Duplicacin del ADN

En 1839, Schleiden y Schwann propusieron la Teora Celular estableciendo que cada organismo se compona de una o ms clulas y que cada nueva clula slo poda provenir de la divisin de alguna clula preexistente. Desde el comienzo de este siglo se sabe que en cada clula, los cromosomas portan la informacin gentica. El conocimiento desde los aos 50 de que el material gentico es el ADN y la elucidacin de su estructura, llev a preguntarse acerca de su replicacin. Hacia 1970 se conoca la composicin bsica de las clulas y entonces comenzaron a abordarse interrogantes sobre los detalles moleculares de los procesos individuales de la vida celular.

Con el modelo de la doble hlice de Watson y Crick se desarroll la idea de que las hebras originales deban servir de patrn para hacer la copia, aunque en principio haba tres posibles modelos de replicacin (figura 1):

1. Modelo conservativo: Propona que tras la replicacin se mantena la molcula original de DNA intacta, obtenindose una molcula idntica de DNA completamente nueva, es decir, con las dos hebras nuevas.

2. Modelo dispersivo: El resultado final son dos molculas nuevas formadas por hebras en las que se mezclan fragmentos originales con fragmentos nuevos. Todo ello mezclado al azar, es decir, no se conservan hebras originales ni se fabrican hebras nuevas, sino que aparecen ambas mezcladas.

3. Modelo semiconservativo o conservador (Figura 2): Esta teora fue propuesta por Watson y Crick, pero fueron Meselson y Stahl en 1958 quienes le dieron confirmacin experimental, incubando durante mucho tiempo clulas de la bacteria Escherichia coli en un medio que contena como fuente de nitrgeno el 15N (istopo). Al cabo de un tiempo todo el ADN microbiano era pesado (las bases pricas y pirimdicas estaban constituidas exclusivamente por 15N). A continuacin, algunas de estas clulas pesadas se pasaron a un medio

que contena nitrgeno ligero (14N) hasta que se duplicara la cantidad de clulas presentes (media hora aproximadamente). En este caso se pudo ver que todo el ADN formaba una nica banda, intermedia entre la posicin que hubiera ocupado el ADN pesado (integrado exclusivamente por 15N) y el ADN ligero (integrado exclusivamente por 14N). El experimento demostr que la replicacin es semiconservadora, dando dos dobles hlices hijas que contienen, cada una de ellas, una hebra pesada y una hebra liviana (Figura 2).

Fig 2

La hiptesis de la replicacin semiconservadora recibi an ms apoyo en la segunda parte del experimento: si se permita que nuevamente se duplicara la poblacin celular en el mismo medio de nitrgeno ligero (con 14N) se producan dos bandas, una correspondiente al ADN hbrido (con una cadena de 14N y otra de 15N) y otra de ADN exclusivamente ligero (producto de la replicacin de las cadenas ligeras en un medio que contena exclusivamente 14N).

Proceso en que la molcula de doble hlice del ADN se copia para producir dos molculas de doble cadena (Fase S). Consiste en un proceso complejo y altamente refinado. La clula enfrenta tres pasos importantes para llevara acabo el proceso de replicacin:

- Separara las dos molculas de ADN- Sntesis del ADN del extremo 5 al extremo 3- Evitar errores de replicacin

1Colegio Hispano AmericanoPadres EscolapiosDepto. De Ciencias BiologaUnidad 1 Gua 3Nivel: 4to medio

Modelo semiconservativo

Modelo conservativo

Modelo dispersivo

Figura 1

El proceso de replicacin posee algunas propiedades como:- Es semiconservativa- Es bidireccional- Secuencial y Ordenada- Utiliza sustratos activados - Exacta- Discontinua.

Duplicacin en Procariontes (E. coli)

En todos los organismos los requerimientos generales para la sntesis de ADN son los mismos:- una hebra de ADN como molde, en otras palabras una seccin de ADN que ser copiado.- la enzima encargada de copiar el ADN, llamada ADN polimerasa.

La sntesis del cromosoma de E.coli siempre comienza en el mismo punto, llamado sitio ori C, una regin de 245 pares de bases, en el cual se encuentran las bases Guanina, Adenina, Timina y Citosina juntas. En ese lugar, una enzima llamada Helicasa comienza a romper los puntes de hidrgeno que mantienen unidas las cadenas de DNA (estructura doble y helicoleidal), al romperse estos puentes, se separa esta molcula bicatenaria. Adems, actan otras enzimas como la Girasa que da giros negativos a la molcula de DNA y topoisomerasas que ambas, alivian la tensin de esta molcula, permitiendo el buen trabajo de la Helicasa (desdoblar y abrir el DNA). Gracias a la accin de las protenas llamadas SSB, las 2 hebras del DNA no se vuelven a juntar o formar la estructura de doble hlice, ya que mantiene separadas las hebras.

Al comenzar la separacin de las bases complementarias, se forma una burbuja de replicacin con dos horquillas, con la finalidad de realizar la replicacin en forma bidireccional (Figura 3), porque las dos cadenas de ADN son antiparalelas.

La duplicacin es un proceso complejo en la que participan muchas protenas. En bacterias, como E.coli, existen 3 polimerasas que sintetizan las hebras complementarias, para formar nuevamente el ADN bicatenario, que contiene una hebra nueva y otra vieja. ADN polimerasa I: Es una de las enzimas que es capaz de catalizar la sntesis de ADN. Esta enzima sintetiza en la direccin

5-->3. (reparacin del DNA)

ADN polimerasa II: Esta enzima sintetiza ADN en forma similar a la ADN polimerasa I, pero no tiene actividad exonucleasa 5 3, es decir, no remueve los segmentos partidores o moldes, para ser reemplazados por los nucletidos nuevos. (reparacin del DNA)

ADN polimerasa III: Enzima responsable de la sntesis de ADN en E.coli. (Principal participante en la polimerizacin de la cadena de ADN recin formada)

Todas las ADN polimerasas poseen una actividad exonucleasa; esto corresponde a la actividad de hidrolizar el ADN de hebra simple, removiendo desoxirribonucleotidos terminales desde el extremo 3 (actividad exonucleasa 3 5) o desde el extremo 5 (actividad exonucleasa 5 3). Todas las polimerasas tienen actividad POLIMERASA,es decir, unen los desoxirribonucletidos complementarios a partir de una hebra molde y EXONUCLEASA, es decir, elimina los nucletidos con bases mal apareadas.

La sntesis de ADN transcurre siempre en direccin 53 y es semidiscontinua (Fig. 4)

Una cadena nueva de ADN siempre se sintetiza en la direccin 53 Debido a que las dos cadenas de ADN son antiparalelas, la enzima que forma la nueva hebra (ADN polimerasa) lee la cadena que acta de molde desde el extremo 3 al 5. Si la sntesis transcurre siempre en la direccin 5 3. Recuerda que las hebras de ADN son antiparalelas y la cadena del ADN que va en direccin 3 5 es copiada directamente por la enzima ADN polimerasa III. La hebra hija sintetizada (5 3) es llamada HEBRA PRINCIPAL o ADELANTADA

Cmo se pueden sintetizar simultneamente las dos cadenas, si las dos hebras que constituyen el ADN estn dispuestas en sentido antiparalelo (opuesto)?

La respuesta la dio Reiji Okazaki en los aos 60, al encontrar que una de las dos cadenas se sintetiza en piezas cortas denominadas desde entonces fragmentos de Okazaki. Ello condujo a la conclusin de que una cadena se sintetiza continuamente y la otra discontinuamente. La cadena continua o cadena conductora es aquella en la que la sntesis 5 3 transcurre en la misma direccin que el movimiento de la horquilla de replicacin.

La otra hebra del ADN padre que tiene la direccin opuesta, 5 3, no puede ser copiada directamente, debido que la enzima es incapaz de trabajar en sentido contario y solamente puede ser sintetizada hasta que una parte del ADN se ha desdoblado. La hebra hija resultante se llama HEBRA RETRASADA y es sintetizada en forma discontinua.

Esta sntesis discontinua resulta de la formacin de cortas secciones de ADN que reciben el nombre de FRAGMENTOS DE OKASAKI. Estas secciones son unidas por la accin de la enzima ADN ligasa produciendo una hebra de ADN continua.

Para comenzar la sntesis de ADN se requiere la presencia de doble hebra como patrn-cebador. La segunda hebra corresponde a una hebra de ARN, llamada PRIMER o PARTIDOR y es sintetizada por una enzima llamada PRIMASA.

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Fig. 3

La regla principal para la actividad de la ADN polimerasa es que cataliza la formacin de un enlace fosfodiester solamente si la base entrante es complementaria al nucletido de la hebra padre. En otras palabras las ADN polimerasas son enzimas dirigidas por la hebra patrn o padre.

Como mencionamos anteriormente las ADN polimerasas I. II y III poseen la actividad exonucleasa que permite aumentar la fidelidad de la duplicacin o replicacin del ADN, removiendo los nucletidos que fueron puestos erradamente.

Resumiendo (Figura 5)

1 Etapa: Desenrrollamiento y apertura de la doble hlice en el punto de inicio

Primero: intervienen las enzimas helicasas que facilitan en desenrrollamiento Segundo: actan las enzimas girasas y topoisomerasas que eliminan la tensin generada por la torsin en el

desenrrollamiento. Tercero: Actan las protenas SSBP (Single strand-binding proteins) que se unen a las hebras molde para que no vuelva a

enrollarse.

2 etapa. Sntesis de dos nuevas hebras de ADN.Sntesis continua

Actan las ADN polimerasas para sintetizar las nuevas hebras en sentido 5-3, ya que la lectura se hace en el sentido 3-5. Intervienen las ADN polimerasas I y III, que se encargan de la replicacin y correccin de errores. La que lleva la mayor parte

del trabajo es la ADN polimerasa III La ADN polimerasa III es incapaz de iniciar la sntesis por s sola, para esto necesita un cebador o primer (ARN) que es

sintetizado por una ARN polimerasa (Primasa). Este cebador es eliminado posteriormente. La cadena 3-5(cadena conductora o continua) ya esta lista para ser leda por la ADN polimerasa III

Sntesis discontinua En la cadena 5-3 no puede ser leda directamente, esto se soluciona leyendo pequeos fragmentos de ella. Los

siguientes puntos resumen el proceso:o La primasa sintetiza varios cebadoreso La ADN pol III alarga los fragmentos de cebador incorporando nucletidos de 5` a 3` estos fragmentos tienen una

longitud aproximada de 1000 a 2000 nucletidos y se denominan fragmentos de Okazaki.o Posteriormente acta la ADN polimerasa I que gracias a sus funcin exonucleasa, retira los segmentos de ARN o

primer, y luego, gracias a su funcin polimerasa, rellena los huecos con ADN.o Finalmente la ADN ligasa sella las uniones entre los fragmentos independientes

3 etapa: Correccin de errores. La ADN polimerasa I y III, es quien corrige todos los errores cometidos en la replicacin o duplicacin, gracias a su actividad

exonucleasa. Al proceso se le denomina correccin de pruebas de la exonucleasa y sirve para incrementar la fidelidad de la sntesis.

Tabla I. Principales protenas de la duplicacin de E.coli.

Protenas FuncionesProtena N o dnaB Capacita a la primasa para comenzar la duplicacin Primasa Sintetiza el ARN partidor.Helicasas Desdobla la doble hlice.Protenas SSB Estabiliza regiones de hebra simple.ADN girasa Introduce giros a la superhlice.ADN polimerasa III Sintetiza el ADN.ADN polimerasa I Saca la hebra partidora y completa los espacios.ADN topoisomerasa I Corta una hebra de ADN.ADN topoisomerasa II Corta ambas hebras de ADN.ADN ligasa Une los extremos de los polinucleotidos preformados.

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Fig. 4: Movimiento de la

Fig. 5

La replicacin en las clulas eucariotas es ms compleja (Fig. 6)Las molculas de ADN de las clulas eucariticas son considerablemente mayores que las de las bacterias y estn adems

organizadas en estructuras nucleoproteicas complejas (ADN asociado a histonas), pero los rasgos esenciales de la replicacin son los mismos que en las clulas procariticas.

La replicacin en eucariotes tiene mltiples orgenes o burbujas de replicacin, tambin reciben el nombre de ojos de replicacin, a diferencia de los procariotas, es decir, presentan muchos Oris.

Por otro lado, existen cinco polimerasas en eucariontes son conocidas como alfa , beta , gamma , delta y psilon. Todos ellas tienen mecanismos de accin similares a las enzimas en procariontes (E.coli). Las ADN polimerasas alfa y delta son las encargadas de la duplicacin del ADN cromosomal. La ADN polimerasa beta consistente de una sola cadena polipeptdica es la responsable de la reparacin del ADN. La ADN polimerasa gamma se encuentra en mitocondrias y es responsable de la duplicacin del ADN mitocondrial. La ADN polimerasa psilon, enzima recientemente descubierta y su actividad es similar a la polimerasa delta.

La velocidad de las polimerasas en eucariontes es mucho menor que en procariontes. Para compensar esto, las clulas eucarioticas contienen ms de 20.000 molculas de enzimas. Adems, las clulas eucarioticas tienen un gran nmero de horquillas de duplicacin y fragmentos de Okasaki mas pequeos de 40 - 300 bases. De esta forma la velocidad de duplicacin del ADN es mayor en eucariontes.

La ADN polimerasa delta es la encargada de sintetizar la hebra principal o adelantada y la polimerasa alfa la hebra retrasada. El ADN en eucariontes esta unido con histonas, por lo tanto la duplicacin involucra dos pasos extras;

- Primero el ADN se debe disociar de las histonas para comenzar la duplicacin.

- La sntesis de histonas tiene lugar al mismo tiempo que la sntesis de ADN y las histonas se deben unir al nuevo ADN.

Algunos virus poseen otra forma de sintetizar ADN, debido que tienen una enzima llamada TRANSCRIPTASA REVERSA capaz de usar como hebra molde la molcula de ARN.

Fig. 6

Reparacin del DNA1. Actividad exonucleasas de las ADN pol.2. La mayora de las clulas del cuerpo entran primero en senescencia.3. Despus, tras daos irreparables en el ADN sobreviene la apoptosis y evitar que la clula se vuelva carcinognica.4. Cuando las clulas entran en senescencia, las modificaciones en la biosntesis y produccin hacen que funcionen de forma poco

eficiente, conduciendo inevitablemente a la enfermedad. La capacidad de reparacin del ADN de la clula es vital para la integridad de su genoma, de su funcionamiento normal y por extensin, de todo el organismo. Muchos genes que al principio parecan estar relacionados con una mayor duracin de la vida han sido relacionados con el mecanismo de reparacin y proteccin del ADN.

5. El fracaso al corregir lesiones moleculares en las clulas que forman gametos conduce a una descendencia con mutaciones, lo que puede afectar a la tasa evolutiva.

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Resumen de la replicacin