1.1 PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE ACIDOS NUCLEICOS:

CUANTIFICACIÓN POR ESPECTROFOTOMETRIA

EFECTO DE LA DESNATURACION POR ALCALI

I. INTRODUCCION

Los ácidos nucleicos absorben luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA o RNA. Esta característica es usada eficientemente para determinar su concentración.

El espectro de absorción es único de cada una de las bases y por lo tanto contribuyen de manera diferente en la absorción total de UV de una molécula de acido nucleico. La exposición de las bases nitrogenadas también provoca una variación de la absorción de UV y este efecto se aprecia en la denaturación de doble cadena de nucleotidos a simple cadena de nucleotidos

Para muchas aplicaciones, se puede ignorar el porcentaje de contribución de cada una de las bases al espectro de absorción de UV de una molécula de DNA de doble cadena de alto peso molecular (dsDNA). Sin embargo, esas contribuciones son mas significativas cuando se tratan de oligonucleótidos y deben ser consideradas si se requiere determinar correctamente la concentración.

Diferentes consideraciones para cuantificar los tipos de acido nucleico

Concentración de Oligonucleótido en pmol/µl

Los ácidos nucleicos tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de 260nm. A esta longitud por lo tanto, la absorción es proporcional a la concentración.

C (pmol/µl)= (A260 * 100 * Factor de dilución) / (1.54*nA + 0.75*nC + 1.17*nG + 0.92*nT)

En la fórmula:    C, es la concentración calculada en picomoles por microlitro (pmol/µl).    A260 es la absorbancia a 260nm.    El denominador consiste de la suma de los coeficientes de cada base multiplicados por el número de veces que aparece en el oligonucleotido.    El factor de dilución es igual a el volumen final de la dilución dividido entre la cantidad alicuotada para la dilución.

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Concentración de Oligonucleótido en µg/ml

   El valor de A260se convierte a µg/ml usando el coeficiente de extinción para ssDNA la cual es 1ml/33µg para una celda de 1cm  de longitud. Por lo tanto, para un valor de O.D. de 1.0, en principio la muestra contine 33µg de ssDNA por ml o en la ecuación:

   1unidad de O.D.de ssDNA=33µg

Concentración en µg/ml de ssDNA de Alto Peso Molecular.

    La concentración de ssDNA de alto peso molecular puede expresarse como pmol/µl, tomando en cuenta el promedio del peso molecular de un nucleotido en la molecula de DNA. que para ssDNA es 330 daltons.  (el termino "dalton" es una unidad definida como 1/12 de la masa atomica del 12C. El cual es utilizado como peso molecular expresado cuantitativamente como  g/mol).

Ejemplo:      el Bacteriofago de ssDNA M13mp18 consiste de 7250nucleotidos. Para expresar

esto como µg/pmol:

(7250nts)  330µg/mol   x  106µg   x _1mol___      =2.39µg/mol nt                g          1012pmol

Si diluyes tu stock de ss DNA M13mp18 a razon de 10µl/1000µl y da una lectura de A260 = 0.163, la concentración es:

(xµg/µl) / (0.163) = (33µg/µl) / (1.0 OD)   x= 5.38 µg/µl   multiplicando por (1000 µl/10 µl) = 538 µg ssDNA/ml 

Para convertir a pmol / µl:(538µg / ml ) (1pmol / 2.39µg )( 1ml / 1000µl ) = 0.225 pmol/µl

Concentración en µg/ml de dsDNA de Alto Peso Molecular.

    Para determinar  la concentración de ssDNA de Alto Peso Molecular, plasmidos o productos de PCR, se realizan mediciones a 260 y 280 nm. Concentraciones tan bajas como 2.5µg/ml pueden ser detectadas. A pH neutro, una solución de DNA a 1 mg/ml tiene una absorción máxima a 260nm de 20 cuando se lee en una celda de 1cm. (este valor es para moléculas de dsDNA con un contenido G+C de 50%. Sin embargo para muchas aplicaciones en Biologia Molecular el contenido de G+C no es necesario considerarlo a menos que sea muy extremo). En principio una solución de dsDNA con una concentración de 50 µg /ml debe tener una A260 i gual a1.0.

  1 (A260) unidad de dsDNA=50 µg /ml 

    Las proteínas tienen un máximo de absorción a A280 (principalmente por residuos de triptofano) las lecturas a esta longitud pueden mostrar si existe algún contaminante proteico. El cálculo de la relación A260 /A280 es una manera común para expresar la pureza del DNA. Dependiendo de la composición nucleica, un valor de 1.65 a 1.9 indican una muestra pura.

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    Debido a otros contaminantes una muestra con una relación alta de A260 /A280 puede no necesariamente producir buenos datos de secuencia. A veces también, una muestra con una  baja relación A260 /A280 puede secuenciarse bien.

    El método mas común de purificación de DNA es extrayendo la preparación con fenol para remover la proteína contaminante. El fenol tiene una absorción máxima a 270nm. Las preparaciones que contienen residuos de fenol pueden dar lecturas artificiales altas a A260  y la concentración de DNA será sobrestimada.

Midiendo la Concentración de RNA en µg/ml.

    La concentración de RNA  de determina por el mismo protocolo que el utilizado para la medición de DNA. Sin embargo se aplica la siguiente relación:

 1 unidad A260 de ssRNA = 40µg / ml 

Las preparaciones puras de RNA tienen una relación A260 /A280 de 2.0

II. OBJETIVOS

1 Estimar la cantidad de ácidos nucleicos empleando las técnicas de espectrofotometría2 Evidenciar el efecto de la desnaturación en medio alcalino.

III. PROCEDIMIENTO:

1. Encender el espectrofotómetro por 15 min la lámpara de UV 2. Hacer 2 preparaciones para cada muestra de acido nucleico a medir:

Para la primera dilución emplear 1950 µL de agua bidestilada, y 50µl de la solución de ácidos nucleicos a medir. Usar como blanco de referencia 2mL de agua bidestilada en una celda de cuarzo (una celda de plástico no trasmite eficientemente la luz ultraviloleta y por lo tanto NO debe utilizarse para este procedimiento).

Para la segunda dilución emplear 1850 µL de agua destilada, 100 µL de NaOH 0.1N (preparación fresca) y 50µL de la solución de ácidos nucleicos a medir. Usar como blanco de referencia 1900µL de agua bidestilada con 100 µL de NaOH 0.1N en una celda de cuarzo.

Mezclar bien y transferir a la celda de cuarzo que se utilizó para el blanco.

3. Leer la absorbancia a 260 y 280nm para cada preparación de cada muestra y calcule la concentración de ácidos nucleicos

4. Determine la pureza de cada muestra y comente sobre los resultados de la lectura.

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1.2 ELECTROFORESIS DE DNA

Electroforesis en geles de Agarosa

Buffer de Electroforesis: Buffer Tris Acetato (TAE)Concentración Stock (1 litro) 50XTris Base 242gAcido Acetico Glacial 57.1mL0.5M EDTA (pH 8.0) 100mL

Buffer de Carga 6XAzul de bromofenol 0.25%Xileno de Cianol FF 0.25%Sucrosa en agua 40% (w/v)

Preparación de Geles de Agarosa

1. Pesar 1.2g de agarosa y agregarla en 100ml de buffer TAE 0.5X en un frasco con tapa rosca.

2. Calentar la mezcla en horno microondas por 2min hasta que toda la agarosa este disuelta, recuerde abrir la tapa del frasco durante el calentamiento.

3. Enfrié el frasco en agua fría con movimiento constante, evite la gelificación.4. Selle los bordes del molde para evitar que la agarosa se derrame por los extremos

e impedir la mala gelificación.5. Agregue la agarosa disuelta en el molde y coloque los peines, evite la cobertura

total de los peines, el gel debe de ser de aproximadamente 3 a 5 mm de grosor.6. Remueva todas las burbujas presentes alrededor de los dientes del peine y a lo

largo del gel.7. Dejar gelificar de 30 a 45 min a temperatura ambiente8. Cuidadosamente remueva los peines y los selladores de los extremos del soporte,

evitando romper el gel.9. Prepare suficiente cantidad de buffer de electroforesis TAE 0.5X como para llenar

la cámara de electroforesis a manera que el gel quede cubierto aproximadamente en 1mm con el buffer.

10. Mezcle las muestras de DNA con el buffer de carga y cargue con una micropipeta en los pozos del gel.

11. Cierre la cámara electroforetica y coloque los electrodos la fuente de poder a manera que el DNA migre hacia el polo positivo.

12. Programe el voltaje y controle el tiempo necesario para la corrida electroforetica.13. Si la tapa de la cámara ha sido colocada correctamente usted podrá observar

burbujas saliendo de los electrodos, debido a la electrolisis.14. Pasado el tiempo necesario podrá observar las bandas correspondientes al azul de

bromofenol y del xileno de cianol.15. Apague la fuente de poder y remueva la tapa

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Visualizacion de la corrida electroforetica

La visualización se da dedido a la tinción con el tinte fluorescente: bromuro de etidio.Esta sustancia contiene un grupo plano que se intercala entre las bases del DNA.El bromuro de etidio por lo general se prepara en una solución stock de 1mg/ml en agua, este es guardado a temperatura ambiente en botellas oscuras o envueltas con papel aluminio. Se realiza una dilución 1/100 del stock (1ug/ml) para teñir el gel durante 5 minLavar el gel teñido por 5 min con agua.Visualizar el gel en el transiluminador UV.

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