Guía Laboratorio Separacion de Celulas
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ESCUELA DE MEDICINA – DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER LABORATORIO BIOLOGÍA CELULAR SEPARACION DE CÉLULAS INTRODUCCIÓN Para investigar los procesos de una célula en particular se requiere aislarla del tejido. Existen distintos procedimientos técnicos dependiendo del tejido, tipo de célula y el propósito del estudio. En la sangre periférica circulan varias células del tejido linfoide: mononucleares (linfocitos y monocitos), polimorfonucleares (basófilos, neutrófilos y eosinófilos), eritrocitos y plaquetas. Uno de los procedimientos más rápidos y de bajo costo para separar células de sangre periférica es la centrifugación basada en la densidad de flotación de cada célula. Para esto se usa una solución que contiene sacarosa y diatrizoato de sodio con densidad de 1.077 g/mL que se conoce como Ficoll-Hypaque. En esta solución las plaquetas y mononucleares flotan quedando en capas en la parte superior y los polimorfonucleares y eritrocitos se precipitan por ser de mayor densidad. OBJETIVO Obtener mononucleares de sangre periférica por centrifugación en Ficoll -hypaque MATERIALES Muestra de sangre anticoagulada (tubo con heparina o citrato) PBS libre de Ca + y Mg ++ Fycoll hypaque Tubos de centrífuga de 15 mL Pipetas de vidrio Pipeteador o pera Pipetas Pasteur de plástico cámara de Neubauer centrífuga PROCEDIMIENTO 1. Tomar una muestra de sangre en tubos con heparina o citrato de sodio. 2. Tomar 5 ml de la sangre y realizar una dilución 1:1 con PBS 3. En un tubo de centrifuga agregar 2 ml de ficoll hypaque y lentamente adicionar 8 ml de la mezcla de sangre y PBS por las paredes del tubo 4. Cuidadosamente llevar a centrifugar a 1500 rpm por 30 minutos 5. Extraer toda la capa de CMSP con pipeta Pasteur de plástico y pasar a otro tubo de centrifuga. 6. Resuspender con 10 mL de PBS, centrifugar a 1500 rpm por 15 minutos 7. Descartar el sobrenadante por inversión y resuspender el pellet celular en 2 ml de PBS
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ESCUELA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BSICAS UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER LABORATORIO BIOLOGA CELULAR SEPARACION DE CLULAS INTRODUCCIN
Parainvestigarlosprocesosdeunaclulaenparticularserequiereaislarladeltejido.Existen distintos procedimientos tcnicos dependiendo del tejido,tipo de clula y el propsito del estudio. Enlasangreperifricacirculanvariasclulasdeltejidolinfoide:mononucleares(linfocitosy monocitos),polimorfonucleares(basfilos,neutrfilosyeosinfilos), eritrocitosyplaquetas.Uno de los procedimientos ms rpidos y de bajo costo para separar clulas de sangre perifrica es la centrifugacinbasadaenladensidaddeflotacindecadaclula.Paraestoseusaunasolucin quecontienesacarosaydiatrizoatodesodiocondensidadde1.077g/mLqueseconocecomo Ficoll-Hypaque.Enestasolucinlasplaquetasymononuclearesflotanquedandoencapasenla parte superior y los polimorfonucleares y eritrocitos se precipitan por ser de mayor densidad. OBJETIVO Obtener mononucleares de sangre perifrica por centrifugacin enFicoll -hypaque MATERIALES Muestra de sangre anticoagulada (tubo con heparina o citrato)PBS libre de Ca+ y Mg++ Fycoll hypaque Tubos de centrfuga de 15 mL Pipetas de vidrio Pipeteador o pera Pipetas Pasteur de plstico cmara de Neubauercentrfuga PROCEDIMIENTO 1.Tomar una muestra de sangre en tubos con heparina o citrato de sodio. 2.Tomar 5 ml de la sangre y realizar una dilucin 1:1 con PBS3.En un tubo de centrifuga agregar 2 ml de ficoll hypaque y lentamente adicionar 8 ml de la mezcla de sangre y PBS por las paredes del tubo4.Cuidadosamente llevar a centrifugar a 1500 rpm por 30 minutos 5.Extraer toda la capa de CMSP con pipeta Pasteur de plstico y pasar a otro tubo de centrifuga. 6.Resuspender con 10 mL de PBS, centrifugar a 1500 rpm por 15 minutos 7.Descartar el sobrenadante por inversin y resuspender el pellet celular en 2 ml de PBS8.Realizar conteo en cmara de Neubauer o laminilla y verificar viabilidad celular con colorante azul de tripano, el cual ingresa en clulas muertas. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1.Por qu se separan las clulas en diferentes fases? 2.Qu otros mtodos de separacin de CMSP se pueden aplicar? 3.Cul es el fundamento del colorante para viabilidad azul de tripano? 4.Mencione al menos cinco propsitos de la separacin de CMSP
