Cátedra de Quimica Biológica

Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales

Universidad Nacional de Córdoba

22DOCENTES Profesora Titular: Dra María Angélica Perillo (Inv.Independiente CONICET))

Profesores Adjuntos: Dr. Daniel A. García (Inv.Adjunto CONICET)

Dr. Raúl H. Marín (Inv.Adjunto CONICET)

Jefes de Trabajos Prácticos Dra. Julieta María Sanchez (Inv. Asistente CONICET)

Dra. Anahi del V. Turina (Inv. Asistente CONICET)

Dra. Verónica Nolan (Inv. Asistente CONICET)

Biól. Eduardo M. Clop (Becario doctoral CONICET)

Biol. Jackelyn M. Kembro (Becaria doctoral CONICET)

Biol. Benjamín Caruso (Becario doctoral CONICET)

Biol. Mariela E. Sánchez (Becaria doctoral SeCyT-UNC)

Becarios Biol.Pedro D.Clop (Becario doctoral Foncyt)

Biol.Gabriela Reiner (Becaria doctoral CONICET)

Biol. Natalia Corvalan (Becaria doctoral CONICET)

Adscripto Biol. Leonardo Fruttero

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PROGRAMA ANALÍTICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA.

1. La lógica molecular de la vida Diversidad biológica y unidad bioquímica. Generalidades sobre metabolismo celular. Obtención, almacenamiento, liberación y utilización de la energía. Ubicación subcelular de la actividad metabólica; fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial. Macromoléculas y ensambles supramoleculares: caracterización; papel del agua, efecto hidrofóbico e importancia de las interacciones débiles (puente de hidrógeno, van del Waals) en su estructura y función. Propiedades coligativas de disoluciones acuosas. Superpoblación molecular: efectos sobre la actividad del agua y sobre la actividad y difusión de los solutos. 2. Evolución Bioquímica Composición química de la materia viva. Evolución prebiótica. Ribozimas. Evolución: desde la información unidimensional de la secuencia (ADN) a la información tridimensional de la función (proteína). Transferencia de información biológica a nivel molecular (ADN- ARN- Proteína; gradientes de carga y de materia) y de la dinámica estructural (cambios conformacionales en proteínas, catástrofe microtubular, el citoplama celular como una matriz de percolación de dimensión fractal). Evolución de la estructura: molécula, agregados supramoleculares, compartamentalización, aparición de gradientes y de bombas. Mecanismos de transducción de energía y de señales. Evolución de la complejidad. Patrones bioquímicos: metabolones. 3. Estructura y función de las Proteínas Equilibrios ácido-base en aminoácidos. Unión peptídica. Proteínas: estructura primaria, secundaria (α-hélice, hoja β, giros, bucles), terciaria (motivos: patrones de clasificación estructural) y cuaternaria. Plegamiento: cooperatividad, estabilización progresiva. Desplegamiento. Cambios conformacionales y actividad. Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas (precipitación selectiva, cromatografías de intercambio iónico, filtración molecular y de afinidad). Electroforésis: determinación de la masa molecular, número de protómeros y localización de puentes disulfuro. Ultracentrifugación. Secuenciación de proteínas. MALDI-TOFF. Inmunodetección y cuantificación, ELISA, “Western blot”. Síntesis en fase sólida. Determinación de estructura tridimensional: RMN (unidimensional y NOESY), dicroismo circular, fluorescencia, difracción de Rayos X. Cuantificación de proteínas. 4. Ácidos nucleicos y flujo de información genética Estructura química de los ácidos nucleicos. Bases púricas y pirimídicas. Nucleósidos y nucleótidos: nomenclatura. Acido desoxirribonucleico (ADN): estructura primaria, secundaria y terciaria. Estructura de los ácidos ribonucleicos: mensajero(ARNm), de transferencia(ARNt) y ribosomal (ARNr). Duplicación del ADN, Transcripción de ADN en ARN, Procesamiento del RNA, intrones y exones, Código genético. Virus: tipos ADN-virus y ARN-virus de uno y de dos filamentos. replicación. Virus oncogénicos. El bacteriofago λ: mecanismo de integración al genoma de la celula huesped. Oncogenes. Viroides. Plásmidos. 5. Investigación en genética Ingeniería genética: aplicaciones y obtención del gen: por corte del ADN con endonucleasas de restricción, por síntesis orgánica en fase sólida y a partir del ARNm. Secuenciación por interrupción controlada de la replicación. Amplificación: PCR. Tecnología del DNA recombinante: Unión de segmentos de ADN de distinto origen: método de las colas homopoliméricas. Vectores: plásmidos semisintéticos y derivados del bacteriofago λ: características deseables. Introducción del vector a la célula huésped (transformación). Selección del clon con el ADN recombinante y clonado. Manipulación de genes de eucariotas, bibliotecas de genes a partir de ARNm. Niveles de expresión génica, chips de genes (microarrays). Animales transgénicos. Mutagénesis dirigida para producir proteínas nuevas. 6. Investigación en evolución Relaciones evolutivas a partir de secuencias de proteínas. Homologías de secuencias: secuencias alineadas, significación estadística (“shuffling”), matriz de sustitución, bancos de datos para detectar secuencias homólogas. Estudio de estructuras tridimensionales. Gráfico autodiagonal (autoalineamiento) para detectar secuencias repetidas. Relación estructura/función: evolución divergente y convergente. Construcción de árboles evolutivos. Evolución molecular en el laboratorio. 7. Bioenergética Estados de equilibrio y estados estacionarios. Entropía y vida. Bioenergética: cambios de energía libre de una reacción. Relación entre la constante de equilibrio y el cambio de energía libre estandar. Cálculo del

44cambio de energía libre estandar y el cambio de energía libre de una reacción redox. Reacciones acopladas. Energética del transporte activo. Compuestos con alto potencial de transferencia de fosfato: factores que influyen en el cambio de energía libre estandar durante la hidrólisis. 8. Enzimología Enzimas clasificación y nomenclatura. Ribozimas. Cofactores. Coenzimas: definición: estructura química y clasificación. Coenzimas de oxido-reducción: nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP), flavina adenina dinucleótido (FAD), coenzima Q (CoQ) y ácido lipoico. Coenzimas que transfieren grupos fosfato; que transfieren grupos acilo: Coenzima A (Co A). Que transfieren grupros glicosilo. Que intervienen en reacciones de decarboxilación: piridoxal fosfato y biotina. Otras coenzimas. Vitaminas hidrosolubles que forman parte de coenzimas. Vitaminas liposolubles, estructura y función. Estrategias catalíticas. 9. Cinética Enzimática Mecanismo de la actividad enzimática. Cinética. Reacciones monosustrato: el modelo de Michaelis- Menten; determinación de la Km y Vm por el método deLineweaver-Burk. Activadores e inhibidores. Tipos de inhibición. Análogos del estado de transición. Anticuerpos catalíticos (reconocen el estado de transición). Reacciones bisustrato: de desplazamiento simple y desplazamiento doble. Estrategias reguladoras: enzimas alostéricas (cinética y modelos), isozimas, modificación covalente, escisiones proteolíticas. 10. Glúcidos y Lípidos Glúcidos: Monosacáridos, carbohidratos complejos, glicoproteínas, lectinas. Lípidos: lípidos de membranas, balance hidrofílico-hidrofóbico, estructuras de autoagregación. 11. Biomembranas Estructura y función de la membrana biológica. El modelo del mosaico fluido. Membranas internas de células eucariotas. Membranas de células procariotas. Tipos de movimientos de las moléculas constituyentes. Difusión (FRAP, SPT). Fluidez (anisotropía) y curvatura. Efectos de factores físico-químicos y de la composición. Proteínas de membrana: extrínsecas, ancladas, intrínsecas. Predicción de secuencias transmembrana a partir de la estructura primaria. Secuencias señalizadotas de direccionamiento de proteínas. Fusión de membranas. 12. Transporte Difusión: Difusión facilitada. Transporte activo.:Las bombas de Na+, K+ y Ca2+. Cotransporte y contratransporte. Antibióticos de transporte. Medidas de conductancia: platch clamp. Sinapsis. Potenciales de acción. Canales activados por voltaje. Canales activados por ligando. Nexus o uniones íntimas. 13. Transducción de la información Receptores de superficie. Curvas de saturación. Receptores ionotrópicos. Receptores 7TM. Segundos mensajeros. Conversación cruzada. Sistema nervioso. Ultraestructura de la sinapsis. Teoría química de la transmisión nerviosa. El potencial de membrana. Liberación, recaptación y degradación de los neurotransmisores. Unión mioneural. El receptor nicotínico de acetilcolina: inhibidores. La acetil coilinesterasa: inhibidores. Receptores de otros neurotransmisores. 14. Metabolismo Metabolismo: visión de conjunto. Reacciones aclopladas. El ATP como divisa universal de energía libre. Potencial de transferencia de grupos fosfato. Potencial de fosforilación. Motivos recurrentes en las vías metabólicas. Transportadores activados. Evolución de las vías metabólicas. Oxidaciones biológicas. Enzimas de oxido-reducción: Clasificación y ejemplos. Metabolismo del superóxido. Glucólisis : reacciones, consumo y generación de ATP a nivel de sustrato. Generación de NADH. Balance energético. Destinos del piruvato: formación de acetil-CoA, de etanol y de lactato. Entrada de fructosa y galactosa. Gluconeogénesis : reacciones. Ciclo de Cori: rendimiento de ATP del lactato. 15. Ciclo de Krebs Ciclo de Krebs o de los ácidos tricarboxílicos (TCA): reacciones, formación de coenzimas reducida y ATP a nivel de sustrato. Acoplamiento de las reacciones. Interacción de los metabolismos de glúcidos , lípidos y proteinas. rendimiento de ATP en la oxidación total de glucosa. Ciclo del glioxalato. 16. Fosforilación oxidativa.

55Fosforilación oxidativa. Ubicación submitocondrial. Cadena Respiratoria Componentes. Niveles de formación de ATP. La hipótesis quimio-osmótica. Motores moleculares: ATPsintasa. Bioenergética. Regulación de la fosforilación oxidativa. Inhibidores. 17. Metabolismo de glúcidos Via de las pentosas-fosfato. Biosíntesis del ácido ascórbico. Degradación intracelular del almidón y del glucógeno: reacciones. Digestión. Interconversión de hexosas. Biosíntesis del glucógeno, almidón y celulosa: reacciones. Regulación del metabolismo del glucógeno via AMPc. Biosíntesis de disacáridos. 18. Fotosíntesis Fotosíntesis: ecuación global. Ubicación del proceso en el cloroplasto, pigmentos. Reacción de Hill. Las reacciones luminosas: fotosistemas I y II. Cadena transportadora de electrones. Formación de ATP y NADPH. Bioenergética. Mecanismo de formación de ATP. Reacciones enzimáticas: ciclo de Calvin. Eficiencia de la fotosíntesis. 19. Metabolismo de lípidos Biosíntesis y degradación de los triglicéridos, glicerofosfolípidos y esfingolípidos. Biosíntesis del colesterol a partir de acetato. Formación de colecalciferol y ácidos biliares Metabolismo de los ácidos grasos, degradación por � -oxidación de ácidos grasos saturados de cadena par e impar y de ácidos grasos insaturados. Balance energético. � y �oxidación. Ubicación subcelular. Biosíntesis: sistema del citosol, reacciones. Sistemas microsomal y mitocondrial. 20. Metabolismo de amino ácidos Metabolismo de los aminoácidos. Ciclo de fijación del nitrógeno. Degradación de los aminoácidos: reacciones de tipo general: desaminación por transaminación, desaminación oxidativa, desaminación no oxidativa y descarboxilación, ejemplos. Transporte del amoníaco. Ciclo de la urea: reacciones. Los aminoácidos como precursores de otras biomoléculas: metabolismo del triptofano, fenilalanina, tirosina, histidina y glutamato. Glutatión. Porfirinas. Biosíntesis del Hem. Hemoglobinas A, F y A2. Derivados de la hemoglobina: oxihemoglobina, carboxihemoglobina, metahemoglobina y carbohemoglobina. Degradadción de la hemoglobina. Formación de pigmentos biliares. 21. Metabolismo de ácidos nucleicos Síntesis de novo de pirimidinas. Biosíntesis de bases púricas y desoxiribonucleótidos. Síntesis de NAD+, FAD, Coenzima A. Uratos. Replicación, recombinación y reparación del DNA, polimerasas, topoisomerasas y helicasas. Fragmentos de Okazaki. Síntesis de DNA en eucariotas, ciclo celular, telomerasa. Síntesis y maduración del RNA. El ribosoma como estructura desupramolecular. 22. Metabolismo de proteínas Biosíntesis de proteínas. Codigo genético: características. Formación de aminoacil-ARNt. Mecanismo de la síntesis de proteínas: etapas de iniciación, elongación y terminación. Modificaciones post-traduccionales. Antibióticos inhibidores. Endo y Exopeptidasas. Tipos de mutaciones. 23. Integración metabólica y control de la expresión génica Regulación metabólica. Control de la expresión genética en procariotas. Ooperón lac y operón trp: inducción y represión. Control en eucariotas. Regulación por modificación de la actividad de la enzima: activación por precursor e inhibición por producto final. Regulación hormonal. Hormonas de mamíferos: bases moleculares del mecanismo de acción. Receptores de hormonas de estructura esteroide, peptídica y derivada de aminoácidos. Endocitocis y reciclo de los receptores. Hormonas vegetales y de insectos. 24. Inmunoquímica Inmunoquímica. Inducción de anticuerpos específicos. La unión Ag-Ac. Heterogeneidad de los anticuerpos. Estructura química de las inmunoglobulinas. Teorías sobre la formación de anticuerpos. 25. Bioquímica de sistemas sensoriales Olfato, gusto, visión, audición y tacto, aspectos bioquímicos. Receptores y mecanismos de transducción de señales involucrados. 26. Motores moleculares NTPasas de lazo P. Mecanismo de la contracción muscular, asociación cíclica de la actina y miosina. Microtúbulos, tubulina, quinesina y dineína. Movimiento flagelar en bacterias, motor rotativo; quimiotaxis.

66PROGRAMA SINTÉTICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA . 1. La lógica molecular de la vida 2. Evolución Bioquímica 3. Estructura y función de proteínas 4. Ácidos nucleicos y flujo de información genética 5. Investigación en genética 6. Investigación en evolución 7. Bioenergética 8. Enzimología 9. Cinética Enzimática 10. Glúcidos y lípidos 11. Biomembranas 12. Transporte 13. Transducción de la información 14. Metabolismo 15. Ciclo de Krebs 16. Fosforilación oxidativa 17. Metabolismo de glúcidos 18. Fotosíntesis 19. Metabolismo de lípidos 20. Metabolismo de amino ácidos 21. Metabolismo de ácidos nucleicos 22. Metabolismo de proteínas 23. Integración metabólica y control de la expresión génica 24. Inmunoquímica 25. Bioquímica de sistemas sensoriales 26. Motores moleculares TRABAJOS PRACTICOS TP 1: Espectrofotometría. TP 2: Purificación, cuantificación y análisis estructural de proteínas TP 3, 4 y 5. Cinética Enzimática TP 6: Fotosíntesis. TP 7: Mecanismos de transducción de energía OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA. Al terminar el curso el estudiante deberá: • Adquirir una clara comprensión del metabolismo celular a la luz de conceptos de:

- Mecanismos de transducción de energía y de información. - Termodinámica, cinética y catálisis de reacciones bioquímicas - Importancia de la compartamentalización en la generación de gradientes químicos y

electroquímicos. - Modulación dinámica de la estructura y función de biomembranas, proteínas y de la organización

compleja del citoplasma - Vías metabólicas fundamentales y su integración - Patrones bioquímicos y su evolución

• Desarrollar del pensamiento crítico. • Adquirir destreza en el uso de metologías del laboratorio bioquímico BIBLIOGRAFIA Bioquímica General - Blanco, A. Química biológica, Ed.El Ateneo, 2006. - Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996*. - Harper, H.A, Manual de Química Fisiológica. Ed. El manual moderno 1980* - Horton, R.H, Moran, L.A., Ochs, R.S., Rawn, J.D., Scrimgeour, K.G. Bioquímica. Ed.Pentice Hall,

Hispanoamericana, SA. Mexico, 1995, 1999*. - Lehninger, Albert L.. Principios de bioquímica . 2ºEd., Omega, Barcelona, 2001.

77- Nelson, David L.. Lehninger : principios de bioquímica .3º Ed., Omega, Barcelona, 2001. - Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, 5º Ed., Reverté SA, España, 2003. - Torres, H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioquímica General. Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983*. - Voet D., Voet JG, Pratt C.W. Fundamentos de Bioquímica. La vida a nivel molecular, Ed. Médica

Panamericana. 2006. - Walker, J. M.. Biología molecular y biotecnología .2º Ed. Acribia, Zaragoza, 1997. Problemas - Esteban J.M. y Cavanillas J.M.. Problemas de Química. Ed. Alhambra. 4a. España. 1976. - Holme, David J. . Resolución de problemas de bioquímica analítica, Acribia, Zaragoza, 1996. - Segel I.J. Cálculos en Bioquímica. Acribia. Saragoza. España. 1972.

Bibliografía de consulta sobre temas específicos Química General, Química Orgánica y Química-Física - Atkins, P.N y M.J Clugston. Principios de Fisicoquímica. 1986. Addisson-Wesley. Ed. Iberoamericana.

México. - Atkins, P.W. Fisicoquimica. Ed. Addison-Wesley Iberoamericana, S.A. Wilmington, Delaware, USA.1991 - Brown, T. L., LeMay, H. E. y Bursten, B.E.. Química, La Ciencia Central. Prentice-Hall

Hispanoamericana, S.A., Quinta Edición. 1993. - Morris, J.G. Fisicoquímica para biólogos. Ed. Reverté. Barcelona. 2002. - Whitten, W.K y K.D Gailey. Química General. Ed. Interamericana. México. 1986. Biofísica-Química y Biología Celular - Alberts, B. . Biología molecular de la célula , 3º Ed., Omega, Barcelona, 1996-2002. - De Robertis, E.M.F.. Biología celular y molecular de Eduardo D. P. De Robertis .12º Ed., El Ateneo,

Buenos Aires, 1998. - Estrada Cerqueda, C.. Cinética del transporte a través de membranas, Ed. Blume, Madrid, 1976. - Grigera, J.R. Introducción a la biofísica del agua, Eudeba, Buenos Aires, 1976. - Maggio B. Introducción a la biofísico-química. Ed.Gonzalez Truccone. Córdoba, Argentina. 1987*. - Vicente Córdoba, C.. Biofísica, Ed.Síntesis, Madrid, 1992 Cinética enzimática - Segel I.H.. Enzyme kinetics. Behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme

systems. Wiley Classics Library Editions. Wiley Intersci.Pub., New York. 1993*. - Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimología. Ed Aguilar. 1967. - Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI Fotosíntesis - Andreo C., Vallejos R. Fotosíntesis. Serie Biología, monografía no 30 OEA, 1984. - Hall D.O., Rao K. Fotosíntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977. - Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977. Análisis Bioquímico e Instrumental - Gore M.G.. Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Ed. Oxford University

Press. Inc. NY. USA. 2000. - Henry RJ, Cannon D.C. y Winkelman J.W. Química Clínica: Bases y Técnicas. Tomo I. 2a Ed. Jims.

Barcelona. España.1980*. - Willard H.H. Merritt Jr. .L, y Dean J.A.. Métodos Instrumentales de Análisis. Ed. CECSA. México. 1974. - Skoog D.A. y West D.M.. Análisis Instrumental. Ed.Interamericana. México. 1975. - D'Ocon Navaza, María Carmen. Fundamentos y técnicas de análisis bioquímico, Paraninfo, Madrid,

1999. Bibliografía especializada - Aon M.A. and Cortassa S. Dynamic Biological Organization. Fundamentals As Applied To Cellular

Systems. Chapman and Hall, London, UK. 1997*. - Daune, M.. Molecular Biophysics. Structures in motion, Oxford University Press, Oxford. 1999*. - Makishima, Shoji. Pattern dynamics : a theory of self-organization, Ed. Kodansha Scientific, Tokio, 2001. La bibliografía citada está disponible en la Biblioteca “Ricardo Lutti" (Centro) de la FCEFyN, UNC. * disponibles en la Cátedra de Química Biológica.

88CRONOGRAMA

CLASES TEÓRICAS: Comienzan: 11de marzo Finalizan: 26 de junio

Sem

ana

CLASES TEÓRICAS Aulas 219 o 218

TRABAJOS PRÁCTICOS

Laboratorio 13 Miércoles

1215-1415 hs Aula 219

TEMA Viernes 10-12 hs Aula 218

TEMA 1o Semana Comisiones

1-3-5

2o Semana Comisiones

2-4-6

1 11/03/09 La lógica molecular de la vida 13/03/09 Metabolismo.

Evolución Bioquímica

2 18/03/09 Proteínas 20/03/09 Proteínas TP 1 Espectrofotometría

3 25/03/09 Ácidos nucleicos 27/03/09 Investigación en genética

TP 1* Espectrofotometría

4 01/04/09 Investigación en evolución / Bioenergética 03/04/09 Cinética Enzimática TP 2*

Proteínas

5 08/04/09 Cinética Enzimática 10/04/09 Feriado (Semana Santa)

TP2 Proteínas *

6 15/04/09 Enzimología 17/04/09 Glúcidos / Lípidos TP3 Cinética I

7 22/04/09 Biomembranas 24/04/09 Transporte TP3 Cinética I

8 29/04/09 Transducción de señales 01/05/09 Feriado (Día de Trabajador)

TP4 Cinética II *

9 06/05/09 Glicólisis

Gluconeogénesis Glucógenolisis

08/05/09 Interconversión de hexosas; Vía de las

pentosas

TP4 Cinética II

10 13/05/09 Ciclo de Krebs Cadena Respiratoria 15/05/09 PRIMER EXAMEN

PARCIAL

TP5 Cinética III y Seminario 1

11 20/05/09 Fotosíntesis 22/05/09 Fotosíntesis / Ciclo de Calvin

TP5 Cinética III y Seminario 1

12 27/05/09 Metabolismo de lípidos 29/05/09 Metabolismo de lípidos

TP6 Fotosíntesis

13 03/06/09 Metabolismo de

aminoácidos/ Biosíntesis de Nucleótidos

05/06/09 Biosíntesis de ácidos nucleicos

TP6 Fotosíntesis

14 10/06/09 Biosíntesis de proteínas 12/06/09 Regulación de la expresion génica

TP7 Transducción de energía y Seminario 2

15 17/06/09 Integración metabólica / Inmunoquímica 19/06/09 Bioquímica de

sistemas sensoriales

TP7 Transducción de energía y Seminario 2

16 24/06/09 SEGUNDO EXAMEN PARCIAL 26/06/09 Recuperatorio TP

y FIRMA REGULARIDAD

01/07/09 Recuperatorio Ex.Parciales

99CONDICIONES PARA EL CURSADO Correlativas regularizadas: Química Orgánica y Física I. TRABAJOS PRÁCTICOS Concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, calzado adecuado (cerrado) y cabello recogido. No podrá realizar el TP aquel alumno que concurra sin estos elementos mínimos de seguridad personal. ASISTENCIA: Clases Teóricas: no obligatoria Trabajos Prácticos: 80% obligatoria ACTIVIDADES Clases teóricas: Exposición. Discusión de problemas teóricos. Trabajos prácticos: Resolución de problemas. Trabajos de laboratorio. Seminarios de discusión de trabajos científicos. EVALUACIONES I. Trabajos Prácticos: a) Evaluación oral durante el desarrollo del TP. Se tendrá en cuenta: desempeño, destreza, atención, participación,

puntualidad, y la presentación de Trabajos Científicos (cuando corresponda). b) Una evaluación escrita al final de cada TP. El resultado de la evaluación estará disponible en el TP siguiente. II Exámenes Parciales: Se tomarán 2 (dos) exámenes parciales sobre temas desarrollados en clases teóricas y prácticas. Los alumnos deberán inscribirse para rendir estos parciales durante la semana previa al parcial (al final de las clases teóricas). La inscripción no es personal. CONDICIONES PARA LA REGULARIZACIÓN Desempeñarse satisfactoriamente durante los TP (item a) y aprobar el 80% de los TP (6 de las 7 evaluaciones escritas de los Trabajos Prácticos (item b). Las evaluaciones de los TP se aprueban con el 60% de las respuetas correctas o alcanzando el 60% de los contenidos de TP. CONDICIONES PARA LA PROMOCIÓN: Correlativas Aprobadas (al comenzar el cursado): Química Orgánica y Física I Aprobar el 80% de los TP Alcanzar un promedio de 7 puntos entre ambos Exámenes.Parciales, con una nota no inferior a 4 puntos. RECUPERATORIOS (al final del cuatrimestre) Se podrá recuperar: - Un TP que haya resultado reprobado, para alcanzar las condiciones indicadas más arriba. En caso de inasistencia, podrá recuperarse el TP, sólo por causa debidamente justificada, en alguna Comisión donde el mismo aún no se hubiera dictado. En el caso de inasistencias no habrá recuperatorio al final del cuatrimestre.. - Un examen parcial (por cualquier razón: inasistencia, reprobado o para aumentar nota). FIRMA DE REGULARIDADES Se realizará el mismo día y horario del recuperatorio de TP. La firma de libretas se realizá unicamente ese dia. El trámite no es personal.

1100NORMAS BASICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS1 INDICE Pág. 1. ORGANIZACIÓN DEL TRABAJO 11 2. HABITOS PERSONALES 11 3. MANIPULACIÓN EN LABORATORIOS. 12 4. MEDIOS DE PROTECCIÓN 14 4. ACTUACIÓN EN CASO DE ACCIDENTES 14 5. TELÉFONOS IMPORTANTES 15 TEMAS 1. ORGANIZACIÓN DEL TRABAJO • La organización del laboratorio, debe ser estudiada a fondo y procurar que sea adecuada para el mantenimiento de un buen nivel preventivo.

• No debe trabajar nunca una persona sola en el laboratorio fuera de horas habituales, por la noche o en operaciones con riesgo.

• Cuando se realicen operaciones con riesgo, incluso las personas que no intervengan en ellas deben estar informadas de las mismas.

• Deberá trabajarse en las campanas extractoras siempre que se manipulen productos tóxicos, inflamables y/o que se desprendan en el proceso. En éstas deberá comprobarse periódicamente el funcionamiento del extractor, su estado general, el cumplimiento de los caudales mínimos de aspiración, que su uso sea el adecuado, etc.

• La programación de trabajos con productos químicos, deberá ir acompañada de la adopción de medidas preventivas que se requiera en cada caso.

• Deberá comprobarse la ventilación general del laboratorio. • Los reactivos almacenados en el laboratorio deben preservarse del sol, no guardarse en estanterías altas, cuidar su etiquetado y mantenerlos en las cantidades imprescindibles. No deberá haber botellas con líquidos inflamables, incluso las botellas empezadas o los reactivos preparados con mezclas de productos inflamables. Ha de controlarse que las botellas una vez utilizadas, se cierren correctamente.

• Está prohibido fumar, beber y comer en los laboratorios. • Los envases para recuperar se enjuagarán y colocarán, sin taponar, para el posterior proceso de lavado.

• No se permitirá la presencia de personas no autorizadas y debidamente informadas de los riesgos inherentes en el laboratorio.

2. HABITOS PERSONALES • Mantener en todo momento guardapolvos, camisas y vestidos abrochados. • No abandonar objetos personales en mesas de trabajo o poyatas. • No comer o beber en los laboratorios. • No guardar alimentos ni bebidas en las heladeras del laboratorio. • No fumar en los laboratorios. • Llevar recogidos los cabellos. • No llevar pulseras, anillos, colgantes o mangas anchas que pudieran engancharse en los montajes.

• Los guardapolvos no deberán llevarse a lugares de asistencia común como son las bibliotecas, cafeterías, salas de reuniones, comedores etc.

1 Extraído de “Seguridad y condiciones de trabajo en los laboratorios” del CSIC-España.

1111• No es aconsejable guardar la ropa de calle en la mesada del laboratorios, para lo cual deberá disponerse de armarios o lugares específicos fuera del área de trabajo.

• Es recomendable usar gafas de seguridad cuando se manipule con productos químicos líquidos de cualquier tipo en ebullición.

• Si la naturaleza del trabajo lo requiere, el personal del laboratorio deberá utilizar los medios de protección adecuados.

• No utilizar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidentes por salpicaduras de productos químicos o sus vapores, al pasar por detrás de las lentes, podrían provocar lesiones en el ojo antes de retirarlas. En estos casos se recomienda el uso de gafas graduadas.

• Si un producto químico salpica a los ojos, utilizar inmediatamente un lavaojos y lavarlos durante 15 minutos sin interrupción. Actuar con urgencia en menos de 10 segundos. No dirigir una corriente de alta presión directamente al ojo porque podria lesionarse. Es necesario mantener los ojos abiertos con ayuda de los dedos para el lavado debajo de los párpados.

• Lavarse las manos: antes de abandonar el laboratorio, siempre que se quiten los guantes protectores y después de toda operación que haya comportado el posible contacto con material irritante, cáustico, tóxico o infeccioso.

• Para secarse las manos, en vez de toallas es preferible el uso de papel desechable o secadores de aire.

• La persona que al término de la jornada sea la última en abandonar el laboratorio deberá asegurarse que los procesos que no queden en funcionamiento, las conducciones de agua y gas estén cortadas, la energía eléctrica desconectada y que el local se encuentra en un estado que excluya el riesgo de incendio.

3. MANIPULACIÓN EN LOS LABORATORIOS Laboratorios con riesgo químico • Toda persona que manipule un producto químico, deberá tener conocimiento de sus características físico-químicas y toxicológicas.

• Deberán conocerse, como mínimo, las frases de riesgo y seguridad (R y S ) de los productos. • Como norma general, cualquier manipulación de una sustancia química deberá realizarse dentro de las vitrinas de laboratorio.

• No llenar los tubos de ensayo más de la mitad de su volumen total. • Calentar los tubos de ensayo de lado y utilizando las pinzas. • Utilizar en todo momento gradillas y soportes. • Tomar los tubos de ensayo con los dedos, nunca con las manos. • No llevar tubos de ensayo ni productos en los bolsillos. • No calentar nunca un recipiente totalmente cerrado. Cuando se caliente, dirigir siempre la abertura en dirección contraria a uno mismo y a las demás personas cercanas.

• Transportar los productos en bandejas o recipientes para evitar derrames en caso de roturas.

• No oler productos químicos si no se está debidamente informado . • No tocar con las manos ni probar los productos químicos. • En caso de producirse una contaminación se limpiará la zona y no podrá utilizarse hasta tener seguridad de su descontaminación utilizando los productos adecuados en cada caso y que deben conocerse previamente.

• No tocarse ninguna parte del cuerpo, material o instrumental con los guantes contaminados. En el caso de que esta circunstancia hubiera ocurrido, limpiar con los productos adecuados y eliminar los elementos utilizados en la limpieza, como residuos tóxicos.

• No efectuar pipeteos con la boca. Se realizará con peras de goma para pipetas o pipetas de seguridad.

• No trabajar separado de la mesa. • Para el encendido de mecheros, utilizar encendedores piezoelectricos; no emplear fósforos ni encendedores de bolsillo.

• Los mecheros no deberán dejarse encendidos sin vigilancia. • Asegurarse del enfriamiento de los materiales antes de aplicar directamente las manos

1122para tomarlos.

• Al finalizar una tarea u operación, recoger materiales, reactivos, equipos, etc, evitando las acumulaciones innecesarias y dejando la zona de trabajo en las debidas condiciones de limpieza.

• Al terminar el trabajo, asegurarse de la desconexión de los aparatos, agua, gases, etc. • Emplear y almacenar sustancias inflamables en las cantidades imprescindibles. • Deberá ponerse especial cuidado en cerrar botellas y frascos inmediatamente después de su utilización.

• No transportar frascos o recipientes tomados por la tapa o tapón. • Siempre que sea posible se trabajará en bandejas con el fin de confinar un posible derrame. Será muy conveniente forrar con papel de filtro dichas bandejas.

• Siempre que sea necesario, deberán utilizarse guantes específicos para los productos que se manipulan.

• Los guantes y todo material contaminado con productos tóxicos y /o infecciosos deberán descontaminarse y/o esterilizarse antes de ser eliminados. Cuando no se utilicen guantes en la manipulación de sustancias químicas, las manos deberán lavarse frecuentemente. Al finalizar la sesión de trabajo, es aconsejable un lavado cuidadoso antes de abandonar el laboratorio. • Las puertas de los laboratorios deberán permanecer cerradas durante la jornada de trabajo. • Deberá mantenerse la limpieza y el orden en los laboratorios en todo momento. • Deberán mantenerse libres los espacios de trabajo, así como las zonas de paso y salida de los recintos.

• No utilizar nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento. • Antes de comenzar un experimento asegurarse de que los montajes y aparatos están en perfectas condiciones de uso. Ante cualquier mínima duda consultar con el responsable del trabajo.

• Los trapos o materiales ensuciados con aceite o sustancias inflamables deberán colocarse en recipientes cerrados que deberán vaciarse diariamente y su contenido será neutralizado.

• Las instalaciones, aparatos e instrumentos destinados a reparación, deberán enviarse limpios, sin trazas de sustancias químicas nocivas.

• Antes de utilizar sustancias inflamables deberemos asegurarnos de que no hay cerca mecheros encendidos, calentadores etc.

• No debe dejarse sin vigilancia ningún tipo de reacción química. • Al finalizar un experimento los productos deberán etiquetarse y colocarse en lugar seguro. • Las sustancias cuya disolución sea exotérmica, deberán disolverse por porciones, agitando y enfriando continuamente.

• Durante la destilación de sustancias inflamables de bajo punto de ebullición, deberá controlarse la llegada de agua al refrigerante y alejar del aparato cualquier otra materia inflamable.

• Cuando se derrame alguna sustancia combustible se procederá a: - Apagar el mechero, si ha lugar. - Cortar la corriente eléctrica en el exterior del laboratorio. - Asegurar una ventilación eficaz. - Se absorberá el líquido con un cuerpo poroso que posteriormente se depositará en un lugar sin peligro. - Se eliminará como residuo tóxico. • Las sustancias químicas deberán estar colocadas en recipientes con materiales adecuados y etiquetados debidamente. Los recipientes deberán estar cerrados.

• Los recipientes que contengan líquidos deberán estar protegidos contra la acción directa de los rayos solares o contra el calentamiento.

• Los metales alcalinos como sodio o potasio deberán conservarse con una capa protectora de un solvente con un punto de ebullición elevado (petróleo, aceite de parafina) y el fósforo blanco con una capa de agua.

• Los productos incompatibles deberán guardarse separadamente. • Los recipientes que contengan productos agresivos no deberán almacenarse a una altura superior a sesenta y cinco cm. Y serán recipientes de pequeña capacidad para su fácil manejo.

1133 4. MEDIOS DE PROTECCIÓN • El trabajo en laboratorios requiere la utilización de guardapolvos, que en trabajos con riesgo deberá considerarse el tejido de los mismos.

• Los guardapolvos deberán tener los puños ajustados a las muñecas. Asimismo, deberán estar cerrados en la parte delantera y en el cuello.

• Tener siempre a disposición las gafas de seguridad. Es recomendable el uso permanente de las mismas. Estas serán de uso personal.

• Utilizar los guantes adecuados para cada tarea que requiera el uso de tales prendas. • Conocer la protección brindada por los distintos equipos de protección individual para las vías respiratorias.

• Conocer la aplicación de los productos de primeros auxilios del botiquín y los mecanismos para recibir posibles ayudas exteriores.

• Mantener en condiciones de uso las duchas de emergencia y lavaojos. • Conocer y ensayar el funcionamiento de equipos extintores. 5. ACTUACIÓN EN CASO DE ACCIDENTES 5.1 Derrames . Líquidos inflamables Absorber con carbón activado productos específicos. Alejar cualquier foco de calor. . Ácidos Neutralizar con bicarbonato o emplear productos específicos comercializados para su neutralización o absorción. Si por casualidad se ha producido un derrame sobre la piel, el remedio inmediato sería exponer la zona afectada al chorro de agua del grifo durante cinco o diez minutos. Las duchas de emergencia serán utilizadas en los casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande. Es necesario quitar la ropa contaminada de la persona afectada mientras esté bajo la ducha. Si se produjesen quemaduras se precisará la asistencia médica. No utilizar cremas ni pomadas grasas en las quemaduras graves. .Bases Emplear productos específicos comercializados para su neutralización y absorción. .Otros líquidos no corrosivos ni inflamables Absorber con aserrín. 5.2. Salpicaduras. En piel y ojos Deben lavarse con abundante agua (si es en los ojos, mediante un lavaojos). No intentar neutralizar. Acudir al médico con prontitud. En la ropa Debe quitarse rápidamente la ropa, lavándola , o colocarse bajo la ducha, según la magnitud de la impregnación. Si hay contacto con la piel, lavar la zona afectada y acudir al médico. 5.3. Cortes Se deberán lavar con abundante agua corriente durante diez minutos como mínimo. Si son pequeños y dejan de sangrar en poco tiempo, Lavar con agua y jabón y taparlos con una venda o apósito adecuados. Si son grandes y no dejan de sangrar, se requiere asistencia médica inmediata. 5.4. Ingestión Si es un ácido o una base. Beber abundante agua, salvo que la sustancia ingerida reaccione con ella. No provocar el vómito, salvo indicación expresa.

1144Disponer de información sobre los productos que se manipulan, consultando a un servicio de información toxicológica cuando sea posible. Si la persona está inconsciente, Ponerlo en posición inclinada con la cabeza de lado y estirarle la lengua hacia fuera. Taparlo para que no coja frío. Acudir al médico con una etiqueta del producto. 5.5. Inhalación Conducir a la persona afectada a un lugar con aire fresco. Al primer síntoma de dificultad respiratoria, iniciar la respiración artificial boca a boca. Tratar de identificar el vapor tóxico. 5.6. Incendio Dar la alarma inmediatamente Apagar los fuegos pequeños tapándolos sin utilizar agua. Escoger adecuadamente el tipo de extintor, recordando el modo de empleo y la duración de la carga. No utilizar nunca sobre una persona. Si prende fuego la ropa: -Tenderse en el suelo y rodar sobre si mismo para apagar las llamas. No correr ni intentar llegar a una ducha de emergencia salvo que esté muy cercana. -Se le cubrirá con una manta apagafuego, llevarle a una ducha de emergencia o hacerle rodar por el suelo. Una vez apagado el fuego, mantener a la persona tendida procurando que no coja frío y proporcionarle asistencia médica. Si se evacua el laboratorio, cerrar las puertas al salir. .Comportamiento ante un incendio en un local donde existan botellas de gases La elevada temperatura provoca un aumento de la presión interna de la botella pudiendo explotar. Las botellas que puedan activar el fuego no deberán abrirse, cerrando las que estén en servicio. Siempre que se pueda se desalojaran de la zona del incendio y si se han calentado se refrigeraran con chorro de agua fría para disminuir la presión interna, avisando de ello al suministrador. En caso de intervenir el Cuerpo de Bomberos se les advertirá de la presencia de éstas indicándoles, cuantas son, donde están y contenido. 6. TELÉFONOS IMPORTANTES En todos los laboratorios debe haber un listado telefónico con los Centros de URGENCIA que enumeramos a continuación, el cual será de conocimiento general.

ECCO (visitantes y alumnos) 44666666 4686868 BOMBEROS 100 SEGURIDAD INTERNA

ART (Docentes y Becarios SeCyT) EMI 4149093 (Becarios CONICET) La Caja 0-800-8880200

Taxi 4650303

1155

NORMAS BÁSICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS

Completar, firma, cortar y entregar al Jefe de Trabajos Prácticos en la primera clase práctica. Los contenidos serán objeto de evaluación en el primer TP.

He leído las NORMAS BÁSICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS incluidas en la Guía de Trabajos Prácticos de Química Biológica (Ciencias Biológicas-Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales-Universidad Nacional de Córdoba) y estoy al tanto de las medidas de seguridad de trabajo en el laboratorio. Nombre y Apellido: …………………………………………………………….. DNI: ………………………………. Nº de Matrícula: …………………………………… Firma: ……………………………………………………………..

1166

1177

TRABAJO PRACTICO Nº 1

ESPECTROFOTOMETRÍA

OBJETIVOS: - Conocer los fundamentos teóricos y las aplicaciones de la espectrofotometría. - Comprender las propiedades que deben reunir los métodos experimentales de análisis. - Adquirir destreza en el manejo del espectrofotómetro. - Valorar la importancia del dominio de técnicas auxiliares para poderlas aplicar con criterio ante los problemas planteados. TEMAS PARA REPASAR: - Disoluciones. - Estequiometría. - Luz. Teoría ondulatoria. Teoría cuántica. - Ondas electromagnéticas. longitud, frecuencia, período de una onda y unidades en que se miden. Relación entre velocidad, longitud de onda y frecuencia. Energía de ondas electromagnéticas.

PROPIEDADES DE LOS MÉTODOS QUÍMICOS DE ANÁLISIS Exactitud: es el grado en que la medida promedio se aproxima al valor real. La determinación de la exactitud se logra comparando los resultados observados con el valor real. Expresa la corrección de una medición. Precisión: es el error debido al azar, la variación de los resultados obtenidos con una técnica cuando la misma muestra se analiza repetidamente. Expresa la reproducibilidad de una medición. Cuanto menor sea la variación observada, mayor es la precisión. Sensibilidad: es la variación mínima en la cantidad de un compuesto que puede ser detectada, o la mínima cantidad significativamente diferente del blanco. Especificidad: es la propiedad del método de medir sólo la especie química en estudio, sin la interferencia de otras que puedan estar presentes. Todo método exacto es preciso, pero un método preciso no es necesariamente exacto.

ERRORES EN LAS MEDICIONES DE LABORATORIO Error: es la diferencia entre el valor observado y el real, es decir, la combinación del error sistemático y el error debido a la falta de precisión. Los errores pueden dividirse en dos clases: 1) errores determinados, 2) errores indeterminados. Errores determinados: son aquellos cuya magnitud puede determinarse: a) errores instrumentales y debidos a aparatos y reactivos: balanza y pesas, aparatos volumétricos, material de vidrio calibrado, reactivos, etc.; b) errores operativos: son de naturaleza física, asociados con manipulaciones en un análisis. c) errores personales: errores operativos del analista. d) errores del método: tienen origen en las propiedades químicas y fisicoquímicas del sistema analítico. Errores indeterminados o aleatorios: son pequeñas fluctuaciones en los sucesivos valores de una cantidad medida. No son evitables ni previsibles por parte del observador. Pueden tratarse por métodos

Los problemas y la guía de estudio deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En caso de necesitar aclarar dudas los docentes estrán disponibles en sus horarios de consulta, en la cátedra. Los alumnos serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante el desarrollo de la experiencia práctica (evaluación oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP. Deberán concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

1188estadísticos. Dada una cantidad de datos el analista puede estimar la incertidumbre introducida por errores aleatoreos y concluir con respecto al efecto de esos errores en un resultado analítico.

ESPECTROFOTOMETRÍA

La espectrofotometría es una técnica que permite medir la absorción de radiación electromagnética, ultravioleta y visible de numerosas especies químicas inorgánicas y orgánicas, para su análisis cuali y cuantitativo. Las moléculas son capaces de absorber radiaciones electromagnéticas. Tanto la longitud de onda de la radiación absorbida como la eficiencia con que se absorbe, dependen de: • la estructura de la molécula y • el medio en que se halla. En el proceso de absorción de la radiación, un fotón incidente cede su energía a una molécula, lo que da lugar a la excitación de la misma que pasa a un nivel de energía superior: h.ν A A* A = molécula absorbente A* = molecula absorbente en estado de excitación energética. h.ν = energía de un fotón donde h= Constante de Planck y ν : frecuencia de radiación. Los estados excitados de los átomos o moléculas son de vida media corta (10-9 s) y, en consecuencia, la molécula en estado excitado vuelve rápidamente al estado fundamental. Comunmente, la energía es liberada al medio como calor, pero en ciertos casos la especie química excitada puede sufrir un cambio (reacción fotoquímica) o emitir parte de la energía absorbida como radiación electromagnética de longitud de onda mayor a la incidente (fluorescencia o fosforescencia).

LEYES DE LA ABSORCION

Cuando la luz atraviesa una muestra, sólo una fracción de ella es transmitida. La proporción de luz transmitida se denomina Transmitancia (T) y se calcula de la siguiente manera: T = I / I0 Donde I = la intensidad de luz transmitida por la muestra I0 = la intensidad de luz incidente La transmitancia toma valores entre 0 – 1. También se expresa como porcentaje si se multiplica por 100 y sus valores están en el rango de 0-100%: %T = (I / I0 ) x 100 La relación (I / I0 ), también puede ser expresada como luz absorbida en lugar de luz transmitida. En ese caso nos referimos a la Absorbancia (A) de una muestra. La Absorbancia es adimensional, varía en el rango de 0 - ∞ y se define como: A = log 1/T = log10 (I0 / I)

1199Por sustitución se comprueba que la absorbancia y el porcentaje de transmitancia están relacionados mediante la siguiente expresión: A = log (100 / %T) A = 2 - log( % T) LEY DE LAMBERT: ¨La fracción de luz absorbida por un medio transparente es independiente de la intensidad de luz incidente, y cada capa sucesiva del medio, absorbe una fracción igual de la luz que pasa a travez de él¨. Esto lleva a un decaimiento exponencial de la intensidad de luz a lo largo del paso óptico en la muestra, que puede ser expresado matemáticamente como sigue: Log10 (I0/I) = A = K b Donde b = la longitud del paso óptico de la cubeta de espectrofotometría y K es una constante del medio, que fue descifrada por Beer. LEY DE BEER: ¨La cantidad de luz absorbida es proporcional al número de moléculas de cromóforo que la luz atraviesa¨. La constante K, es proporcional a la concentración de cromóforo (c) : K = a c , donde a es la absortividad o coeficiente de absorción, una propiedad del cromóforo en sí misma. La absortividad a es una constante que depende de: • la longitud de onda de la luz incidente, • la identidad de la sustancia analizada y • del medio en que ésta se encuentre (pH, solvente e interacción con otras sustancias) La constante a representa la probabilidad de absorción a una longitud de onda determinada La LEY DE LAMBERT Y BEER queda resumida entonces, en la expresión: Log10 (I0/I) = a c b A = a c b Cuando el paso óptico está expresado en cm y la concentración en M, la absortividad se denomina ¨coeficiente de extinción molar o absortividad molar¨ (ε), entonces sus unidades son M-1 cm-1. Cuando b=1 cm, la absorbancia se denomina Densidad óptica (DO) DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE SOLUTO EN UNA SOLUCIÓN Dadas una disolución de concentración desconocida a la que llamaremos “problema” y otra disolución de concentración conocida a la que llamaremos “testigo”, aplicando la ley de Lambert y Beer a cada disolución se obtienen las siguientes expresiones: Ap=a.b.cp At=a.b.ct Dado que el “problema” y el ”testigo” son disoluciones de una misma sustancia cuyos valores de absorbancia se determinan a la misma λ , los valores de absortividad serán iguales. Además, dado que se utiliza la misma cubeta para medir la A, los valores de b también serán iguales. En consecuencia:

2200Dividiendo m.a.m. a.b.cp Ap.ct Ap/ At = __________ podemos simplificar a y b, y al despejar queda: cp= a.b.ct At

donde Ap= absorbancia del problema. cp = concentración del problema. At= absorbancia del testigo. ct = concentración del testigo. CURVA DE CALIBRACIÓN Una curva de calibración es un gráfico de A o %T en función de la concentración de soluto; su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentración del absorbente. En general se grafica A en función de la concentración (Fig.1a) pero, hay instrumentos que sólo miden %T (Fig.1b). En éste caso, deben transformarse las lecturas de %T en valores de A, mediante el empleo de la ecuación A = 2 - log( % T). Alternativamente, puede trazarse el gráfico de %T en función de la concentración en papel semilogarítmico (Fig.1c). De otro modo, resultaría difícil utilizando un número limitado de puntos obtenidos experimentalmente, comprobar gráficamente si la lectura sigue o no la ley de Lambert y Beer . Fig.1: Curvas de Calibración Por consideraciones del error fotométrico, debe procurarse que los puntos situados entre valores de A de 0,1 y 1,0 (10% y 80% T) sean representados de la forma más exacta posible al trazar la gráfica. Las escalas del sistema de registro del aparato son: lineal para %T y logarítmica para A: por éste motivo, el error en las lecturas de %T es constante en toda la escala, lo cual no ocurre con la A. Sin embargo, debido a que A y concentración se relacionan proporcionalmente, en la práctica se lee A. En equipos con visores digitales, es posible trabajar con disoluciones con 0,1>A>1,0, como se indica más arriba. En los equipos donde los valores de A se determinan de acuerdo a la posición de una aguja que se mueve sobre una escala (galvanómetro), la aplicación de esta técnica se limita a muestras que produzcan lecturas comprendidas entre 0,1 y 0,3, dado que en este rango de valores aún es posible interpolar datos en la escala logarítmica. Valores menores pueden estar por debajo de la sensibilidad del equipo y, a valores mayores, las menores divisiones de la escala son muy pequeñas y la apreciación de las lecturas resulta poco precisa. ESPECTRO DE ABSORCIÓN Las soluciones absorben energía preferentemente en una ó más regiones del espectro electromagnético, siendo la absorción inferior o nula en las demás regiones. Se denomina Espectro de absorción a la representación gráfica de la probabilidad de absorción en función de la longitud de onda. El espectro de absorción se determina midiendo la absorbancia a distintas longitudes de onda para establecer la longitud de onda de máxima absorción (λ max). En el siguiente ejemplo, la λ max es aproximadamente 420nm (indicada por la fecha).

Concentración (mg/ml)

A

Concentración (mg/ml)

% T

Concentración (mg/ml)

%T

Papel semilogarítmicoa b c

2211 ESPECTROFOTÓMETRO Las mediciones de absorbancia se realizan en un espectrofotómetro, que básicamente consta de una fuente de luz, un monocromador para seleccionar la longitud de onda, una cubeta transparente para contener la muestra, un detector de intensidad luminosa y un sistema de registro (Fig. 3).

Fig. 3. Esquema de un espectrofotómetro MEDICION DE LA ABSORBANCIA 1) Si tenemos una solución coloreada de concentración desconocida, la denominamos tubo problema. Podemos conocer su concentración midiendo la absorbancia en el fotocolorímetro o espectrofotómetro a una longitud de onda apropiada. 2) Previamente a la lectura, el aparato es llevado a cero de absorbancia con un tubo que contiene solvente sin la sustancia problema y se denomina blanco. Este tubo puede contener varias sustancias, además de disolvente, a la misma concentración en que se encuentra en el tubo problema, excepto la sustancia que se desea cuantificar. Por ej. si la sustancia coloreada problema se encuentra disuelta en agua conteniendo NaCl al 1% e KOH al 2%, el tubo blanco contendrá NaCl al 1% e KOH al 2% en agua, sin la sustancia en estudio. La finalidad de usar el tubo blanco es descontar la absorción de sustancias que no sean específicamente la sustancia problema y así poder medir la absorbancia propia de la sustancia en estudio. 3) Un tercer tubo que denominamos testigo corresponde a una solución de concentración conocida de la sustancia en estudio. Se prepara disolviendo una cantidad conocida de soluto en un volumen conocido de solvente conteniendo las mismas sustancias que la solución problema: por ej. NaCl al 1% e KOH al 2% para el caso que se está analizando. Se lee al espectrofotómetro, llevado previamente a cero de

Long onda (nm)

300 350 400 450 500A

bsor

banc

ia

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

λλmmaaxx

Sistema de Registro

Fig. 2. Espectro de Absorción

2222absorbancia con el blanco, de la misma forma que se hizo con el tubo problema. Finalmente, la concentración del tubo problema se puede calcular mediante la interpolación del valor de absorbancia en una curva de calibración (para lo cual es necesario la preparación de varios tubos testigos) o mediante la comparación con un testigo. 4) Lo descripto en los puntos anteriores es válido para medir la concentración de sustancias incoloras siempre que estas sustancias sean capaces de reaccionar con otras, dando productos de reacción coloreados y que el color finalmente obtenido sea proporcional a la concentración de la sustancia en estudio. El tubo blanco, el cual no contiene la sustancia que desarrolla color, deberá ser tratado de forma similar al tubo problema y a los testigos, es decir tendrá los mismos reactivos y se los procesará de forma similar y paralela a los otros tubos. Hay sustancias incoloras que tienen la propiedad de absorber la luz ultravioleta; en estos casos pueden ser cuantificadas sin tratamiento previo, midiendo la absorbancia a una λ comprendida entre 200 y 400 nm (correspondiente al rango de luz ultravioleta).

GUIA DE ESTUDIO 1. Observe el esquema del espectro electromagnético de la Fig.4 y compare c (velocidad), λ (longitud de

onda), ν (frecuencia) y energía de la radiación electromagnética indicada. 2. Defina luz blanca y luz monocromática. 3. ¿Qué tipos de monocromadores conoce ? 4. ¿Qué efecto produce la absorción de la luz por una molécula? 5. ¿Existe alguna restricción con respecto a la longitud de onda de la luz que una sustancia puede

absorber? 6. ¿Cuál es la utilidad de un espectro de absorción? 7. Concepto de ley de Lambert y Beer. 8. Definición de absorbancia y transmitancia. 9. ¿Cómo se preparan y qué utilidad tienen los tubos blanco, testigo y problema? 10. ¿Cómo construye y qué utilidad tiene una curva de calibración ? 11. ¿Cómo elige la longitud de onda de trabajo? 12. ¿Cuál es el fundamento químico del método de Biuret para cuantificar proteínas? Fig. 4: Espectro Electromagnético

2233

Color λ (m) x 107 ν (Hz) x 10-17

Violeta 3.90 – 4.55 7.69 – 6.59

Azul 4.55 – 4.92 6.59 – 6.10

Verde 4.92 - 5.77 6.10 – 5.70

Amarillo 5.77 – 5.97 5.70 – 5.03

Naranja 5.97 – 6.22 5.03 – 4.82

Rojo 6.22 – 7.80 4.82 – 3.84

PROBLEMAS 1- Una disolución de proteínas de concentración desconocida, se diluye 5 veces con agua destilada. A

partir de esta dilución, se vuelve a diluir 3 veces con agua destilada. Esta última dilución dió por método Biuret una absorbancia de 0,12 (testigo de concentración = 4 mg/ml, dió 0,25 de absorbancia).¿Cuál es la concentración de la solución original de proteínas? R = 28,8 mg/ml.

2- Una solución de proteínas de concentración desconocida, dió por método de Biuret una A = 0,09

(testigo de concentración 4mg/ml dió A = 0,25 ).De dicha solución se desea tomar 100 ug. ¿ Qué volumen de dicha solución se debe pipetear? R = 69 µl.

3- Interprete el significado de las sig. curvas de calibración para la cuantificación de proteínas por el

método de Biuret. ¿ Cuál de ellas corresponde a un esquema de trabajo correcto?

Concentración (mg/ml)

4- Los datos de la Tabla 1 corresponden a absorbancias de una solución de flunitrazepam 25 µM en etanol 3% V/V y

en tris HCL 50 mM, pH 7,4 medidos a diferentes longitudes de onda:

λ 210 220 250 260 270 280 290 320 330 340 350 360 370

A 0.2 0.604 0.446 0.407 0.320 0.286 0.272 0.250 0.190 0.120 0.070 0.040 0.020 a)Grafique el espectro de absorción y coloque el título correspondiente. b)¿Qué longitud de onda elegiría para realizar una curva de calibración? c)¿ Cómo se preparó el tubo blanco? d)¿ Es necesario descontar el blanco cada vez que se cambia la longitud de onda? Si-No. J.S.R. 5- El siguiente es un protocolo de trabajo para la cuantificación de ADN en base a su contenido de

desoxirribosa empleando el reactivo de difenilamina.

Absorbancia 1

2

3

.E hν= cνλ

=

.h cEλ

=

2244

Blanco Testigo Problema

NaCl 1M 1ml

ADN 100µg/ml

en Nacl 1M

1 ml

ADN [ ] desc en

NaCl 1M

difenilamina 2ml

Volumen final

a) Complete los espacios en blanco. b)¿ Por qué coloca NaCl 1M y no agua destilada en el blanco? c)¿ Cómo realizaría una curva de calibración si sólo cuenta con una solución de ADN de 100 µg/ml? d)¿ Qué precauciones debe tener al elegir las concentraciones de los testigos? e)¿ Cómo corregiría este protocolo en los casos en que: 1-la absorbancia del problema sea >> 0,3 y 2- la absorbancia del problema sea << 0,1 ? f)¿ Por qué deben tener todos los tubos igual volumen final? 6- Calcular la absorbancia que corresponde a cada uno de los siguientes valores de transmitancia: a) 0% b) 0,2% c) 0,8% d) 1,52% e) 68%. 7- Calcule el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol si A = 0,2 y la concentración es 11.428 µoles/l,

λ= 410 nm y b = 1 cm. R = 17.500 8- Se cuantificó una solución de tirosina por absorción al UV. Esta solución dio A = 0,16 ; calcule la

concentración nM de tirosina considerando que dicha solución había sido diluida primero 3 veces y luego 2 veces más. ε = 14.000 l.mol-1 . cm-1 , λ = 274 nm. R = 6,85.10-5 M.

9- Una solución de una sustancia de PM 600 a una concentración de 40 µg/ml tiene A = 0,3 a 540 nm,

medida en una cubeta de 1 cm de paso óptico. Calcule el coeficiente de extinción molar. R = 4.500 10- Una solución contiene dos flavonoides : flavonoide 1 (F1) y flavonoide 2 (F2). Se quiere cuantificar

ambos sin una purificación previa. Analizando la Fig. 6 se observa que entre 220 nm y 420 nm sus espectros se superponen, por lo tanto la cuantificación de cualquiera de ellos interfiere con la del otro. A longitudes de onda superiores a 420 nm sólo absorbe F1. Calcule la concentración molar de F1 y F2 en ésa solución sabiendo que:

Testigo de F1 Testigo de F2 Solución problema (mezcla de F1/F2)

c1 = 15 µM c2 = 15 µM c1 = ? c2 = ?

A350 = 0,105 A350 = 0,195 A350 = 0,25

A450 = 0,293 A450= 0,3

Respuesta:

• concentración de F1=1,54.10-5 M.

• concentración de F2=1,09.10-5 M.

0

FF11

FF22

Abs

orba

ncia

250 300 350 400 450 500

Longitud de onda (nm)

2255 EJERCITACION ADICIONAL 1- Calcule el número de moles, micromoles y milimoles que hay en 2g de Na(OH) (PM=40). 2- ¿Qué cantidad de glucosa (PM=180) tiene que pesar para preparar 200 ml de una solución 0,05 M? R = 1,8 g. 3- ¿Qué volumen de una solución 10 mM se puede preparar con 1 g de glucosa (PM=180). R = 555,6 ml. 4- Si tiene 3 litros de una solución de Na(OH) 0,5 M, ¿Cuántos moles y que concentración molar poseen

los siguientes volúmenes: a) 50 ml; b) 0,25 ml; c) 1 litro. R: a) 0.025 moles, 0.5 M; b) 1.25 x 10-4 moles, 0.5 M; c) 0.5 moles, 0.5 M 5- ¿Qué molaridad tiene una solución que contiene 60 gr de NA(OH) (PM=40) por litro? R: 1.5 M. 6- ¿Qué cantidad de NA(OH) (PM=40) estan contenidos en 3 litros de una solución 2.5 M ? R: 300gr. 7- Una solución de ácido sulfúrico al 98% P/P, cuya densidad es 1.8 g/cm3, ¿qué molaridad tiene? R: 18

M. 8- ¿Cuál será la molaridad de una solución de ácido clorhídrico (PM=36.5) al 37% P/P cuya densidad es

1.19 g/cm3?. R: 12 M 9- ¿Cómo procedería para preparar 2 litros de una solución de ClK 10 mM a partir de una solución 3 M ?

R: tomar 6.67 ml (3 M). colocarlos en un matraz de 2 litros enrasar con agua destilada. 10-Se quieren preparar 6 litros de una solución 0.25 M de ácido sulfúrico a partir de una solución 63% P/P

(densidad=1.7 g/cm3 ). ¿Qué volumen debe tomar?. R: 137,28 ml. 11-Los siguientes son los resultados de la cuantificación de H2SO4 en una misma muestra realizado por

un método "A" por cuatro analistas diferentes: a- 50,00 % P/P, densidad= 1,3952 g/ml b- 70,00 % P/V c- 7,00 M d- 7100 mM De acuerdo al enunciado anterior diga: a-¿Cómo procede para comparar los resultados anteriores? b-¿Que puede decir acerca de la precisión del método empleado en la cuantificación? DATOS: PM H2SO4 = 98,08

12-Se desea investigar los efectos de flunitrazepam sobre el comportamiento de ratas en situación de

"stress". Para ello cuenta con dos lotes de cinco ratas de 300 g cada una. El lote Nº1 (experimental) es inyectado con una solución de flunitrazepam 67µM en cloruro de sodio 0,8775 % P/V (solución fisiológica). a) ¿Cómo procede para preparar 100 ml de dicha solución ? b) ¿Cuál es la utilidad del segundo lote de ratas? ¿Con qué inyecta esas ratas? ¿Cómo prepara esa solución? c) Si la dosis de flunitrazepam cuyo efecto se desea investigar es 70 µg/kg de peso corporal, ¿qué volumen debe inyectar a cada animal?. DATOS: flunitrazepam = droga sólida , PMflunitrazepam = 313,3 PACl = 35,5 PANa = 23

13- En el siguiente gráfico se muestran espectros de absorción de varias sustancias. ¿Cuál de las

longitudes de onda indicadas elegiría para luego trabajar con un fotocolorímetro y cuál para trabajar

2266con un espectrofotómetro? Estos espectros fueron obtenidos con un espectrofotómetro o con un fotocolorímetro? Podria obtener un espectro como el B si sólo dispusiera de un fotocolorómetro para analizar su muestra?

14- La siguiente tabla corresponde a absorbancias de soluciones estándares de albúmina sérica bobina: a)¿ Se cumple la ley de Lambert y Beer en este intervalo de concentraciones? b) Si no fuera así.¿ Cuál es el límite superior de concentración del rango lineal? c) Determinar la concentración de albúmina cuya absorbancia medida en las mismas condiciones experimentales es 0,116.

15- Se desea investigar el contenido de glucosa en sangre después de la administración por vía oral de

0,5 g de dicho compuesto. Se trabajó con un grupo de 20 ratas de 2 meses de edad, peso promedio 300 g. Se tomaron muestras de sangre a 0, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos después de la ingestión y se determinó en suero la cantidad de glucosa por un método fotocolorimétrico, expresó como el valor promedio en mg % P/V de glucosa en sangre. (Tabla 4). En otro experimento se tomó otro grupo de 20 ratas con las mismas características y sometidas al mismo tratamiento que las anteriores. Una hora antes del experimento fueron inyectadas por vía endovenosa con 200 µl de una solución 20 µM de Glucagón (el glucagón es una hormona pancreática que incrementa el nivel de glucosa por la estimulación de la degradación de glucógeno en higado) (Tabla 5). a) Identifique para cada experimento la variable dependiente y la independiente. J.S.R b) Grafique los resultados y coloque título a los mismos. c) Indique la ecuación matemática a la que se ajustan los datos.

TABLA 4 TABLA 5

mg % p/v glu/sangre tiempo min mg % p/v glu/sangre tiempo min

70 0 140 0

105 30 175 30

122 45 195 45

140 60 210 60

175 90 260 90

210 120 290 120 16- Postule dos modelos de experimentación donde pueda identificar variables dependientes e independientes.

[Albúmina] (Mx103) A 0.2 0.033 0.5 0.081

1.25 0.195 3.12 0.440 7.81 0.703

Long Onda (nm)

300 450 600 750

Abs

orba

ncia

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

A

B

C

2277PARTE PRACTICA

CUANTIFICACIÓN DE ALBÚMINA POR EL MÉTODO DE BIURET

FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE BIURET (Gornall, A.G et al., 1949, J. Biol. Chem., 177-766): Las sustancias que contienen dos -CONH2 ; -CH2NH2; -C(NH)(NH2); o -CSNH2, unidos, sea directamente entre sí, o a través de un átomo de carbono o nitrógeno; y las estructuras peptídicas que contengan como mínimo dos enlaces peptídicos, en presencia de Cu++y en solución alcalina, forma un complejo de color violeta, el complejo de Biuret.

NH

CO

RC

CO

NHRC

Cu2+H

OCHN

CR

C OHN

CR

H

HH

Violeta-púrpura Complejo proteína-Cu(II) El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado llamado Biuret que se forma cuando se calienta la urea a una temperatura de unos 180°C, en presencia de Cu++y en medio alcalino.

Esta reacción también es producida, naturalmente, por los enlaces peptídicos de las proteínas y es el fundamento de la técnica del biuret para la determinación de proteínas en suero u otros líquidos biológicos. El método de biuret desarrollado por Gornall et al. permite cuantificar soluciones que contengan entre 1 y 10 mg de proteínas por mililitros. MATERIALES Y MÉTODOS: Reactivo de biuret: Disolver 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) y 6g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado en 500ml de agua destilada. Agitando constantemente, añadir 300ml de Na(OH) al 10%. Diluir hasta 1 litro con agua destilada y guardar en frasco de plástico. Solución testigo: Albúmina bovina a una concentración de 5mg/ml en agua destilada.

NH2

C

NH

C

NH2

NH2

C

NH

C

NH2

NH2

CHN

C

NH2

NH2

CHN

C

NH2

Cu2+

O

O

O

O

O

O

O

O

NH2

C

NHC

NH2

O

O

NH2

C

NH2

O180 ºC

UREA BIURET

+ NH2Cu2+

Complejo Cu-Biuret

2288 Protocolo: En el tubo blanco colocar 1 ml de agua destilada; en el tubo testigo colocar 1 ml de solución testigo de albúmina; en el tubo problema colocar 1 ml de la solución problema. Agregar a cada uno de los tubos 4 ml de reactivo de biuret, agitando y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Con el tubo blanco llevar a cero de absorbancia al fotocolorímetro (550 nm). Luego leer el tubo problema y el tubo testigo. En el trabajo práctico se prepararán varios tubos testigos a los fines de construír una curva de calibración RESULTADOS

Tubo Absorbancia [Proteinas] (mg/ml

T1

T2

T3

P

2299DISCUSIÓN

BIBLIOGRAFÍA - Problemas de Química. J.M. Esteban y J.M. Cavanillas. Ed. Alhambra. 4a. 1976. España. - Cálculos en Bioquímica. I.J.Segel. Ed. Acribia. Saragoza. España. 1972. - Métodos instrumentales de análisis. H.H. Willard,.L.Merritt Jr., y J.A.Dean. Ed. CECSA. México. 1974. - Análisis Instrumental. D.A. Skoog y D.M. West. Ed.Interamericana. México. 1975. - Química Clínica: Bases y Técnicas. R.J. Henry, D.C. Cannon y J.W. Winkelman. Tomo I. 2a Ed. Jims. Barcelona. España.1980. - Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3º Ed. NY. USA.2000 - Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Edited by Michael G. Gore. Ed. Oxford University Press. Inc. NY. USA. 2000.

3300

TRABAJO PRACTICO Nº 2

PURIFICACIÓN, CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS

OBJETIVOS - Conocer los fundamentos teóricos de las técnicas utilizadas en la purificación y caracterización de proteínas. - Valorar la importancia del dominio de diferentes técnicas y del conocimiento acerca de las características particulares de la proteína a purificar, para poder aplicarlos con criterio. - Adquirir y aplicar herramientas teóricas para la resolución de los problemas planteados. TEMAS PARA REPASAR 1- Estructura de Proteínas. Abreviaturas de los nombre de los aminoácidos: código de 1 y 3 letras. 2- Equilibrio Acido-Base de amino ácidos y de proteínas. 3- Coeficiente de sedimentación. 4- Enzimas de restricción. 5- Concepto Actividad específica 6- Tema 3 del programa de la materia.

TÉCNICAS UTILIZADAS EN EL ESTUDIO DE PROTEÍNAS:

PURIFICACIÓN CUANTIFICACIÓN ANALISIS DE ESTRUCTURA

ANALISIS DE ACTIVIDAD

1- Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial y por gradiente de sacarosa.

1-Espectrofotometría 1- Espectrofluorimetría 1- Actividad enzimática

2- Precipitación salina. 2- Espectrofluorimetría 2- Dicroismo circular 2- Unión de radioligandos

3- Diálisis. 3- Elisa 3- RMN 3-Formación de complejo Ag-Ac

4- Cromatografía de filtración por gel.

4- FTIR 4- Conductancia a iones

5- Cromatografía de intercambio iónico.

5- MALDI-MS

6- Cromatografía de afinidad. 6- Secuenciación 7- Cromatografía líquida de alta presión.

7-Perfil hidropático

8- Electroforesis en geles. 8-Difracción de rayos X 9-Isolelectroenfoque y electroforesis bidimensional.

9- Comparación de secuencias.

Los alumnos deberán concurrir con la tarea de investigación (por escrito) sobre técnicas para estudios de proteínas que les fue asignada por el docente en el TP anterior. Se hará una puesta en común de la información obtenida por cada grupo. Serán evaluados en forma escrita al final de esta clase.

3311PROBLEMAS

1- Forma y Dimensión (a) La tropomiosina, una proteína muscular de 70 kDa, está formada por un

superhelicoide de α-hélices con dos hebras. Calcular la longitud de la molécula. (b) Suponer que un segmento protéico de 40 residuos se pliega en una estructura β-antiparalela de dos hebras con un giro en horquilla de 4 residuos. ¿Cuál es la longitud máxima de este motivo?

2- La ubicación lo es todo. Las proteínas transmembranas contienen a menudo α-hélices. Teniendo en

cuenta que el interior de las membranas es muy hidrofóbico, predecir qué tipo de aminoácidos habría en estas hélices. ¿Porqué una α-hélice es especialmente adecuada para encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una membrana?

3- Especies menores. En un aminoácido como la alanina la forma principal a pH 7 en disolución es la

zwitteriónica. Suponiendo un valor de pKa de 8 para el grupo amino y un valor de pKa de 3 para el ácido carboxílico, calcular la proporción entre la concentración de la forma neutra del aminoácido y (con el ácido carboxílico protonado y el grupo amino neutro) y la forma zwitteriónica a pH 7.

4- Mensaje oculto. Traducir la siguiente secuencia de aminoácidos en código de una letra: Leu-Glu-Ala-

Arg-Asn-Ile-Asn-Gly-Ser-Cys-Ile-Glu-Asn-Cys-Glu-Ile-Ser-Gly-Arg-Glu-Ala-Thr. 5- Concentrado en la concentración. Una disolución de una proteína cuya secuencia incluye tres

residuos de triptofano, sin residuos de tirosina, ni de fenilalanina, tiene una absorbancia de 0,1 a 280 nm en una celda de 1 cm de paso óptico. Obtener la concentración de la proteína en unidades de molaridad. Si la proteína tiene una masa molecular de 100 kd, hallar la concentración en miligramos de proteína por mililitro de disolución.

6- Movimiento lento. La tropomiosina, una proteína muscular de 93 kDa , sedimenta más lentamente

que la hemoglobina (65 kDa). Sus coeficientes de sedimentación respectivos son 2,6 S y 4,31 S. ¿Cuál es la carácteristica estructural responsable de su lentitud en la sedimentación?

7- Esferas que sedimentan ¿Cual es la dependencia entre el coeficiente de sedimentación S de una

proteína esférica y su masa? ¿Cuánto más rapidamente sedimentará una proteína de 80 kDa que una de 40 kDa?

8- Determinación del tamaño. Las movilidades electroforéticas relativas de una proteína de 30 kDa y

una de 92 kDa utilizadas como estándar en un gel de SDS-poliacrilamida son, respectivamente, 0,8 y 0,41. ¿Cuál es la masa aparente de una proteína que tiene una movilidad de 0,62 en este gel?

9- ¿Una asociación nueva? El gen que codifica una proteína que tiene un único puente disulfuro

experimenta una mutación que sustituye un residuo de serina por uno de cisteína. Se quiere comprobar si el apareamiento de los sulfhidrilos en este mutante es el mismo que en la proteína original. Proponer un experimento que resuelva esta cuestión.

10- Elegir la columna. El octapéptido AVGWRVKS se digirió con tripsina. a) ¿Sería el intercambio iónico o

la exclusión molecular la técnica más apropiada para separar estos productos? Explicarlo (b) Suponer que el péptido se digiere con quimiotripsina. ¿Cuál sería la técnica de separación óptima? Explicarlo

11- ¿Haciendo más enzima? Durante la purificación de una enzima un investigador realiza un paso de

purificación que produce un incremento en la actividad total dando un valor mayor que el que está presente en el extracto crudo. Explicar como se puede incrementar la actividad total.

332212- Problema de purificación de proteínas. Completar la siguiente tabla

Procedimiento de purificación

Proteína total (mg)

Actividad total

Actividad específica

Nivel de purificación

Rendimiento(%)

Extracto puro 20 000 4.000000 1 100

Precipitación con (NH4)2SO4

5000 3.000000

Cromatografía DEAE-celulosa 1500 1.000000

Cromatografía de exclusión molecular 500 750 000

Cromatografía de afinidad 45 675 000

13- Estructura cuaternaria. Una proteína se purificó hasta la homogeneidad. La determinación del peso

molecular por cromatografía de exclusión molecular da 60 kDa. La cromatografía en presencia de urea 6 M da una especie de 30 kDa. Cuando se repite la cromatografía en presencia de urea 6 M y β-mercaptoetanol 10 mM, aparece una especie molecular única de 15 kDa. Describir la estructura de la molécula.

14- Secuencia de proteínas I. Determinar la secuencia de un hexapéptido basándose en los siguientes

datos. Nota: Cuando no se conoce la secuencia, los aminoácidos se separan con una coma. (ver datos en la Tabla de ruptura específica de los polipéptidos, al final de la guía).

Composición de aminoácidos (2R,A,S,V,Y) Análisis N-terminal del hexapéptido A Digestión por tripsina (R,A,V) y (R,S,Y) Digestión por carboxipeptidasa no hay digestión Digestión por quimiotripsina (A,R,V,Y) (R,S)

15- Secuencia de proteínas II. Determinar la secuencia de un péptido de 14 aminoácidos en base a los

siguientes datos.

Composición de aminoácidos (4S,2L,F,G,I,K,M,T,W,Y) Análisis N-terminal del péptido S Digestión por carboxipeptidasa L Digestión por tripsina (3S,2L,F,I,M,T,W) y (G,K,S,Y) Digestión por quimiotripsina (F,I,S) (G,K,L) (L,S) (M,T) (S,W) (S,Y) Análisis N-terminal del péptido (F,I,S), S Tratamiento con bromuro de cianógeno (2S,F,G,I,K,L,M*,T,Y) (2S,L,W)

3333DATOS 1 residuo de α-hélice contribuye con 1.5 Å a la longitud total de la α-hélice. 1 residuo de hoja plegada β contribuye con 3.5 Å a la longitud total de la estructura β. 1 residuo = 110 D

Ruptura específica de los polipéptidos Reactivo - Ruptura química Lugar de ruptura Bromuro de cianógeno Lado carboxilo de los residuos metionina O-Iodobenzoato Lado carboxilo de los residuos triptofano Hidroxilamina Enlaces asparragina-glicina 2-Nitro-5tiocianobenzoato Lado amino de los residuos cisteína Ruptura enzimática tripsina Lado carboxilo de los residuos lisina y arginina clostripaína Lado carboxilo de los residuos arginina Proteasa de Staphylococcus Lado carboxilo de los residuos aspartato y

glutamato (el glutamato solo en ciertas condiciones)

trombina Lado carboxilo de los residuos arginina quimiotripsina Lado carboxilo de los residuos tirosina,

triptofano, fenilalanina, leucina y metionina. Carboxipeptidasa A Lado amino del aminoácido C-terminal (salvo

arginina, lisina y prolina)

BIBLIOGRAFÍA - Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3º Ed. NY. USA.2000 - Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.

3344TRABAJO PRÁCTICO Nº 3

CINÉTICA ENZIMÁTICA I

OBJETIVOS - Conocer el mecanismo por el cual transcurren las reacciones catalizadas por enzimas. - Comprender como influyen el tiempo de incubación, la concentración de enzima, la concentración de sustrato, temperatura, pH, y la presencia de inhibidores sobre la velocidad inicial y la concentración de producto formado en reacciones catalizadas por enzimas Michaelianas. - Interpretar el significado de las constantes cinéticas KM y Vmax. - Valorar la importancia del trabajo prolijo y ordenado para la obtención de resultados confiables. TEMAS PARA REPASAR - Soluciones amortiguadoras, - pH, - Fotocolorimetría. INTRODUCCIÓN Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza protéica. Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima libre (E):

E + S ES E + P La mayoría de las reacciones biológicas transcurren lentamente si no son catalizadas; las enzimas hacen que el equilibrio de esas reacciones sea alcanzado rápidamente. Varios factores como a) el tiempo de incubación; b) la concentración de enzima; c) la temperatura del medio; d) el pH y e) la concentración de sustrato influyen en el transcurso de la reacción. a) TIEMPO DE INCUBACIÓN: en la Fig. 1 se observa la variación de las concentraciones de complejo enzima-sustrato (E-S), de sustrato [S] y de producto [P], en función del tiempo. La velocidad inicial (Vo) corresponde a la velocidad medida dentro de un lapso de tiempo lo suficientemente corto como para que la cantidad de sustrato consumido sea despreciable respecto a la cantidad de sustrato inicial (en la práctica menos del 5% del total). La velocidad se expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej. µmoles/min)

En la primera semana (Cinética Enzimática I) se discutirán los aspectos teóricos y, en la segunda y tercera semana (Cinética Enzimática II y III) se desarrollará la parte experimental. Los alumnos serán evaluados al finalizar cada T.P de cinética (I, II y III) acerca de todos los apectos teóricos del tema y de los fundamentos de las técnicas utilizadas. Deberán concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

Fig.1. Variación de la concentración de las especies químicas que participan en una reacción catalizada por enzimas, en función del tiempo. [E]: concentración de enzima; [S]: concentración de sustrato; [ES]: concentración de complejo enzima-sustrato; [P]: concentración de producto.

tiempo

[ES]

[E]

[P]

[S]

3355b) CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA: Velocidad en función de la concentración de enzima. La concentración de enzima óptima se elige un rango de concentración de enzima tal que la velocidad inicial (Vo) sea directamente proporcional a la concentración de la enzima c) EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACIÓN: Dentro de ciertos límites, la velocidad de reacción aumenta con la temperatura. En general la velocidad se duplica a cada incremento de unos 10°C y viceversa. Existe una temperatura óptima, por encima de esta, la velocidad decrece rápidamente por desnaturalización de la enzima. La temperatura de máxima actividad no corresponde necesariamente a la temperatura de máxima estabilidad. d) EFECTO DEL PH DEL MEDIO DE INCUBACIÓN: Cambios moderados en el pH afectan el estado iónico de la enzima y con frecuencia también del sustrato. En general , la actividad óptima se encuentra entre pH 5 y pH 9 como la tripsina. ver Fig.5., sin embargo algunas enzimas como la pepsina Fig.6 tiene su óptimo a valores de pH bastante alejados de dichos límites. A valores extremos de pH se produce desnaturalización de la enzima. A partir de estos gráficos se puede determinar las constantes cinéticas que caracterizan a una enzima: KM (constante de Michaelis) y Vmax (velocidad máxima), para un sustrato y en condiciones determinadas. KM: este valor corresponde a la concentración de sustrato necesaria para alcanzar una velocidad igual a la mitad de la Vmax

Fig 2. V elocidad de reacción vs concentración de enzima

V

E

Concentración de enzima óptima

% Actividad máxima

Temperatura

Fig.4. Actividad enzimática vs temperatura

6 8 10 2 4 6 pH

pH

Actividad Actividad

3366Vmax: es la velocidad que se alcanza cuando la enzima está saturada con sustrato (a altas concentraciones de sustrato). e) EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO: Variación de la velocidad inicial en función de la concentración de sustrato. Si aumenta la concentración de S, mientras permanecen constantes las demás condiciones, V0 crece hasta un valor máximo. La velocidad crece hasta que la enzima es saturada por el S y se alcanza la velocidad máxima (Vmax).

[S] Fig.6 (a) Curva de Michaelis–Menten de Vo en función de la concentración de S; (b) Gráfico de Lineweaver-Burk o de dobles recíprocas.

GUÍA DE ESTUDIO

1. Catalizadores. 2. Enzimas. Características. Sitio activo de una enzima: características. Cofactor. Coenzima. Holoenzima. 3. Clasificación de enzimas. 4. Ubicación de las enzimas en la célula. 5. ¿A que se llama sustrato y producto?. 6. Mecanismo de acción de las enzimas. 7. ¿Alteran las enzimas el equilibrio de la reacción? 8. ¿Cómo se mide la concentración de una enzima?. 9. ¿Qué es la actividad específica de una enzima y en qué unidades se expresa?. 10. Factores que influyen en una reación catalizada por enzimas. 11. Función de Michaelis Menten. Representación gráfica. 12. Velocidad inicial. Velocidad máxima. Unidades. 13. ¿Porqué se debe trabajar a velocidad inicial? 14. KM. Unidades. ¿Cómo se determina? 15. Ecuación de Lineweaver-Burk. Representación gráfica. 16. Inhibición reversible e irreversible, concepto. Inhibidores competitivos y no competitivos, concepto. ¿Cómo se diferencian? ¿cómo son las curvas de las directas e inversas de la velocidad en función de la concentración de sustrato?.

1 [S] 1

KM

1 Vo

1 Vmax

Vo

Vmax

Vmax

2

(a) (b)

3377PROBLEMAS

1. Explique el siguiente gráfico 2. a. Grafique velocidad en función de concentración de sustrato b. Grafique la inversa de velocidad en función de la inversa de la concentración de sustrato.Identifique en cada una de estas curvas Km y Vm. 3. ¿Qué relación existe entre Km y la afinidad de una enzima por un determinado sustrato?

4. ¿Cuándo la concentración de sustrato es igual a Km, Como es la velocidad inicial? 5.¿Qué relación exíste entre Km y sustrato cuando la reacción catalizada por la enzima alcanza el 80% de la Vm? 6. Para medir la actividad catalítica de la fosfatasa ácida de higado de rata, la preparación enzimática fue obtenida homogenizando 0.5 g de hígado en 10 ml de buffer. Se incubaron 0.2 ml de la preparación enzimática a pH 5 y 37ºC en presencia de Ca++ durante 6' , en un volumen de 0.4 ml, el cual fue diluido a 4 ml para detener la reacción. Calcule los µmoles de producto formado por min. y por mg de tejido, sabiendo que la absorbamcia fue 0.2, ε: 17500. 7. Se incubaron 200 µl de una preparación enzimática (0,3 mg proteínas/ml) en presencia de 0,5 ml del sustrato correspondiente y de 0,5 ml de buffer pH 5, durante 15 min. a una temperatura constante de 37ºC. La reacción se detuvo por dilución del incubado hasta un volumen final de 10 ml con NaOH 0,1 M. La absorbancia de esta solución fue 0,215. Calcular los µmoles de producto formado por min. y por mg de proteínas. Solución testigo 2 µM → Abs. 0,15. 8. La trehalasa cataliza la hidrólisis de la trehalosa, en determinadas condiciones (pH 7, 30ºC). Una muestra de trehalasa presenta un valor de Vm de 1.5 µmol de glucosa formada por minuto por mg de proteína. ¿Cuál será el valor de Vm para la misma preparación enzimática pero en presencia de de 5 mmoles de trehalosa 6-fosfato el cual es un inhibidor competitivo con Ki = 2mmol/ml? 9. Pseudomonas aeruginosa cultivada en un medio de acetato posee una enzima que puede hidrolizar la propionamida.

CH3CH2CONH2 + H2O -----------------> CH3CH2COOH + NH3 los estudios de velocidad inicial en los que se midio la producción de amoníaco a partir de la propionamida a pH 7 y 37oC demostraron que la urea inhibe esta reacción. Examinando los efectos de dos concentraciones diferentes de urea sobre un rango de concentraciones de propionamida se obtuvieron los siguientes resultados:

V

Tiempo

3388 VELOCIDAD INICIAL [Propionamida] (µmoles de NH3 liberados/min/mg de proteína) SIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR (Urea) 1 mmol/ml 2 mmol/ml

5 160 111 76 6.7 194 140 95 10 263 183 123 20 400 279 188 50 576 400 277

Determinar la Km para las diferentes condiciones. ¿Actúa la urea como un inhibidor competitivo o no competitivo? 10. A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar a) tipo de inhibición b) KM del sustrato.

Concentración de S (mM) VELOCIDAD (µg de producto formado/hora)

Sin inhibidor Con inhibidor 6 mM

2 139 88 3 179 121 4 213 149 10 313 257 15 370 313

3399TRABAJO PRÁCTICO Nº 4

CINÉTICA ENZIMÁTICA II

PARTE PRACTICA I

ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA ÁCIDA DE HÍGADO

OBJETIVOS - Medir la formación de producto en función del tiempo de incubación. - Determinar la variación de la velocidad inicial en función de la concentración de la enzima. Es decir, se determinarán las condiciones óptimas de tiempo de incubación y de concentración de enzima, las que serán usadas durante el trabajo práctico siguiente para determinar KM y Vmax.

FUNDAMENTO DE LA REACCIÓN La fosfatasa ácida de hígado cataliza la siguiente reacción: p-nitrofenilfosfato + H2O p-nitrofenol + PO4

3-

El sustrato p-nitrofenilfosfato disódico, es una reactivo artificial que tiene la propiedad de ser hidrolizado por esta enzima del hígado y de otros tejidos, por ello puede ser usado para estudiar dichas enzimas. La reacción es medida siguiendo la cantidad de producto formado, el p-nitrofenol, el cual se puede medir mediante fotocolorimetría en un medio alcalino a 410 nm (Coeficiente de extinción molar: 17500) (ref. Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI). MATERIALES Y MÉTODOS Preparación de la enzima: Homogeneizar (en homogeneizador a embolo) 0.25 g de hígado en 15 ml de agua destilada. Dejar en baño de hielo durante 10 min. En esas condiciones hipo-osmóticas, se rompen los lisosomas que contienen la enzima, la cual queda soluble. Luego llevar la suspensión a 30 ml con buffer acético- acetato de sodio, pH 5, y 0,2 M. La suspensión queda con una concentración de 1 mg de proteína por ml.

O2N

O

HO

OH

P O

O2N

OH

p-nitrofenilfosfato

Enzima

HH++

p-nitrofenol

+ Enz + PO4-3 OH-

O2N

O-

p-nitrofenolato

+ H2O

4400Sistema de incubación: Contiene cantidades variables de los siguientes componentes: Sustrato: p-nitrofenilfosfato, 25 mM. PM 371,12. Buffer: acido acético- acetato de sodio, pH 5, 0,1 M. Enzima: homogeneizado de hígado 1 mg de proteína / ml. Activador: Cl2Ca 11 mM. Inactivador: NaOH 0,1M Recomendaciones: Colocar en un tubo todos los componentes menos la enzima. La reacción comienza con el agregado de la enzima y la incubación a 37°C. Mezclar rápidamente y continuar la incubación durante un tiempo que se indicará en cada caso. La reacción se detiene por el agregado de 5 ml de NaOH 0.1 M. El álcali, por un lado inactiva a la enzima y por otro da el medio alcalino necesario para que el producto (p-nitrofenol) desarrolle color. Es importante hacer en cada caso un tiempo de cero de incubación, este tubo contiene lo mismo que los tubos problema pero con la enzima agregada después del NaOH. Este tubo se usa como blanco para el fotocolorímetro. PROTOCOLO A) CURVA DE TIEMPO :

Tubo No sustrato µl Cl2Ca µl buffer µl enzima µl tiempo (min)

1 100 (5 mM) 100 250 100 (0,1 mg prot)

10

2 100 “ 100 250 100 “ 15

3 100 “ 100 250 100 ” 20

4 100 “ 100 250 100 ” 25

5 100 ” 100 250 100 ” 30

blanco 100 ” 100 250 100 ” 0

Incubar a 37°C. Al cabo del tiempo de incubación frenar la reacción agregando 5 ml de NaOH 0.1 M. En el blanco la enzima debe añadirse después del alcali. Leer en el fotocolorímetro a 410 nm y calcular los µmoles de producto formado. RESULTADOS

Tubo No Absorbancia µmoles de P µmoles de p/min

1

2

3

4

5

4411 GRÁFICO CONCLUSIONES B- CURVA DE CONCENTRACIÓN DE ENZIMA

Tubo No Sustrato (µl) Cl2Ca (µl) Buffer (µl) enzima (µl) tiempo (min) 1 100 (5 mM) 100 300 50 (0,05 mg prot) SEGÚN

2 100 “ 100 250 100 (0,1 “ ) LO

3 100 “ 100 200 150 (0,15 ” ) DETERMINADO

4 100 “ 100 150 200 (0,2 ” ) EN: A

5 100 ” 100 100 250 (0,25 ” )

blanco 100 ” 100 100 250 ( ” )

Incubar a 37°C durante el tiempo determinado en A. Frenar la reacción agregando 5 ml de NaOH 0.1 M. En el blanco la enzima debe añadirse después del álcali. Leer en el fotocolorímetro a 410 nm y calcular los µmoles de producto formado. RESULTADOS

4422Tubo No Absorbancia µmoles de P µmoles de p/min

1

2

3

4

5

GRÁFICO CONCLUSIONES

4433TRABAJO PRÁCTICO Nº 5

CINÉTICA ENZIMÁTICA III

PARTE PRÁCTICA II

ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA ÁCIDA DE HÍGADO

OBJETIVO - Determinar los valores de KM y Vmax de la fosfatasa ácida de hígado.

PROTOCOLO PREPARACIÓN DEL SISTEMA DE INCUBACIÓN:

Tubo sustrato (µl) Cl2Ca (µl) Buffer (µl) enzima (µl) tiempo (min)

1 50 (2,5 mM) 100 250 SEGÚN SEGÚN

2 100 (5 mM) 100 200 LO LO

3 150 (7,5 mM) 100 150 ESTIMADO ESTIMADO

4 200 (10 mM) 100 100 EN: B EN: A

5 250 (12,5 mM) 100 50

blanco 100 100 200

Incubar a 37°C según el tiempo determinado en A. Luego agregar a cada tubo 5 ml de NaOH 0.1 M. En el blanco la enzima se añade después del alcali. Leer en el fotocolorímetro a 410 nm y calcular los µmoles de P formado. ANÁLISIS DE DATOS: a) Calcular las inversas de la concentración de sustrato indicadas en la tabla. b) calcular las inversas de µmoles de producto formados en cada tubo. c) graficar 1/Vo en función de 1/[S]. d) Determinar los valores de KM y Vmax. RESULTADOS: Curva de Saturación

Tubo No Absorbancia µmoles de P µmoles de P/min

1

2

3

4

5

4444 Curva de dobles recíprocas

Tubo No 1/V 1/[S]

1

2

3

4

5

4455 CONCLUSIONES

4466

DISCUSIÓN DE TRABAJOS CIENTÍFICOS GUÍA DE ESTUDIO.

Trabajo científico:

Jung G.Y. and Stephanopoulos G. (2004). A functional protein chip for pathway optimization and in vitro metabolic engineering. Science 304: 428-431. 1. Escriba la cita bibliográfica completa (busque en bases de datos tales como PubMed). 2. Optimización de vías metabólicas: a) ¿cuál es su interés?, b)¿dónde reside su dificultad?, ¿cómo puede

encararse?. 3. ¿Qué son los microarreglos?, ¿en qué contexto se comenzaron a desarrollar?. 4. ¿Cuál es el objetivo del presente trabajo? 5. ¿Cuál es la estrategia experimental elegida? (palabras clave: fusión RNA-proteína, polilisina, DNA,

hibridización). 6. ¿Cuáles son las dos reacciones acopladas que se usan para poner apunto el sistema experimental?.

¿Cuál es la utilidad del DNA marcado con fluoresceína?. ¿Cómo se detecta el producto de estas reacciones acopladas?. Describa los experimentos realizados para poner a punto la técnica (Figs. 1 y 2).

7. ¿Qué es la trehalosa y cuál es su importancia? 8. ¿Cuál es la vía metabólica a cuyo estudio se aplica la técnica desarrollada? 9. Describa la Fig. 3. 10.¿Cuáles son las conclusiones alcanzadas respecto al funcionamiento de esta vía metabólica? ¿Es

posible generalizar estas conclusiones a otras vías metabólicas?.

BIBLIOGRAFÍA . Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003. . Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY. USA. 2000. . Harper H.A, Manual de química fisiológica. Ed. El manual moderno 1980 . Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimología. Ed Aguilar. 1967. . Morris J., Fisicoquímica para biólogos. . Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996. . Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA. México, 1995. - Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan Vol. XXXI.

4477TRABAJO PRÁCTICO Nº 6

FOTOSÍNTESIS

OBJETIVOS - Valorar la importancia de la fotosíntesis como proceso necesario para la vida en el planeta - Conocer los procesos bioquímicos y termodinámicos involucrados en el proceso. - Comprobar algunos aspectos de la fotosíntesis por medio de experimentos. TEMAS PARA REPASAR - Termodinámica de las reacciones redox. INTRODUCCIÓN La fotosíntesis es un proceso que puede tener lugar tanto en células de plantas y como de bacterias verde-azules; por medio de este proceso estos organismos son capaces de utilizar la luz solar como fuente de energía para efectuar la síntesis de ciertos compuestos. La ecuación global de la fotosíntesis es :

Luz 6 CO2 + 6 H2O -----------------> C6H12O6 + 6O2

Puede resolverse en dos procesos caracterizados por el tipo de reacciones que se realizan en cada uno, estas son: • reacciones dependoentes de la luz ( o reacciones claras): la energía luminosa es captada por los pigmentos y la transforman en ATP y NADPH y simultaneamente se libera oxígeno molecular. • Reacciones de fijación del carbono (o de fase oscura): llamada así porque no es necesaria la luz para llevarse a cabo; aquí el ATP y el NADPH se emplean como fuentes de energía y poder reductor, respectivamente, y se produce la reducción del CO2 y la síntesis de glucosa. Fotólisis del agua: Esta reacción se conoce como reacción de Hill:

H2O + A ----------------> AH2 + 1/2 O2

El estudio del transporte electrónico inducido por la luz comienza con el descubrimiento de R.L Hill: "La iluminación de cloroplastos en presencia de aceptores electrónicos artificiales provocaba el desprendimiento de oxígeno y la simultánea reducción del aceptor”. En la fotosíntesis normal el aceptor es el NADP pero en la reacción de Hill se utiliza un aceptor artificial por ejemplo, un colorante que al reducirse se decolora.

Los problemas y la guía de estudio deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En caso de necesitar aclarar dudas, los docentes estrán disponibles en sus horarios de consulta en la cátedra. Los alumnos serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante el desarrollo de la experiencia práctica (evaluación oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP. Deberán entregar un informe escrito de la experiencia práctica en donde se detallen claramente: Objetivos, Hipótesis, Materiales y Métodos, Resultados y Discusión. Deberán concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

4488GUIA DE ESTUDIO

1. Concepto de fotosíntesis. 2. Concepto de reacciones dependientes de la luz y de fijación del carbono. 3. Formas de captación y transferencia de Energía. 4. Fuerza electrón-motriz. 5. Fuerza protón motriz. 6. Diferencia entre mitocondrias y cloroplastos. 7. Dadores y aceptores de electrones. 8. Importancia de la reacción de Hill 9. Diferencias entre fosforilación a nivel de sustrato, fosforilación oxidativa y fotofosforilación. Ejemplos.

Rol Dual de citocromo b6f (cytochrome b6f) y citocromo c (cytochrome c) en cianobacterias como ejemplo de transporte electrónico y fosforilación en la fotosíntesis y en la cadena respiratoria. Estos organismos utilizan citocromo b6f, citocromo c y plastoquinonas para la fosforilación oxidativa y la fotofosforilación. (a) En la fotofosforilación los electrones fluyen desde el agua al NADP+ (b) En la fosforilación oxidativa los electrones fluyen desde el NADH al O2. Ambos procesos son acompañados por el movimiento de protones a través de la membrana.

Figura tomada de: Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY. USA. 2000.

4499 Integración de fotosistemas I y II en el cloroplasto. Este “esquema en Z” muestra el transporte de electrones transferidos desde el agua (abajo a la izquierda) hacia el NADP+ ( a la derecha) en la fotosíntesis no cíclica. La posición en escala vertical de cada portador de electrones refleja su potencial de reducción estandar. Para elevar la energía de electrones derivados del agua al nivel energético requerido para reducir NADP+ a NADPH, Los electrones deben ser impulsados por fotones absorbidos en PSI (Photosystem I o Fotosistema I) y PSII (Photosystem II o Fotosistema II) (ver flechas anchas). Un fotón es requerido por un electrón de cada Fotosistema. Luego de la excitación los electrones de alta energía fluyen corriente abajo a través de una cadena transportadora. Los protones se mueven a través de las membranas tilacoidales durante la lisis del agua y durante el transporte de electrones a través del complejo citocromo b6f (o cytochrome b6f) generando un gradiente de protones que es central para la formación de ATP. La flecha punteada indica la vía cíclica de la transferencia de electrones, donde solo esta involucrado PSI, los electrones regresan por una vía cíclica al PSI, en lugar de reducir NADP+ a NADPH.

Adaptado de : Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY. USA. 2000.

Dirección del flujo de electrones

5500PARTE PRACTICA

Mecánica del TP: 1º) Determinar el o los objetivos de cada experiencia práctica. 2º) Enunciar la o las hipótesis que se pondrán a prueba con cada una de las experiencias. 3º) Elaborar un protocolo de trabajo tomando en cuenta la información disponible en la Guía de TP. 4º) Desarrolar la experiencia y registrar los resultados. 5º) Discutir y fundamentar adecuadamente los resultados obtenidos. Las preguntas que se encuentran en

la guia deben ser usadas para orientar la discusión de los diferentes aspectos del problema que se aborda con cada una de las experiencias.

6º) Exponer los resultados y redactar un informe acerca de la experiencia práctica utilizando un lenguaje adecuado, detallando claramente: Objetivos, Hipótesis, Materiales y Métodos, Resultados y Discusión.

7º) Evaluación escrita al final del TP. EXPERIENCIA Nº 1: Fotosíntesis y luz. Liberación de oxígeno y fijación de CO2.

MATERIALES Material vegetal: un trozo de Elodea Solución de bicarbonato de sodio al 1% P/V. Tubos de ensayo, tapones de goma atravesados por un tubo de 0,5 cm de diámetro, pipetas de 0,2 ml. Fuente de luz blanca. Soportes y gradillas. PROCEDIMIENTO: 1. Disponer los elementos en la manera indicada en la Fig.1, teniendo en cuenta que desde el tubo de

ensayo hasta la pipeta graduada el sistema debe estar lleno de solución de bicarbonato de sodio al 1%.

2. Marcar el nivel del líquido contenido en la pipeta. 3. Medir el pH de la solución de bicarbonato de sodio 4. Conectar la fuente de luz a 10 cm de distancia y observar la base del tallo de Elodea. 5. Controlar el pH de la solución a los 45 min de iniciada la experiencia. a) Por qué utiliza una solución de bicarbonato de sodio en lugar de agua? b) Cómo es la reacción de la que participa el dióxido de carbono disuelto en agua? c) Qué efecto produce el desprendimiento de oxígeno en el sistema? d) Qué sucedería en el sistema si modificara la distancia entre la planta y la lámpara? e) Cambió el pH?

Fig.1

5511EXPERIENCIA Nº 2: Consumo de CO2 MATERIALES: Material vegetal: Elodea Dos tubos de ensayo Solución de rojo de fenol Fuente de luz blanca. Papel de aluminio. PROCEDIMIENTO: 1. Colocar 10 ml de solución de rojo de fenol en dos tubos de ensayo e insuflar aire con una pipeta hasta

que la solución vire de color rojo a color amarillo. 2. Introducir en cada tubo de ensayo un trozo de Elodea. 3. Exponer un tubo a la luz y cubrir el otro con papel de aluminio (oscuridad). 4. Observar los tubos a los 45 min de iniciada la experiencia. a) Qué función cumple el Rojo Fenol? b) Por qué el color vira a amarillo cuando se insufla dióxido de carbono? c) Cuál es la fuente de dióxido de carbono? d) Cambió el pH? e) Que sucedería en el sistema en ausencia de luz?

CCOO22

Rojo

Fig. 2

5522EXPERIENCIA Nº 3: Fotólisis del agua. Reacción de Hill. MATERIALES: Material vegetal: hojas de Palam-palam o de espinaca (50 g) Solución de NaCl 0,035 M. Solución de NaCl 0,35 M. Solución de 2,6-diclorofenolindofenol 2,5 x 10-4 M Licuadora (tanto el vaso de la licuadora como las soluciones deben mantenerse en frío (0-4oC) Aislamiento de cloroplastos Homogeneizar en licuadora 50 g de material vegetal en 100 ml de NaCl 0,35 M durante 1 min. Filtrar por gasa doble, recoger en un vaso y mantener en baño de hielo. Tomar 30 ml del homogeneizado y centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Decantar y eliminar el precipitado de restos celulares. Centrifugar el sobrenadante a 4000 rpm durante 10 min. Separar el sobrenadante y resuspender el precipitado de cloroplastos en NaCl 0,035 M (1 ml). Mantener en baño de hielo. PROCEDIMIENTO: f) Porqué utiliza NaCl 0.35 M para realizar el homogeneizado? g) Porqué utiliza NaCl 0.035 M para resuspender los cloroplastos? h) Qué función cumple el 2,6-diclorofenolindofenol? i) Cómo podría demostrar la producción de oxógeno? j) Cómo podría mejorar esta experiencia?

2,6 di-Cl-fenolindofenol

5533PROBLEMAS

1. Interprete el siguiente gráfico en el que se observan varios factores que afectan la velocidad de la fotosíntesis: ¿Qué indica la zona marcada con *? 2. Explique las causas de las interconversiones entre RuDp (ribulosa difosfato) y PGA (ácido fosfoglicérico) en experimentos de fotosíntesis, cuando varían la intensidad de iluminación y la concentración de CO2.

3. Calcular ∆Go´ para la reducción del NADP+ por FRS. 4. Calcular la fuerza electron-motriz expresada en voltios, registrada por un electrodo sumergido en una

solución que contiene las siguientes mezclas de NAD+ y NADH a pH=7 y 25oC, con referencia a una semicelda de 0,00V:

a) NAD+ 1 mM y NADH 10 mM b) NAD+ 1 mM y NADH 1 mM c) NAD+ 10 mM y NADH 1 mM

5. Ordenar las siguientes sustancias según su tendencia creciente a ceder electrones:

a) clorofila del fotosistema I, b) plastoquinona, c) ferredoxina, d) agua, e) Feofitina (pheo), 6. Ordenar las siguientes sustancia según su tendencia creciente a aceptar electrones:

a) clorofila del fotosistema II, b) P680*, c) NADP+, d) plastocianina. 7. Suponiendo que se necesitan 8 cuantos de luz para la incorporación de una molécula de CO2 en

moléculas de glúcidos por medio de la fotosíntesis, calcule la eficiencia termodinámica en condiciones estándar, para la síntesis de 1 mol de glucosa, si la longitud de onda de la luz utilizada es a) 400 nm y b) 750 nm. (Energía necesaria= 686 Kcal).

CCoo nn

cc eenn tt

rr aacc ii

óó nn

Efecto de la intensidad de luz a: 1. 25oC y CO2 0,4% 2. 15oC y CO2 0,4% 3. 25oC y CO2 0,01%

Velocidad de

fotosíntesis

1

2

3

Intensidad de la luz incidente

**

1% CO2 0,003% CO2

Tiempo (min)

RUDP

PGA

Luz Oscuridad

Tiempo (min)

PGA

RUDP

55448. Cuál es la diferencia entre las cadena transportadoras de electrones que tienen lugar en

mitocondrias y en cloroplastos? Calcule el ∆G para la transferencia de electrones que ocurre en ambos casos y justifique los resultados.

9. El aparato fotosintético del alga verdeazulada contiene grandes cantidades de ficoeritrina y ficocianina,

además de la clorofila A. La ficoeritrina tiene una absorción máxima entre 480 y 680 nm; la ficocianina a 620 nm. Sugerir la misión de estos pigmentos.

10. Observe y analice el siguiente gráfico. Indique el tipo de fosforilación y justifique su respuesta. 11. Observe y analice el siguiente gráfico. Indique el tipo de fosforilación y justifique su respuesta. DATOS: Para resolver los problemas. Agua: +0,82 V NADP+: -0,324 V Ferredoxina: -0,4 V P700: +0,4 V P680: +0,95 V P680*: -0,95 V Feofitina (Pheo): -0.75 V Plastocianina: +0.13V

Plastoquinona: +0,1 V NAD+: -0.32V

BIBLIOGRAFÍA . Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY. USA. 2000.

. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.

. Hall D.O., Rao K. Fotosíntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977.

. Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977.

. Andreo C., Vallejos R. Fotosíntesis. Serie Biología, monografía no 30 OEA, 1984.

. Molt A.S. et al. 1951, Plant Physiology, 26, 164-175.

. Torres H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioquímica General Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983.

. Harper H.A, Manual de química fisiológica. Ed. El manual moderno 1980

. Morris J., Fisicoquímica para biólogos.

. Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996.

. Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA. Mexico, 1999.

Tiempo

Tiempo

- - - µmoles de oxígeno liberado ___ µmoles de fosfato esterificado

- - - µmoles de oxígeno liberado ___ µmoles de fosfato esterificado

5555TRABAJO PRACTICO Nº 7

MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN DE ENERGÍA

OBJETIVOS - Reconocer la aplicabilidad de las leyes de la físicas a los sistemas biológicos. - Analizar fenómenos biológicas desde un punto de vista termodinámico. Fotosíntesis, respiración y motores moleculares como ejemplos. TEMAS PARA REPASAR: Energia libre de Gibbs; reaciones de oxido reducción; transferencia de energia en la fotosintesis; cadena respiratoria; fuerza proton motriz; motores moleculares.

GUIA DE PROBLEMAS 1- Condiciones estándar frente a la vida real. La aldolasa cataliza la siguiente reacción en la glicólisis: aldolasa

Fructosa 1,6-bifosfato dihidroxiacetona fosfato + gliceraldehído 3-fosfato El ∆G 0’ para esta reacción es de + 5,7 kcal.mol-1, mientras que el ∆G en la célula es -0,3 kcal.mol-1. Calcular la relación entre reactantes y productos en el equilibrio y en condiciones intracelulares. Utilizando los resultados obtenidos explicar: ¿cómo puede resultar esta reacción endergónica en condiciones estandar y exergónica en condiciones intracelulares?

2- No siempre es lo mismo. Las concentraciones de ATP, ADP y Pi difieren según el tipo de célula,

consecuentemente la liberación de energía libre para la hidrólisis de ATP será tambien diferente según el tipo de célula. Utilizando los datos de la tabla siguiente, calcular ∆G para la hidrólisis de ATP en las células de músculo, hígado y cerebro. Teniendo en cuenta que el ∆G 0’ para esta reacción es de - 7,3 kcal.mol-1,

3- Fuerza ácida: El pK de un ácido es una medida de su potencial de transferencia de grupos protónicos.

a) Establecer una relación ∆G 0’ y pK. b)¿Cuál es el ∆G 0’ para la iónización del ácido acético, si su pK es de 4,8?

ATP (mM) ADP (mM) Pi (mM) Hígado 3,5 1,8 5,0Músculo 8,0 0,9 8,0 Cerebro 2,6 0,7 2,7

Los problemas y la guía de estudio deberán ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En caso de necesitar aclarar dudas los docentes estrán disponibles en sus horarios de consulta, en la cátedra. Los alumnos serán evaluados al final del TP (evaluación escrita) y durante la discusión del trabajo científico (evaluación oral), sobre los contenidos que se encuentran en la guía de TP.

55664- Los opuestos se atraen. El gráfico siguiente muestra como el ∆G 0 para la hidrólisis de ATP varía en

función de la concentración de Mg2+ (pMg=log 1/[ Mg2+ ]). a) ¿Cómo afecta el descenso de [Mg2+] al ∆G para la hidrólisis de ATP? b) ¿Cómo se puede explicar este efecto?

pMg2

2 3 4 5 6 7 830

31

32

33

34

35

36

-∆G

(kj.m

ol-1

)

-∆G

(kca

l.mol

-1)

8.4

8.2

8.0

7.8

7.6

7.4

7.2

5- Cambio de divisas. Para una fuerza protón-motriz de 0,2 V (negativa en el lado de la matriz). ¿Cuál es

el valor máximo del cociente [ATP]/ [ADP] [Pi ] compatible con la síntesis de ATP? Calcular el valor de este cociente de tres maneras, suponiendo que el número de protones translocados por cada ATP formado es dos, tres, y cuatro respectivamente. La temperatura es de 25ºC.

6- Cruce de caminos. Es posible determinar el lugar exacto donde actúa un inhibidor de la cadena

respiratoria gracias a la técnica de punto y corte. Britton Chance diseño elegantes métodos espectroscópicos para determinar el cociente entre las formas oxidada y reducida de cada uno de los transportadores. Este cálculo es posible porque cada uno de los estados tiene un espectro de absorción característico, tal y como se ilustra en el gráfico adjunto para el caso de citocromo c. Si usted se encuentra en posesión de un inhibidor y descubre que al añadirlo a mitocondrias que respiran, los transportadores localizados entre el NADH y QH2 se encuentran más reducidos y los transportadores localizados entre el fitocromo c y el O2 se encuentran más oxidados ¿en qué punto actúa el inhibidor?

55777- Distancia. Supongamos que la transferencia de energía entre dos moléculas de clorofila a distantes

entre sí 10 Å tiene lugar en 10 picosegundos. Supongamos que la distancia se incrementa hasta 20 Å manteniendo constantes el resto de los factores. ¿Cuánto tardará en ocurrir la transferencia de energía?

8- ¿Se dice que es lenta? A su máxima velocidad una molécula de quinesina se desplaza con una

velocidad de 6400 Å por segundo. Teniendo en cuenta que el tamaño de la región motriz del dímero de quinesina es de 80 Å, calcular su velocidad en unidades de su tamaño por segundo. Según esta relación ¿cuál sería la velocidad correspondiente de un automóvil que tuviera una longitud de 3 metros?

9- Levantamiento de pesos. Un único dominio motor de la miosina puede desarrollar una fuerza de

aproximadamente 4 piconewtons (4pN) ¿Cuántas veces puede levantar su peso un dominio motor de miosina? Tener en cuenta que 1 newton = 1 kg fuerza (1kg masa m.s-2). Considerar que la masa molecular del dominio motor es de 100 kd.

10- Las helicasas como motores. Las helicasas tales como la PcrA pueden utilizar una hebra sencilla de

ADN como guía. En cada ciclo la helicasa se desplaza una base en el sentido 3’-5’. Teniendo en cuenta que la PcrA en presencia de un molde formado por una hebra sencilla de ADN puede hidrolizar ATP con una velocidad de 50 moléculas por segundo (se hidroliza una molecula por ciclo) y que la longuitud de una base de ADN es 3,4 Å. ¿Cómo es esta velocidad comparada con la velocidad de la quinesina que es de 6400 Å por segundo?¿A qué se puede deber la diferencia de velocidad entre estos dos motores moleculares?.

11- Nuevamente se mueve. Cuando a las bacterias tales como E. coli se las mantiene en ayunas durante

un período de tiempo suficiente, dejan de moverse. Sin embargo, cuando estas bacterias inmóviles se colocan en un medio ácido nuevamente comienzan a moverse. Aportar una explicación teniendo en cuenta el mecanismo de movimiento del flagelo de una bacteria.

12- Arrastrar cargas. Considérese la actividad de una única molécula de quinesina que transporta una

vesícula a lo largo de un microtúbulo. La fuerza necesaria para arrastrar una partícula esférica de radio a con una velocidad ν en un medio de viscosidad η es: F= 6 π η a x ν Supongamos que una esfera de 2 µm de diámetro se transporta con una velocidad de 0,6 µm. s-1 en un medio acuoso con una viscosidad de η= 0.01 g.cm-1. s-1.

a) ¿Cuánta es la fuerza desarrollada por la quinesina? Expresar el valor en dinas (1 dina= 1 g.cm. s-2) b) ¿Cuánto trabajo realiza en un segundo? Expresar el valor en ergios (1 ergio=1 dina cm). c) Un motor de quinesina hidroliza aproximadamente 80 moléculas de ATP por segundo. ¿Cuánta es

la energía asociada a esta hidrólisis de ATP expresada en ergios? Comparar este valor con el trabajo realizado.

5588

DISCUSIÓN DE TRABAJOS CIENTÍFICOS

GUÍA DE ESTUDIO.

Trabajo científico: Yasuda, R., Noji, H., Kinosita, K., & Yoshida M.. (1998). F1-ATPase Is a Highly Efficient Molecular Motor that Rotates with Discrete Steps. Cell. 93: 1117–1124. 1. ¿Cúal es la función del ATP sintetasa? ¿Cómo es su estructura? ¿Cuál es la función de cada una de las subunidades? 2. ¿Qué fenómeno se observa si la parte F1 se encuentra en ausencia de la parte F0 en un medio que contiene ATP? 3. ¿Cómo se logra experimentalmente observar la rotación γ del F1-ATPase? 4. Explicar brevemente los resultados que se observa en la Figura 2a y 2b. 5. A cuál de los experimentos que se realizaron en los T.Prácticos de la materia, se asemeja el experimento del gráfico 2b.

BIBLIOGRAFÍA . Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3ºEd. NY. USA. 2000. . Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioquímica, Ed. Reverté SA, 5ºEd. España 2003.