ácidas. Medios para el crecimiento de Lactobacillus spp, sobre todo en conservas de

fruta y otras conservas ácidas.

7. Nivel de Riesgo:

- 3 bata manga larga, guantes, zapato cerrado, gafas protectores, cofia, tapabocas- El materia biológico para descartar se empaca en bolsa, se marca y entrega al

auxiliar

8. Bibliografía







9. Anexos



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1. Titulo: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE EQUIPOS, SUPERFICIES, AMBIENTES Y MANIPULADORES

2. Objetivos:

2.1 Conocer las técnicas empleadas para hacer análisis de superficies, equipos, ambiente y manipuladores de alimentos.

2.2 Desarrollar destrezas para analizar y evaluar si las prácticas de limpieza y desinfección son efectivas en la industria alimentaria.

3. Marco teórico:

Para garantizar la calidad sanitaria de los productos alimenticios que se procesan en las fábricas de alimentos, estas deben tener implementados procedimientos adecuados de limpieza y desinfección, así como, adecuados y suficientes agentes detergentes y desinfectantes, que permitan mantener a la fábrica libre de focos de contaminación, y prevenir riesgos que puedan afectar la salud del consumidor.

Limpieza: Es el proceso de remoción de mugre (contaminantes) y prevención de la acumulación de restos de alimentos que pueden descomponer o soportar el crecimiento de organismos que causen deterioro al alimento o enfermedades al consumidor.

La limpieza se debe aplicar a todas las áreas de la planta, detectando puntos de control critico, con énfasis en especial en las superficies de contacto con alimentos.

Desinfección: Es la destrucción de microorganismos, presentes en una superficie. No siempre incluye sus formas de resistencia

Saneamiento: Reducción de las formas vegetativas de os microorganismos patógenos o perjudiciales para el alimento, hasta niveles seguros que permitan garantizar la inocuidad del alimento durante toda su vida útil.

ORIGEN DE LA CONTAMINACIÓN EN LAS INDUSTRIA DE ALIMENTOS

En la industria de alimentos se considera que la contaminación procede de:

1. La materia de contacto con los alimentos2. El aire3. El personal

Desinfección de superficies:

Antes de cualquier operación de desinfección, es necesario definir cual es el problema que se va a tratar para poder fijar tos parámetros de tos procesos de desinfección, lo cual



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incluye: la concentración del producto activo, la temperatura, el tiempo de contacto, la acción mecánica (cepillado, circulación, pulveración, remojo entre otras formas). Cada empresa debe fijar sus parámetros de desinfección, así como de limpieza. Adaptando un modelo de limpieza y desinfección acorde a las necesidades de la planta de producción.

El aire:La contaminación del ambiente procede de restos de alimentos, en el suelo o sobre las superficies, favoreciendo el desarrollo de microorganismos, de la manipulación de embalajes de cartón contaminados en su mayoría con esporas de mohos, de la contaminación generada por el personal, de las corrientes de aire y de las instalaciones de aire acondicionado que se encuentran en mal estado. Esta contaminación se puede reducir mediante el uso de radiaciones ultravioleta, filtración, uso de aerosoles, pulverizaciones o nebulizaciones que no precipiten rápidamente y que sean seguras para el personal y el alimento.

El personal:

Los operarios que trabajan en las industrias de alimentos, pueden transmitir microorganismos a los alimentos a través del cabello, la barba, la cavidad nasofaringea, la ropa, las manos y el calzado; en cada caso se produce una contaminación por diferentes microorganismos y de diferente procedencia. Las labores de desinfección enfocadas al personal son limitadas a: desinfección de las manos, con alcoholes o mezclas de ellos y a la desinfección de uniformes, particularmente las botas, petos, delantales, batas, con productos alcalinos o clorados.

MÉTODOS PARA EL CONTROL DE LA DESINFECCIÓN EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

Utilización de hisopos: La toma de muestras con hisopos se emplea mucho, sobre todo para el control de material en las salas de despiece, quesería, moldes, bandejas, válvulas, palas de agitadores y en general de superficies que entren en contacto con el alimento o donde se sospeche sea una fuente de microorganismos y donde el método sea factible de aplicación.

Métodos de enjuague: Utilizados para el control de circuitos, tanques, botellas, el inconveniente radica, en que en los sistemas cerrados no se logra establecer cual es el punto de contaminación, si es que el problema persiste en algún equipo.

Métodos de vaciado: Se utilizan para el control de recipientes pequeños, requiriendo de cierta experiencia para la distribución regular del medio, durante la operación de vaciado.

Métodos por impresión: Se adaptan bien a las superficies planas, los microorganismos son extraídos por contacto directo con el medio de cultivo. De esta forma se puede establecer la localización de los microorganismos en las superficies desinfectadas (método de placa RODACb).



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Control de aire con placas de medio de cultivo: El control se lleva a cabo exponiendo la superficie del medio de cultivo a la atmósfera seleccionada por un tiempo determinado (sedimentación).

Sistemas colectores de aire: Estos equipos toman un volumen de aire determinado en una unidad de tiempo determinada, proyectando el aire captado sobre la superficie de una placa de petri con un medio definido. Es una técnica significativa de la contaminación ambiental.


Muestras: Elegir un área de trabajo en las cual se puedan aplicar los controles de superficies, operarios, ambiente de trabajo.

- 5 Pipetas de 1 ml estériles - 2 Pipetas de 0.1 ml estériles- 5 tubos taparrosca con 10 ml de caldo nutritivo- 5 cajas de Petri estériles- 6 hisopos estériles- 1 plantilla de 5x5 cm2

- Incubadoras- 20 ml de Agar SPC fundido - 20 ml de Agar OGY fundido- 60 ml de EMB fundido - 2 cajas servidas de Baird Parker Agar - 2 cajas servidas de OGY Agar - 2 cajas servidas de SPC Agar

5. Reactivos

6. Procedimiento

Toma de muestras de superficies. Seleccione del lugar a trabajar un área de 100 cm2 y realice un hisopado, guiándose por las pautas dadas en la fundamentación teórica de la guía. Utilice los medios de cultivo apropiados para el análisis a realizar (conteo total de bacterias, mohos y levaduras, coliformes totales, E. coli y otros grupos de microorganismos).

Para la misma determinación, realice los métodos de enjuague con caldo nutritivo y técnica RODAC con los medios adecuados. Incube todos los análisis por el tiempo y temperatura adecuados.

Toma de muestras de aire. Seleccione del lugar de trabajo, un área, en la cual debe exponer la superficie de una caja de agar plate Count para conteo total de bacterias y



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de Ogy para recuento de mohos y levaduras (por sedimentación de microorganismos). Exponga las cajas durante máximo 15 minutos al ambiente y ciérrelas. Proceda a incubar por el tiempo y temperatura adecuados.

Toma de muestras a manipuladores. Con los hisopos previamente humedecidos con el caldo TAT, realice un frotis por las manos de los operarios, siguiendo las indicaciones dadas en la fundamentación teórica de la guía. Con estos, proceda a realizar los análisis de grupos de microorganismos que se desea detectar (Coliformes totales, E. coli, etc...). Con algunos de los hisopos con el frotis de las manos, realice directamente una siembra masiva sobre la superficie de la placa de petri con el medio apropiado para el análisis.

Reporte correctamente los resultados. Pasado el tiempo de incubación de todos los análisis realizados a las superficies, operarios y aire, proceda a realizar los conteos y reporte los resultados correctamente, guiándose por los criterios mencionados en los cuadros de la fundamentación teórica o en el anexo C. Los resultados deben en su totalidad estar tabulados.

NOTA: siempre tenga la precaución de marcar previamente los tubos, cajas y demás pruebas con la fecha, lugar, análisis, hora, temperaturas de incubación y demás información necesaria para el correcto desarrollo de las pruebas.

ANEXO A. EVALUACIÓN RÁPIDA DE PROCEDIMIENTOS DE L&D

Un ambiente limpio involucra procesos verdaderos que garanticen superficies y aire no contaminados; por el contrario pisos sucios, aire de baja calidad microbiológica, operarios que no cumplen con las BPM, crean las condiciones propicias para la contaminación del producto.

Para poder verificar si un programa de L&D está funcionando correctamente, existen dos tipos de pruebas que pueden aplicarse: las pruebas rápidas y los métodos tradicionales, sin embargo estos últimos requieren de tiempo y no permiten determinar en el momento si el proceso ha quedado en las condiciones óptimas para su utilización; dentro de estos sistemas el que ha tenido mayor aceptación, es la tecnología del ATP bioluminiscente.

Este método utiliza como principio, la capacidad de la enzima luciferasa (obtenida de luciérnagas), que en presencia del sustrato (luciferín), y utilizando como cofactor el ATP puede emitir luz, la cual puede ser cuantificada. La reacción generadora de luz en la luciérnaga es:

Luciferín + Luciferasa + ATP + Mg Luciferasa-luciferadenilato + pirofosfato

Luciferasa-luciferadenilato + O2 Luciferasa + oxiluciferín + AMP + Luz + CO2



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El sustrato luciferín, es fosforilado por la enzima luciferasa en presencia de ATP, molécula presente en todas las células vivas (bacterias, hongos, protozoos, animales, vegetales, etc…), la reacción química final es la producción de luz que es referida como bioluminiscencia. Esta técnica puede utilizarse para determinar si un equipo ha quedado bien higienizado, ya que puede detectar cantidades pequeñas de material orgánico vivo.

Los sistemas típicos de ATP, consisten en:

Luminómetro. Reactivos para realizar la prueba (buffer, enzima, sustrato, e hisopos). Impresora.

Existen algunos inconvenientes para correlacionar medicines de ATP (las cuales son expresadas en unidades relativas de luz URL), con el número de microorganismos:

1. La cantidad de ATP varía de un organismo a otro.2. La cantidad de ATP varía de acuerdo a la fase de crecimiento.3. La presencia de biopelículas hace difícil la cuantificación como células individuales.4. No se diferencian células de origen no microbiano.5. En la industria láctea existe la posibilidad de ATP libre, proveniente de los productos y

que pueden permanecer durante varios días en la superficie.6. El ATP libre puede sobrevivir a rangos de pH ácido a temperatura ambiente.

No obstante, todos estos inconvenientes se deben garantizar en los procesos de L&D.

Una limpieza efectiva que remueva los residuos alimenticios y una correcta desinfección que asegure la lisis y muerte celular microbiana, soportan la razón por la cual este sistema puede utilizarse como indicador del programa L&D.

¿Cuándo no debe utilizarse este sistema?

Cuando se desea detectar bajos niveles de bacterias (<10 ufc). Detectar la muerte microbiana. Cuando se pretende correlacionar URL con el número de bacterias o levaduras. En las manos de operarios, pues siempre se están eliminando células epiteliales.

Como cualquier técnica, se requiere un conocimiento del sistema para obtener datos confiables. Es importante recordar que los monitores de ATP son la primera línea de defensa; usualmente en plantas con superficies sucias, se encuentran tres tipos de ATP, por ello se debe recordar que las mediciones son del ATP total, es por esta razón que cada planta antes de poner esta método de detección debe estandarizar los valores de URL que puedan diferenciar entre superficies sucias e higienizadas correctamente.



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Es importante valorar dentro de una industria aquellos sitios donde es más difícil el proceso de L&D, como : bandas transportadoras, mesas de corte, cuchillas, equipos como despulpadoras, molinos, centrífugas de discos y en los servicios de alimentación, licuadoras y coladores.

En términos generales, los siguientes pasos, son los necesarios para utilizar el sistema de bioluminiscencia en una planta de proceso:

Se toma el escobillón, si la superficie está húmeda no se requiere de humedecer el hisopo previamente en la solución de enjuague; se pasa el hisopo por una superficie de 10 cm2, esta área muestreada siempre debe ser igual para reducir el error analítico.

Posteriormente se introduce el hisopo en el tubo de enjuague y se agita vigorosamente durante 10 segundos. Se coloca el dispositivo (varilla)m de reacción ( el cual contiene la enzima y el sustrato liofilizado, razón por la cual no reacciona ente sí), dentro del tubo del enjuague de manea que llegue hasta el fondo; posteriormente se libera el reactivo, se mezcla e inmediatamente se introduce la varilla en el luminómetro y se espera a que el equipo dé la lectura.

Como todo sistema novedoso, tiene el inconveniente del costo, sin embargo, cuando en un proceso se pueden tomar las medidas correctivas a tiempo, la inversión que se hace es baja, comparada con la calidad final del producto y los costos generados de productos elaborados en ambientes no adecuados.

7. Nivel de Riesgo:

- 2 bata de laboratorio manga larga, guantes, cofia, zapato cerrado, pantalón largo.- El materia biológico para descartar se empaca en bolsa, se marca y entrega al

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8. Bibliografía









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9. Anexos


PRODUCTO NORMA


AEROBIOS

MESÓFILOS

COLIFORMES

E. coli

MOHOS Y

LEVADURAS

S. aureus E..C.S.

R.

Bacillus

cereus

Salmonella spp OTROS

Planta ambientes EMP. PRIVADA 100 -- -- 30 -- -- -- -- --

Planta agua EMP. PRIVADA 100 0 -- -- -- -- -- -- --

Planta manos EMP. PRIVADA -- 100 -- -- -- -- -- -- --

Plantas manos (agua) EMP. PRIVADA -- 50 -- -- -- -- -- -- --

Planta superficies preproceso

EMP. PRIVADA 100 <10 -- -- -- -- -- -- --

Planta superficies proceso

EMP. PRIVADA 500 <10 -- -- -- -- -- -- --

Tabla 3. Algunos criterios microbiológicos para ambientes en plantas procesadoras de alimentos.

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