FILIAL NORTE

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: BIOQUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICA

SEGUNDO AÑO

II Semestre

2007

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INSTRUMENTACIÓN

CENTRIFUGACIÓN

rocedimiento por el cual se aplica la FUERZA CENTRÍFUGA para separar partículas que se encuentran en suspensión en un medio líquido. El incremento de la fuerza centrifuga

condicionará que las partículas migren alejándose del eje de rotación de la centrifuga. El proceso migratorio de las partículas se denomina sedimentación y la velocidad con que sedimentan es proporcional a la fuerza centrifuga expresada como incrementos de la gravedad (G).

La constante gravitatoria es proporcional a la velocidad de giro del rotor – soporte del medio que se centrifuga – y del radio del mismo. El radio del rotor de la centrifuga depende si ésta es del tipo ángulo fijo o flotante. En el primer caso es un promedio entre el radio mínimo y el máximo, y en el segundo es la distancia entre fondo del tubo y el eje.

La velocidad de la sedimentación se altera por la fuerza centrífuga, pero además por la forma de las partículas, y por la viscosidad del medio líquido que las suspende. También depende de la temperatura en cuanto ésta altere la viscosidad del medio o de las cargas eléctricas de las partículas.

Los equipos que permiten la centrifugación se llaman centrífugas y constan de un motor con controles, que mueven un rotor que sostiene los tubos de centrifugación. Los rotores son de dos clases, de ángulo fijo y flotantes, tal como se ve más arriba.

P

2

La mayoría de la centrífugas de laboratorio alcanzan las 5000 rpm, aunque algunas alcanzan los 16 000 rpm. Algunas centrífugas tienen refrigeración lo que permite separar partículas biológicamente activas tales como factores de coagulación, enzimas, etc.

Las ultracentrífugas son centrífugas con vacío, refrigeración y velocidades de más de 500 000 x g. Permiten la separación de los componentes tisulares, tal como se aprecia en el cuadro adjunto y poder estudiar cada uno de ellos a partir del homogenizado de un tejido cualquiera.

Para evaluar con certeza la capacidad de una centrífuga para separar los componentes celulares debemos manejar gravedades en lugar de revoluciones por minuto, por lo que frecuentemente usamos el nomograma de Dole y Cotziar que presentamos a continuación.

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Suspender el tejido al 10%Homogenizar en Potter E.

Centrifugar a 600g x 10´

Sedimento: núcleos, restos celulares

Centrifugar el sobrenadante a 4000g x 15´

Sedimento:mitocondrias

Centrifugar el sobrenadante a 16 500g x 15´

Sedimento:lisosomas

Centrifugar el sobrenadante a 100 000g x 40´

Sedimento:microsomas

Sobrenadante: citosol

TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN

1. Diferencial: separa de acuerdo a las diferentes velocidades de sedimentación de distintas partículas. La usamos en la clínica para separar sedimentos de orina, o componentes del plasma.

2. Zonal: usando una gradiente de densidad lograda con un soluto denso, la más usada la sacarosa, las moléculas sedimentan de acuerdo a su coeficiente de sedimentación. La sacarosa densa evita que las bandas se mezclen.

La gradientes pueden ser discontinuas – preparadas mediante la colocación de soluciones de diversa densidad una sobre otra- y continuas – preparada mediante un equipo de mezcla de soluciones, que va incrementando la densidad progresivamente.

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NOMOGRAMA DE CALCULO VELOCIDAD Y RADIO DE CABEZAL DE CENTRÍFUGA

TUBOS DE CENTRIFUGACIÓN:

Existen tubos de centrífuga de diversa composición:1. Policarbonato: vidrio transparente, autoclavable y resistente

a los ácidos y bases de baja dilución.2. Borisilicato: vidrio muy resistente a químicos de alta

concentración .3. Polietileno: plástico muy resistente a los químicos, pero

sensible a la temperatura.4. Propileno: plástico bastante resistente a la temperatura –

autoclavable- y resistente a casi todos los químicos.

PORTATUBOSSon de plástico o de metal y poco resistente a ácidos y bases fuertes. Deben ser conservados muy limpios.

COLORIMETRÍAEs el análisis de la concentración de una muestra por el color que presenta. Todos hemos tenido la experiencia de valorar la concentración de sustancias coloreadas en solución, por observación directa, una taza de café o té, un vaso de refresco, son apreciados de esa manera. El examen se funda en la mayor o menor absorción de luz de acuerdo al mayor número de moléculas y tonalidad dependerá de la capacidad de absorber una u otra longitud de onda de luz, específicamente. La fotocolorimetría manipula las variables de este fenómeno controlando la luz incidente proveniente de un foco luminoso y su pureza, de modo tal que sólo incida aquella luz que es específicamente absorbida por la partícula que medimos.

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450nm540nm640nm

Ultravioleta:400nm a 1nm

Rayos X1nm a 1pm

Rayos γ < 1pm

Infrarrojo:750nm a 25 um

Microondas:25um a 1mm

Ondas de radio> 1mm

Los cuerpos luminosos como el sol o las lámparas eléctricas emiten un gran espectro electromagnético que comprende amplias longitudes de onda, de las cuales muy pocas corresponden al espectro visible. En el cuadro anterior se aprecian todas las radiaciones electromagnéticas conocidas.

Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores complementarios) Esta luz reflejada es la que observamos como color propio del cuerpo coloreado. No interesa particularmente los colores que absorbe la solución que queremos medir. La selectividad de absorción que queremos medir. La selectividad de absorción de una partícula por una longitud de onda se basa en el hecho de que cada longitud de onda de luz corresponde a un distinto nivel de energía, y para excitar los electrones de cada partícula necesitamos un particular nivel de energía.

Si consideramos que cada molécula absorbe luz de acuerdo a la concentración en que se encuentre dentro de la solución, a mayor absorción de luz y menor luz trasmitida. Estos factores están considerados en la ley de Lambert y Beer.

Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores complementarios). Esta luz reflejada es la que observamos como color propio del cuerpo coloreado. Interesa particularmente los colores que absorben la solución que queremos medir. La selectividad de absorción de una partícula por una longitud de onda

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se basa en que cada longitud de onda de luz corresponde a un distinto nivel de energía y para excitar los electrones de cada partícula se necesita un particular nivel de energía.

Sí consideramos que cada molécula absorbe luz de acuerdo a la concentración en que se encuentre dentro de la solución, a mayor concentración de sustancia, mayor absorción de luz y menor luz trasmitida. Estos factores están considerados en la Ley de Lambert y Beer, que es la siguiente:

Log Io/It = e.l.cDonde: Io = Luz incidente, It = Luz transmitida, C = concentración, L = longitud de paso, e = constante.

FOTOCOLORIMETRIA – ESPECTROFOTOMETRIA

La fotocolorimetría es la medida de la luz absorbida por una solución mediante un aparato que es un fotocolorímetro. El equipo consta de una fuente de luz artificial, un monocromador que separa exclusivamente luz de una sola longitud de onda (la que sea preferente para la medida), un recipiente o tubo de vidrio (que alberga la solución a medir), una célula fotoeléctrica que transforma la luz trasmitida en corriente eléctrica y una unidad de medida de la corriente eléctrica o galvanómetro.

La calificación de colorímetro o espectrofotómetro depende del monocromador, sí éste es un filtro tendremos un fotocolorímetro, pero si es un prisma, o cualquier aditamento que proporcione luz de diversas longitudes de onda tendremos un espectrofotómetro.

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Luz Incidente Io Luz trasmitida It

Fuente de luz blanca

Muestra: Absorción

Celda

Galvanómetro

Monocromador

Los fotocolorímetros y los espectrofotómetros reportan sus resultados bajo dos formas: absorbancia o luz absorbida por las partícula de la solución y transmitancia a o luz transmitida luego de atravesar el tubo con la solución. La transmitancia se expresa en valores numéricos entre 0 y 100%, es decir que una solución que no tiene particular trasmitirá el 100% y una perfectamente opaca el 0%. La absorbancia, también llamada densidad óptica DO, se expresa en valores semilogarítmicos entre 0 y 2 correspondiendo el 0 a aquella solución que no tiene partículas y por lo tanto no absorbe la luz.

Para encontrar la concentración de una solución problema, debemos comparar su lectura frente a un blanco – agua destilada o reactivos sin modificarse – con la lectura de un patrón o solución estándar bajo las mismas condiciones. Una solución estándar es generalmente una que contiene el problema con una concentración perfectamente medida en el laboratorio. CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UN PROBLEMA

Para hallar la concentración de una muestra problema tenemos dos procedimientos:

1. Factor de Calibración 2. Curvas de calibración

Factor de calibración: es la concentración de sustancia que corresponde a una unidad de medida, generalmente 0,001 de absorbancia.

Se obtiene Factor de calibración: concentración del patrón

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Lectura del patrón (en absorbancia)

Esta fórmula deriva de la densidad óptica o absorbancia del problema:

DOP= eP lP cP

Si el coeficiente de extinción (e) es el mismo en ambos casos y el diámetro del tubo de lectura(l) es el mismo, la única diferencia está en la concentración. Luego:

DOst CS

= DOp CP

Despejando la concentración del problema cp, obtenemos la siguiente formula:

cs

cp=Dp x -------- Dost

Concentración del problema = Densidad Óptica del Problema X Factor de calibración

La curva de calibración consiste en la obtención de las lecturas de absorción 0 de % de trasmitancia que corresponde a una secuencia creciente de concentraciones, estas son graficadas en un papel milimétrico si se trata de absorbancia o densidad óptica y de papel semilogarítmico si se trata de % de transmitancia.

POTENCIOMETRÍA

La potenciometría es el procedimiento de elección para la medida del pH. El pH en una expresión numérica que corresponde al logaritmo de la inversa de la concentración de iones H+. La potenciometría se basa en la diferencia de potencial (voltaje) entre dos electrodos, el de medida y el de referencia, ambos sumergidos en la solución y bajo condiciones de equilibrio.

El instrumento consta de un ELECTRODO DE REFERENCIA que se mantiene constante durante la medida, un ELECTRODO DE MEDIDA que varia de acuerdo a la concentración de hidrógeno de la solución y un dispositivo o potenciómetro que mide la diferencia de potencial. El electrodo de referencia puede ser de dos clase: de calomel, mercurio metálico y cloruro mercurioso y de plata plata y cloruro de plata. El potencial de ese electrodo depende de la solución de cloruro de potasio en que está sumergido internamente.

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Batería

0V 1V

AAg.Aa HclgCl.HCl.Vidrio

KCl.Hg2Cl2.HgSoluciónProblema.

El electrodo de medida, es también llamado electrodo de vidrio, está constituido por un tubo de vidrio cuyo extremo es particularmente selectivo al paso de iones hidrógeno. En su interior hay ácido clorhídrico HCl 0,1 M y un alambre de plata, cloruro de plata,

En el potenciómetro, un voltaje variable se opone al de la celda de medida. Un galvanómetro actúa como detector del punto nulo para indicar que es igual al voltaje opuesto de la celda de medida. Conectando la celda desconocida al circuito se produce un desnivel de voltaje que debe corregirse hasta alcanzar el punto nulo. La magnitud de la corrección puede leerse como fuerza electromotriz o como pH directamente.

En la práctica se ha usado los electrodos de pH para medir la concentración de otros iones. Los electrodos tienen una membrana adicional que sólo es selectiva al paso de determinado electrolito, sodio, potasio, calcio son medidos bajo esta manera con facilidad. También existe el electrodo de CO2 que deja pasar moléculas se este gas las que modifican el pH y por lo tanto son medidas con el electrodo de vidrio de pH. PRACTICAS DE LABORATORIO

1. EXPERIMENTO.- Preparación de una curva de calibración: el experimento consiste en preparar tubos de concentración creciente de un colorante y leerlos al fotocolorímetro o al espectrofotómetro, llevando a cero (0) el aparato con agua destilada. Construir una gráfica usando

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papel milimetrado para las lecturas hechas en DO (densidad óptica) o papel semilogarítmicos para las lecturas hechas en % transmitancia.Para el efecto, preparar cinco tubos de acuerdo al esquema y leer las soluciones al espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda. Practicar esta lectura tanto en DO como en % de transmitancia.Construir dos curvas de calibración, una en papel milimetrado y otra en papel semilogarítmico.

ContenidoTubo Nº

1 2 3 4 5mL Azul metileno al (5 mg/mL) 2 4 6 8 10mL Agua destilada 8 6 4 2 0

Concentración (mg/mL) % T A (A=2-logT%)

Desconocido 1

Desconocido 2

COMENTARIO ………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………...

11

Usando los valores obtenidos en % de trasmitancia, grafique usando el papel semilogarítmico de esta página.

COMENTARIO………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

Firma del alumno Firma del profesor

2. EXPERIMENTO: Titulación de un ácido débil con una base fuerte.

Se trata de determinar el pH de un grupo de tubos con varios niveles de titulación de ácido acético con hidróxido de sodio. Cuando se titula un ácido débil con una base fuerte se produce un aumento de pH inicialmente rápido para luego hacerse lento, dentro de ciertos márgenes y al final se alcaliniza rápidamente. La identificación del cambio de pH en cierto período de la titulación, se debe a la formación transitoria de una combinación de ácido débil y la sal correspondiente. En el caso del experimento será la combinación de ácido acético y acetato de sodio y son los componentes ordinarios de una solución amortiguadora o solución buffer.Para la experiencia preparar 11 tubos de acuerdo al siguiente esquema:

Tubo No mL acético 0,1 N mL NaOH 0,1 N mL agua destilada

1 5,0 0,0 5,02 5,0 0,5 4,53 5,0 1,0 4,04 5,0 1,5 3,5

12

5 5,0 2,0 3,06 5,0 2,5 2,57 5,0 3,0 2,08 5,0 3,5 1,59 5,0 4,0 1,010 5,0 4,5 0,511 5,0 5,0 0,0

Leer los tubos en el potenciómetro y graficar los resultados

COMENTARIO

…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

CINÉTICA ENZIMÁTICA

Las enzimas son proteínas que aceleran las reacciones químicas hasta su punto de equilibrio.

La ecuación general de las enzimas es:

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E + S ES E + P C’ C››

La actividad enzimática se manifiesta y mide por:

Desaparición de sustratoFormación de productoModificación de cofactor

Muchos factores modifican la actividad enzimática:

pHTemperaturaConcentración de sustratoConcentración de enzimaTiempo de incubación

En nuestra práctica observamos el efecto de la pepsina sobre la albúmina del huevo. La actividad enzimática se apreciará por la pérdida de la turbidez proteica. La actividad enzimática reportar en función del % de formación de producto par ello hacer uso de la siguiente ecuación:

% Formación de producto (FC) = 100 – (Abs tubos/Abs albúmina)*100

Donde: Abs tubo = Absorbancia de los tubos después del incubado. Abs albúmina = Absorbancia de la albúmina (Abs = 0.995)

3. EXPERIMENTO.- Efecto del pH

El pH actúa sobre los grupos ionizados que pertenecen a los centros activos de las enzimas. Los grupos que pierden la ionización pierden la capacidad de interaccionar con el sustrato. Cada enzima tiene un pH óptimo de trabajo.

Preparar cinco tubos con:TUBO Nº 1 2 3 4 5

pH 1,0 1,5 6,0 9,5 11mL albúmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0mL HCL 1N 2,0 0,5 0,0 0,0 0,0mL CO3Na2 0,0 0,0 0,0 0,5 2,0mL agua destilada 0,0 1,5 2,0 1,5 0,0

Preincubar los cinco tubos más un tubo conteniendo 20 mL de pepsina al 1% a 37ºC por 5 minutos. Luego añadir rápidamente 3 mL de la pepsina preincubada a cada uno de los tubos 1–5. Mezclar e incubar a 37ºC por 10 min. Observar la diferencia o leerla en fotocolorímetro con filtro azul (420 nm).

4. EXPERIMENTO: Efecto de la temperatura.

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Todo aumento de temperatura incrementa la actividad enzimática por aumento de la energía de activación. Pero paralelamente se va produciendo una desnaturalización parcial de la enzima que la inactiva.

Preparar cinco tubos con:TUBO Nº 1 2 3 4 5

mL albúmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5mL agua destilada 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5

Preparar otros cinco tubos con:TUBO Nº 6 7 8 9 10

mL pepsina 1% 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Incubar por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura:

TUBO Nº 1 y 6 2 y 7 3 y 8 4 y 9 5 10

Temperatura O ºC Amb. 37 ºC 70 ºC 37 ºC 100 ºC

Agregar los respectivos tubo Nº 6 al Nº 10 a los que hay que incubar a las temperaturas a que se pre-incuban los tubos 1 – 5.

5. EXPERIMENTO. -Efecto de la concentración de la enzima

Aunque las enzimas no se destruyen ni con las reacciones, el aumento de ellas en la cubeta de reacción incrementa la velocidad.

Preparar 5 tubos con:TUBO Nº 1 2 3 4 5

mL albúmina 5,0 5,0 5.0 5,0 5,0

mL HCL 1N 0,5 0,5 0.5 0,5 0,5

mL agua destilada 1,5 2,5 3.5 4,0 4,5

mL pepsina 0,0 0,0 0.0 0,0 0,0

Incubar los 5 tubos a 37ºC por 5 minutos y enseguida añadir:TUBO Nº 1 2 3 4 5

mL pepsina incubada 3,0 2,0 1,0 0.5 0,1

Incubar por cinco minutos a 37ºC. Observar al fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul), contra una lectura de agua.

6. EXPERIMENTO.-Efecto de la concentración del sustrato

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Si es una reacción enzimática incrementamos progresivamente la concentración del sustrato, aumentará la velocidad enzimática (velocidad inicial) hasta un punto en que la velocidad llega a una meseta plana que no modifica aunque sigamos aumentando el sustrato, habremos saturado la enzima.

Preparar 6 tubos con:

TUBO Nº 1 2 3 4 5 6

mL albúmina 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0

mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

mL agua destilada 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0

mL pepsina 1% 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Leer a 420 nm (filtro azul). Anotar los resultados: incubar a 37ºC. Colocar 0,5 mL que pepsina pre-dirigida. Incubar por otros 5 minutos a 37ºC. Leer al fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Restar la segunda lectura de la primera. Graficar y comentar los resultados.

Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

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Experimento: Efecto del pH

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

pH

% F

orm

ac

ión

pro

du

cto

Experimento: Efecto de la temperatura

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100

Temperatura (ºC)

% F

orm

ació

n p

rod

uct

o

Experimento: Efecto de la concentración de enzima

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12

Concentración enzima (mg/mL)

% F

orm

ació

n p

rod

uct

o

Experimento: Efecto de la concentración de sustrato

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6

Concentración de sustrato

% F

orm

ació

n p

rod

uct

o

Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

DIGESTIÓN DE CARBOHIDRATOS

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El carbohidratos más importante en la alimentación es la glucosa, la cual ingerimos bajo la forma de disacáridos (maltosa, sacarosa y lactosa) o de almidón, polisacáridos formado por muchas moléculas de glucosa. El almidón es el constituyente esencial de cereales, leguminosa, tubérculos y raíces. La digestión del almidón se produce en el intestino delgado gracias a la presencia de enzimas digestivas producidas por las glándulas salivares, el páncreas y la pared intestinal. Estas enzimas son:

La alfa amilasa salivarLa alfa amilasa pancreáticaLa amilo 1,6 glucosidasa de la pared intestinal

Las alfa amilasas son enzimas que actúan a pH neutro y en presencia de iones cloro. Rompen los enlaces amilo 1,4 dando como resultado oligosacáridos y glucosa.Existe dos formas de evaluar la actividad enzimática de la amilasa:

Por desaparición de sustrato: forma como desaparece el almidón el que se aprecia por la reacción del lugol.

Por formación de producto: forma como aparecen carbohidratos reductores (glucosa) en el medio, los que se aprecian por reducción del cobre.

En nuestra práctica evaluaremos la actividad enzimática de la amilasa sobre el almidón mediante la reacción del remanente de almidón frente al yodo a mayor decoloración, mayor actividad enzimática.

7. EXPERIMENTO.- Digestión del almidón por la amilasa salivar.

Para la experiencia preparar cuatro tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema.

TUBO 1 2 3 4

ml almidón 1% 2 2 2 2

ml Buffer fosfato pH 6,6 1 1 1 0

ml HCL 0,3N 0 0 0 3,4

ml Suero fisiológico 3 2,4 0 0

ml Agua destilada 0 0 2,4 0

Colocar en baño de María a 37ºC por 5 minutos. Agregar:ml solución de saliva 0 0,6 0,6 0,6

Colocar en baño de maría a 37ºC por 20 minutos Pasado este tiempo tomar 0,5ml de cada tubo y preparar cuatro tubos más de acuerdo al esquema

TUBO 1 2 3 4

ml digestión tubo 1 0, 5 0 0 0

18

ml digestión tubo 2 0 0,5 0 0

ml digestión tubo 3 0 0 0,5 0

ml digestión tubo 4 0 0 0 0,5

ml HCL 0,05N 5 5 5 5

ml Solución yodada 0,5 0,5 0,5 0,5Dejar en reposo por 15 minutos. Leer al fotocolorímetro con filtro rojo (660nm)

INFORME DE LA PRÁCTICA III

Nombre:Grupo : Fecha:

Experimento 7.- Digestión del almidón por la amilasa salivar

COMENTARIO:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

Firma del alumno Firma del profesor

ABSORCIÓN DE CARBOHIDRATOS

Después de la digestión de los carbohidratos por efecto de amilasas salivar y pancreática, amilo 1,6 glucosidasa, y disacarasas tenemos como resultado

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monosacáridos: glucosa, fructosa, galactosa, que deberán ser absorbidos por la mucosa intestinal para su ingreso a la circulación sanguínea. Los carbohidratos se absorben en el yeyuno mediante dos mecanismos, la simple difusión favorecida por la gradiente de concentración y el transporte activo, aún contra la gradiente. El orden de facilidad en la absorción es de galactosa glucosa: ribosa.

El borde en cepillo de las células intestinales tiene varios sistemas trasportadores. Un transportador de glucosa dependiente del sodio (SLGT1) se enlaza tanto a la glucosa como al sodio en sitios separados aumentando el tenor de sodio intracelular. La energía necesaria para este transporte se obtiene de la hidrólisis del ATP vinculado a una bomba de sodio que intercambia sodio con potasio.

También participa un transportador facilitador independiente del sodio llamado GLUT 5. La hidrólisis de los polisacáridos, oligosacáridos y disacáridos es muy rápida por lo que usualmente los procedimientos de absorción se saturan con rapidez.

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8. EXPERIMENTO.-Absorción de la glucosa por el intestino de la rata

1. Se usan ratas con 24 a 36 horas de ayuno. Se les anestesia con eter bajo una campana de vidrio. Abrirles el abdomen y se retira una porción de 5 cm de intestino, de modo que no puede mesenterio adherido.

2. Se lava la luz intestinal varias veces mediante una jeringa con solución Ringer Fosfato pH 7,4 Mediante el uso de una baqueta de vidrio se empuja un extremo del intestino dentro del mismo buscando evertir la porción mucosa hacia fuera. Mantener el intestino en solución Ringer Fosfato pH 7,4 a temperatura ambiente.

3. Cerrar un extremo del intestino con hilo y dejar otra ligadura suelta en el otro extremo del intestino.

4. Introducir en el saco intestinal formato 2 ml de solución Ringer Fosfato pH 7,4 con 0,2% de glucosa. Cerrar la ligadura suelta y revisar que no haya pérdida de líquido.

5. Introducir el saco lleno en un tubo con 2 ml solución Ringer Fosfato pH 7,4 con glucosa 0,2% Incubar a 37ºC por 30 minutos. Pasado del tiempo sacar el saquito, secarlo por fuera con papel de filtro. Cortarlo con tijera y vaciar el contenido en u tubo de ensayo.

6. Diluir 1:10 con agua destilada, tanto el contenido del saquito, como el del tubo que lo recibió durante la incubación. Luego proceder a preparar 4 tubos de acuerdo al siguiente esquema.

TUBO 1 2 3 4ml reactivo para glucosa 2 2 2 2μl agua destilada 50 0 0 0

μl patrón 20 mg/dL 0 50 0 0

μl solución diluida intra saco 0 0 50 0

μl solución diluida extra saco 0 0 0 50Incubar a 37ºC por 10 minutos. Enfriar y leer en el fotocolorímetro a 520nm. Usando el tubo 1 como blanco

COMENTARIO: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

Firma del alumno Firma del profesor

GLICÓLISIS

La vía metabólica más importante para la glucosa es la vía glicolítica o de Embden Meyehof. Esta presente, naturalmente, en todos los tejidos y es responsable del

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aprovechamiento energético de la glucosa y aún de otros carbohidratos. Tiene dos formas de manifestarse: la forma anaeróbica cuando la concentración de oxígeno es baja, produce ácido pirúvico y ácido láctico, y genera escasamente dos moléculas de ATP, tal como se aprecia en la siguiente fórmula global.

GLUCOSA + 2ADP + Pi 2 lactato + 2ATP + 2H2O

Cuando la glicólisis transcurre en presencia abundante de oxígeno, tiene como producto final el ácido pirúvico, el cual se transforma en acétil CoA mediante el proceso de decarboxilación oxidativa, en ingresa al Ciclo de Krebs donde produce 38 moléculas de ATP.

9. EXPERIMENTO.- Glicólisis.

La glicólisis anaeróbica (parcialmente) se demuestra por el aumento de compuestos ácidos (pirúvico y láctico) en el tubo de reacción. Para el efecto preparar cuatro tubos de acuerdo al esquema.

TUBO 1 2 3 4

ml solución de Potter pH 7,4 2,5 2,5 2,5 2,5ml Glucosa 0,1 m 0,5 0,5 0,5 0,5

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ml NAD 10m g/ml 0,2 0,0 0,2 0,2ml ATP 5m g/ml 0,2 0,2 0 0,2ml Nicotinamida 0,4m 0,1 0,1 0,1 0,1

ml Yodoacetato 0,1m 0 0 0 0,1

ml Agua destilada 0,1 0,3 0,3 0

Colocar en baño de maría 37ºC por 5 minutos

Gotas de rojo de fenol Ii Ii ii Ii

ml homogenizado de hígado 0,5 0,5 0,5 0,5Tapar e incubar 1 hora a 37ºCTitular cada tubo con NaOH 0,01N hasta el color original

COMENTARIO: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

Firma del alumno Firma del profesor

RESPIRACIÓN TISULAR

La respiración tisular es el proceso por el cual se aprovecha la energía almacenada en los nutrientes (glucosa, ácidos grasos, aminoácidos) a través del Acétil CoA, mediante procesos de oxidación.Durante el proceso de oxidación del Acil Coa se forman equivalentes reductores en forma de hidrógeno o electrones que ingresan a la cadena respiratoria, localizada en las mitocondrias y genera muchas moléculas de ATP. Como puede apreciarse en el esquema adjunto hay tres fuentes de generación de electrones que producen 3 moléculas de ATP, el isocitrato, el cetoglutarato y el malato y una que sólo proporciona dos ATP que es el succinato, debido a que ingresa al ciclo de Krebs a nivel de la Coenzima Q y no del NAD como las otras.El punto final del transporte de los electrones por la cadena respiratoria es el oxígeno. Dos átomos de hidrógeno se unen a ½ molécula de oxígeno para forma una molécula de

agua. El proceso oxidativo de los nutrientes se puede seguir por el consumo de oxígeno. .

10. EXPERIMENTO: Respiración Tisular

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El experimento estudia la respiración tisular mediante la manometría. Un manómetro es un instrumento que mide los cambios en la presión de los gases. Esta basado en el principio de vasos comunicantes, si colocamos un líquido en dos recipientes que se comunican entre sí, ambas ramas serán iguales siempre que sobre ellas exista la misma presión sobre una de ellas disminuye los niveles de líquido se desigualan. Los equipos que usaremos serán iguales o semejantes a los que se observan en el gráfico, es decir constan de un ambiente cerrado para la reacción, un medio de absorción de CO2 que puede combinar

Preparar dos frascos de acuerdo al siguiente esquema:

FRASCO Nº 1

ml Solución de Potter pH 7,4 3ml Succinato de potasio 0,5m 0,3

ml Agua destilada 0,7

ml Homogenizado 0,5

Cerrar bien los frascos. Incubar a temperatura ambiente. Medir cada 2 minutos la modificación del nivel del manómetro. Prepara un gráfico de consumo de oxígeno vs tiempo.

Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTESPara los organismos aerobios el oxigeno es un compuesto esencial, sin embargo su reducción secuencial dentro de las células conduce a la formación de las llamadas especies reactivas del oxígeno, que son en su mayoría

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radicales libres. Un radical libre es una molécula o átomo que presenta un electrón no apareado, razón por la cual son sumamente reactivos. Al formarse pueden interactuar rápidamente con moléculas orgánicas tales como proteínas, lípidos, carbohidratos, e incluso con el ADN, provocando en ellas diversas alteraciones estructurales, que conducen a alteraciones de tipo funcional y de esta manera la fisiología de las células y por consecuencia la de los organismos se ve afectada. Paralelamente al estudio de radicales libres, los antioxidantes constituyen un mecanismo de protección, de manera que los radicales libres derivados de la activación del oxigeno pueden ser transformados a productos menos tóxicos o no tóxicos. Con respecto a los antioxidantes enzimáticos se puede señalar que se presentan tres sistemas principales de enzimas antioxidativas: la superóxido dismutasa, la catalasa y la glutation peroxidasa.

2O2 + 2H- H2O2 + O2

SOD Cu-Zn

2H2O2 2H2O + O2 CAT

2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O GP Se

Sistema de producción contra radicales libres del oxigeno10.EXPERIMENTO: Capacidad de secuestro de peroxido de hidrogeno

(H2O2) por acción de la catalasa (enzima antioxidante).

MATERIAL Y REACTIVOSMaterial- Probeta graduada de 250 mL

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- Pipeta de 10 mL- Bageta- Papel Whatman Nº 42 - Catalasa (Extraída de “papa” Solanum tuberosum L)ReactivosPeroxido de hidrogeno al 1 %, 0.7 %, 0.3 %, 0.1 %PROCEDIMIENTO EXPERIMENTALAdicionan el filtro embebido con la enzima antioxidante (catalasa), colocar dentro de la probeta de 250 mL, con la ayuda de una bageta. Adicionar la solución de peroxido de hidrogeno a diferentes concentraciones medir la distancia de la base cuando el filtro comience a ascender. Tiempo (segundos) 1.0% H2O2 0.7% H2O2 0.3% H2O2 0.1% H2O2

TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOSMedir el tiempo recorrida por el disco hasta llegar a la superficie. Calcular la pendiente de la recta la que nos indicará la velocidad con la que la enzima antioxidante (catalasa) secuestra el radical libre (H2O2).

Comentario: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

COLESTEROL DE LAS FRACCIONES LIPOPROTEÍCAS

Las proteínas son lípidos complejos resultado de unir la grasa con proteínas. Los lípidos sanguíneos se encuentran bajo esta forma y divididos en cuatro tipos de lipoproteína:

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Alfa lipoproteína (HDL) ricas en proteínas y fosfolípidosPre –beta lipoproteínas (VLDL): ricas en triglicéridoBeta lipoproteínas (LDL): ricas en colesterol Quilomicrones (Q): ricos en triglicéridos dietéticos

Toda las lipoproteínas tienen colesterol, triglicéridos, fosfolípidos y proteínas, pero en distinta concentración relativa.

El colesterol es la grasa que genera la arterioescleroris al depositarse en las paredes de los vasos sanguíneos. El colesterol de las betalipoproteínas está en actitud de depositarse en los vasos constituye la mayor parte del colesterol sanguíneo. El colesterol de las alfa lipoproteínas (HDL) es aquel que está siendo retirado de los vasos, por lo que su presencia es beneficiosa.Para investigar el colesterol de las alfa lipoproteínas usamos un reactivo precipitante (fosfotúngstico-cloruro de calcio) que precipita a las betas y prebetalipoproteínas dejando en solución a las alfa, sobre las que se realiza la reacción de color típica del colesterol.

11.EXPERIMENTO Dosaje colesterol total y colesterol HDL en sangre.

Se toma una muestra de sangre del paciente en ayuno de por lo menos 24 horas. La sangre se coloca en tubo limpio sin anticoagulante.

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Preparar un tubo al que se le coloca:

1ml de suero límpido0.1 ml de reactivo precipitante HDL o II gotas

Agitar y dejar en reposo por minutos al ambiente Centrifugar a 3 000 por 10 minutos separar el sobrenadante.

Preparar cuatro tubos límpidos y colocar:

TUBO Nº 1 2 3 4

ml Suero límpido0,02 0 0 0

ml Sobrenadente anterior0 0,02 0 0

ml Patrón de colesterol0 0 0,02 0

ml Agua destilada0 0 0 0,02

ml Reactivo de color2 2 2 2

Agitar: Incubar por 15 minutos a 37ºC.

Leer al fotocolorímetro a 520 mu los tubos 1,2 y 3, llevando a cero con el blanco (tubo4)

Cálculos 200

Colesterol mg/dl= -------- X D.O.(1 ó 2) D.O (3)

12.EXPERIMENTO : Dosaje de triglicéridos

Preparar tres tubos con:

TUBO Nº 1 2 3

ml Suero 0 0,02 0

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ml Patrón de triglicéridos0 0 0,02

ml Reactivo de color2 2 2

Agitar, incubar a 37ºC por 15 minutos

Leer al fotocolorímetro a 520 nm los tubos 2 y 3 llevando a “O” con el tubo 1

Conc. patrón

Triglicéridos mg/dl = ------- x D.O.(2) D.O (3)

INFORME DE LA PRÁCTICA V: RIESGO CORONARIO

Nombre:.................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

Experimento 11: Dosaje de colesterol total y colesterol HDL en sangre

Patrón: Lectura: Concentración: Factor de Calibración:Colesterol total:

13.EXPERIMENTO : Valoración de las lipoproteínas por electroforesis en acetato de celulosa

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) sobre la base de su tamaño molecular y carga eléctrica. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas son moléculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de aminoácidos (fundamentalmente ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina e histidina). Para la separación se usa un gel de agarosa, poliacrilamida o acetato de celulosa. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por el papel, por la que las pequeñas se moverán mejor y rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.

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En resumen, puede decirse que cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga eléctrica 2) su tamaño 3) la intensidad del campo eléctrico y 4) la temperatura del medio.Las proteínas están compuestas de aminoácidos que poseen grupos ionizables (principalmente -COO-y -NH3+), pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer eléctricamente neutras según la proporción de los diversos grupos ionizados a un determinado pH.

En suero humano la composición normal es: Proteína total: 6,4 a 8,3 g/dL Albúmina: 3,5 a 5,0 g/dL Alfa-1 globulina: 0,1 a 0,3 g/dL Alfa-2 globulina: 0,6 a 1,0 g/dL Beta globulina: 0,7 a 1,2 g/dL Gammaglobulina: 0,7 a 1,6 g/dL ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSASe usa para la separación y caracterización de proteínas y otras moléculas. El soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de adsorción mínimas, por lo que se evita la formación de colas y los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Otras ventajas son:1) La separación es muy rápida2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeñas3) Las tiras pueden hacerse transparentes4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes separados5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivosMATERIAL Y REACTIVOSMaterial- Tiras de acetato de celulosa (“Cellogel”)- Papel de filtro para secar las tiras de acetato- Cubeta de electroforesis- Aplicador- Fuente de electroforesisReactivos-Tampón Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH=8,6-Solución de tinción: 0.1% (p/v) ponceau S stain en ácido acético 1% -Solución de lavado: ácido acético 1% -Suero

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTALElectroforesis:- Humedecer en tampón las tiras de acetato de celulosa 10 minutos antes de su

uso, para su equilibrado.- Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la superficie- penetrable quede hacia la parte superior. El lado penetrable es el que se ve

cuando la tira se coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la esquina inferior derecha

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- Depositar la muestra de suero en la tira de acetato de celulosa, en el extremo próximo al cátodo.

- Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 100 voltios durante 60 minutos.

Revelado:- Finalizada la separación, depositar las tiras en una cubeta con solución de

tinción, de modo que queden cubiertas por el líquido, durante 10 minutos.- Lavar las tiras en solución de destinción hasta que se observen bien las

bandas de proteína (rojo) sobre un fondo blanco.TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOSDibujar el patrón de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de proteínas séricas, indicando la posición de ánodo y cátodo así como el punto de aplicación de la muestra. Identificar las proteínas que corresponden a cada banda y justificar el orden.

Comentario: ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

TRANSAMINACIÓNUna de las reacciones generales de los aminoácidos es la transaminación o trasporte de un grupo amino de un aminoácido a un cetoácido, trasformado al primero en cetoácido y al segundo en aminoácido. Esta transformación posibilita la formación de carbohidratos a partir de aminoácidos, esto es el fenómeno de la neoglucogénesis.

LA ecuación general de estas reacciones es:

R=CH-COOH + R-C-COOG R-C-COOH+R-CH-COOH

Nh2 O O NH2

En el caso de nuestro experimento la transaminasa que estudiaremos es la transaminasa glutámico pirúvica que transforma el alfa cetoglutárico (cetoácido) en glutámico (aminoácido) y a la alanina (animoácido) en perúvico (cetoácido).Esa enzima que es particularmente rica en el tejido hepático es un excelente herramienta de estudio clínico de ese órgano, en problemas como la hepatitis o la cirrosis hepática.

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El procedimiento de análisis se llevará a cabo mediante la cromatografía en capa fina.

PROCEDIMIENTO CROMATOGRÁFICOS

La cromatografía es un procedimiento de análisis por el cual una mezcla de moléculas es separada en sus componentes mediante el uso de una fase estacionaria y una móvil.

La fase estacionaria o soporte da nombre al tipo de cromatografía: papel, columna, capa fina y la fase móvil es líquida o gaseosa.

La separación de componentes se produce por el fenómeno de partición por solventes, esto es ante una mezcla de líquidos no miscible entre sí, algunos componentes tendrán mayor posibilidad de localizarse en uno u otro componente, aquellos que se localicen en el componente más lejano del soporte migraran más y aquellos cercanos serán adsorbidos por el soporte.

Existen una forma identificatoria de medir la migración de las moléculas analizadas y es el Rf. Este valor corresponde a la relación entre los cm migrados por la molécula y aquellos migrados por el medio móvil.

13. EXPERIMENTO: Demostración de transaminación por cromatografía

Preparar 4 tubos de acuerdo la esquema:

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TUBO Nº 1 2 3 4

ml cetoglutarato 0,2 M0,3 0,3 0 0

ml alanina 0,2M0,3 0,3 0 0

ml piruvato 0,2M0 0 0,3 0,3

ml glutamato 0,2M0 0 0.,3 0,3

ml arsenito 0,1M0,4 0,4 0,4 0,4

ml Enzima activa0 1 0 1

ml Enzima inactiva1 0 1 0

Incubar todos los tubos por 45 minutos a 37ºC. Retirar los tubos del baño de María y agregar 6ml de alcohol etílico a cada tubo. Agitar y esperar por dos minutos. Centrifugar y usar los sobrenadantes para la cromatografía.

CromatografíaMarcar a 3 cm del borde una línea suave con un lápiz, tratando de no dañar la sílica gel. Marcar en esa línea seis puntos separados por 2 cm cada uno. Colocar en cada punto cinco gotas del respectivo sobrenadante y en las dos últimas 5 gotas de alanina y cinco de glutamato respectivamente. Dejar secar

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RF =-----------------

a

b

ab a

Colocar la cromatoplaca en una cámara de cromatografía con una mezcla de propanol: agua en la proporción de 8: Dejar correr hasta que el nivel líquido le falte 1 cm para llegar al extremo de la placa. Marcar el nivel al que alcanzó el líquido con un lápiz y dejar secar.

Aplicar con un spray una solución de ninhidrina al 0,1% e butanol. Colocar a la estufa por 10 minutos. Marcar las manchas obtenidas.

Obtener el Rf de cada mancha mediante la fórmula:

Distancia de origen al punto medio de la mancha Rf:

Distancia de origen al nivel máximo del solvente

Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

EVALUACIÓN NUTRICIONAL

Experimento 1.- Manejo de Tablas de Composición de Alimentos

La forma más exacta de evaluar la ingesta de nutrientes por un sujeto es a través del cálculo de la ingesta alimentaria, bien documentada y exacta y mediante las Tablas de Composición de Alimentos. En la presente práctica analizaremos:

1. Las necesidades calóricas de un sujeto: tomando en cuenta, peso y trabajo. Así conocemos que una persona gasta como Metabolismo Basal 1 kcaloría /kg. Peso/hora. A ello añadimos aproximadamente un 50% por trabajo de mediana intensidad.

2. Las necesidades proteícas de un sujeto: tomado su peso, aceptamos una necesidad de 1g/kg de peso/día( en condiciones mínimas 0,5/kg peso/día).

3. Las necesidades de nutrientes (proteína, carbohidratos y grasa) de un día al azar. Con ello podemos establecer su ingesta calórica y proteíca y por lo tanto su déficit o adecuación.

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Para el efecto usaremos la siguiente Tabla de Composición de Alimentos resumida.

TABLA DE COMPOSICIÓN DE ALIMENTOSg/100g de alimento

Alimento Proteína Lípido Carbohidratos

Atún (conserva) 29,0 4,8 0,0Bacalao (seco) 81,8 2,8 0,0Calamar 16,4 0,9 0,0Camarón 17,3 0,2 2,5Carne (cerdo) 15,0 15,1 0,0Carne (Pavo) 20,1 20,2 0,0Carne (pollo) 18,2 10,2 0,0Carne (pulpa) 21,3 1,6 0,0Carne Seca 48,1 9,4 0,0Chicharrones 11,3 61,4 0,0Cojinova 20,2 0,7 0,0Corvina 19,9 0,9 0,0Hígado 19,5 6,6 3,6Huevo (total) 12,8 11,8 1,0Jamón del País 15,9 26,6 0,0Jamón Inglés 25,8 20,5 0,0Leche fresca 2,9 3,3 7,0Lenguado 19.0 0,5 0,0Merluza 19,3 0,8 0,0Pejerrey 18,7 1,2 0,0Queso Fresco 16,0 10,3 3,7Queso mantecoso 25,8 20,2 7,4Tocino 9,1 65,0 1,6Trucha 18,2 1,0 0,0

Alimento Proteína Lípido Carbohidratos

Arroz (seco) 6,5 0,7 78,1Arveja (verde) 8,3 0,7 24,2

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Avena 10,6 0,9 68,5Bizcocho 8,8 6,9 64,4Camote 1,2 0,2 27,1Fideos 8,7 0,3 78,3Frejol negro 21,2 1,7 53,3Frejol soya 33,4 16,4 35,5Frejol tarhui 40,9 13,4 27,3Galletas (soda) 9,4 14,7 67,9Galletas (Vainilla) 6,0 12,7 75,0Garbanzo 19,1 5,1 61,4Lentejas 22,8 1,2 59,4Maíz (cancha) 6,7 2,7 79,8Maíz (choclo) 3,3 0,8 27,8Maní 28.8 46,9 18,1Nuez 13,7 67,2 13,2Olluco 0,8 0,1 14,2Pallares 19,9 1,1 61,8Pan (frances) 9,2 0,3 68,2Papa blanca 2,1 0,3 22,4Papa Seca 8,3 0,5 73,2Quinua 11,9 4,7 67,6Yuca 0,8 0,2 39.3

Alimento Proteína Lípido Carbohidratos

Aceitunas 1,2 33,2 6,8

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Blanquillo 0,6 0,1 17,1Cebolla 0,9 0,1 7,4 Coco 3,8 18,9 19,7Col 1,4 0,0 5.2Coliflor 2,0 0,6 5,8Lechuga 1,4 0,2 3,3Nabo 0,8 0,2 5,2Pepina 0,5 0,1 2,7Rabanitos 0,8 0,0 3,1Tomate 0,8 0,2 4,0Zanahoria 0,6 0,4 9,5Zapallo 0,7 0,2 6,4

Alimento Proteína Lípido Carbohidratos

Aceite 0,0 100 0,0Azucar 0,0 0,0 99,5Chocolate 2.0 30,0 60,0Cocoa 9,0 19,0 31,0Gelatina(seca)* 85,6 0,1 0,0Limón 0.5 0,0 11,2Maizena 8,0 3,0 74,0Margarina 0,6 81 0,4Naranja 1.2 0,0 11,2Palta 1,7 12,6 6,5Papaya 0,4 0,1 8,3Platano isla 0,8 0,2 23,8Uva negra 0,3 0,1 17,9

* Se usan al 3-4g%

GASTOS DE ENERGIA DE ACUERDO A ACTIVIDAD Y SEXO

ACTIVIDAD MUJER : Kcal /kg/hora

HOMBRE : Kcal /k Kg/hora

Durmiendo 1,1 1,0 – 1,2 ,9-

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Muy Ligera: manejo de auto, laboratorio, mecanografía, coser y planchar

2,0 1,2 – 2.5 1,1-

Ligera: caminar, carpintería, mecanica, lavado de ropa

3,9 2,5-4,9 2,0-

Moderada: fregar pisos, ciclismo, tenis, baile

5,9 5,0-7,4 4,0-

Pesada: albañil, natación, fútbol, básquetbol.

10,0 7,5-12,0 6,0-

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