GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS

Y PREGUNTAS SOBRE TEMAS DE LAS CLASES

TEÓRICAS

CURSO DE INMUNOLOGÍA BÁSICA

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

U.N.C.P.B.A.

2015

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CURSO DE INMUNOLOGÍA BÁSICA

2015

Contenidos

I Inmunobiología

1. Introducción a la Inmunología: referencias históricas.

2. Inmunología; relaciones con otras ciencias. Especialidades.

3. Inmunidad; funciones; clasificación.

I.I Sistema inmunitario

1. Sistema inmunitario o inmunocompetente; Composición: órganos. Sector de formación.

Médula ósea. Células troncales. Mielopoyesis y linfopoyesis. Citoquinas participantes.

Sector de diferenciación (órganos primarios). Timo; bolsa de Fabricio; placas de Peyer

ileocecales. Sector de activación y de generación de respuestas inmunitarias (órganos

secundarios) médula ósea; ganglios linfáticos; bazo. Tonsilas, nódulos linfoides.

Estructura relacionada con la función.

2. Sistema inmunitario asociado a mucosas; organización y función. Sectores inductivos y

efectores. Linfocitos intraepiteliales. Placas de Peyer yeyunales. Células M.

3. Células: clasificación; ontogenia. Linfocitos T y B; marcadores; receptores; recirculación;

maduración final. Subpoblaciones T (Th1, Th2, Th3); polimorfonucleares neutrófilos,

eosinófilos y basófilos; mastocitos; plaquetas.

4. Células presentadoras; macrófagos; sistema de Langerhans; células dendríticas

(interdigitantes); endoteliales; linfocitos B. Otras células. Importancia; funciones.

I.2 Inmunidad Innata

1. Factores condicionantes: genéticos, nutricionales, edad, estrés, sanidad.

2. Barrera cutáneo-mucosa, piel. Aparato digestivo. Aparato respiratorio. Aparato

genitourinario. Glándula mamaria. Ojos.

3. Mecanismos de reconocimiento inmunitario innato (inmunidad innata): Patrones

moleculares asociados a patógenos (PMAP). Receptores para PMAP.

4. Indicadores tempranos de infección: inflamación: signos clínicos; dinámica. Proteínas

de fase aguda (PFA). Colectinas. Pentraxinas: proteína C reactiva, amiloide sérico.

Proteínas fijadoras de manosa y de lipopolisacáridos. Sistema del Complemento;

nomenclatura. Vías de activación: vía clásica: inductores; unidad de reconocimiento;

unidad de activación; unidad de ataque de membrana; amplificación. Vía alterna:

inductores; unidad de activación; unidad de ataque de membrana; amplificación. Vía de

las lectinas. Enzimas líticas: Lisozima y otras. Interferones tipo I.

5. Sistemas de captura de material extraño. Fagocitosis. Sistema mieloide:

polimorfonucleares neutrófilos; polimorfonucleares eosinófilos. Sistema Fagocítico

Mononuclear; Células de Langerhans. Quimioquinas: función en la infección. Selectinas.

Integrinas. Mecanismo de la fagocitosis. Funciones. Mecanismos microbicidas

dependientes e independientes del oxígeno. Compuestos microbicidas derivados del

nitrógeno. Defensinas.

6. Células Asesinas Naturales (NK): tipos; características; funciones y mecanismos de

acción. Perforinas y granzimas.

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I.3 Inmunidad adaptativa: Inmunógenos y Antígenos.

1. Inmunógenos; Inmunogenicidad. Atributos de un inmunógeno: exogenicidad, tamaño,

estabilidad metabólica, estado biológico. Efecto de la dosis, adyuvantes, especie animal,

edad.

2. Especificidad. Antígenos: características, clasificación. Composición química: proteínas,

hidratos de carbono, lípidos, mixtos o combinados. Antígenos timoindependientes y

timodependientes. Epitopes T y B. Superantígenos y su relación con la enfermedad.

Competición antigénica; importancia. Metabolismo: características; fases; destino.

I.4 Generación y expresión de la respuesta inmunitaria adaptativa.

1. Inmunidad adaptativa (adquirida o específica). Inmunidad mediada por anticuerpos;

inmunidad mediada por células.

2. Procesamiento de proteínas y presentación de antígenos. Células presentadoras

profesionales y no profesionales. Células dendríticas, macrófagos y linfocitos B. Génesis

de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (mCMH: clases I y II). Vías

de procesamiento endógena (citosólica) y exógena (endosómica). Circuitos del antígeno

(péptido) dentro de la célula presentadora. Presentación. Interacción con receptores y

correceptores. CD4 y CD8; B7. Superantígenos. Interacción con LT . Importancia de la

vía de procesamiento en el establecimiento de una respuesta efectora adecuada.

Presentación de antígenos no peptídicos. Presentación vía CD1.

3. Inmunidad mediada por anticuerpos: Inmunoglobulinas; Anticuerpos; selección clonal.

Anatomía y dinámica de los centros germinativos: inducción, ubicación ganglionar,

procesamiento, presentación, colaboración celular, proliferación celular; hipermutaciones

y ajuste de la afinidad; cambio de isotipo; diferenciación celular. Célula plasmática:

biosíntesis de Ac; célula B de memoria.

4. Inmunoglobulinas: síntesis, composición; estructura; dimensiones; propiedades;

distribución; funciones; catabolismo; isotipos; subisotipos; idiotipos; alotipos. Nociones

sobre generación de la diversidad. Inmunoglobulinas secretorias: inducción; isotipos; Ig

A secretoria: biosíntesis, estructura, secreción, circuito enterohepático, funciones.

5. Dinámica de la respuesta inmunitaria; respuesta primaria y secundaria: evolución y

características. Cambio isotípico. Afinidad. Memoria inmunitaria.

6. Inmunidad mediada por células: inducción: linfocitos T efectores: linfocitos T de

hipersensibilidad tardía; linfocitos T citotóxicos; linfocitos T colaboradores; linfocitos T

supresores; linfocitos T de memoria Fenómenos de citotoxicidad. Apoptosis. Citotoxinas:

perforina y granzimas. Activación del macrófago.

I. 5 Regulación de la Respuesta Inmunitaria

1. Mecanismos de control: importancia; tipos: fisiológicos, celulares, genéticos, (i) por el

inmunógeno: Tolerancia inducida; características: tipos de inmunógenos, dosis, vía,

edad, aparición, persistencia, uso de drogas; inducción: subpoblaciones LT y LB; (ii) por

los Ac: mecanismos de retroalimentación, concentración de Ig, inmunocomplejos (IC),

idiotipos; (iii) por células: mecanismos de restricción del CMH, linfocitos CD4 y CD8,

macrófagos supresores; (iv) por otros factores.

2. Equilibrio de respuesta inmunitaria humoral versus celular. Nociones de respuesta de

tipo I y tipo II. Citoquinas reguladoras.

II Inmunodiagnóstico

1. Pruebas in vitro: Reactantes: tipos, obtención, manejo, conservación. Suero, plasma,

otros fluídos biológicos. Detección de Ig totales.

2. Unión Ag-Ac: teorías, fase específica, fuerza de unión, afinidad, avidez; fase inespecífica:

factores condicionantes, clasificación: interacción primaria, secundaria y terciaria.

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3. Pruebas de interacción primaria: tipos: radioinmunoensayo, inmunofluorescencia,

inmunoenzimáticas (ELISA, Western blot, dot-blot): Fundamentos.

4. Pruebas de interacción secundaria: tipos: precipitación en medios líquidos y

gelificados; aplicación; aglutinación: directas, indirectas; aplicaciones. Fundamentos.

5. Expresión del resultado de una prueba: pruebas cualitativas, semicuantitativas y

cuantitativas. Título: significado y determinación. Conversión serológica.

6. Estudio de las proteínas séricas: electroforesis, inmunoelectroforesis, aplicaciones.

7. Anticuerpos monoclonales: propiedades, obtención y aplicaciones.

III Inmunoprofilaxis

1. Inmunoprofilaxis: Objetivos. Inmunidad activa: vacuna: finalidad, características:

seguridad y eficacia; clasificación: (i) por su finalidad, (ii) por su substrato, (iii) por su

especificidad, (iv) por su estado biológico, (v) por la vía de aplicación.

2. Vacunas y respuesta inmunitaria: vías de inmunización en relación con la patogenia y

la respuesta inmunitaria buscada, selección, aplicaciones.

3. Vacunas convencionales: tipos. Atenuación: por pasajes en otras especies o por cultivos.

Razones de la atenuación: ejemplos. Vacunas inactivadas. Métodos de inactivación.

4. Adyuvantes. Tipos. Clasificación (origen animal, vegetal, mineral, sintético).

Mecanismos de acción. Inmunomodulación. Usos.

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PERFIL DEL CURSO

Departamento: Sanidad Animal y Medicina Preventiva (SAMP)

Cuatrimestre de Dictado: 1er

Cuatrimestre

Duración: 11 semanas

Página web: http://www.vet.unicen.edu.ar/facultad/areas

Organización:

Clases guía: 9

Talleres:3

Taller de integración: 1

Trabajos Prácticos: 6

Integrantes del curso:

Guillermo Arroyo, M. V. gharroyo@vet.unicen.edu.ar

Silvia Estein, M. V., Dr. silmares@vet.unicen.edu.ar

Analía Etcheverría, M. V., Dr analiain@vet.unicen.edu.ar

Silvina Gutiérrez, M. V., Dr. segutier@vet.unicen.edu.ar

Paula Lucchesi, Ing. Agr., Dr. paulaluc@vet.unicen.edu.ar

Claudia Lützelschwab, M.V., Dr. clutz@vet.unicen.edu.ar

Nora Lía Padola, M. V., Dr. nlpadola@vet.unicen.edu.ar

Marcelo Sanz, M.V., Dr. msanz@vet.unicen.edu.ar

Daniel Fernández, M.V., Dr. dfer_inm@vet.unicen.edu.ar

Vanesa Fernández, M.V. vanesaf@vet.unicen.edu.ar

Descripción del curso:

El curso provee conocimientos sobre los componentes del sistema inmune y los

mecanismos inmunológicos básicos, cubriendo aspectos importantes para la formación del

profesional veterinario. Estos temas se desarrollarán en las clases guía y luego aspectos de

los mismos se trabajarán durante los talleres. En el taller de integración se realizarán

actividades de autoevaluación con una discusión grupal posterior. Los trabajos prácticos

desarrollarán los fundamentos de las pruebas de diagnóstico con base inmunológica más

importantes para el diagnóstico clínico. Los talleres y los trabajos prácticos son de

asistencia obligatoria.

Objetivos

A-Objetivos del Curso

Los objetivos del curso son:

1. Comprender los conceptos más importantes sobre los que se basa el funcionamiento

del sistema inmune.

2. Conocer las funciones de tejidos, células, proteínas y genes del sistema inmune.

3. Comprender los mecanismos, interacciones y regulación de la respuesta inmune.

4. Conocer el fundamento de los métodos con base inmunológica utilizados para el

diagnóstico veterinario.

B-Objetivos de aprendizaje

Para que el alumno adquiera dominio de la fisiología del sistema inmune debe lograr:

1. Adquirir el vocabulario específico de la materia.

2. Identificar los estímulos capaces de activar al sistema inmune.

3. Conocer la diferencia conceptual entre la inmunidad innata y adaptativa.

4. Comprender los mecanismos humorales y celulares que intervienen en la inmunidad

innata.

5. Comprender los mecanismos que intervienen en la respuesta humoral y celular de la

respuesta inmune adaptativa y su regulación.

6. Explicar los principios de la inmunoprofilaxis

6

7. Comprender los fundamentos de los métodos inmunológicos utilizados para el

diagnóstico veterinario.

Objetivos de

aprendizaje

Recursos para la

enseñanza Evaluación

Aptitudes que se

pretende

desarrollar

B1, B2, B3, B4, B5,

B6

Clases teóricas

guía

Talleres

Taller de

integración

Uso de libros de

texto y material

seleccionado por los

docentes

Confección de

glosario personal

Evaluación

mediante 1 examen

parcial escrito y

talleres

Evaluación

formativa durante el

taller de integración

Selección de

conceptos relevantes

Comprensión e

interrelación de

componentes y

mecanismos

Comprensión de

los mecanismos

inmunitarios más

importantes

Adquisición y

desarrollo de una

metodología de

estudio

B7

Clases prácticas

Clases teóricas

guía

Taller

Uso de libros de

texto y material

seleccionado por los

docentes

Evaluación

escrita de trabajos

prácticos

Examen parcial

escrito

Manejo de

material de

laboratorio

Comprensión del

fundamento de las

pruebas con base

inmunitaria.

Bibliografía • Tizard I.R. 2009. Introducción a la Inmunología Veterinaria: 8va ed. Elsevier España

S. L. ISBN 978-84-8086-431-2.

• Abbas, A.K., Lichtman, A.H., Pillai, S. 2008. 6ta. Ed. Elsevier. ISBN N°

9788480863117

• Fainboim, L., Geffner, J. Editores. 2011. Introducción a la Inmunología Humana. 6ª

Ed. Editorial Médica Panamericana. ISBN 978-95-0060-.70-92.

• Pennimpede, E., Gomez, C., Stanchi, N. Editores. 2004. Introducción a la

Inmunobiología. 1º Ed. Edulp. La Plata. Argentina. ISBN 950-34-0259-x.

• Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Shlomchik, Mark. 2001.

Immunobiology. 5th ed. New York and London: Garland Publishing;. ISBN 0–8153–

3642–X (en inglés).

Parham, Peter. 2000. The Immune System. New York and London: Garland

Publishing ; ISBN 0-8153-3043-X (en inglés).

Regueiro, J.R.; Lopez Larrea C. 1996. Inmunología. Biología y Patología del sistema

inmune. 2da Ed. Editorial Medica Panamericana S.A. ISBN 84-7903-403-3

Rojas-Espinosa, O. 1996. Inmunología (de memoria). 1ª Ed. Editorial Médica

Panamericana, S.A. de C.V. ISBN 968-7157-72-0

• Material complementario elegido por los docentes.

• Guía de Trabajos Prácticos. Curso de Inmunología Básica 2015. Disponible en

Fotocopiadora del Centro de Estudiantes. Estará disponible también en la página web del

curso.

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Conocimientos Previos requeridos

Se espera de los alumnos tengan conocimiento básico de:

• biología celular

• anatomía macroscópica

• histología del sistema linfático y sanguíneo

Estructura de los talleres:

Los talleres de Inmunidad Innata y los de Inmunidad Adaptativa serán realizados en grupos

reducidos a cargo de un docente. Se trabajará con participación activa de los alumnos, los

cuales deberán representar de manera gráfica los conceptos más relevantes de los mecanismos

inmunológicos y responder preguntas, teniendo como objetivo mostrar de una manera clara y

sencilla un resumen del contenido teórico seleccionado para el taller. Los talleres contarán

con una evaluación individual al inicio de los mismos, referida a conceptos clave

correspondientes al tema del taller.

Estructura del taller de integración: Se realizará luego de la última clase guía, previo al parcial, para reforzar e integrar los

conceptos más importantes.

Se trabajará respondiendo un cuestionario y luego se discutirán las respuestas entre docentes y

alumnos.

La presentación verbal de los temas planteados en cada taller a los docentes y al resto de los

alumnos ejercitará la expresión oral de los alumnos, fomentará la discusión de los temas,

ayudará a la comprensión e integración de los mismos y contribuirá al dominio del

vocabulario específico.

Estructura de las clases prácticas:

Las clases prácticas introducirán a los fundamentos de las principales pruebas inmunológicas

utilizadas en diagnóstico veterinario, para lo cual se cuenta con una guía de trabajos prácticos

que contiene los fundamentos teóricos del tema a desarrollar y que cada alumno debe traer

leída al momento del práctico. Se desarrollarán en 3 comisiones de trabajo en los laboratorios

del edificio SAMP e incluirán una explicación de 15 minutos por parte de los docentes, con

participación activa de los alumnos, y luego la realización de tareas de laboratorio, lectura de

pruebas serológicas y actividades de integración de fundamentos teóricos.

Evaluaciones:

Trabajos prácticos: serán evaluados mediante un breve cuestionario escrito al final de la

actividad de laboratorio y calificados como “aprobado” o “desaprobado”.

Examen parcial: será escrito, con preguntas estructuradas, semiestructuradas y a desarrollar.

-Condiciones de aprobación del curso:

1) 75% de asistencia y aprobación de actividades obligatorias (mínimo de 7 actividades

prácticas aprobadas de un total de 10 que incluyen: 6 trabajos prácticos, 3 talleres y un

taller de integración):

2) Aprobación del examen parcial y del examen final.

-Para poder recuperar, deben tener un mínimo de 4 actividades prácticas aprobadas, dado

que se recupera hasta el 50% de las actividades obligatorias desaprobadas. Los ausentes sin

certificado no se recuperan.

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Los certificados médicos se deben traer dentro de las 48 hs de la inasistencia (hasta martes

siguiente inclusive)

Un ausente con certificado a una actividad obligatoria se recupera el viernes siguiente

Clases de consulta:

Se atenderán consultas, con el fin de aclarar temas puntuales, en la oficina de atención de

alumnos del edificio SAMP, en los horarios que figuren en cartelera.

TRABAJOS PRÁCTICOS

TP 1: Toma y conservación de muestras. Proteinograma. Serología. Medición de

Ig totales

Objetivos: Que el alumno:

Conozca las muestras más utilizadas para la detección de anticuerpos y/o antígenos en el

diagnóstico serológico, su obtención, remisión y conservación, y los fundamentos de la

serología.

Reconozca distintas técnicas para evaluar los niveles de Ig totales.

Contenido

Venas de elección para la extracción de sangre en las diferentes especies. Material necesario,

modo de obtención. Toma de muestra con y sin anticoagulantes. Remisión al laboratorio

(tiempo y temperatura de remisión).

Separación de plasma y suero. Características de una buena muestra. Conservación de la

muestra (tiempo y temperaturas adecuadas).

Serología, definición y valor diagnóstico. Anticuerpos. Fuerzas de unión entre anticuerpos y

antígenos.

Toma de otros tipos de muestra: secreciones (leche, calostro, lágrima, mucus, secreción

vaginal y prepucial, semen y plasma seminal, líquido articular, etc) y tejidos (biopsias).

Observación de diferentes técnicas para evaluar los niveles de Ig totales: Proteinograma

electroforético, precipitación de Ig con sales, coagulación con glutaraldehído y densitometría.

TP2 : Pruebas de interacción primaria: fundamentos

Objetivos: Que el alumno:

Comprenda los fundamentos de las principales técnicas serológicas de interacción primaria

utilizadas en diagnóstico veterinario.

Utilice el material de laboratorio para realizar algunos pasos de las pruebas de ELISA.

Interprete diferentes variantes de pruebas de ELISA y sus posibles resultados.

Contenido

Clasificación de las pruebas serológicas. Técnicas de interacción primaria. Concepto.

Fundamentos, conjugado, tipos de marcadores, enzimoinmunoensayo (ELISA),

inmunofluorescencia directa e indirecta (IFD, IFI), ensayo de polarización de la fluorescencia

(FPA), radioinmunoensayo (RIA), Inmunocromatografía Western Blot, Citometría de flujo.

Aplicación en la identificación de células.

TP3: Pruebas de interacción primaria: ELISA e inmunocromatografía

Objetivos: Que el alumno:

Conozca los pasos de una prueba de ELISA indirecto, comprenda la importancia del uso de

controles en la pruebas de laboratorio e interprete los resultados.

Conozca las etapas de una prueba de inmunocromatografía e interprete los resultados.

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Contenido

Clasificación de las pruebas serológicas. Técnicas de interacción primaria. Concepto.

Fundamentos, conjugado, tipos de marcadores, enzimoinmunoensayo (ELISA),

Inmunocromatografía. Título de un suero.

TP4: Pruebas de interacción secundaria: fundamentos

Objetivos: Que el alumno comprenda los fundamentos de las principales técnicas serológicas

de interacción secundaria utilizadas en diagnóstico veterinario.

Contenido

Pruebas de interacción secundaria. Concepto. Fundamento, clasificación (aglutinación en

placa, aglutinación en tubo, inmunodifusión radial, inmunodifusión bidimensional), detección

de diferentes isotipos de Ig. Fenómeno de prozona.

TP5: Pruebas de interacción secundaria: Aglutinación y precipitación

Objetivos: Que el alumno:

Realice pruebas de aglutinación en placa (rápidas).

Observe los resultados de pruebas de aglutinación en tubo (lentas) y de inmunodifusión radial

y bidimensional.

Realice reacciones de aglutinación cualitativas y semicuantitativas.

Identifique el isotipo responsable de la aglutinación, comparando los resultados de la prueba

en presencia y ausencia de -mercaptoetanol.

Explique el fenómeno de prozona.

Contenido

Pruebas de interacción secundaria. Fundamento, clasificación (aglutinación en placa,

aglutinación en tubo, inmunodifusión radial, inmunodifusión bidimensional), detección de

diferentes isotipos de Ig. Fenómeno de prozona. Título de un suero.

TP6: Características de la pruebas serológicas. Integración de TP

Objetivos: Que el alumno:

Discuta conceptos importantes relacionados con la serología.

Identifique y describa las pruebas serológicas adecuadas para distintas situaciones.

Contenido

Conversión serológica o seroconversión, Ac monoclonales, afinidad, avidez, especificidad de

un Ac, reacción cruzada, sensibilidad y especificidad de una prueba serológica. Pruebas de

interacción primaria y secundaria.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº1

TOMA Y CONSERVACIÓN DE MUESTRA – PROTEINOGRAMA – SEROLOGÍA -

MEDICIÓN DE Ig TOTALES

Extracción sanguínea: obtención de plasma y suero, remisión y conservación de la

Muestra.

La toma de muestra es una etapa esencial para asegurar un buen diagnóstico. En la extracción

sanguínea es imprescindible que se utilice material limpio y seco (agujas de calibre adecuado,

jeringas, tubos rotulados, tapones) para evitar la contaminación y hemólisis de la muestra. Es

importante conocer para qué se utilizará la muestra y qué volumen de muestra es necesario

tomar. Si se desea obtener sangre para recuento de células sanguíneas, para analizar la

presencia de microorganismos o para obtener plasma, la extracción debe realizarse en tubos

con anticoagulante (EDTA o heparina). Para obtener suero, la sangre se deja coagular en

determinadas condiciones de tiempo y temperatura.

Las técnicas de extracción varían de una especie a otra, según el vaso sanguíneo de elección y

el espesor, dureza y capa de la piel.

En los rumiantes y equinos, la sangre se extrae de la vena yugular o bien de la vena caudal

(bovinos). La vena yugular se ingurgita por compresión manual del canal yugular y se

introduce la aguja por encima de este punto. La extracción puede realizarse directamente de la

aguja al tubo o con jeringa llevando el émbolo hacia atrás lentamente. También puede

utilizarse el sistema de tubos al vacío (tipo vacutainer), que presentan mayor facilidad de uso

y garantía en cuanto a la asepsia y preservación de las muestras. Este sistema manejado en

forma adecuada presenta un menor riesgo de hemólisis de las muestras con respecto al

sistema de extracción con jeringa. Si la extracción se practica sin jeringa, para que no se

genere turbulencia y se produzca la hemólisis, se saca la aguja y se deja que la sangre fluya

lentamente por las paredes del tubo. Cuando la extracción se realiza a partir de la vena caudal,

se levanta la cola y se introduce la aguja a 15 cm de la base de la cola en la línea media hasta

que penetre en el vaso.

En cerdos la muestra se obtiene a partir de la punción de la vena de la oreja.

Sangre entera

Suero

Plasma

Sangre con anticoagulante

Sangre sin anticoagulante

Leucocitos

Glóbulos rojos

Coágulo

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En perros y gatos la muestra se extrae de la vena cefálica antebraquial o de la vena safena.

En las aves se realiza por punción de la vena radial (alar).

Equino Vena yugular

Bovino, ovino, caprino Vena yugular o vena caudal (bovino)

Cerdo Vena de la oreja

Perro y gato Vena cefálica antebraquial o vena safena

Ave Vena radial

Cuando la muestra se toma con la adición de anticoagulante, luego de verter la sangre entera

en el tubo, se realiza la homogeneización mediante una suave inversión. Cuando la sangre

entera no se procesa inmediatamente, debe conservarse refrigerada (4ºC-8ºC) de lo contrario

se mantiene a temperatura ambiente (20-22ºC). Para obtener el plasma, la sangre se centrifuga

a 1500-2000 r.p.m. durante 10-15 min y se separa la capa líquida (superior). Éste se extrae

mediante aspiración con una pipeta y se almacena en viales o tubos.

Para la obtención del suero, se deja coagular la sangre en el tubo a temperatura ambiente

durante un tiempo mínimo de 1-2 h. y máximo de 12 h. (cuanto más tiempo se deje para que

la retracción tenga lugar, mayor cantidad de suero se obtendrá aunque nunca más del 40% del

volumen total). La coagulación y retracción se produce más rápido si se incuba la sangre en

estufa a 37ºC durante 1-2 hs y luego se lleva a refrigeración durante 30 min. más. El suero

obtenido a partir de la retracción del coágulo es separado con la ayuda de una pipeta. Si

existieran glóbulos rojos en suspensión deberá centrifugarse a 1500-3000 r.p.m. y obtener el

sobrenadante.

La coagulación es un proceso que ocurre a temperatura corporal. Para obtener un buen suero

la muestra se debe incubar entre 20-37ºC (a menor temperatura mayor tiempo de incubación).

Las muestras de suero y plasma (sin células) pueden conservarse refrigeradas (4ºC) si van a

utilizarse en corto plazo, de lo contrario si se pretende una conservación por más tiempo se

distribuye en alícuotas y se congela a (-20ºC). El fraccionamiento evita las congelaciones y

descongelaciones sucesivas las cuales conllevan a la desnaturalización y agregación de las

proteínas.

Las características deseables de un suero o plasma es que sea translúcido e inodoro. Esto

implica que no deben utilizarse en las pruebas serológicas sueros hemolisados o

contaminados.

Otras muestras de utilidad para el inmunodiagnóstico o diagnóstico serológico

Para obtener muestras de secreciones vaginales o de tracto prepucial se realiza la perfusión de

solución salina, luego se colecta el líquido del lavado y se centrifuga para eliminar todo tipo

de partículas.

Cuando se desea obtener plasma seminal debe usarse un electroeyaculador o vagina artificial.

Una vez obtenida la muestra debe centrifugarse para obtener el sobrenadante que se retira con

pipeta.

Las muestras de descargas nasales, lágrimas, secreciones vaginales o prepuciales se realizan

mediante hisopado. Luego el hisopo se coloca en solución salina con el agregado de un agente

bacteriostático durante 24 h. a 4ºC para permitir la difusión de las moléculas. La eliminación

de partículas extrañas se logra mediante centrifugación. La muestra se conserva a (-20ºC).

Las muestras de leche o calostro se toman directamente en el tubo y se agrega algún agente

bacteriostático. La conservación y remisión de la muestra se realiza a 4ºC.

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Muestras de tejidos:

Las muestras tomadas se procesan hasta obtener el preparado histológico en el portaobjetos.

Éste puede utilizarse para la detección de Ag o Ac en pruebas de inmunofluorescencia o

inmunohistoquímica. Estas pruebas también pueden desarrollarse sobre frotis o improntas.

PROTEINOGRAMA ELECTROFORÉTICO

El proteinograma electroforético (o electroforesis de proteínas del suero) es una técnica

simple de laboratorio que permite separar las proteínas séricas en distintas fracciones por

medio de la aplicación de un campo eléctrico.

Esta prueba es muy usada para evaluar y monitorear distintos cuadros clínicos así como

también de gran ayuda en el diagnóstico de distintas enfermedades asociadas a desórdenes

proteicos.

Fundamento:

El plasma contiene muchas proteínas (proteínas transportadoras, enzimas, anticuerpos, etc.).

Tanto la carga eléctrica que poseen las proteínas, dada por los aminoácidos que la componen,

como su peso molecular afectan su movimiento sobre un soporte cuando se aplica un campo

eléctrico. Es decir, pequeñas proteínas altamente cargadas migran más rápido que grandes

proteínas, lo que permite que se separen durante la corrida electroforética.

La distinta velocidad de migración permite la formación de varias bandas o fracciones en el

gel de electroforesis, formadas por grupos de proteínas de tamaño y carga similar.

Procedimiento: Se coloca una pequeña muestra de suero en un soporte, que puede ser de distintos tipos:

- Soportes tipo 1: acetato de celulosa gelificado o agarosa, donde se observan 5-6 bandas de

proteínas plasmáticas (la migración es según relación carga-masa de cada proteína)

- Soportes tipo 2: almidón o poliacrilamida, donde se observan 25 o más bandas (la

migración es según la relación carga-masa y tamaño).

En los laboratorios se usa habitualmente los soportes tipo 1 ya que son más fáciles de

interpretar.

Se coloca el soporte en la cuba de electroforesis con un buffer de corrida de pH y fuerza

iónica determinados tal que las proteínas posean carga eléctrica negativa y migren hacia el

ánodo (polo +) cuando se aplica voltaje.

Luego de terminada la corrida se retira el soporte y se deja evaporar el solvente. Se fijan las

bandas y se colorean con algún colorante para proteínas (según el soporte usado):

- Rojo Ponceau (acetato).

- Negro Amido (agarosa), etc.

Las bandas pueden mirarse a simple vista o leerse con un densitómetro (aparato que permite

cuantificar la intensidad y el ancho de cada banda para conocer el porcentaje de cada fracción

proteica). Si por otro método se determina la concentración de las proteínas totales del suero,

es posible calcular el contenido de cada fracción.

Albúmina

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Fig.1 Gel de un proteinograma de suero normal, y su lectura en densitómetro.

Como se observa en la Fig.1, las proteínas se separan normalmente en 5 fracciones:

albúmina, y , 2, y globulinas

Albúmina: es una proteína que se sintetiza en el hígado, y es la de mayor concentración en el

suero. Además de su función de transportadora de algunas sustancias endógenas y exógenas,

es de gran importancia en el mantenimiento de la presión coloidosmótica y reservorio móvil

de aminoácidos.

globulinas: incluye varias proteínas, algunas se mencionan a continuación:

globulina: incluye principalmente a la -antitripsina, una proteína de fase aguda.

globulina: en esta fracción se encuentra la haptoglobina, una proteína que une

hemoglobina intravascular evitando su excreción por el hígado. También se encuentran

macroglobulina y ceruloplasmina.

En general, los niveles de las proteínas de las fracciones y globulina se incrementan en

inflamación.

globulinas: incluye proteínas de baja densidad involucradas en el transporte lipídico

(lipoproteínas), de hierro (transferrina) y factores del complemento (C3 y C4).

globulinas: en esta fracción están incluidos los Ac del isotipo IgG.

Es importante aclarar que no todos los anticuerpos migran electroforéticamente con las -

globulinas, sino que algunos de ellos lo hacen con las y globulinas. (ver fig.2)

(Fig. extraída de http://inmunologia-online.tripod.com)

Los niveles de gamma globulinas pueden estar disminuidos en hipogammaglobulinemias

como en agammaglobulinemias, mientras que pueden estar aumentados en enfermedades

inflamatorias crónicas (artritis reumatoidea, lupus eritematoso sistémico) e infecciones.

Además de las gammapatías policlonales, el proteinograma también permite identificar

gammapatías monoclonales mediante la detección de bandas estrechas en las fracciones

gamma y beta (y, excepcionalmente, en la fracción alfa).

Las disminuciones de los niveles de Ig pueden corresponder a estados de inmunodeficiencia.

En Medicina Veterinaria se cuantifican inmunoglobulinas por ejemplo, para conocer si un

recién nacido ha recibido suficientes Ig maternas (transferencia de inmunidad de la madre al

recién nacido = inmunidad natural pasiva). El nivel de Ig alcanzado en el suero del neonato

dependerá fundamentalmente de la fuente original de Ig, es decir, el calostro materno

(cantidad consumida y contenido en Ig) y del momento de su ingesta.

Fig. 2

22

2222

2

14

En algunos casos, puede ser necesario evaluar el contenido en Ig del calostro, para saber si es

inmunológicamente adecuado o no. En otros, puede interesarnos conocer el nivel de Ig en

suero del recién nacido o de un animal cualquiera, independientemente de su edad.

En ambos casos, estamos buscando evaluar los niveles de Ig totales.

Para ello se cuenta con diferentes técnicas:

Precipitación de Ig con sales

Coagulación con glutaraldehído

Electroforesis

Inmunoelectroforesis

Inmunodifusión radial cuantitativa

ELISA

Densimetría

PRECIPITACION DE Ig CON SALES (SULFITO DE SODIO O SULFATO DE ZINC)

La prueba de precipitación de Ig con sales como sulfito de sodio o sulfato de zinc, es efectiva

y rápida, mediante ésta es posible determinar la concentración de inmunoglobulinas maternas

en suero del neonato. Permite realizar la prueba varias crías en un mínimo tiempo, y con un

equipo básico, lo cual hace posible su utilización en condiciones de campo. Se basa en la

precipitación de las Ig del suero con sulfito de sodio o con sulfato de Zinc.

Fundamento:

Se utilizan sales de metales pesados como el sulfato de zinc (Zn SO4) o sulfito de sodio

(Na2 SO3) que en determinada concentración pueden unirse al Fc (fracción cristalizable) de las

Ig produciendo un fino precipitado. Se denominan también pruebas turbidimétricas porque la

precipitación enturbia la mezcla (mayor turbidez corresponde a una mayor concentración de

Ig).

COAGULACION CON GLUTARALDEHIDO

El glutaraldehído es un reactivo que tiene la propiedad de coagular las proteínas séricas (razón

por la cual es una sustancia tóxica). El suero se mezcla con una solución de glutaraldehído y

se observa luego si hay formación o no de un coágulo. La formación de un coágulo firme y

adherente indica un nivel adecuado de Ig.

DENSITOMETRIA

El calostro es rico en Ig. Dentro de las fracciones proteicas del calostro, las Ig son las que

sufren mayor variación cuantitativa. Por lo tanto, la densidad del calostro varía más en

función del contenido en Ig que por otros factores. Midiendo la densidad del calostro, se

puede tener una idea aproximada de su contenido en Ig. La densidad puede estimarse

fácilmente mediante el uso de un calostrómetro.

15

1030 1040 1050 1060 1070

20

40

60

80

densidad del calostro

concentración en

inmunoglobulinas

(g/l)

SEROLOGÍA

La serología es la ciencia que estudia la detección de anticuerpos (Ac) en los distintos

líquidos corporales tales como lágrimas, secreciones bronquiales, líquido sinovial, leche,

calostro, plasma seminal, moco vaginal, suero sanguíneo, plasma, etc.

Aunque la palabra "serología" se refiere al suero (y más precisamente, al suero sanguíneo), se

utiliza en un sentido amplio abarcando todas las técnicas empleadas para identificar Ac en

cualquier humor o tejido del organismo. Por ej., en el diagnóstico de algunas enfermedades,

resulta importante detectar Ac en plasma seminal, en moco vaginal, en leche o suero lácteo.

Los Ac son elaborados por las células plasmáticas en respuesta a la estimulación producida

por una molécula extraña para el organismo llamada Ag. Estos Ag se hallan en las bacterias,

los virus, parásitos, hongos, partículas del polvo ambiental, células eucarióticas, etc. Los Ag

poseen sitios de unión (epitopes o determinantes antigénicos) a los cuales se unen los Ac en

forma específica. El número de epitopes constituye la valencia del Ag. Estos pueden ser

iguales o diferentes entre sí, pueden estar repetidos en un mismo Ag (Figura 2).

Figura 3 El suero contiene Ac dirigidos contra los distintos epitopes (1, 2, 3, 4)

Fuerzas de unión Ag-Ac Factores que afectan la unión

Las fuerzas de unión que participan en la interacción Ag-Ac son de tipo no covalente (Figura

4). Si bien cada una de éstas por sí sola es débil, la sumatoria de las mismas crea una

unión estable y reversible. Los factores que influyen en esta unión son:

- pH

- temperatura

16

- tiempo de incubación

- agitación

- concentraciones relativas de Ag-Ac

- concentración de electrolitos

Enlace de

hidrógeno

Enlace

electrostático

Fuerzas de

van der Waals

Fuerzas

hidrofóbicas

O

N

O

N

-

-

+

+

-

+

+

-

- +

+ -

agua excluida

H

H

Anticuerpo Antígeno

Figura 4. Fuerzas de interacción atractivas. Extraído de: Regueiro J.R., López Larrea C.

“Inmunología. Biología y Patología del sistema inmune”. Editorial Médica Panamericana.

1996.

17

TRABAJO PRÁCTICO Nº2

PRUEBAS DE INTERACCION PRIMARIA: FUNDAMENTOS

Clasificación de las pruebas serológicas

Las pruebas serológicas pueden clasificarse en tres categorías principales:

Pruebas de interacción primaria: Detectan la unión Ag-Ac, es decir la formación del

complejo inmune.

- inmunofluorescencia

- ensayo de polarización de luz fluorescente

- radioinmunoensayo

- enzimoinmunoensayo

- inmunocromatografía

Pruebas de interacción secundaria: Detectan la consecuencia de la unión Ag-Ac que se

observa como un aglutinado o precipitado de acuerdo a las características físicas del Ag

(particulado o soluble).

- aglutinación

- precipitación

Pruebas de interacción terciaria: La unión Ag-Ac desencadena un fenómeno biológico

visible in vitro (ej: lisis de glóbulos rojos en la prueba de fijación del complemento) o in vivo

(ej: reacción intradérmica) gracias a la acción de otros efectores solubles o celulares.

- Fijación de complemento

- Pruebas intradérmicas

Título de un suero

El título es una forma de expresar la potencia de un suero inmune. Si en una prueba se

enfrenta al Ag con distintas diluciones del suero a analizar, se puede determinar el título del

suero. El título se expresa como la inversa de la máxima dilución del suero que dio reacción

positiva.

PRUEBAS DE INTERACCION PRIMARIA: Las pruebas de laboratorio que detectan la unión directa (o interacción molecular) entre un Ag

determinado y el Ac específico para ese Ag se conocen como pruebas de interacción

primaria. Estas pruebas pueden ser utilizadas para detectar tanto Ag como Ac en muestras

problema.

Estas pruebas se basan en el reconocimiento de un Ag por parte de los Ac, formando

inmunocomplejos. Normalmente, uno de los dos componentes (Ag o Ac) está adsorbido

(inmovilizado, fijado) en una fase sólida, como por ejemplo un tubo de poliestireno, una placa

multipocillos de plástico, un portaobjetos conteniendo tejidos o células, o una membrana de

nitrocelulosa; y el otro reactivo está "marcado" para facilitar la detección del

inmunocomplejo formado. Luego de producida la interacción entre el Ag y el Ac (para lo cual

se incuba determinado tiempo), se separara el reactivo marcado libre (en exceso) de aquel que

está formando parte de los inmunocomplejos fijos a la fase sólida, para lo cual se realizan

sucesivos lavados.

El "marcado" del Ag o del Ac se realiza mediante la unión covalente con elementos que

emiten una señal característica y observable. A este reactivo (Ag o Ac) marcado se lo

denomina conjugado.

18

Las sustancias marcadoras más comúnmente utilizadas para la fabricación de conjugados son

isótopos radiactivos, enzimas o colorantes fluorescentes; siendo la señal emitida detectada

mediante contadores de radiactividad, a simple vista y/o con espectrofotómetros,

fluorocitómetro y/o microscopio de fluorescencia, respectivamente.

En algunas de estas pruebas se utilizan los anticuerpos anti-inmunoglobulinas. ¿Cómo se

obtienen estos reactivos?: cuando inmunoglobulinas (Ig) purificadas provenientes de una

determinada especie animal (ej. bovino) se inyectan en un animal de otra especie (ej. conejo),

éstas se comportan como Ag (son reconocidas como extrañas). En este caso, el sistema

inmune del conejo reacciona formando anticuerpos (anti-inmunoglobulinas) contra las Ig

bovinas, los cuales se purifican para utilizarlos como reactivo en el laboratorio.

Entre las pruebas de interacción primaria más utilizadas en el diagnóstico de enfermedades se

encuentran

Inmunofluorescencia (IF)

Enzimoinmunoensayo (Enzyme linked immunosorbent assay o ELISA)

INMUNOFLUORESCENCIA

Es una técnica utilizada para la detección de moléculas (tanto Ag como Ac, dependiendo del

diseño) usando reactivos con colorantes fluorescentes, como el isotiocianato de fluoresceína

(FITC), la rhodamina o la ficoeritrina (PE). Estas sustancias al ser excitadas con luz de

longitud de onda del rango ultravioleta (190-380 nm), emiten luz visible de longitud de onda

mayor que se observa como una fluorescencia amarillo-verdosa (FITC, 495 nm) o anaranjado-

rojiza (PE y rhodamina, 480-565 nm).

Existen dos variantes de esta técnica: la IF directa y la IF indirecta.

Inmunofluorescencia Directa (IFD)

En esta técnica se utiliza un Ac marcado con una sustancia fluorescente para detectar la

presencia del Ag en una muestra de tejido o células o en frotis de cultivos de

microorganismos (ver Fig 1A).

La muestra es previamente fijada sobre un portaobjetos con un solvente (metanol-acetona).

Esta fijación además permeabiliza la membrana de las células para facilitar la entrada del Ac.

En un paso posterior se incuba la muestra con el conjugado y luego se elimina el reactivo

excedente por medio de lavados con solución salina tamponada. La muestra se examina en un

microscopio de fluorescencia con luz azul o verde observándose la fluorescencia generada por

el conjugado en los lugares en que ha quedado unido al Ag de la muestra; el resto del campo

permanece oscuro.

Fig 1A. Inmunofluorescencia directa

19

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

Esta variante de la IF utiliza como conjugado un Ac anti-Ig marcado con sustancias

fluorescentes, para detectar la unión entre un Ac no marcado con su Ag específico (ver Fig

1B)

El procedimiento es similar al de IFD, excepto que al corte de tejido (o a las células) fijado al

portaobjetos conteniendo un Ag determinado (microorganismo, receptores, etc), se le agrega

una muestra problema (conteniendo potencialmente Ac que reconocerán al Ag). Los

inmunocomplejos formados luego de la incubación de estos dos componentes serán

detectados por la adición del conjugado (la anti-Ig marcada). Luego de los lavados necesarios

para la eliminación del conjugado libre, la muestra se observa con microscopio de

fluorescencia.

Fig 1B. Inmunofluorescencia indirecta

ENSAYO DE POLARIZACIÓN DE LUZ FLUORESCENTE (FPA)

Se basa en que una molécula en solución rota con una velocidad inversamente proporcional a

su tamaño. Si esa molécula está unida a un marcador fluorescente (por ej. FITC) y se lo excita

con luz polarizada, se puede evaluar la tasa de rotación de la molécula según en qué

direcciones emita la luz. Esto es medido por un detector que lo traduce en una señal.

Para la detección de Ac, se hace reaccionar la muestra (por ejemplo suero o sangre) con un

Ag de pequeño tamaño marcado con una sustancia fluorescente. Si en la muestra hay Ac

específicos contra ese Ag, se unirán al Ag marcado por lo cual este complejo (Ac + Ag

marcado), al tener mayor tamaño molecular, tendrá una menor velocidad de rotación que el

Ag libre, y esto podrá ser medido mediante un lector de polarización de fluorescencia.

Las principales ventajas de este ensayo son que no es necesario separar los complejos Ag-Ac

del reactivo en exceso, es una prueba rápida (el resultado se obtiene en menos de 10 minutos

habitualmente) y de fácil automatización. En veterinaria se ha estandarizado para el

diagnóstico de unas pocas enfermedades infecciosas, y es utilizada más ampliamente en la

detección de drogas y metabolitos en distintos fluidos.

RADIOINMUNOENSAYO (RIA)

El RIA es una prueba de interacción primaria que utiliza un radioisótopo como marcador del

conjugado. El más común es el 125

I. Esta prueba es muy sensible y permite cuantificar

concentraciones muy pequeñas de una sustancia (hasta el orden de pg/ml), Los

radioinmunoensayos pueden realizarse en fases fluidas (RIA) o sólidas. Por ejemplo, en

20

endocrinología permite la cuantificación de hormonas mientras que en clínica se usa para el

diagnóstico de enfermedades atópicas detectando la presencia de IgE y alergenos (RIST y

RAST).

Estas pruebas deben ser ejecutadas por personal autorizado y experimentado, debido a los

potenciales peligros para la salud y la contaminación ambiental que supone el manipuleo de

sustancias radiactivas.

ENZIMOINMUNOENSAYO (EIA)

El enzimoinmunoensayo es una técnica versátil y muy sensible, que puede utilizarse para

detectar y medir en una muestra tanto Ag como Ac. Los conjugados que se emplean tienen

como marcadores a diversas enzimas. Las enzimas más utilizadas son la peroxidasa, la

fosfatasa alcalina y la ß-galactosidasa.

Esta técnica recibe diferentes nombres de acuerdo al soporte sobre el que se realiza: cuando es

en placa, se denomina ELISA; sobre tejidos, inmunohistoquímica y sobre células, inmuno-

citoquímica.

ELISA (en placa)

La prueba se realiza en placas de plástico (poliestireno) de 8 cm x 12 cm que contienen 96

pocillos, cada uno de aprox. 1 cm de profundidad y 0,7 cm de diámetro (Fig. 2)

Fig. 2 Placa de ELISA con 96 pocillos

Existen muchas variantes del ELISA y su diseño depende de lo que se quiera determinar. La

más utilizada es el ELISA indirecto que se usa para determinar la presencia de Ac en una

muestra problema, utilizando como conjugado un Ac anti-Ig marcado con una enzima (Fig 3).

Para detectar la presencia de este conjugado, se agrega a la reacción un sustrato específico de

dicha enzima y un cromógeno que permita observar la acción de la enzima sobre su sustrato.

Si luego de la reacción inmunológica y de los posteriores lavados, el reactivo marcado

permanece unido a la fase sólida, al agregar la mezcla de sustrato-cromógeno la enzima

actuará sobre su sustrato, modificándolo, y este producto inducirá un cambio de color en el

cromógeno soluble sobrenadante (Fig 2). La intensidad de color es directamente proporcional

a la cantidad de anti-Ig marcada que se haya captado, y ésta a su vez será proporcional a la

cantidad de Ac que se encuentren en la muestra problema. La intensidad de color se puede

estimar a simple vista (cualitativo), o lo que es más adecuado, mediante espectrofotometría,

expresándose como densidad óptica. Si uno deseara determinar el título de un suero debería

incubar la placa en la que se encuentra fijado el Ag con diferentes diluciones del suero

problema. La inversa de la última reacción que da reacción positiva es el título del suero.

21

Inmunohistoquímica (IHQ) e inmunocitoquímica (ICQ)

Cuando el enzimoinmunoensayo se realiza sobre tejidos o células, hablamos de

inmunohistoquímica e inmunocitoquímica, respectivamente. Estas pruebas se realizan

sobre cortes de tejido de un modo similar a las IF, pudiendo ser directas o indirectas. En este

caso, el conjugado es una inmunoglobulina marcada con una enzima que al actuar sobre su

sustrato, lo modifica, y este producto induce un cambio en el cromógeno, convirtiéndolo en

un producto de reacción coloreado. Esta prueba se lee con microscopio de luz observándose

una reacción positiva como un precipitado de color sobre las estructuras histológicas o las

células que contengan el Ag buscado (Fig. 4).

Fig. 4. Esquema de una Inmunohistoquímica.

INMUNOCROMATOGRAFÍA (CROMATOGRAFIA DE FLUJO LATERAL)

La inmunocromatografía es un tipo de prueba de interacción primaria que se utiliza en

ensayos sencillos y de lectura rápida.

En esta prueba uno de los componentes está marcado con nanopartículas coloreadas, por

ejemplo con metales pesados (oro o selenio coloidal, generando bandas de color rosa o azul

respectivamente). Otros marcadores pueden ser partículas de látex coloreadas o de carbón.

La reacción se lleva a cabo sobre una tira de un material poroso (por ejemplo, nitrocelulosa).

En las tiras reactivas se pueden distinguir 5 zonas:

1. Zona de siembra de la muestra

2. Zona del conjugado

3. Zona de detección

4. Zona de control

5. Región absorbente

El procedimiento es muy sencillo: la muestra con el Ag a analizar se coloca en la zona de

siembra de la muestra, y fluye por capilaridad hasta la zona del conjugado, en donde el Ac

específico marcado (conjugado) se encuentra inmovilizado. Al pasar la muestra solubiliza al

conjugado, y en caso de haber Ag en la muestra forma inmunocomplejos. Estos

inmunocomplejos formados siguen migrando lateralmente hasta la zona de detección, en la

cual se hallan fijados a la membrana Acs específicos contra otro epitope del Ag, de manera

que los inmunocomplejos son fijados en esta zona de detección, formando una banda

coloreada, rosa o azul dependiendo del metal utilizado en el conjugado.

La muestra fluye por capilaridad hasta la zona de control. Aquí el exceso de conjugado es

capturado por un Ac anti-conjugado, formándose una banda coloreada tanto si el Ag está

presente en la muestra como si no lo está. Este control indica que la prueba ha sido realizada

correctamente y todos los reactivos funcionan bien. Finalmente el resto de la muestra es

absorbida en la región absorbente (ver figura 1).

22

Esta prueba puede ser utilizada también para la detección de Acs. En este caso, el conjugado

es el Ag específico marcado. En la zona de detección está fijado un Ac anti-Ig (dependiendo

de la especie en la cual se buscan los Acs), el cual capturará los complejos inmunes formados

si la muestra posee Acs específicos. En la zona de control un Ac específico para el conjugado

(en este caso el Ag marcado) captura el exceso de Ag solubilizado por la muestra.

Aplicaciones:

En medicina humana se utiliza este test para detectar la gonadotrofina coriónica (test de

embarazo).

En medicina veterinaria se utiliza para detectar antígenos (Virus de la leucemia felina, parvo y

rotavirus, parásitos como Dirofilaria inmitis, y bacterias) o anticuerpos (anticuerpos anti-

virus de la inmunodeficiencia felina).

Zona de la muestra Zona del conjugado Zona de detección Zona de control

Fig 1: Esquema de una prueba de inmunocromatografía para detección de antígeno. En la parte superior se

esquematiza la prueba positiva, dando una banda en la zona de detección y una segunda banda en la zona de

control. En la parte inferior, se esquematiza la prueba negativa, donde sólo se observa reacción en la zona de

control.

………………………

La siguiente tabla resume los marcadores utilizados en algunas de las pruebas de

interacción primaria más importantes y los equipos utilizados para la lectura o

visualización de los resultados.

Técnica Marcador del

conjugado Lectura de la prueba

Inmunofluorescencia Fluorocromo Microscopio de fluorescencia

Polarización de luz fluorescente Fluorocromo Lector de

polarización de fluorescencia

Radioinmunoensayo Radioisótopo Contador de radiactividad

EIA

ELISA

Enzima

Espectrofotómetro o a simple vista

Inmunohistoquímica Microscopio óptico

Inmunocitoquímica Microscopio óptico

Inmunocromatografía Nanopartículas

coloreadas A simple vista

23

Fig 3. Enzimo inmuno ensayo (ELISA) indirecto

24

25

26

27

TP3: PRUEBAS DE INTERACCIÓN PRIMARIA:

ELISA E INMUNOCROMATOGRAFÍA

ELISA INDIRECTO: procedimiento e interpretación de resultados

Objetivos: conocer los pasos de una prueba de ELISA indirecto, comprender la importancia

del uso de controles en la pruebas de laboratorio e interpretar los resultados.

Se utilizará la técnica de ELISA indirecto para determinar la presencia/ ausencia y título de

los Acs específicos contra un virus.

Materiales necesarios:

- Placas de 96 pocillos o tiras de 8 pocillos, recubiertas con Ag.

- Suero control negativo (sin Acs específicos) y positivo (con Acs específicos)

- Diluyente para las muestras y controles

- Conjugado (Ac anti-Ig bovina marcado con peroxidasa)

- Solución de lavado

- Mezcla de sustrato-cromógeno

- Servilletas de papel

- Micropipetas mono y multicanal

- Espectrofotómetro lector de ELISA

Procedimiento:

A continuación se detalla el procedimiento completo. En el TP terminaremos una prueba

comenzada por los docentes (a partir del paso 3)

1. Colocar los reactivos a TA con 30 minutos de anticipación.

2. Incubación de las muestras y controles en los pocillos recubiertos con Ag, según los

siguientes diseños:

a. Diseño utilizado para detectar presencia/ausencia de Acs específicos. En este caso

tanto los controles como la muestra problema se colocan a una dilución

determinada, por ejemplo 1:10. En los pocillos que no se coloca muestra (blancos)

se coloca solamente el diluyente de muestras.

POCILLO MUESTRA COLOR DO 405 nm RESULTADO

A -

B -

C Ctrl. positivo

D Ctrl. positivo

E Ctrl. negativo

F Ctrl. negativo

G M. problema

H M. problema

b. Diseño utilizado para determinar el título de un suero. Se analizan varias

diluciones de una muestra problema (MP)

POCILLO MUESTRA COLOR DO 405 nm RESULTADO

A1 -

B1 -

C1 Ctrl. positivo

D1 Ctrl. positivo

E1 Ctrl. negativo

28

F1 Ctrl. negativo

G1 MP 1:25

H1 MP 1:25

A2 MP 1:50

B2 MP 1:50

C2 MP 1:100

D2 MP 1:100

E2 MP 1:200

F2 MP 1:200

G2 MP 1:400

H2 MP 1:400

Incubación durante 1 hora a 37ºC.

3. Lavar 4 veces con solución de lavado (Invertir las tiras y eliminar el líquido, llenar los

pocillos con solución de lavado. Repetir este procedimiento 4 veces. Invertir la tira

sobre una servilleta de papel para escurrir)

4. Agregar 100 µl/pocillo de conjugado. Incubar 15 minutos a 37ºC.

5. Lavar 4 veces con solución de lavado (Idem paso 3).

6. Agregar 150 µl/pocillo de mezcla sustrato/cromógeno (ABTS/H2O2)

7. Incubar de 20 a 30 min a temperatura ambiente.

Observar el desarrollo o no de color en los distintos pocillos. Registrar los resultados

en la tercera columna de la tabla.

8. Realizar lectura espectrofotométrica a 405 nm. Registrar los valores obtenidos en la

cuarta columna de la tabla.

9. Interpretación de resultados:

¿A qué se debe el desarrollo de color en los pocillos C y D?

¿Por qué no se desarrolla color en los pocillos E y F?

¿Cuál es el título de la muestra problema?

INMUNOCROMATOGRAFIA: procedimiento e interpretación de resultados

Objetivos:

Conocer las etapas de una prueba de inmunocromatografía e interpretar los resultados.

Se utilizará un test comercial de inmunocromatografía para detectar la presencia de una

hormona (gonadotrofina coriónica humana) en orina. Se seguirán las instrucciones provistas

por el fabricante. Se interpretarán los resultados obtenidos y se discutirán otros posibles

resultados.

29

TRABAJO PRÁCTICO Nº 4

PRUEBAS DE INTERACCION SECUNDARIA: FUNDAMENTOS

Estas pruebas comprenden dos etapas. En la primera se forman rápidamente los complejos

Ag-Ac (complejos primarios), los cuales no pueden observarse directamente. Luego, en la

segunda etapa o reacción secundaria, los complejos se van agregando hasta hacerse visibles

como precipitado o aglutinado. La temperatura acelera esta segunda etapa, que además es

dependiente de la concentración de electrolitos (generalmente la reacción se realiza en

solución fisiológica).

Las uniones entre los complejos primarios dan origen a estructuras tridimensionales en forma

de red (enrejado de Marrack). La formación de estos agregados es una consecuencia de la

bivalencia de los Ac y la multivalencia de los Ag, ya que si no se cumplen estos requisitos,

la red no puede formarse. Además, los reactivos deben estar en proporciones óptimas, dado

que la concentración en exceso tanto del Ag como del Ac origina complejos solubles (Fig. 1).

Si a la preparación antigénica se le agrega un exceso de Ac no se produce reacción. Este

fenómeno se denomina prozona.

Pre

cip

itad

o f

orm

ado

(m

g)

Antígeno (mg)

Zona de exceso de

anticuerpos

Zona de proporciones

óptimas

Zona de exceso de

antígeno

0

1

2

3

0,3 1 1,5

Figura 1: Curva de precipitación cuantitativa.

Modificado de Tizard, I. Inmunología Veterinaria. Ed. Interamericana, Méjico. 1995.

Cuando los Ac se combinan con Ag solubles (toxinas, proteínas, extractos de pared

bacteriana) en soluciones con condiciones apropiadas, los complejos precipitan (REACCION

DE PRECIPITACION). Si los Ag son particulados (bacterias, eritrocitos) y están en

suspensión, entonces se aglutinan al unirse a los Ac específicos en condiciones adecuadas

(REACCION DE AGLUTINACION). Un mismo Ac puede dar aglutinación y

precipitación, por ejemplo, con una suspensión bacteriana y con un lisado de la misma,

respectivamente.

PRUEBAS DE AGLUTINACION

Se pueden leer a simple vista o bajo aumento (microscopio óptico o lupa).

La reacción positiva (presencia de aglutinado o grumos) indica que Ag y Ac están presentes

en la reacción (y en proporciones óptimas).

En la figura 2 se muestra un esquema de los resultados obtenidos en dos pruebas de

aglutinación en tubo. La primera (Fig. 2a) se realizó con suero del primer muestreo de un

animal, ensayando las diluciones 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640. Se ve que la reacción

30

es positiva sólo en los 2 primeros tubos (1/20 y 1/40). La segunda prueba (Fig. 2b), realizada

con suero de un muestreo del mismo animal a los 40 días del primero, muestra reacción

positiva hasta una dilución 1/320. Esto indica que hubo seroconversión (conversión

serológica), ya que el título del suero en el primer muestreo fue 40 y en el segundo fue 320.

1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640

Figura 2a: Aglutinación en tubo. Reacción positiva en diluciones 1/20 y 1/40.

1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640

Figura. 2b: Aglutinación en tubo. Reacción positiva en diluciones 1/20 a 1/320.

Las pruebas de aglutinación pueden clasificarse según:

Los elementos reactivos, en:

- directas: cuando el Ag es particulado.

- indirectas o pasivas: cuando el Ag soluble se acopla a partículas (por ejemplo: partículas de

látex, glóbulos rojos) para que la reacción con Ac específicos sea una aglutinación en vez de

una precipitación.

el tiempo de realización, en:

- rápidas: si se pueden realizar en pocos minutos.

- lentas: si se requiere una incubación de horas o días.

el grado de detección, en:

- cualitativas: si sólo detectan presencia o ausencia de Ac.

- semicuantitativas: si permiten estimar la concentración de Ac en la muestra (título del

suero).

el soporte, en:

-en placa (corresponde a las pruebas rápidas).

- en tubo (corresponde a las pruebas lentas).

Aplicaciones:

- Diagnóstico serológico de enfermedades infecciosas.

- Identificación de serotipos bacterianos.

- Tipificaciones de sueros sanguíneos (para determinación de grupos sanguíneos).

31

- Identificación del isotipo de Ig (IgG o IgM) al que pertenecen los Ac presentes en el suero:

mediante el tratamiento previo del suero con -mercaptoetanol se despolimeriza la IgM,

perdiendo su capacidad de aglutinar. Este procedimiento permite conocer en qué etapa de la

respuesta inmune del animal se obtuvo la muestra.

- Valoración de anticuerpos “incompletos” o bloqueantes (prueba de Coombs): ciertos Ac

(monovalentes desde el punto de vista funcional), al estar en presencia de las partículas

correspondientes, se unen a ellas pero no las aglutinan. Esta unión bloquea a las partículas,

impidiendo la aglutinación por Ac específicos bivalentes.

Para valorar estos Ac bloqueantes, luego de que éstos se han unido a las partículas, se agrega

una antiglobulina la cual producirá la aglutinación por unión a los Ac bloqueantes.

Esta prueba permite detectar la presencia de anticuerpos en suero que reaccionan con

antígenos presentes en la superficie de los glóbulos rojos como ocurre en la isoeritrolisis

neonatal del potrillo.

PRUEBAS DE PRECIPITACIÓN

Se utilizan para detectar tanto Ag como Ac, en forma cuali o cuantitativa. Pueden realizarse

en medio líquido (en tubos) o en medio semisólido (en tubos, placas, portaobjetos).

Cuando se realizan en medio semisólido (gel de agar o agarosa) reciben el nombre de

inmunodifusión. Al difundir y ponerse en contacto el Ag con el Ac, precipitarán formando

una banda o halo cuando estén en la relación óptima. El número de bandas de precipitación

indica la cantidad mínima de sistemas reaccionantes presentes. Es decir que, si las soluciones

contienen varios Ag y Ac diferentes, se producirá una línea de precipitación separada para

cada grupo interactuante de Ag y Ac.

En las pruebas de inmunodifusión se preparan, por ejemplo, placas de Petri con una capa de

gel de agar o agarosa donde se realizan pequeños orificios.

En la inmunodifusión radial (Fig. 3) uno de los reactivos (por ejemplo, el Ac) se añade al

gel antes de preparar la placa, y en los orificios se siembra el otro reactivo a analizar (por

ejemplo, muestras conteniendo o no al Ag), colocando siempre controles positivos. Al

difundir en forma radial y enfrentarse el Ag con el Ac correspondiente, se formará un halo o

anillo de precipitación alrededor del orificio.

La lectura se realiza midiendo el área del anillo de precipitación, y comparándola con los

valores de una curva estándar, siendo el diámetro del halo proporcional a la cantidad de

reactivo sembrado en el pocillo (Fig. 4).

anticuerpos disueltos en el

gel

antígeno en los

pocillos

Figura. 3: Inmunodifusión radial

32

Figura 4. Curva estándar para determinación de la concentración de Ig mediante

inmunodifusión radial

En la inmunodifusión doble bidimensional (prueba de Ouchterlony) ambos reactivos (Ag y

Ac) son sembrados en orificios enfrentados y los dos difunden en el gel. La presencia de una

banda de precipitación entre los dos orificios, indica una reacción positiva (Fig. 5).

Ag

1

2

3

4

5

6 Pocillos 2, 4 y 6:

sueros controles

positivos. Pocillos 1, 3 y 5:

sueros problema

a. Pocillo central: Ag Agantígeno.

Figura 5: Inmunodifusión doble bidimensional

De acuerdo a las leyes de la difusión, la distancia a la que una sustancia difunde está en

relación directa con su concentración y en relación inversa con su peso molecular. Es decir

que, si uno de los reactivos está en exceso, la banda se formará cerca del pocillo del reactivo

presente en menor concentración (Fig. 6, reactivo a) y si uno de los reactivos tiene moléculas

de distinto peso molecular, éstas difundirán con distinta velocidad, dando lugar a la formación

de más de una banda (Fig. 7).

a b c d

Figura 6 Figura 7

33

Aplicaciones:

- Las reacciones en medio líquido se aplican al diagnóstico e identificación de distintas

proteínas animales en productos alimenticios (análisis bromatológicos) o en medicina forense.

- Las pruebas de inmunodifusión se aplican en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y

para la determinación de Ig, C3, transferrina y otras proteínas. También se utilizan para el

análisis de la pureza de una preparación antigénica y de las reacciones cruzadas entre distintos

Ag.

En esta última aplicación se investiga el grado de identidad que presentan dos Ag entre sí,

enfrentándolos con un suero específico para uno de ellos. Pueden obtenerse distintos

resultados:

Ag x Ag x

Ac x

Ag x Ag x-y

Ac x + Ac y

Ag x Ag y

Ac x + Ac y

a)Identidad total b) Identidad parcial c) No identidad

Figura 8

La identidad total indica que ambos Ag son idénticos, es decir, no pueden ser diferenciados

entre sí por el antisuero utilizado. Las bandas de precipitación se funden en una sola línea

(Fig. 8 a).

La identidad parcial indica que existe una cierta relación entre los Ag, pero que uno de ellos

(Ag x-y) presenta componentes antigénicos (epitopes) no compartidos con el otro. Las bandas

de precipitación se funden parcialmente en una línea, apareciendo una prolongación o espolón

(Fig. 8 b).

La no identidad expresa que no hay ninguna característica compartida entre ambos Ag. Cada

sistema reacciona independientemente, originando bandas de precipitación que se cruzan (Fig.

8 c).

1) ¿Cuáles son las condiciones necesarias para que ocurra una reacción de aglutinación? ¿Y

una de precipitación?

2) ¿Qué ocurre si en una precipitación se emplea un suero con exceso de Ac?

3) Esquematice una reacción de aglutinación con IgG, otra con IgM. ¿Qué ocurre en ambos

casos si el suero se trata con -mercaptoetanol?

4) ¿Cómo se calcula el título de un suero?

34

TRABAJO PRÁCTICO Nº5

PRUEBAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA: AGLUTINACIÓN Y

PRECIPITACIÓN

PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN:

Objetivo: realizar pruebas de aglutinación en placa (rápidas) y observar resultados de pruebas

de aglutinación en tubo (lentas). Realizar reacciones de aglutinación cualitativas y

semicuantitativas (empleando distintas diluciones de un suero para determinar el título del

mismo). Identificar el isotipo responsable de la aglutinación, comparando los resultados de la

prueba en presencia y ausencia de -mercaptoetanol. Explicar el fenómeno de prozona.

Materiales:

Sueros

Suspensiones de antígenos

Tubos

Pipetas

Pro-pipetas

Solución fisiológica

Aglutinoscopio

Procedimiento/Protocolo:

Aglutinación en placa:

1) Colocar sobre el vidrio 30 l de la suspensión antigénica y un volumen igual del suero sin

que se mezcle con la suspensión.

Repetir el procedimiento utilizando 30 l de solución fisiológica en vez de suero (control

negativo).

Mezclar el suero con el antígeno, y por otro lado, la solución fisiológica con el antígeno.

El resultado se expresa como positivo (+) cuando se forma un aglutinado o negativo (-)

cuando esto no ocurre. Esta es entonces una reacción cualitativa.

Describa cómo observa una reacción positiva y una negativa.

2) Emplear el suero puro y también realizar las siguientes diluciones, empleando solución

fisiológica como diluyente:

Diluciones

puro 1/2 1/4 1/8 1/16

Soluc. fisiol.: 40l 40l 40l 40l

Suero: 80l 40l

40l 40l 40l 40l

Esta es una reacción semicuantitativa. Observar hasta cuál dilución hay aglutinación. Calcular

el título (inversa de la máxima dilución que dio resultado positivo).

Aglutinación en tubo:

Esta prueba es lenta, ya que luego de mezclar en el tubo la suspensión del antígeno con el

suero, debe incubarse en estufa a 37ºC durante 48 h. Por lo tanto observaremos el resultado de

pruebas realizadas con anterioridad.

Considerar que todos los tubos tienen el mismo volumen de antígeno y que las diluciones del

suero son: 1/25, 1/50, 1/100, 1200 (Esta es una reacción semicuantitativa).

Observar aglutinado en el fondo del tubo y líquido claro (reacción positiva). Diferenciar con

botón y líquido turbio (reacción negativa).

35

1) ¿Cuál sería el resultado si ocurre el fenómeno de prozona con un determinado suero?

2) Calcular el título de uno de los sueros en presencia y en ausencia de -mercaptoetanol.

3) Realizar un esquema de lo que ocurre en presencia y en ausencia de -mercaptoetanol si la

aglutinación se debe a la presencia de IgM específica contra ese antígeno. Dibujar las

moléculas de antígeno y los anticuerpos.

PRUEBAS DE PRECIPITACIÓN (INMUNODIFUSIÓN):

Objetivo: Conocer cómo se realiza una inmunodifusión doble bidimensional, realizando la

siembra de sueros y soluciones de antígenos. Observar la presencia de bandas en reacciones

preparadas con anterioridad. Observar reacciones de inmunodifusión radial. Conocer los

factores que influyen sobre la velocidad de difusión y las causas que originan una doble banda

de precipitación.

1) Realizar un esquema de:

a) una prueba de inmunodifusión doble bidimensional realizada para determinar la

presencia de anticuerpos contra un antígeno determinado.

b) una prueba de inmunodifusión radial

c) una prueba de inmunodifusión doble bidimensional que evidencia identidad parcial

entre 2 antígenos. Realice también el esquema para identidad total y no identidad.

2) Sobre una placa conteniendo un gel de agarosa, sembrar 5 l de la solución del antígeno en

el pocillo central y 5 l de cada suero en los demás pocillos. Haga además un esquema de

resultados a obtener si algunos de los sueros contienen anticuerpos específicos contra ese

antígeno.

36

TRABAJO PRÁCTICO Nº6

CARACTERÍSTICAS DE LAS PRUEBAS SEROLÓGICAS. INTEGRACIÓN DE TP

Repaso y discusión de conceptos importantes: conversión serológica o seroconversión, Ac

monoclonales, afinidad, avidez, especificidad de un Ac, reacción cruzada, sensibilidad y

especificidad de una prueba serológica.

El suero es una fuente heterogénea de Ac producto del contacto con diferentes antígenos

(Ag). Si deseamos investigar la presencia de Ac específicos contra un Ag determinado

debemos utilizar una prueba serológica adecuada. El resultado de la prueba nos permitirá

establecer si el animal tuvo contacto con el Ag en cuestión. La presencia de Ac para un

determinado Ag no implica que el animal esté enfermo.

Para determinar si ocurre una evolución de la respuesta inmunitaria (humoral), deben

compararse los títulos de dos muestras de suero tomadas con un intervalo de 3 semanas, y si

el título de la segunda muestra es mayor (mínimo 4 veces) que la primera se dice que ocurrió

seroconversión o conversión serológica.

Por lo anteriormente expuesto se dice que la serología cumple un papel complementario en la

confirmación de un diagnóstico.

La respuesta del sistema inmune a cualquier antígeno, aún el más simple, es policlonal. Esto

significa que el sistema fabrica anticuerpos contra un gran rango de epitopes del Ag. Los

sueros policlonales obtenidos luego de la inoculación de un Ag en un animal, son

comúnmente utilizados como herramientas en serología, diagnóstico e investigación.

Los anticuerpos monoclonales (ANEXO 1) son anticuerpos idénticos de especificidad única

sintetizados por un único clon de células plasmáticas modificadas artificialmente para que

pueda hacérselos crecer indefinidamente. Los Ac monoclonales son hoy ampliamente usados

como reactivos de diagnóstico e investigación.

Afinidad – La afinidad de un Ac es la fuerza de reacción entre un epitope simple y un sitio

individual de combinación con el Ag sobre un Ac. Es la sumatoria de las fuerzas de atracción

y repulsión que operan entre el determinante antigénico y el sitio de unión al Ag del Ac.

(figura 5)

Figura 5.

Avidez Avidez es la medida de la fuerza total de unión de Ac multivalentes con un Ag que

presenta varios determinantes antigénicos.

Alta afinidad

Baja afinidad

Ac Ac

37

Por lo tanto, la afinidad se refiere a la fuerza de unión de un solo determinante antigénico y un

sitio de combinación para el Ag en un anticuerpo individual, mientras que la avidez se refiere

a la fuerza de unión total entre varios antígenos y anticuerpos polivalentes.

La avidez es influenciada por las valencias del anticuerpo y del antígeno.

Figura 6

Especificidad de un Ac: se refiere a la capacidad de un Ac de reaccionar con un solo epitope

a través de un sitio individual de unión con el Ag. También puede decirse de un conjunto de

moléculas de Ac que tiene la capacidad de reaccionar con solo un Ag. En general, existe un

alto grado de especificidad en las uniones Ag-Ac.

Reacción cruzada: se refiere a la capacidad de de un Ac individual o de un conjunto de Ac de

reaccionar con más de un Ag. La reacción cruzada puede originarse por el reconocimiento de

Ag que comparten epitopes con el Ag original o epitopes similares al del Ag original (Figura

7).

Figura 7

Dos conceptos importantes: Sensibilidad y especificidad

Para interpretar una prueba serológica se deben tener en cuenta los conceptos de sensibilidad

y especificidad. La sensibilidad de una prueba serológica es la capacidad para detectar la

mínima cantidad de Ag o Ac presente en la muestra (Tabla 3). La especificidad de una prueba

serológica está dada por la capacidad de la prueba para detectar uniones Ag-Ac específicas.

Afinidad: 104 Avidez:

106

Avidez:

1014

Ac

Anti-A

Ac

Anti-A

Ac

Anti-A

Epitope compartido Epitope similar

Ag A Ag B Ag C

Reacción cruzada

38

Pruebas Valores Ac (mg/ml)

Pruebas de unión primaria

Radioinmunoensayo competitivo 0,00005

ELISA 0,0005

Pruebas de unión secundaria

Neutralización de antitoxina 0,00005

Inhibición de la hemaglutinación 0,005

Aglutinación bacteriana 0,05

Hemaglutinación pasiva 0,01

Prueba de precipitación en anillo 18

Precipitación en gel 30

Pruebas de unión terciaria

Prueba de fijación de complemento 0,05

Tabla 3. Cantidad mínima de anticuerpo detectable con ciertas pruebas inmunológicas.

Extraído de: Tizard I. “Inmunología Veterinaria”. Editorial Interamericana. 1996.

Cuestionario para la integración de TP

1) Para cada uno de los siguientes objetivos, elija una prueba serológica y describa cómo la

realizaría para:

a) determinar si en las muestras de suero de 3 animales hay Ac contra cierta bacteria

b) conocer cuál es el título de esos sueros

c) determinar el isotipo de esos Ac (si son IgM o IgG)

d) detectar la presencia de una bacteria en un tejido

e) conocer en qué células de un tejido está presente determinada proteína

f) cuantificar IgM total en un suero canino

g) determinar si un animal está respondiendo a un determinado Ag

h) detectar la presencia de Ac incompletos o monovalentes

2) En una prueba de interacción secundaria, ¿en qué situaciones puede haber formación de

complejos inmunitarios sin formación de la red de Marrack? ¿Cómo se podrían confirmar las

distintas hipótesis?

39

ANEXO 1

ANTICUERPOS MONOCLONALES

Los anticuerpos generados en un animal por inmunización activa, (natural o artificial),

son heterogéneos ya que tienen diferentes especificidades y afinidades. Proceden de distintos

clones de linfocitos B estimulados, por lo que constituyen un conjunto policlonal de

anticuerpos. Esta respuesta policlonal representa una ventaja adaptativa, permitiendo disponer

de Ac capaces de unirse a una gran variedad de antígenos, de expresar diferentes funciones

biológicas y de evolucionar adaptándose al curso de la respuesta inmunitaria.

Por ser reactivos específicos (hacia un antígeno), los Ac pueden ser también utilizados

por el hombre para diversos fines, por ejemplo, para diagnóstico, en terapéutica o para separar

moléculas con fines industriales. Tradicionalmente, un Ac hacia un antígeno se obtiene

inmunizando animales y obteniendo su suero, fuente principal de Ac. Los conejos y los

caballos han sido y aún son muy usados como productores de sueros inmunes. Recordemos

que éstos son reactivos policlonales.

Para algunos usos, sin embargo, la heterogeneidad de los Ac de un suero puede ser una

desventaja. Además, cada preparación de suero es diferente, aún cuando se usen animales

genéticamente idénticos, inmunizados con la misma preparación de antígeno y con el mismo

protocolo de inmunización. Dicho en otros términos: cada respuesta inmunitaria es única. Por

lo tanto es imposible usar reactivos serológicos idénticos en una larga serie de pruebas.

Estas desventajas pueden ser salvadas por los anticuerpos monoclonales, que, como su

nombre lo indica, derivan de un único clon de linfocitos B y son por lo tanto específicos para

un epitope determinado e idénticos entre sí, constituyendo una población homogénea.

Como no es posible purificarlos a partir de un suero policlonal, G. Köhler y C. Milstein

desarrollaron en 1975 un método para su preparación, que se basa en la fusión de un linfocito

B normal con una célula plasmática tumoral (célula de mieloma). La célula híbrida resultante

(llamada hibridoma) hereda de la célula de mieloma la capacidad de crecer indefinidamente in

vitro, y del linfocito B la de secretar anticuerpos.

Luego de la fusión, las células híbridas deben separarse de las que no se fusionaron y de

las que se fusionaron con otra célula del mismo tipo. Esto se logra usando células de mieloma

deficientes en una enzima requerida para la síntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos por una

vía alternativa que reutiliza las purinas. Por lo tanto, si luego de la fusión las células se

cultivan en un medio que contiene un inhibidor de la vía de síntesis de novo de los

nucleótidos (medio HAT), sólo podrán desarrollar las células que puedan utilizar la vía de

síntesis alternativa (es decir, los hibridomas, porque heredan del linfocito la capacidad de

utilizar esta vía). Las células de mieloma que no se fusionaron o se fusionaron entre ellas no

se multiplicarán porque no poseen la vía alternativa, y a su vez, los linfocitos B que no se

fusionaron o se fusionaron entre ellos tampoco se multiplicarán ya que no tienen la capacidad

de crecer indefinidamente in vitro.

El paso siguiente es la selección de los clones que secreten el Ac con la especificidad

deseada, para lo cual se analiza el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma mediante

pruebas serológicas como ELISA y RIA.

Una vez detectados los hibridomas productores del Ac deseado, y controlada su

clonalidad, cada clon se cultiva para producir el Ac monoclonal deseado. El cultivo puede

hacerse in vitro (en medios apropiados para células) o bien in vivo, inyectando

intraperitonealmente las células del hibridoma en ratones y obteniendo tiempo después el

líquido ascítico acumulado, que contendrá una elevada concentración del Ac monoclonal. Los

hibridomas por su parte, se conservan indefinidamente por congelación, pudiendo

descongelarse y cultivarse todas las veces que se desee, obteniendo siempre el mismo Ac.

Como cada hibridoma es un clon derivado de la fusión de un único linfocito B, todas las

moléculas de Ac que produce son idénticas en estructura y por lo tanto tienen el mismo sitio

de unión al antígeno e isotipo.

40

Aislar

células

del bazo

Antígeno

Suero

Linfoblastos Cél. de mieloma Hibridomas

Fusión Selección

Anticuerpos monoclonales

Ac1 Ac4Ac3Ac2

Ac2

Ac1

Ac4

Ac3Ac1

Ac2

Ac3

Ac4

Anticuerpos policlonales

Aislar

células

del bazo

Antígeno

Suero

Linfoblastos Cél. de mieloma Hibridomas

Fusión Selección

Anticuerpos monoclonales

Ac1 Ac4Ac3Ac2

Ac2

Ac1

Ac4

Ac3Ac1

Ac2

Ac3

Ac4

Anticuerpos policlonales

Diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales

Ac policlonales (suero) Ac monoclonales

Epitopes que

reconocen Varios * Unico

Especificidad

Varía entre animales y entre

sangrías.

No varía.

Alta especificidad.

Afinidad Variable entre sangrías. Fija

Rendimiento Concentración media 1 mg/ml

Volumen variable (según especie)

Bajo en cultivo de tejidos.

Alto (hasta 20 mg/ml) en

líquido ascítico)

Costo relativo Bajo Alto

*Sin embargo, cada uno de los Ac presentes en el suero reconoce un único epitope.

Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales

- Investigación (purificación y detección de antígenos).

- Diagnóstico in vitro (de preñez, microorganismos patógenos, medición del nivel de ciertas

drogas en sangre, estudios de histocompatibilidad, detección de antígenos tumorales) e in

vivo (detección de antígenos tumorales).

- Fines terapéuticos (inmunotoxinas compuestas por Ac monoclonales específicos de

células tumorales unidos a una toxina letal).

Bibliografía: - Kuby, J. 1997. Immunology. 3rd. ed. W. H. Freeman and Company, New York. p. 131-135.

- Campbell, A. M. 1984. Monoclonal antibody technology. 1st. ed. Elsevier Science Publishers B.V.,

Amsterdam. p. 1-30.

41

ANEXO 2

Pruebas de interacción primaria

Enzimo Inmuno Ensayo

Dentro de las pruebas de interacción primaria, las pruebas de ELISA han sido de las más

difundidas. Pueden utilizarse para detectar o cuantificar tanto antígenos como anticuerpos,

pueden aplicarse fácilmente a diversos fluidos como leche u orina, requieren pequeños

volúmenes de muestra y son relativamente rápidas. Otra propiedad importante es que la señal

(color) puede ser cuantificada por aparatos específicos (espectrofotómetro) dando un

resultado objetivo que puede ser fácilmente automatizado.

En el desarrollo de los TP Nº3 y 4, se discutió el ejemplo de prueba de ELISA llamado

ELISA indirecto. Dependiendo de la secuencia en que se empleen los diferentes reactivos

(anticuerpos, antígeno y conjugado), podemos generar gran cantidad de variantes de esta

prueba. A continuación se describen algunas de ellas, como son el ELISA de captura o

sandwich y el ELISA competitivo (fig. 1 y 2)

Fig 1. ELISA de captura o sandwich

42

Este tipo de ELISA puede utilizarse tanto para la detección de Ag como la de Ac. En este

ejemplo se utiliza para la detección de un AgX en una muestra compuesta por diferentes

proteínas. Los Ac del isotipo.

Fig. 2: ELISA competitivo.

El ELISA competitivo puede utilizarse para determinar la concentración tanto de Ag como

Ac. En el ejemplo de la Fig. 2, se determina la concentración de Ag de una muestra utilizando

un Ac específico inmovilizado en la placa. El método se basa en la competencia por la unión

con el Ac de captura entre el Ag de la muestra y un Ag marcado con enzima. Cuanto menor

sea la intensidad del color generado, es decir menor absorbancia medida con el

espectrofotómetro, mayor será la concentración de Ag en la muestra problema. El Ag de la

muestra (Ag sin marcar) desplaza al conjugado (Ag marcado), que se elimina con los lavados,

disminuyendo así la cantidad de enzima presente en el pocillo y por consiguiente la cantidad

de color generado al agregar la mezcla de sustrato-cromógeno. Las concentraciones del Ag en

la muestra se calculan a partir de una curva patrón construida con concentraciones conocidas

del Ag.

43

Veamos algunos de los reactivos que se utilizan en las pruebas de interacción primaria:

Anticuerpos policlonales, obtenidos a partir del suero de animales inmunizados con el

antígeno de interés.

Anticuerpos monoclonales, es decir, producidos por un único clon de células plasmáticas, por

lo tanto con única especificidad. Investigue en la bibliografía como se obtienen los

anticuerpos monoclonales.

Anticuerpos anti-inmunoglobulina, obtenidos por inmunización con inmunoglobulinas de una

especie determinada en un animal de otra especie. Por ejemplo: anticuerpos generados en

conejo anti-IgG bovina (conejo anti IgG bovina)

Por su practicidad y relativo bajo costo, las pruebas de ELISA son de fácil implementación en

programas de control y erradicación de enfermedades infecciosas y en relevamientos

serológicos.

Aplicaciones del ELISA

Hay una gran variedad de infecciones en animales domésticos en las que el ELISA puede ser

aplicada para su detección. A continuación se resumen algunas de las aplicaciones de esta

técnica tanto en la detección de Ag como de Ac en enfermedades infecciosas (Cuadro 1) y no

infecciosas. En el cuadro 2 se muestran las aplicaciones de la técnica de ELISA en otras áreas

distintas a las enfermedades infecciosas.

Enf. Virales Enf.

Bacterianas

Enf.

parasitarias

Detección de Ac

Rotavirus Leptospira Trichinella

spiralis

Parvovirus

Salmonella Tripanosoma

Coronavirus Brucella

abortus

Babesia

Rabia Campylobacter

fetus

Toxoplasma

gondii

Detección de

Ag

Leucosis aviar Haemophilus Toxoplasma

gondii

Leucosis

bovina

Toxina tetánica Fasciola

hepatica

Aftosa Enterotoxina de

E. coli

Echinococus sp.

Parvovirus Brucella

abortus

Anemia

Infecciosa

Equina

Rotavirus

Cuadro 1: Aplicaciones de la técnica de ELISA para el diagnóstico de enfermedades

infecciosas.

44

Hormonas Enf.

Autoinmunes

Inmunoglobuli

nas

Bromatología

Insulina Ac anti

tiroglobulina

IgG especie de

origen de las

carnes

Estrógenos Ac anti

eritrocitos

IgA

Progesterona Complejos

inmunes

IgE

Hormonas

tiroideas

Ac anti ADN IgM

Cuadro 2: Otras aplicaciones de la técnica de ELISA.

Otras pruebas de interacción primaria utilizadas tanto en investigación como para el

diagnóstico de enfermedades se enumeran a continuación:

Radio Inmuno Análisis (RIA)

Test de adsorción inmune (Radio Inmuno Sorbent Test o RIST)

Test de adsorción de alergeno (Radio allergo Sorbent test o RAST)

Western Blot

Inmunofluorocitometría

Radioinmunoanálisis (RIA)

El RIA es una prueba de interacción primaria que utiliza un radioisótopo como marcador. El

más común es el 125

I. Esta prueba es muy sensible y permite cuantificar concentraciones muy

pequeñas de una sustancia (hasta el orden de pg/ml), por ejemplo, en endocrinología permite

la cuantificación de hormonas (Fig 3).

En clínica se usa para el diagnóstico de enfermedades atópicas detectando la presencia de IgE

total y específica para un determinado antígeno (RIST y RAST, respectivamente). El soporte

sólido utilizado en ambos casos es un disco de celulosa.

RIST (radioinmunosorbent test) es un RIA competitivo en el cual se detecta la cantidad total

de IgE del suero de un paciente alérgico sin importar su especificidad. Los niveles séricos de

IgE son generalmente bajos. Una respuesta de Ac en la que se elevan significativamente las

concentraciones séricas de IgE sugiere una predisposición genética a padecer alergia, pero no

aporta datos sobre el Ag que provoca esa respuesta. Se detectan asimismo niveles aumentados

de IgE en animales parasitados.

RAST (radio allergo sorbent test) es un radioinmunoensayo donde se detecta IgE específica

para un determinado Ag o alergeno.

Estas pruebas deben ser ejecutadas por personal autorizado y experimentado, debido a los

potenciales peligros para la salud y la contaminación ambiental que supone el manipuleo de

sustancias radioactivas.

45

Fig. 3 Radioinmunoensayo competitivo

Western Blot

Mientras que el ELISA detecta los anticuerpos contra un determinado Ag presentes en

líquidos biológicos, dando resultados negativos, positivos o indeterminados, el Western Blot

es un test más específico. Esta técnica permite identificar un Ag o Ac determinado en una

muestra de composición heterogénea. Por ejemplo, se pueden identificar los Acs generados

contra diferentes fracciones de un patógeno, que componen una respuesta policlonal contra el

mismo. El Western Blot combina la separación de proteínas de una mezcla de acuerdo a su

peso molecular, con la detección inmunológica de Ag individuales mediante el uso de Ac

específicos para esos Ag. (Fig. 4).

46

Dada su alta especificidad, el Western Blot se utiliza en muchos casos como prueba

confirmatoria (p.e.: SIDA) y ha probado ser una herramienta muy útil para identificar los Ag

más importantes en microorganismos complejos y parásitos.

Fig. 4 Western Blot

47

FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) o Citometría de flujo

Fluorescence activated cell sorting (FACS o Citometría de flujo) es una técnica que permite

analizar ciertas propiedades físicas y químicas de células o partículas a las que se les ha unido uno

o mas Ac monoclonales marcados con colorantes fluorescentes, capaces de reconocer epitopes

sobre antígenos de superficie celular (por ejemplo CD4, CD8 y CD3). (Fig. 5). Estas células o

partículas se encuentran en suspensión y fluyen, una a una, frente a un rayo láser. A su paso frente

al rayo, la luz es desviada en un ángulo determinado, el cual es proporcional al tamaño de esa

célula. A su vez, los fluorocromos (colorantes fluorescentes) de los anticuerpos unidos a la célula

son activados por la luz del rayo láser, emitiendo fluorescencia, que es colectada por sensores,

filtrada y almacenada en una computadora.

El análisis de poblaciones celulares mediante citometría de flujo ha impactado enormemente en

inmunología dada su capacidad para diferenciar y cuantificar simultáneamente sub-poblaciones

Fig. 5. Esquema de funcionamiento del Citómetro de flujo y gráficos de resultados

Diagrama de puntos Histograma

FITC fluoresc. (CD4)

PE (CD8)

Doble positivo(CD4+CD8+)

CD4+CD8-

CD4-CD8+

CD4-CD8-

1 10 100 1000

1 1

0 1

00

1

00

0

48

celulares. Los resultados obtenidos de este análisis pueden graficarse de diferentes formas, entre

ellas en forma de histograma y en forma de diagrama de puntos. En el histograma se representa la

cantidad de células con una alta intensidad de fluorescencia (área sombreada) debida a la unión del

conjugado con moléculas de la superficie celular comparada con una población control negativa

(area blanca). En el ejemplo presentado para el diagrama de puntos se analizan, mediante el uso de

dos conjugados (Ac anti CD8 marcados con Phicoeritrina (PE), y Ac anti CD4 marcados con

fluoresceína (FITC), las subpoblaciones de linfocitos T colaboradores (CD4+), citolíticos (CD8+) e

inmaduros (CD4+CD8

+) de una suspensión de timocitos.

Entre las aplicaciones de esta prueba se pueden nombrar medición de la intensidad de expresión de

moléculas de superficie, contenido de ADN, ARN y proteína, tamaño, viabilidad, granularidad y

pH.

49

Preguntas sobre temas de clases

50

INTRODUCCIÓN AL SISTEMA INMUNITARIO

1. ¿Qué es el sistema inmune?¿Qué ocurre en ausencia de un sistema inmunitario funcional?

2. ¿La vigilancia inmunitaria se cumple sólo frente a agentes externos al organismo?

3. Indique las barreras naturales que posee un animal, clasificándolas en físicas, químicas y

biológicas. Identifique algunos factores que puedan alterarlas.

4. Frente a las siguiente situaciones, indique en qué caso espera obtener mayor respuesta inmune

del animal inyectado y justifique su respuesta.

I Un bovino al que se le inyecta:

a) Una proteína de ratón

b) Una proteína de ovino

II Un bovino al que se le inyecta :

a) Una proteína de 200 KDa

b) Un pequeño péptido, proveniente de la digestión de esta proteína.

III Un bovino al que se le inyecta :

a) Una proteína

b) Un lípido

5. ¿Cuáles células del sistema inmune derivan de la línea mieloide y cuáles de la línea linfoide?

Para cada uno de los tipos celulares mencionados, indique la función y la principal localización.

6. ¿Qué diferencias existen en el reconocimiento de material por parte de la inmunidad innata y la

inmunidad adaptativa. ¿Qué estructuras son reconocidas por la inmunidad innata? Indique los

receptores que las reconocen y su localización.

7. Realice un esquema de los pasos del proceso de fagocitosis. Indique las células y moléculas

involucradas.

8. ¿Cuáles son las diferencias entre la actividad fagocítica de los macrófagos y de los neutrófilos?

9. Indique cuáles son los mecanismos bactericidas más importantes que se desencadenan tras la

fagocitosis.

10. ¿En qué tipo de infecciones participan las células NK?

Glosario

Dar una definición de los siguientes términos. Puede incluir en la lista otros términos nuevos para

su vocabulario.

Antígeno Microorganismos comensales

Epitope Epitope

Inmunógeno Epitope secuencial y conformacional

Hapteno Opsoninas

Barreras naturales Quimioquinas

Paratope

Bibliografía :

Escriba los datos del /los libros o material utilizado citando: Autor/es del capítulo si corresponde

(apellido e iniciales de cada uno separados por “;”). Año de publicación. Nº de Capítulo. Título

completo del capítulo. Página inicial y final. Editor/es o autor del libro (apellido e iniciales ). Título

completo del libro. Nº de Edición. Editorial, lugar de publicación.

Ejemplo: Coffin, J.M. (1996). Capítulo 26. Retroviridae: the viruses and their replication, pp 763-

843. En: B.N. Fields; D.M. Knipe; P.M. Howley; et al. Fundamental Virology. 3ra edición.

Lippincott – Raven Publishers, Philadelphia.

En el caso de ser material encontrado en Internet citar: Nombre del sitio. Año de actualización.

Título del artículo. Dirección completa del sitio.Ejemplo: ONUSIDA-OPS. 2004.

Vigilancia del SIDA en las Américas. Disponible en http://www.unaids.org.

51

COMPONENTES HUMORALES DE LA INMUNIDAD INNATA

1) Complete el siguiente cuadro sobre el sistema del complemento:

Vías de

Activación

a)……………………………………………………………………………………

b)……………………………………………………………………………………..

c)……………………………………………………………………………………….

Funciones del

C´/ Factores

involucrados

a)……………………………………./…………………………………………

b) ……………………………………./…………………………………………

c) ……………………………………./…………………………………………

d) ……………………………………./…………………………………………

2) Teniendo en cuenta las distintas funciones del complemento, esquematice las células y

moléculas que intervienen en los siguientes mecanismos:

a) fagocitosis

b) inflamación

3) Complete el siguiente cuadro teniendo en cuenta solo los interferones relacionados con la

inmunidad innata:

Tipo de

interferón

Nombre Principal célula que lo

produce

Función

4) ¿A qué se llama respuesta de fase aguda? ¿Qué componentes y mecanismos intervienen? ¿qué

signos y síntomas se presentan a nivel sistémico?

5) ¿Cuál es la función de la respuesta inflamatoria? ¿Por qué se desencadena esta respuesta?

¿Cómo se relaciona con otros componentes de la respuesta inmunitaria?

6) ¿Cuáles son los signos característicos de la inflamación local y qué los provoca?

7) Indique cuáles son las citoquinas proinflamatorias. ¿Qué células las producen? ¿Sobre qué

tejidos/órganos actúan y qué efecto tienen sobre los mismos?

Glosario

Respuesta de fase aguda Virus Proteínas de fase aguda

Interferones de tipo I Inflamación

Interleuquinas proinflamatorias

Bibliografía utilizada:

52

ORGANIZACIÓN DEL SISTEMA INMUNITARIO. CÉLULAS DE LA INMUNIDAD

ADAPTATIVA.

1) Describa la organización celular del tejido linfoide en el ganglio linfático ¿Cómo circulan los linfocitos

en este órgano?

2) Qué procesos se llevan a cabo en :

a. zona paracortical del ganglio

b. folículo secundario

c. centro germinativo

d. médula

e. vénula de endotelio alto

3) ¿Qué rol tiene la bolsa de Fabricio y cuál es su equivalente en otras especies?

4) Complete el siguiente cuadro:

Propiedad Linfocitos B Linfocitos T

Órgano donde madura

Distribución

Circulación

Receptores de Ag

Tipo de Ag que reconocen

Células diferenciadas

Productos secretados

5) Ordene en una lista las siguientes células en relación con el desarrollo. Identifique al lado de cada célula

el órgano en el cual se las encuentra y además si en el mismo hay contacto con antígeno o no.

a. Linfocito B virgen

b. Progenitor linfoide común

c. Linfocito T citotóxico

d. Plasmocito

e. Célula troncal pluripotente

f. Linfocito T virgen.

6) a)¿Qué componentes del sistema inmunitario se verán afectados en un animal cuya médula ósea es

destruída por irradiación?

b)¿Cuál sería el efecto de una timectomía (extirpación del timo) en un animal recién nacido?

7) Realice un esquema de los mecanismos que se llevan a cabo en el timo indicando las células y moléculas

de superficie involucradas más importantes. ¿Cuál es la consecuencia de la falla de estos procesos?

8) Indique que tipo de selección interviene y su consecuencia sobre los LT inmaduros en los siguientes

casos:

a. No hay TCR

b. TCR + MHC+ autoantígeno

c. TCR + MHC de diferente haplotipo

d. TCR + MHC +Ag X extraño

9) Realice un esquema de una molécula de inmunoglobulina e identifique sus diferentes componentes y regiones.

Glosario Timocitos

Selección positiva

Selección negativa

Selección clonal

Haplotipo

Centro germinal

Células dendríticas

Células dendríticas foliculares

Vénulas de endotelio alto (HEV)

LT autorreactivo

Tolerancia

Células M

Órganos linfoides primarios

Órganos linfoides secundarios

53

RECEPTORES DE ANTÍGENO. PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN DE ANTÍGENO.

1) ¿A qué se denomina Ag? Explique las características que debe poseer una sustancia para comportarse

como Ag. Cite ejemplos de sustancias antigénicas y no antigénicas para cada una de esas características.

2) ¿Qué diferencias existen en el reconocimiento del Ag por el LT y el LB? Describa los receptores

involucrados en el reconocimiento.

3) ¿Qué camino debe seguir un Ag para ser reconocido y activar a un LT? Mencione células, receptores

más importantes y moléculas que participan. Indique el lugar anatómico donde ocurre la activación del

LT.

4) ¿Cuántos péptidos diferentes puede presentar una misma célula presentadora? ¿Cuántos epitopes

diferentes puede reconocer un LB? ¿Y un LT? Explique

5) ¿Cómo el sistema inmunitario puede reconocer y responder específicamente a una gran variedad de

antígenos (y al mismo tiempo preservar su identidad sin agredirse)?

Glosario

Antígeno

Hapteno

Repertorio

TCR

BCR

CMH

Restricción del CMH

Coestimulación

Especificidad

Diversidad

Bibliografía utilizada:

54

RESPUESTA INMUNITARIA HUMORAL

1) En la respuesta inmunitaria en relación a un antígeno T-dependiente (que es procesado por la vía

endosómica):

a) ¿Qué células son capaces de procesar y presentar este antígeno?

b) ¿Cómo es reconocido este antígeno por los linfocitos B y T? Indique las moléculas y células

involucradas. ¿Cómo son los epitopes reconocidos en cada caso (LB y LT)?

c) ¿Qué subpoblación de linfocitos T interviene? ¿Cómo lo hace?

d) ¿Cuáles son las consecuencias de la activación de los linfocitos B específicos?

2) La respuesta humoral frente a un antígeno T-dependiente evoluciona en 2 fases denominadas

respuesta primaria y secundaria.

a) ¿Por qué se llaman 1aria

y 2aria

?

b) Realice una curva que represente los niveles e isotipos de anticuerpos a través del tiempo (días)

para esas 2 respuestas

c) Observando el gráfico indique cuál de las 2 respuestas:

- tiene mayor duración

- tiene menor nivel (es decir que alcanza una menor concentración de anticuerpos)

- tiene a la IgG como isotipo predominante

- tiene a la IgM como isotipo predominante

- es más rápida

Explique el por qué de cada una de esas características.

3) ¿Qué características tienen los antígenos T-independientes (TI)? Dé ejemplos. Esquematice cómo

interacciona un antígeno TI con las células que intervienen y las características de la respuesta humoral

que éste genera. Realice un cuadro señalando las diferencias con la respuesta humoral que genera un

antígeno T-dependiente.

4) Identifique los mecanismos en los que los anticuerpos intervienen para eliminar o limitar la acción de

un agente patógeno. Realice esquemas en los que se representen estas funciones biológicas de los

anticuerpos.

Glosario

Antígenos T dependientes

Antígenos T independientes

Maduración (aumento) de la afinidad

Procesamiento de Ag

Inmunidad humoral

Centro germinal

Cooperación celular

Cambio isotópico

Selección clonal

Clase o isotipo de Ig

Moléculas coestimulatorias

Bibliografia utilizada:

55

RESPUESTA INMUNITARIA CELULAR

1) Mencione las distintas subpoblaciones de linfocitos T y qué factores influencian su diferenciación

2) Elabore un cuadro indicando receptores celulares de las subpoblaciones de linfocitos T, vías de

presentación que las activan, función y principal citoquina/s que liberan.

3) Identifique los elementos celulares y humorales que intervienen en la respuesta inmune frente a un

antígeno que es procesado por la vía citosólica

a. Describa el mecanismo de presentación del antígeno, indicando las moléculas de membrana

que intervienen.

b. ¿Cuáles son los requerimientos para la activación de la célula efectora?

c. ¿Cuáles son las consecuencias de la activación de la célula efectora? ¿Cómo lleva a cabo la

eliminación del antígeno?

4) Elabore un cuadro comparando las vías de activación y mecanismo de citotoxicidad de los linfocitos T

citotóxicos y de las células NK (naturales asesinas).

5) ¿Cómo se diferencian la vía de citotoxicidad mediada por FAS de la mediada por perforinas?

6) ¿Qué mecanismos llevan a la activación de los macrófagos? ¿Cuáles son las consecuencias de su

activación?

Glosario

Linfocitos Th1

Linfocitos Th2

Linfocitos Th0

Apoptosis

FAS/ ligando de FAS

Perforinas

Citotoxicidad

INF

Macrófago activado

citotoxinas

Células naturales asesinas o NK

Bibliografia utilizada

56

RESPUESTA INMUNE EN ACCIÓN

1) Cite al menos 2 ejemplos de BACTERIAS EXTRACELULARES, de importancia en Medicina

Veterinaria, que sean productoras de EXOTOXINAS. Identifique sus principales factores de virulencia.

2) Ante la primera entrada de una bacteria productora de exotoxinas, identifique:

a. Las barreras naturales debe vencer para establecer una infección

b. Los principales mecanismos de la inmunidad innata que intervienen. ¿Cómo actúan estos

mecanismos para la eliminación y neutralización del microorganismo?

c. Los mecanismos de la inmunidad adquirida que son importantes para la eliminación de la

infección y para la protección frente a una nueva invasión del mismo microorganismo.

Explique brevemente como se inducen esos mecanismos, indicando cuál es la vía de

procesamiento principal del antígeno, poblaciones y subpoblaciones celulares que intervienen y

principales citoquinas liberadas.

¿Cómo actúan estos mecanismos para la eliminación y neutralización del microorganismo?

3) Conteste las preguntas 1 y 2, pero tomando en consideración BACTERIAS de vida

INTRACELULAR FACULTATIVA de importancia en Medicina Veterinaria.

4) Conteste las preguntas 1 y 2, pero tomando en consideración un VIRUS.

Con la información obtenida, complete el siguiente cuadro:

Tipo de microorganismo

Mecanismos Bacteria extracelular

toxigénica

Bacteria intracelular Virus

Mec.

efectores de

la II

solubles

celulares

Vía de procesamiento

principal del Ag

Principal subpoblación

de LT colaborador que

actúa

Mec.

efectores de

la IA

Solubles

Celulares

Glosario:

Virus

Endotoxina

Endotoxina

respuesta protectora

mecanismos de evasión de la respuesta inmune

Bibliografía utilizada:

57

INMUNOPREVENCIÓN

1) Complete el siguiente cuadro con los términos escritos en negrita:

Tipo de

inmunidad

activa/pasiva/

natural/artificial

Efectores involucrados

inducidos/transferidos

células/Ac

Duración de

la protección

corta/larga

Generación

de memoria

si/no

Vacunación

Sueroterapia

Infección o

enfermedad

Transferencia de

Ig vía placentaria

Transferencia de

Ig vía calostral

2) Indique en el siguiente cuadro las ventajas y desventajas del uso de vacunas convencionales vivas y

muertas.

Tipo de vacunas Ventajas Desventajas/riesgos

Vivas/ atenuadas

Muertas/inactivadas/inertes

3) ¿En qué tipo de vacunas deben usarse adyuvantes? ¿Cómo actúan estas sustancias sobre el sistema

inmunitario? Cite los adyuvantes de mayor empleo en medicina veterinaria.

4) ¿Qué es una anavacuna/anacultivo/vacuna integral?

5) ¿Con qué propósito vacunaría una hembra gestante? ¿Qué tipo de vacuna utilizaría y en qué momento

antes del parto lo haría? Fundamente sus respuestas.

6) ¿Cómo será la respuesta a una vacuna en la cual el Ag es un polisacárido de la cápsula de un

microorganismo? ¿Cómo se denominan este tipo de antígenos? ¿Qué tipo de vacuna sería más adecuado

si se quiere desarrollar una respuesta más eficiente y duradera contra ese Ag?

7) Ud. recibirá en clase un frasco de vacuna. En base al estudio del mismo complete este informe:

Se trata de una vacuna: combinada o mixta

monovalente / polivalente

viva / inerte

liofilizada / en suspensión o solución

El contenido es monodosis / varias dosis (¿cuántas?)

¿Por qué vía se aplica? ocular / subcutánea / intramuscular./ oral/ intranasal

¿Contiene adyuvante? SI-NO ¿cuál?

¿Qué tipo de antígenos incluye? Somas bacterianos / somas virales / toxoides / lisados / otros

¿Hay indicaciones respecto de su conservación?

Tiene etiqueta de aprobación oficial (SENASA). ¿Qué información hay en la misma?

¿A qué controles debió haberse sometido esta vacuna?

Glosario:

Bibliografía utilizada:

58

REGULACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNITARIA

1) Describa en qué se fundamenta la tolerancia hacia los propios tejidos.

2) ¿Por qué están regulados los mecanismos de la inmunidad innata?

3) ¿Por qué la respuesta inmunitaria frente a un Ag determinado no aumenta indefinidamente? Explique.

4) Identificar los procesos (incluidos los de regulación) que ocurren en cada etapa de la respuesta inmune

humoral (1-2-3).

5) ¿Por qué 2 animales pueden desarrollar una respuesta inmunitaria diferente frente a una misma

vacuna?

6) Compare las siguientes curvas de respuesta frente a vacunas atenuadas (vivas) e inactivadas (muertas).

¿A qué se debe la diferencia? Relacione con las funciones de los adyuvantes.

7) Discuta cuáles componentes incluiría en vacunas que protejan contra:

a) una potente exotoxina

b) una bacteria de vida intracelular facultativa

c) un virus

8) Discuta cómo debería ser el esquema de vacunación para proteger a un ternero contra enfermedades

que podría presentar en sus primeras semanas de vida. ¿Vacunaría al ternero recién nacido? Justifique su

respuesta.

Glosario:

Bibiografía utilizada:

1

2

3

Rta. a vacuna

inactivada

Rta. a vacuna

atenuada