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UN IV ERSID A D D E BUEN O S A IRES

FA C ULTA D D E C IEN C IA S V ETERIN A RIA S

QUMICABIOLGICA

GUA DE TRABAJOSPRACTICOS

2013

SEC RETA RIA D E PUBLIC A C IO N ES

CENTRO DE ESTUDIANTES DE VETERINARIA

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Curso de Qumica Biolgica

Gua de Trabajos Prcticos

Prof. Asociado a cargo Dr. Pablo Cetica

Prof. Titular Consulta Dra. Martha Beconi

2013

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Curso de Qumica Biolgica

Gua de Trabajos Prcticos

Edicin 2013

Redaccin: Prof. Titular Consulta Dra. Martha BeconiProf. Asociada Regular Bioq. Norma BeorleguiJefe de T.P. Lic. Laura Pintos

Actualizacin: Prof. Asociado Regular a cargo Dr. Pablo CeticaColaboracin del Dr. Gabriel Alvarez, Vet. Silvina Fernndez,Med. Vet. Noem Mora y Vet. Eva Romero

Rediseo: Prof. Asociado Regular a cargo Dr. Pablo CeticaJefe de T.P. Dr. Gabriel Dalvit

Docentes 2013

Profesores: Asociado Regular a cargo Dr. Pablo CeticaTitular Consulta Dra. Martha Beconi

Jefes de Trabajos Prcticos: Dra. Mara Vernica AchiDra. Elizabeth BreiningerDra. Mariana CrdobaDr. Gabriel DalvitMed. Vet. Noem MoraMg. Mercedes Satorre

Ayudantes de Primera: Dr. Gabriel Alvarez

Vet. Silvina FernndezVet. Cynthia GutniskyDra. Ana MarqunezVet. Sergio MoradoVet. Mara Sol Prez AguirreburualdeDr. Pablo RodrguezVet. Eva RomeroVet. Matas Tellado

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Indice

MATERIAL DE LABORATORIO Y BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIOBIOQUIMICO.....................................................................................................................pg. 41. Material de laboratorio no volumtrico.2. Material de laboratorio volumtrico.3. Bioseguridad en el laboratorio de bioqumica.PROTEINAS.......................................................................................................................pg. 14

4. Comportamiento de protenas en solucin.5. Mtodos ms usados para el fraccionamiento y/o purificacin de protenas.6. Protenas plasmticas.7. Fotometra.8. Determinacin de protenas plasmticas.9. Trabajo prctico experimental.10.Fraccionamiento de protenas plasmticas: Electroforesis.11.Trabajo prctico experimental.BIOENERGETICA...........................................................................................................pg. 46

1.

Definicin.2. Principios de la Termodinmica.3. Variacin de energa libre.4. Carga energtica de la clula.ENZIMAS...........................................................................................................................pg. 531. Aislamiento y purificacin de enzimas.2. Determinacin de la actividad de la lipasa pancretica.3. Trabajo prctico experimental.FERMENTACION LACTICA.......................................................................................pg. 63

1. Procesos aerbicos y anaerbicos.2. Trabajo prctico experimental.REGULACION HORMONAL DEL METABOLISMO DE LOS HIDRATOSDE CARBONO..................................................................................................................pg. 711. Mecanismos de regulacin de glucosa en sangre.2. Mtodo de dosaje de glucosa sangunea.3. Trabajo prctico experimental.

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LIPIDOGRAMA................................................................................................................pg. 80

1. Lipoprotenas plasmticas.2. Aplicaciones clnicas.3. Trabajo prctico experimental.METABOLISMO DE AMINOACIDOS....................................................................pg. 901. Enzimas sricas.2. Transaminasas.3. Mtodos de determinacin de actividad de las transaminasas.4. Interpretaciones clnicas.5. Trabajo prctico experimental.CUESTIONARIOS.........................................................................................................pg. 103a) Material de laboratorio y bioseguridad en el laboratorio bioqumico.b) Protenas I.c) Protenas II.d) Bioenergtica.e) Enzimas.f) Digestin y metabolismo de hidratos de carbono I.g) Metabolismo de hidratos de carbono II.h) Metabolismo de hidratos de carbono III.i) Respiracin celular I.j) Respiracin celular II.k) Aspectos genticos del metabolismo.l) Hormonas.m)Regulacin hormonal del metabolismo de los hidratos de carbono.n) Digestin y metabolismo de lpidos I.o) Metabolismo de lpidos II.p) Digestin de protenas y Metabolismo de aminocidos.q) Digestin y metabolismo en poligstricos.r) Fotosntesis.

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MATERIAL DE LABORATORIOY BIOSEGURIDAD EN EL

LABORATORIO BIOQUIMICO

TEMARIO

1. Material de laboratorio no volumtrico. Material volumtrico sin graduaciones. Materialno volumtrico con graduaciones aproximadas.

2. Material de laboratorio volumtrico. Matraces. Probetas. Pipetas. Buretas.3. Bioseguridad en el laboratorio bioqumico. Normas bsicas de bioseguridad en el

laboratorio de bioqumica. Sustancias qumicas peligrosas.

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Para la realizacin de los Trabajos Prcticos es necesaria la correcta utilizacin delmaterial de laboratorio. Uno de los factores que influyen en la aparicin de errores en el

laboratorio es la inadecuada utilizacin del material destinado a la medicin de volmenes,generando resultados confusos, principalmente al realizar determinaciones que sirvan como basepara la toma de decisiones teraputicas. El material de laboratorio se puede clasificar en novolumtrico y volumtrico.

1. MATERIAL DE LABORATORIO NO VOLUMETRICO

1.1. Material no volumtrico sin graduaciones

Corresponde al material que no posee ningn tipo de escala graduada, como el caso de los

tubos de ensayo. Una caracterstica a tener en cuenta es que el dimetro y longitud de losmismos es variable entre distintos fabricantes, lo que puede generar confusiones al controlarvisualmente el llenado de los mismos. Los tubos de ensayo se colocan en gradillas diseadas paraese fin que pueden ser de metal, de plstico o de madera. Las de madera no deben sumergirsedentro de baos de incubacin, ya que el agua puede arruinar la madera.

1.2. Material no volumtrico con graduaciones aproximadas

La graduacin que presenta este tipo de material no es exacta. Generalmente se indica,junto al volumen mximo de graduacin, el error aproximado que se puede realizar al medir coneste material, a una temperatura de 20C.

En el laboratorio, comnmente se utilizan: vasos de precipitados, balones yerlenmeyers.

Este material no se usa para la medicin de volmenes exactos. Por ejemplo, al llenar unvaso de precipitados hasta la lnea que indica 100 ml no tenemos exactamente 100 ml, sino queexisten aproximadamente 100ml. Esto significa que, aunque hayamos enrasado perfectamente enla lnea que indica los 100 ml, en realidad puede haber 93, 114 100,4 ml. Esto no se debe aerrores en la manipulacin por parte del operador, sino que es una caracterstica del materialutilizado.

Los erlenmeyers se utilizan para preparar soluciones y facilitar la mezcla acelerando elproceso de disolucin. Tambin se usan en las titulaciones para facilitar la agitacin.

2. MATERIAL DE LABORATORIO VOLUMETRICO

Corresponde al material especficamente fabricado para la medicin de volmenes. Porejemplo: matraces, probetas, pipetas (manuales y automticas) y buretas.

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Cmo realizar la lectura del nivel en el material graduado (Enrase)En los tubos delgados de vidrio, debido a la tensin superficial de los

fluidos contenidos en ellos, se forma un menisco cncavo (M en elgrfico) en la superficie del lquido a medir.La lectura se debe realizar en la lnea de graduacin (G en el grfico)correspondiente a la parte ms baja del menisco.Para evitar errores en la lectura, el material deber encontrarse enposicin vertical, y el menisco deber mantenerse a la altura de los ojosdel operador.

2.1. Matraces

Se trata de material volumtrico con una nica medida. Estn graduados para medir unvolumen determinado cuando son llenados hasta la lnea de graduacin correspondiente, por lo

tanto, no se pueden utilizar, para medir volmenes inferiores o superiores al volumen indicado.Existen matraces de diversas capacidades, desde 5 hasta 2000 ml (5, 10, 25, 50, 100, 250, 500,1000 y 2000 ml).

Se utilizan principalmente para la preparacin de soluciones y reactivos y no paradeterminar el volumen desconocido de un lquido.

2.2. Probetas

Son cilindros graduados de boca ancha y permiten la medicin de volmenes de 10 a 2000ml (10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 ml). Siempre se debe utilizar una probeta con capacidadsuperior ms cercana al volumen a medir. Por ejemplo: Para medir 45 ml, se deber utilizar una

probeta de 50ml. Para medir 180 ml, se deber utilizar una probeta de 250ml.

2.3. Pipetas manuales (De simple y doble aforo)

Las pipetas ms comunes pueden ser de: 0,1, 0,2, 1, 2, 5 y 10 ml. Para la correctautilizacin de las pipetas manuales se debe tener en cuenta:

2.3.1. Conocer que pipeta utilizarComo en el caso de las probetas, siempre debe utilizarse la pipeta de un volumen superior

prximo al volumen a medir. Po ejemplo, para medir 0,7 ml, se deber utilizar una pipeta de 1ml. Para medir 2,6 ml, se deber utilizar una pipeta de 5 ml.

2.3.2. Identificar la pipeta a utilizar

a) Identificar el volumen mximo y la precisin: Todas las pipetas tienen en su extremosuperior la indicacin de sus caractersticas, por lo tanto se puede observar:

- El volumen mximo que puede ser medido (Por ejemplo, 5 ml)- El volumen que hay entre dos lneas de graduacin (Por ejemplo, la marca "1/100"

indica que cada lnea de graduacin contiene 1/100 de ml).

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b) Identificar el tipo de pipeta, de simple o de doble aforo: Las pipetas de simple aforose cargan hasta un volumen superior a cero, luego se enrasa y se descarga exactamente hasta el

volumen requerido, o completamente si se necesita el volumen total.Las pipetas de doble aforo tienen la particularidad de tener el rea graduada separada del

extremo de la pipeta, lo que implica que el volumen mximo a medir queda incluido entre doslneas claramente definidas, que indican el inicio y el final de la escala. Por lo tanto, debern serdescargadas hasta la marca inferior y no hasta el final de la pipeta.

Si es necesario hacer la descarga completa de la pipeta, las mediciones realizadas con unapipeta de doble aforo son ms exactas que las realizadas con las de simple aforo (excepto almedir agua destilada). La razn de esto es que en las pipetas de simple aforo las graduacionesinferiores corresponden a la seccin cnica de la pipeta y el volumen remanente que queda porcapilaridad puede variar de una sustancia a otra.

c) Cargar la pipeta: Para realizar la carga de la pipeta es recomendable el uso de unapropipeta o una pera de goma, ya que el operador se expone menos al riesgo de tragar la sustanciaa pipetear y permite controlar el ascenso de la columna del lquido hasta la graduacin deseada.

Manipulacin de la pipetaLa pipeta debe ser tomada entre los dedos medio y pulgar,utilizando al dedo ndice como tope en el extremo superior de lamisma.Esta forma de tomar la pipeta puede ser dificultosa al principio,pero tiene las siguientes ventajas respecto a tomarla con la mano,tapando con el pulgar:- Al tomar la pipeta en la forma correcta, el centro de rotacin dela misma se encuentra en una posicin ms conveniente, por lotanto la manipulacin, ya sea para cargarla o descargarla, es muchoms precisa.- La movilidad fina en el dedo ndice es mejor, permitiendo que ladescarga de la pipeta pueda ocurrir en forma gradual, lo que noocurre al ocluirla con el dedo pulgar.

Manipulacin de propipetasLas propipetas de goma se manipulan de la siguiente forma:- Para expeler el aire presionar la vlvula A sobre la parte

superior del bulbo.- Succionar el lquido hacia arriba presionando la vlvula S

ubicada en la parte inferior.- Para descargar presionar la vlvula E que se encuentra al

costado de la vlvula S.

Las propipetas de mbolo se manejan con una sola mano. Girandola rueda dentada hacia arriba o abajo se obtiene un llenado ovaciado preciso y pulsando la clavija lateral se produce el vaciadoautomtico.

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d) Descargar la pipeta: Para efectuar la descarga de la pipeta deber apoyarse el extremoinferior de la misma a la pared del recipiente en donde se descargue el contenido, liberando

lentamente el dedo ndice y permitiendo la descarga del volumen deseado. En el caso dedescargar completamente el contenido de una pipeta de simple aforo, se considera al volumenremanente en el extremo de la misma, incluido en el volumen medido, por lo tanto este volumenremanente no debe ser descargado. Esto implica que nunca se debe soplar el contenido remanentede la pipeta.

2.4. Buretas

Las buretas se utilizan para realizar titulaciones. Constan de un cilindro graduado (condoble aforo) y un robinete, que permite ocluir el paso del lquido en forma total o parcial. Elrobinete deber ser manipulado con los dedos ndice y pulgar de la mano izquierda,mantenindose el cuerpo de la bureta en el espacio dejado por estos dedos. Esto permite quecualquier exceso de fuerza no desplace al robinete de su ubicacin, evitando las prdidas por loslaterales del mismo.

Al realizar una titulacin, el punto de inters es el recipiente en donde se est realizando lamisma, detenindose el proceso en el momento en el que el indicador utilizado realice el cambioesperado en su coloracin, por lo tanto las buretas permiten independizarse de la lectura delvolumen utilizado, que se realiza despus de finalizar la titulacin.

Los pasos a seguir para la correcta utilizacin de las buretas son los siguientes:

2.4.1. Montaje de la bureta en su soporte

Para tal fin deber armarse el soporte, utilizando una doble nuez que se fija al mismo ymantiene a la bureta en posicin vertical. Para fijar la bureta, deber ajustarse lentamente latuerca mariposa de la doble nuez, hasta que la bureta no tenga ms movilidad. El ajuste deberser lo suficientemente firme como para mantener a la bureta en posicin vertical, evitando elexceso de presin, lo que podra provocar la rotura de la bureta. La altura de la doble nuez nodeber interferir con la lectura de las graduaciones de la bureta.

2.4.2. Cargado de la bureta

a) Llenado: Una vez fijada la bureta con el robinete cerrado, se coloca un embudo en laparte superior para efectuar la carga, prestando especial cuidado en evitar la formacin deburbujas en el interior de la misma. En este paso, no es necesario el enrase a cero. El airecontenido en la porcin inferior al robinete debe ser desalojado para poder utilizar las buretas conexactitud. Para esto, se deber colocar un recipiente debajo de la bureta, y abrir el robinete, hastaque la burbuja sea desalojada completamente. En caso que la burbuja persista, se puede descargarcompletamente la bureta e iniciar nuevamente la carga con el robinete abierto, habiendo colocadopreviamente un recipiente debajo de la misma.

b) Enrase: Una vez cumplidos los pasos anteriores, se proceder al llenado final y enrasede la bureta, manteniendo las mismas precauciones citadas anteriormente.

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c) Descarga de la bureta: La descarga del contenido de la bureta deber ser realizada enforma de goteo lento (no abrir el robinete completamente), reduciendo gradualmente el flujo de la

solucin a medida que se aproxima el punto de viraje del indicador utilizado. Cuando se logra elpunto final de la titulacin se debe cerrar el robinete.

d) Lectura del volumen utilizado: La lectura del volumen utilizado deber realizarse alfinal de la utilizacin de la bureta, tomando las precauciones descriptas anteriormente para elenrase y lectura.

e) Recarga: Una vez finalizada la lectura, es recomendable la recarga y el enrase de labureta, si es necesario realizar otra titulacin.

Limpieza del material de laboratorioTodo el material utilizado debe ser enjuagado inmediatamente despus de su uso, para evitar que se tapen yeliminar sustancias extraas que puedan interferir en futuras determinaciones. Como las buretas son utilizadaspara realizar titulaciones con soluciones de cidos o bases, el secado de dichas soluciones, forma cristales, loscuales pueden provocar la obstruccin del pico o el bloqueo del robinete, con lo cual quedarancompletamente inutilizadas. Si se trabaja con una pipeta que se utiliz para medir una solucin de protenasy fue mal lavada, se estar obteniendo e informando un valor de protenas superior al valor real del paciente.Al finalizar el trabajo prctico se deber lavar el material con detergente y abundante agua corriente,particularmente si se utiliz material biolgico con materia grasa como leche o yogur. Para ello se puedeutilizar escobillas, que resultan particularmente tiles para lavar el fondo de tubos de ensayo, probetas yerlenmeyers. Finalmente deben enjuagarse todos los materiales lavados utilizando preferentemente aguadestilada.Posteriormente se dejar secar al aire, antes de ser colocado en su lugar correspondiente, si no se dispone de

estufa para secar el material. Queda exceptuado del secado en estufa el material de vidrio volumtrico, ya queel vidrio puede sufrir modificaciones en su forma por efecto del calor y del enfriamiento, afectando la escalade graduacin.

3. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO BIOQUIMICO

3.1. Normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio de bioqumica

Las prcticas que se llevan a cabo en el laboratorio presentan riesgos propios de cadaactividad. Las reglas bsicas que se detallan a continuacin, son un conjunto de normasdestinadas a prevenir accidentes y proteger la salud de alumnos y docentes. El conocimiento deesta informacin resulta esencial para evitar o minimizar inconvenientes dentro del laboratorio.

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Se deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad como matafuegos, salidas deemergencia, duchas y lavaojos.

Se debe utilizar la vestimenta apropiada para el trabajo en el laboratorio. El guardapolvoconstituye una barrera de proteccin, por lo que debe usarse completamente abrochado, sinarremangar y sin ninguna vestimenta por encima. Las piernas deben estar totalmente cubiertasy el calzado debe ser cerrado. El cabello largo debe estar siempre recogido.

Las mesadas de trabajo deben estar siempre despejadas, libres de libros, abrigos, materialesde estudio y objetos personales como celulares.

Las manos deben lavarse cuidadosamente luego de manipular cualquier sustancia qumica omaterial biolgico y antes de retirarse del laboratorio.

Se debe dar aviso inmediato al personal docente si detecta fallas en las instalaciones elctricaso de gas, as como al detectar materiales de laboratorio rotos o daados.

Toda herida o abrasin, por ms pequea que sea, as como el ingerir accidentalmente algunasustancia, se deber informar inmediatamente a los docentes. El laboratorio debe contar conun botiqun de primeros auxilios correctamente identificado y de fcil acceso.

Todo residuo que se genere deber ser depositado en el recipiente destinado para tal fin. Estosdeben estar correctamente rotulados con el tipo de desechos que pueden contener, comosustancias txicas, material biolgico, papeles, etc. El material de vidrio roto deberenvolverse en papel antes de ser depositado en el cesto de basura.

Utilizar preferentemente dispositivos mecnicos como propipetas o peritas de goma parapipetear.

Mantener el orden y la limpieza dentro del mbito del laboratorio. Las mesadas debernquedar perfectamente limpias y libres de cualquier residuo o elemento al finalizar laactividad.

SI

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No se debe comer, beber o fumar dentro del laboratorio. No llevar las manos a la boca u ojos cuando se haya manipulado sustancias qumicas y

biolgicas.

No inhalar o probar productos qumicos o biolgicos. Se debe evitar el uso de accesorios, como pulseras, collares, relojes, anillos, etc. No retirarse del laboratorio sin haberse quitado el guardapolvo para dirigirse a otras reas

(comedor, sanitarios, aulas, oficinas) o viajar.

No se deben bloquear los pasillos y caminos de escape ante una emergencia con bancos,sillas, mochilas o cualquier elemento que entorpezca la correcta circulacin. No se permitecorrer dentro del laboratorio, el andar dentro del mismo debe ser cuidadoso para evitarromper los materiales y causar derrames de sustancias.

No utilizar equipos sin haber recibido entrenamiento previo o supervisin del personaldocente.

No se deben guardar alimentos en heladeras o freezers donde se almacenen sustanciasqumicas o material biolgico.

No utilizar el contenido de un recipiente que no est identificado. Todo material a utilizardebe estar adecuadamente rotulado.

Est prohibido descartar sustancias txicas, inflamables y corrosivas, as como materialbiolgico, por las piletas.

3.2. Sustancias qumicas peligrosas

Las sustancias qumicas se clasifican en funcin de su peligrosidad y se reconocen por unsmbolo especfico.

NO

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Sustancias y preparados que pueden explotar al acercarles una llama

o por choques o movimientos violentos. Debe evitarse el calor,fuego, chispas, percusin o friccin.Mezclas como sodio y agua, hidrgeno y aire (en contacto con unallama).

Sustancias que por la accin de una fuerte ignicin, puedenarder y continuar quemando. Deben mantenerse lejos de llamas,chispas y fuentes de calor.Acetona, alcoholes, benceno, magnesio en polvo, hexano,fenolftalena, ter etlico.Lquidos con puntos de inflamacin y ebullicin bajos, y gases

que a presin y temperatura ambiente son muy inflamables en elaire. Deben mantenerse lejos de llamas, chispas y fuentes decalor.

En contacto con otros productos, especialmente con losinflamables, reaccionan desprendiendo calor. Pueden provocarincendios.Nitrato de amonio, de plomo, de potasio, de aluminio y de cinc,clorato de sodio y de potasio, cido perclrico, dicromato depotasio, cido ntrico, agua oxigenada.

Por inhalacin, ingestin o penetracin por la piel pueden producirenvenenamientos graves o incluso la muerte. Benceno, mercurio,metanol, cianuros, arsnico, dicromato de potasio, tetracloruro decarbono, xidos de nitrgeno, halgenos, fenol, sulfato de cromo,anilinas.La absorcin de estas sustancias en cantidades muy pequeas puedetener efectos muy graves para la salud, pudiendo llegar aconsecuencias mortales.

Por inhalacin, ingestin o penetracin por la piel pueden producirdaos de gravedad limitada.

cido brico, permanganato de potasio, yodo, algunas sales y xidode plomo, naftaleno, algunas sales y xidos de cobre.Por contacto prolongado con piel y mucosas, pueden originarinflamaciones.Hidrxido de amonio, sulfato de sodio, cromato de potasio, gases demuchos cidos (clorhdrico, ntrico, sulfrico, etc.).

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Sustancias y preparados que tienen una accin corrosiva sobre la piel.Muchos cidos (ntrico, clorhdrico, sulfrico, etc.), nitrato de plata,

bases fuertes (hidrxido de sodio, de potasio, amonaco).

El contacto de esta sustancia con el medioambiente puede causardaos en el ecosistema.Benceno, cianuro de potasio, entre otros.

Riesgo de emisin radiactiva.Ciertos istopos de algunos elementos (yodo, polonio, etc.).

Riesgo de peligro biolgico.Virus, bacterias, priones, parsitos.

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PROTEINAS

TEMARIO

Estructura y funciones biolgicas de las protenas. Desnaturalizacin. Propiedades cido-basede aminocidos y protenas. Significado del punto isoelctrico y pK. (Estos temas debernrepasarse del Curso de Qumica Orgnica de Biomolculas).

1. Comportamiento de protenas en solucin. pH. Fuerza inica. Propiedades dielctricas delsolvente. Temperatura.

2. Mtodos ms usados para el fraccionamiento y/o purificacin de protenas.Centrifugacin. Cromatografa lquida. Electroforesis. Fraccionamiento Salino. Dilisis.

3. Protenas plasmticas. Composicin de la sangre. Fracciones proteicas del plasma.4. Fotometra. Introduccin. Teora de la espectrofotometra. Instrumental: Fotocolormetro y

Espectrofotmetro. Curva de calibracin. Utilizacin del blanco. Clculo del factor.

5. Determinacin de protenas plasmticas. La reaccin del Biuret: Fundamento. Otrosmtodos para valorar protenas.

6. Trabajo prctico experimental. Dosaje de protenas plasmticas.7. Fraccionamiento de protenas plasmticas: Electroforesis. Introduccin. Teora de la

Electroforesis. Electroendsmosis. Variacione fisiolgicas. Aplicaciones clnicas.

8. Trabajo prctico experimental. Proteinograma electrofortico.

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1. COMPORTAMIENTO DE PROTEINAS EN SOLUCIONLa solubilidad de las protenas depende del pH, de la fuerza inica de la solucin, de laspropiedades dielctricas del solvente y de la temperatura. Estas variables pueden usarse paraseparar mezclas de protenas.

1.1. pHLas protenas muestran un mnimo de solubilidad a un determinado pH, que es especfico paracada una de ellas y se denomina punto isoelctrico (PI), que se define como el pH en el cual, lamolcula proteica no posee carga elctrica neta. En estas condiciones no hay repulsinelectrosttica entre molculas vecinas y tienden a agregarse y a precipitar. A mayores o menoresvalores de pH, las protenas tienen carga elctrica neta del mismo signo, incrementando la capade solvatacin e impidiendo que se formen agregados insolubles. El PI vara con la composicininica del medio. Cuando las protenas estn disueltas en agua pura (deionizada) el PI se conocecomo pH isoinico. El pH isoelctrico de una protena, esta determinado por el nmero y los pKde cada grupo R que se ioniza.

1.2. Fuerza inicaLa fuerza inica de una solucin es una medida de su concentracin salina y se puede calcular a

travs de la siguiente frmula: 221 ZiCi , donde Ci es la concentracin de cada in

presente en la solucin y Zi es la carga correspondiente a cada uno de estos iones. Las salesneutras en solucin se disocian, formando iones solvatados que modifican la solubilidad de lasprotenas. A baja concentracin salina, la solubilidad de la protena aumenta: "salting in",debido a que las cargas de las protenas interaccionan con los iones de las sales, incrementando lacapa de solvatacin de las mismas y disminuyendo la interaccin protena-protena.Por otra parte, a altas concentraciones de sales neutras, la solubilidad de las protenas disminuye("salting out") porque los iones de la sal disuelta atraen el agua de solvatacin disponible,aumentando la interaccin entre las molculas de protena. Las protenas precipitadas por"salting out", retienen su conformacin nativa y pueden disolverse nuevamente con el agregadode solvente sin experimentar desnaturalizacin.

1.3. Propiedades dielctricas del solventeLa solubilidad de una protena a una fuerza inica y pH determinados, es funcin de la

constante dielctrica del medio. A medida que disminuye la constante dielctrica del solventedisminuye la solubilidad de las protenas, porque a menor constante dielctrica aumenta la fuerzade atraccin entre las cargas opuestas, luego las protenas tienden a agregarse y precipitar. Elagua tiene la mxima constante dielctrica, mientras que los solventes orgnicos tienen valoresms bajos de constantes dielctricas.

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1.4. TemperaturaDentro de un rango limitado entre 0 y 40C, la mayor parte de las protenas aumenta susolubilidad al aumentar la temperatura. A temperaturas mayores de 40C, aumenta la agitacintrmica y se rompen las uniones que mantenan las estructuras secundaria, terciaria, cuaternaria yla protena se desestabiliza y precipita (desnaturalizacin).

2. METODOS MAS USADOS PARA FRACCIONAMIENTO Y/OPURIFICACION DE PROTEINAS

En el fraccionamiento y/o purificacin de protenas se utilizan mtodos que se describen a

continuacin:

2.1. CentrifugacinLa fuerza centrfuga permite separar partculas en suspensin que posean diferente masa odiferente densidad, depositndolas en el fondo del tubo a diferentes velocidades. A menorvelocidad se depositan las partculas ms pesadas o de mayor densidad. Los tipos ms usadosson:

2.1.1. Centrifugacin diferencial (se ver ms adelante)2.1.2. Centrifugacin en gradiente de densidadSe prepara una solucin de sacarosa de densidad creciente en un tubo de centrfuga, luegose deposita la mezcla de protenas y se centrifuga en posicin horizontal a alta velocidad. Seobtienen as diferentes bandas segn su tamao y densidad.

2.2. Cromatografa lquidaEs otra tcnica utilizada comnmente para separar mezclas de protenas, que se basa en lainteraccin entre las molculas disueltas y una superficie slida que se halla contenida en unacolumna. Este tipo de cromatografa puede ser:

2.2.1. Cromatografa de exclusin o de filtracin por gelLas protenas se separan de acuerdo a su tamao. En este caso la columna contiene polmeros conporos de diferente tamao, de acuerdo a las protenas que se desean separar. La mezcla con lasprotenas disueltas fluye sobre la columna, las molculas de pequeo tamao penetran en losporos del polmero y su movimiento a travs de la columna se retarda. En cambio las protenasde mayor tamao no pueden penetrar en los poros del gel y fluyen ms rpidamente.

2.2.2. Cromatografa de intercambio inicoLas protenas son separadas por diferencia de carga. Grupos funcionales cargados positivamente(-NH3

+) o negativamente (-COO-) se unen covalentemente a un soporte slido formando un

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intercambiador aninico o catinico. Cuando una molcula proteica cargada se hace pasar por unintercambiador de carga opuesta, sta es retenida por fuerzas electrostticas, mientras que las

molculas neutras o de igual carga, pasan a travs de la columna. La unin de la molcularetenida es reversible y puede ser eluida por el agregado de soluciones de diferentesconcentraciones salinas o por una solucin con un gradiente de pH.

2.2.3. Cromatografa de afinidadSe basa en la afinidad con que una protena se une especficamente a otra molcula

(ligando). Ej: enzimas unen coenzimas e inhibidores, anticuerpos unen a protenas antignicas,etc. Un ligando est covalentemente unido al soporte y est dentro de una columnacromatogrfica. Cuando se coloca una mezcla de componentes, los compuestos que no tienenafinidad por el ligando, fluyen a travs de la columna, quedando retenida la protena que tieneafinidad por dicho ligando. La elucin se hace con soluciones que contienen exceso de ligando.

2.3. ElectroforesisEs una tcnica para separar protenas bajo la influencia de un campo elctrico. La

movilidad de cada uno de las molculas cargadas en un campo elctrico depende de su carga y desu tamao molecular. Si dos molculas tienen la misma masa y forma, la que tiene una cargaelctrica neta mayor, se mover ms rpidamente hacia el electrodo de signo opuesto.

Las ms comnmente usadas son:

2.3.1. Electroforesis en tiras de acetato de celulosa (se utilizar en el trabajo prcticoexperimental)

2.3.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-poliacrilamida)En este caso la mezcla de protenas es tratada con SDS (dodecil sulfato de sodio) que es

un detergente cargado negativamente, que se une a las protenas. Colocando la mezcla sobre elgel de poliacrilamida y aplicando una corriente elctrica, los complejos SDS-protenas migran atravs de los poros del gel de poliacrilamida (el tamao de los poros del gel depende de la tcnicade preparacin del mismo). Las protenas ms pequeas pasan a travs de los poros del gel msfcilmente, recorriendo una mayor distancia, lo contrario ocurre con las protenas de mayortamao, como consecuencia, las protenas se separan en bandas de acuerdo a su tamao. Estasbandas se visualizan por tratamientos con un colorante. Si L es el largo del gel y d1, d2 y d3 sonlas distancias recorridas se pueden calcular los Rf ("Running front": frente de corrida) para cada

una de ellas:

L

dRf

A partir de los Rf se puede calcular el peso molecular de cada una de las protenas.

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2.4. Fraccionamiento salinoSe basa en la separacin de una mezcla proteica por el agregado de sales ("salting in" o

"salting out"). La precipitacin con sales es un mtodo muy efectivo para la purificacin proteica.El agente precipitante ms usado es el sulfato de amonio: (NH4)2SO4. Se usa para la precipitaciny purificacin de las distintas enzimas presentes en un tejido determinado, debido a su gransolubilidad en agua destilada an a bajas temperaturas, lo que permite usarlo en altasconcentraciones, es adems econmico y no tiene efectos nocivos sobre las protenas.

2.5. DilisisPermite separar las protenas, de un soluto de bajo peso molecular, haciendo pasar este

ltimo a travs de una membrana semipermeable que retiene a las molculas proteicas.

3. PROTEINAS PLASMATICAS3.1. Composicin de la sangre

La sangre es un tejido que circula dentro del sistema de los vasos sanguneos. Estcompuesta por elementos figurados (eritrocitos o glbulos rojos, leucocitos o glbulos blancos yplaquetas) y por el plasma que mantiene a las clulas en suspensin.

La sangre constituye el vehculo por el cual la mayor parte de los nutrientes son

transportados al hgado y a los rganos en general, y los productos de desecho retornan a lospulmones y a los riones, para su excrecin. La sangre transporta el oxgeno desde los pulmonesa los tejidos, y el dixido de carbono, producido durante el metabolismo respiratorio desde lasclulas hacia los pulmones.

Casi la mitad, aproximadamente, del volumen sanguneo lo ocupan sus clulas, queconsisten en su mayor parte en los glbulos rojos y en una cantidad mucho ms pequea, losglbulos blancos y las plaquetas.

Si se saca sangre de una vena y se agrega un anticoagulante apropiado para prevenir sucoagulacin, los elementos celulares en suspensin pueden ser separados por centrifugacin. Ellquido sobrenadante, normalmente de color ligeramente amarillo, se denomina plasmasanguneo.

Si al extraer la sangre se deja que coagule, y se somete luego a centrifugacin, se separaun lquido que se denomina suero sanguneo.As, la diferencia entre plasma y suero sanguneo es que este ltimo carece de fibringeno

(precursor de la fibrina que forma el cogulo).El plasma contiene aproximadamente un 10% de solutos disueltos, de estos un 2% esta

integrado por nutrientes orgnicos y sustancias de desecho. Un 1% est representado por salesinorgnicas y aproximadamente el 7% restante, lo constituyen las protenas plasmticas.

Los principales iones inorgnicos del plasma sanguneo son el Na+, Ca++, Mg++, Cl-,HCO3

- y H2PO4-, que desarrollan una importante funcin en la regulacin de la actividad hstica.

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Las protenas plasmticas estn integradas por una mezcla de diferentes fraccionesproteicas. La concentracin total de protenas plasmticas en mamferos vara entre 5,5 y 8,5

g/100ml (ver cuadro pg. 28).

3.2. Fracciones proteicas del plasma3.2.1. Fibringeno

Es el precursor de la fibrina, que participa en la formacin del cogulo sanguneo. Estaprotena es producida por el hgado y constituye solo el 4 - 6% de las protenas totales del plasma.El suero no contiene fibringeno puesto que se usa en el mecanismo de coagulacin, pero scontiene la misma cantidad de albminas y globulinas que el plasma.

3.2.2. AlbminaEs la fraccin ms abundante, aunque las cantidades relativas, varan entre 40-60% de las

protenas totales, segn las distintas especies. La albmina es sintetizada en el hgado y susprincipales funciones son:a) El mantenimiento del volumen del plasma, o sea del equilibrio osmtico entre la sangre

circulante y el lquido intersticial.b) El transporte de sustancias poco solubles en agua (Ej: cidos grasos libres).3.2.3. Globulinas

La fraccin globulnica de las protenas plasmticas es una mezcla muy compleja, queagrupa las siguientes fracciones principales: 1 y 2 globulinas, globulinas y globulinas.Todas cumplen funciones biolgicas muy importantes; por ejemplo:a) Antitripsina (1 globulina)b) Ceruloplasmina: (2 globulina), transporta el 90% del cobre presente en el plasma.c) Transferrina: ( globulina) es una glucoprotena que transporta el Fe+++ desde el intestino a

los lugares del organismo que lo necesiten.d) Inmunoglobulinas: ( globulina) son sintetizadas en los linfocitos B, secretadas a la

circulacin sangunea y constituyen un mecanismo importante de defensa del organismo.Las proporciones de las globulinas varan segn las especies animales.

Las protenas plasmticas se pueden dosar por varios mtodos espectrofotomtricos.

4. FOTOMETRIA4.1. Introduccin

La luz, energa radiante o radiacin electromagntica interacta con la materiaproduciendo una variedad de fenmenos ampliamente conocidos: reflexin, refraccin,absorcin, polarizacin, etc. De todos estos fenmenos, el de absorcin de la luz constituye labase de los mtodos de anlisis ms importantes de la qumica biolgica y otras ciencias.

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Cuando un haz de luz llega a un medio homogneo, una parte de la luz incidente serefleja, otra se absorbe y el resto es transmitida.

Verificndose que: I0=Ia+It+IrDonde:Io = intensidad de la luz incidente.

Ia = intensidad de la luz absorbida.It = intensidad de la luz transmitida.Ir = intensidad de la luz reflejada.De la ecuacin anterior puede despreciarse la Ir por ser del orden del 4% respecto de la

incidente (cuando se trata de interfase aire-vidrio) quedando:

I0=Ia+It

La fraccin de luz transmitida It depende:a) De la intensidad de la Io.b) Del espesor (l) del medio atravesado por la luz.c) De la estructura molecular de la sustancia disuelta en ese medio y tambin de la estructura del

solvente.d) De la concentracin (c) de dicha sustancia.e) De la longitud de onda () utilizada en el haz incidente.f) De la temperatura del sistema.

Los mtodos fotomtricos se pueden utilizar para:

a) La identificacin de una sustancia por medio de su espectro de absorcin caracterstico.b) Hallar la concentracin en base a la luz absorbida a una determinada longitud de onda ().

De estas dos posibilidades que brinda la espectrofotometra, estudiaremos aqu la segundao sea la medicin de la concentracin de una sustancia en solucin en base a la luz absorbida.

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4.2. Teora de la espectrofotometra4.2.1. Ley de Lambert

En 1760, Lambert investig la relacin existente entre Io e It cuando la luz atravesabalminas coloreadas de diferentes espesores, estableciendo que la It decrece exponencialmente alaumentar el espesor (l) de la lmina, es decir:

l0 10

IIt (1)Siendo el coeficiente de extincin que es constante y especfico de la lmina utilizada.4.2.2. Ley de Beer

En 1852, Beer estudi la absorcin de la luz por medio de soluciones coloreadas variandola concentracin (c) en lugar del espesor, llegando a una expresin matemtica similar:

ct II

100 (2)Lo que significa que la It disminuye exponencialmente al aumentar c.

Como las soluciones pueden medirse bajo espesores diferentes se pueden combinar lasdos ecuaciones anteriores (1) y (2) en una que rene las leyes de Lambert y Beer:

lct II

100 o bienclt

I

I 100

Que al aplicarle logaritmo resulta:

10loglog0

clI

It

Multiplicando por (-1) nos conduce al concepto de absorbancia (A) ya que:cl

I

I

I

I

t

t 0

0loglog clA (3)

De la ecuacin (3) podemos despejar el coeficiente de extincin molar:cl

A que puede

definirse como la absorbancia de una solucin cuando el espesor es igual a 1 cm y la

concentracin es 1 M y sus unidades son: 11 Mcm ya que la absorbancia no tiene unidades.

Se llama transmitancia (T) a la relacin0I

IT t o fraccin de luz transmitida, y

transmitancia porcentual:

0

100%I

IT t

De estas definiciones se deduce la relacin entre Absorbancia y Transmitancia porcentual:

Como0

100%I

IT t

Aplicando logaritmos 0100 IIT t logloglog%log

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Multiplicando x (-1) 0100 IIT t logloglog%log

tIIT 0log2%log

AT 2%log

Para T% = 100 100% de luz transmitidala A = 0

Para T% = 0 0% de luz transmitidala A 2

4.3. Instrumental: Fotocolormetro y espectrofotmetroEl fotocolormetro se esquematiza en la siguiente figura:

Se emplea usualmente luz blanca de tungsteno que es filtrada por lminas coloreadas(fotomtro a filtro). De todo el espectro visible, el filtro deja pasar un cierto ancho de longitudesde onda ( ) que incidir en el tubo o cubeta con la solucin a medir.

Si en lugar de filtros se utiliza un prisma o una red de difraccin (o ambos combinados) seconsiguen medidas ms precisas, pudindose modificar la longitud de onda del espectro en formacontinua. Con esto se consigue ms definicin en las lecturas del aparato (espectrofotmetro).

Por otra parte, puede cambiarse la fuente de luz y alcanzarse, usando otras lmparas,zonas del espectro no visibles, por ej. lmparas de Deuterio para leer en la zona Ultra Violeta(U.V.). Todos estos mtodos permiten dosar sustancias en muy pequeas cantidades (trazas).

Las lecturas se hacen en un galvanmetro graduado directamente en unidades deabsorbancia, aunque la mayora de los equipos cuentan con una doble escala paralela deAbsorbancia y Transmitancia porcentual (ver esquema). En el trabajo prctico utilizaremos laabsorbancia que mantiene una relacin lineal con la concentracin.

Por ltimo puede mencionarse que en equipos ms modernos la lectura es digital y poseenminicomputadoras que permiten obtener directamente la concentracin expresada en las unidadesdeseadas.

%log2 TA

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4.4. Curva de calibracin

Se usa para evaluar la concentracin de una sustancia S. De la ecuacin lcA seinfiere que si se grafica la absorbancia de una solucin en funcin de concentraciones variablesde la misma, se obtiene una recta que pasa por el origen y cuya pendiente es l, o sea una curvade calibracin consiste en un grfico que relaciona absorbancia con concentraciones conocidas dela sustancia S a dosar.

Para realizar una curva de calibracin:a) Se utiliza como testigo una solucin de la sustancia a dosar (S), valorada por otro mtodo.b) Se toman diferentes alcuotas de la solucin testigo, llevndolas en cada caso al mismo

volumen final con agua destilada, luego se agregan el o los reactivos que producen lareaccin de color. Quedan as diferentes concentraciones de la sustancia y a cada una lecorresponder un valor determinado de absorbancia.

c) Se prepara un blanco en el que intervienen todas las sustancias que participan en la reaccincolorimtrica menos la que se quiere dosar.

d) Se coloca el blanco en la cubeta de un fotocolormetro o espectofotmetro y se ajusta laabsorbancia a cero.

e) Se lee a continuacin las absorbancias de cada una de las distintas concentraciones de lasolucin testigo.

f) Los datos obtenidos se consignan en una tabla y luego se realiza un grfico de absorbancia enfuncin de la concentracin.

Este grfico puede ser una recta o una curva que en ambos casos pasan por el origen.

En el caso I se observa que la absorbancia es directamente proporcional a laconcentracin o sea, se cumple la Ley de Lambert y Beer: A = lc en todo el rango deconcentraciones elegidas en este ejemplo (salvo pequeas desviaciones experimentales).

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En el caso II, se produce una desviacin para concentraciones mayores de 4 mg/ml. Estose debe a alteraciones del que modifican la pendiente.

Una vez construida la curva de calibracin, se procede a hallar la concentracindesconocida de la sustancia (S) contenida en algn material biolgico; para ello, a una cantidaddeterminada de dicha sustancia se le agrega el o los reactivos de color y se lee la absorbancia(As).

El valor de la absorbancia (As) se busca sobre el eje de las ordenadas y se halla laconcentracin correspondiente.

En el caso II que no cumple con la Ley de Lambert y Beer se deber hacer una dilucinde la sustancia en estudio para que el valor de la absorbancia est comprendido en la zona en quese cumple la ley (menor 4mg/ml).

4.5. Utilizacin del blancoSe prepara un blanco con los reactivos (R) sin el agregado de la sustancia a dosar (S). El

blanco puede ser utilizado en dos formas:

1er Mtodo:a) Se coloca el blanco en la cubeta del aparato y se ajusta la absorbancia a cero.

Ab=0

b) Se prepara un tubo con la sustancia a dosar (S) ms los reactivos (R+S). Se coloca en lacubeta del aparato y se mide su absorbancia As. El valor de la absorbancia leda correspondeal color desarrollado en la reaccin colorimtrica debido a S. A este valor se lo llamaabsorbancia corregida (Ac).

2 Mtodo:a) Se coloca agua destilada en la cubeta del aparato y se ajusta la absorbancia a cero.b) Luego se mide la absorbancia del blanco de los reactivos y obtenemos Ab.c) Por ltimo se mide la absorbancia de (R+S) y se obtiene As.

AbAsAc Este ltimo mtodo se utiliza cuando el color de los reactivos es casi tan pronunciado

como el de la reaccin. Si se ajustara la absorbancia a cero con el 1er mtodo, la lectura de laabsorbancia de la reaccin sera muy baja, movindose la aguja en una zona de la escala en lacual el aparato tiene muy poca sensibilidad.

4.6. Clculo del factorCuando se obtiene una recta, como en el caso I, que mantiene la proporcionalidad como

exige la Ley de Lambert y Beer, puede hallarse un factor para calcular la concentracin

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b) Reduccin del reactivo fosfomolbdico-fosfotngstico por accin de la tirosina y el triptofanopresentes en las protenas. Se obtiene as una sensibilidad unas 100 veces mayor que la del

Biuret solamente.

5.2.2. Mtodo de absorcin en el ultravioletaFundamento: Las protenas tienen una absorcin mxima de la luz ultravioleta a 280 nm,

luego la lectura directa de una solucin proteica en la = 280, es un mtodo rpido y sensiblepara calcular la concentracin de protenas.

5.2.3. Mtodo de BradfordFundamento: El colorante Coomasie Brillant Blue G250 existe en dos diferentes colores, azul yrojo, la forma roja se convierte en la azul cuando el colorante se une a protenas formando uncomplejo de color azul. Este ensayo evita la mayor parte de las interferencias de los otros

mtodos mencionados y puede ser aplicado a una gran variedad de muestras. Es un mtodo muysensible debido al alto coeficiente de extincin del complejo formado. Rango de trabajo: 10 100g. Puede reducirse la escala y llevarla al rango 1 10 g.

El aumento de la concentracin de las protenas plasmticas (hiperproteinemia) o sudisminucin (hipoproteinemia) estn vinculados con diferentes patologas cuyo diagnstico, debeser completado con el estudio de las diferentes fracciones proteicas mediante un proteinograma.

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6. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

DOSAJE DE PROTEINAS PLASMATICAS

DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DEL BIURET

1. MuestraSuero sanguneo de concentracin proteica desconocida.

2. Reactivosa) Solucin saturada de hidrxido de sodio

Hidrxido de sodio p.a. 70 g

Agua destilada c.s.p. 100 mlb) Solucin de hidrxido de sodio 10%

Solucin saturada 42,8 mlAgua destilada c.s.p. 300 ml

c) Solucin testigo de albmina bovina 10 mg/ml:

Albmina bovina 1 gCloruro de sodio 0,9% c.s.p. 100 mlDisolver a temperatura ambiente.

d) Reactivo del Biuret

Sulfato cprico penta hidratado p.a. 1,6 gTartrato de sodio y potasio puro 6,0 g

Solucin de hidrxido de sodio 10% 300 mlAgua destilada c.s.p. 1.000 mlDisolver el sulfato cprico y tartrato de sodio y potasio en aproximadamente 300 ml de

agua destilada, agregar 300 ml de solucin de hidrxido de sodio 10% dejar enfriar y llevar avolumen en un matraz aforado de 1 litro.

3. Material de laboratorio (por grupo de alumnos)13 tubos de ensayo1 pipeta de 0,1 ml graduada 1/10001 pipeta de 0,2 ml graduada 1/10001 pipeta de 1 ml graduada 1/100

1 pipeta de 2 ml graduada 1/101 pipeta de 5 ml graduada 1/101 gradilla para tubos de ensayo

4. Aparatos e instrumentosFotocolormetro o espectrofotmetro

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5. Tcnica

5.1. Curva de calibracin

Rotular un tubo de ensayo con la letra B (blanco) y cuatro tubos de ensayo con losnmeros 1, 2, 3, 4. Agregar los reactivos segn se indica en el cuadro.

Orden de los tubosen la gradilla

B 1 2 3 4

Sc. Testigo Prot. 10mg/ml - 0,2 0,4 0,6 0,8

Agua destilada (ml) 2 1,8 1,6 1,4 1,2

Reactivo del Biuret 5 5 5 5 5

Mezclar y leer a los 20 minutos las absorbancias del contenido de cada uno de los tubos,usando como blanco el contenido del tubo B, para llevar a 0. Usar filtro 546 nm y anotar losresultados en este cuadro.

Absorbancia corregida

Cantidad de protenas en lostestigos (mg)

- 2 4 6 8

Reproducir "Absorbancias corregidas" en el cuadro de resultados del informe y con ellosgraficar en papel milimetrado la curva de calibracin (Absorbancia corregida en funcin de mgde protena). El grfico debe dar una recta que pasa por el origen.

5.2. Dosaje de protenas totales en suero sanguneo

Rotular dos tubos de ensayo con las letras B (blanco) y M (muestra). Colocar en los tubosrotulados los reactivos en el orden que indica el siguiente cuadro.

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Orden de los tubos en la gradilla B M

Suero (ml) - 0,1

Agua destilada (ml) 2 1,9

Reactivo del biuret (ml) 5 5

Mezclar el contenido de cada tubo y esperar 20 minutos para que se desarrolle color. Leerlas absorbancias a 546 nm usando el contenido del tubo B como blanco. Anotar en este cuadro.

Absorbancia corregida

mg protenas -

Concentracin de protenas en g/100 ml -

Buscar e indicar en la curva de calibracin los mg de protenas correspondientes a laabsorbancia de la muestra y anotarlas en la ltima columna. La ltima fila (g/100 ml) se calcular

en base a la cantidad de muestra utilizada, 0,1 ml de suero, teniendo en cuenta que se mididirectamente (sin diluir).

Ej.: Una muestra de suero sanguneo da por el mtodo del Biuret una absorbancia de0,300. Suponiendo que esta absorbancia corresponda, segn la curva de calibracin, a 6 mg deprotenas, calcular la concentracin en g/100 ml si se utilizaron para la reaccin 0,1 ml de suero.

0,1 ml de suero 6 mg de protenas100,0 ml de suero x mg de protenas x = 6000 mg = 6g

Luego la concentracin de protenas = 6 g/100 ml de suero.Reproducir las tres ltimas filas del cuadro anterior en la hoja del informe y calcular la

concentracin de protenas totales. Este valor depende de la edad, sexo, y de la especie animal.Su alteracin tiene significado clnico en algunas enfermedades. Volcar estos resultados en elltimo cuadro del informe.

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Apellido y nombre:Comisin:

Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTALDOSAJE DE PROTEINAS PLASMATICAS

1. Objetivo y fundamento

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2. Resultados

a) Curva de calibracin

Tubo B 1 2 3 4

Absorbanciacorregida

mg Protenas 0 2 4 6 8

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b) Grfico

c) Dosaje de protenas totales

Tubo B M

Absorbancia

mg Protenas -

g de protenas/100 ml suero -

3. Conclusiones

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7. FRACCIONAMIENTO DE PROTEINAS PLASMATICAS: ELECTRO-

FORESISIntroduccin

Se denomina electroforesis al movimiento de partculas cargadas, presentes en unasolucin, bajo la influencia de un campo elctrico. Las partculas cargadas pueden ser enzimas,cidos nucleicos, lipoprotenas, glucoprotenas o elementos organizados como virus, bacterias,espermatozoides.

En la electroforesis sobre soporte, la solucin que contiene las sustancias a separar secoloca (o siembra) sobre un soporte, embebido en un buffer adecuado, cuyos extremos estnsumergidos en sendas cubas cargadas con dicho buffer y conectadas a los electrodos provenientes

de una fuente de poder. Como soportes pueden utilizarse agar, gel de poliacrilamida, papel defiltro, acetato de celulosa, etc.En el trabajo prctico se realizar la electroforesis de protenas plasmticas en tiras de

acetato de celulosa: Proteinograma. El acetato de celulosa contiene la celulosa con parte otodos los grupos -OHde las unidades de glucosa reemplazados por acetato. Esto elimina casienteramente las propiedades adsorbentes de la celulosa. Es un soporte delgado que presenta lassiguientes ventajas:a) Mnima adsorcin, separacin de las fracciones ms rpida y eliminacin del color de base

ms fcilmente.b) Material homogneo, microporoso y qumicamente puro.c) Se usa menos material biolgico que con el papel.d) Se puede transparentar para su "scanning", o cortar las bandas y medirlasfotocolorimtricamente.

Las desventajas seran:a) Tendencia a secarse durante la corrida por su delgadez.b) Alta electroendsmosis.c) Alto costo.

El proteinograma se efectuar con un equipo semejante al de la siguiente figura.

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Una vez colocado el soporte adecuadamente, se siembra el suero en la zona indicada en lafigura, luego se aplica una corriente elctrica para lograr la separacin de las fracciones proteicas

segn la especie, por ejemplo en bovinos las fracciones son albminas, 1, 2, y globulinas.Luego de efectuada la corrida electrofortica, las fracciones proteicas separadas se pondrn demanifiesto mediante la tincin de las mismas.

El aspecto de la tira coloreada (proteinograma) mostrando las zonas separadas es elsiguiente en una muestra de suero bovino:

Teora de la electroforesis

En principio, podemos considerar que la velocidad de una partcula cargada esdirectamente proporcional al campo elctrico aplicado y la constante de proporcionalidad esllamada movilidad m.

mHv Donde

d

VH

H = campo elctrico v = velocidad de migracin de la partcula

V = voltaje aplicado d= distancia entre electrodos

A su vez, la movilidad depende de la carga neta de la partcula, su radio, la viscosidad delmedio lquido en que se mueve y de la trama microcapilar del soporte slido sobre el cual migra(papel o acetato de celulosa), siendo adems inversamente proporcional a la raz cuadrada de lafuerza inica.

En condiciones de trabajo estndar (cubeta, soporte, soluciones buffers y voltajedefinidos) los factores que hacen que la movilidad (m) de cada una de las fracciones proteicas sea

diferente son principalmentesu tamao y su carga elctrica neta.

La carga elctrica depende asu vez del punto isoelctrico de cada protena y del pH del buffer elegido.En general, en la realizacin del proteinograma se utiliza un buffer de pH alcalino (9,2) al

cual todas las protenas del suero estarn cargadas negativamente, dependiendo la cantidad decargas del nmero de grupos COO - , O - de cada una de las fracciones proteicas. Si unaprotena tiene mayor cantidad de estos grupos, migrar ms rpidamente hacia el polo positivo onodo.

De todo lo dicho puede inferirse que las funciones del buffer sern:a) Mantener el pH constante por encima del PI de las protenas, para que los grupos COO - y

O- estn disociados.

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b) Transportar la corriente elctrica.c) Proveer al medio de la fuerza inica adecuada para lograr una eficiente movilidad de las

protenas.

Otros factores que, si bien no influyen en la migracin diferencial de las protenas,determinan una eficiente corrida electrofortica son: intensidad de corriente, temperatura yevaporacin. La intensidad de la corriente elctrica que depende del voltaje aplicado (V) y de laresistencia de las tiras (R), genera un calentamiento de las mismas por efecto Joule, efecto queexplica la elevacin de la temperatura de cualquier elemento que funcione como resistenciaelctrica. Al aumentar la temperatura de las tiras, aumenta la evaporacin del solvente en elsoporte, lo que se traduce en un aumento de la concentracin del buffer. Esto a su vez implica un

aumento de la fuerza inica

2

2

1zc y por ende una disminucin de la movilidad, que es

inversamente proporcional a , como se dijo anteriormente.La evaporacin del solvente puede disminuirse trabajando con la cuba electrofortica

cerrada. Esto producir condensacin del mismo en la cara interna de la tapa de la celdaelectrofortica. Cuando se trabaja a elevados voltajes es necesario refrigerar por mediosespeciales las tiras electroforticas.

Debido a que los extremos de las tiras estn sumergidos en la cuba se generan corrientesascendentes de succin por capilaridad. Para que estas corrientes tengan igual velocidad esimportante que el nivel del buffer en los compartimientos electrdicos sea el mismo.

(1) Succin por capilaridad. (2) Evaporacin. (3) Condensacin en la tapa.

Electroendsmosis

En la electroforesis sobre soporte debe tenerse en cuenta el fenmeno deelectroendsmosis. Como la electroforesis se realiza en presencia de un buffer de pH alcalino (ennuestro caso veronal sdico pH 9,2), los grupos ionizables del soporte estarn cargadosnegativamente (-COO- del acetato de celulosa) y se rodean de iones cargados positivamente.

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Al aplicar la corriente elctrica las partculas cargadas negativamente no se desplazan porestar unidas al soporte mientras que las cargadas positivamente se desplazarn haca el polo

negativo o ctodo. Esta corriente lquida que se desplaza en sentido contrario al de la corrienteelctrica, se llama corriente electroendosmtica y el fenmeno se llama electroendsmosis.Dicha corriente puede ser lo suficientemente fuerte como para arrastrar a molculas neutras o conpocas cargas negativas (como las globulinas) en sentido contrario al resto de las protenas,como s hubieran estado cargadas positivamente, sobre todo si la muestra fue sembrada cerca delcentro de la tira donde las corrientes de succin se anulan.

Considerando el conjunto de todas las fuerzas e interacciones que intervienen en unacorrida electrofortica, el proceso final se puede resumir esquemticamente en la siguiente figura.

Zona 1 Zona 2

La direccin de la corriente elctrica ser del polo negativo (-) hacia el polo positivo (+) yla direccin de la corriente electroendosmtica, opuesta a la direccin de migracin de lacorriente elctrica, ser entonces hacia el polo negativo (-). Las corrientes de succin en la zona 1(segn el esquema) es en el mismo sentido que la electroendsmosis y en la zona 2 a favor de lacorriente elctrica. En la zona central las corrientes lquidas de succin se anulan.

Para que un proteinograma sea ptimo debe ser ntido y contrastado, o sea sus bandasdeben ser paralelas y bien marcadas, con buena resolucin entre ellas (espacios blancos biendefinidos entre ellas).Variaciones fisiolgicas

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Hiperproteinemia

a) Puede ser causada por hemoconcentracin debido a una deshidratacin que provocarhiperalbuminemia e hiperglobulinemia, de modo que se mantiene el cociente proteicoalbmina/globulina normal.

b) Problemas infecciosos e inflamatorios aumentan las protenas plasmticas totales poraumento de sntesis de globulinas. El aumento de globulinas se debe a estados de defensacontra agentes infecciosos (inmunidad natural o adquirida por vacunacin)

Las y globulinas aumentan tambin en procesos inflamatorios agudos y/o crnicos.

HipoproteinemiaResulta de una variedad de estados patolgicos que se pueden agrupar en:

a) Desrdenes que producen prdida de protenas. Ej: Hemorragias, nefropatas, enteropatas.b) Desrdenes causados por disminucin de la sntesis de protenas. Ejemplo: Insuficiencia

heptica, mala absorcin, desnutricin, neoplasia heptica, que cursan con hipoalbuminemia;o hipoplasia y neoplasia linfoide que presentan hipo globulinemia.

c) En preez y lactancia debido a las necesidades proteicas aumentadas. En ovinos la albminadisminuye en la primera mitad de la gestacin, mientras la globulina disminuye en la etapafinal por lo que el calostro es rico en globulinas.

La electroforesis de protenas sricas ha sido utilizada en estudios inmunoqumicos dediversas enfermedades en distintas especies (fiebre aftosa, peste porcina, etc.).

En todo proceso inmunitario se produce un aumento de globulinas (debido a lageneracin de anticuerpos que se hallan presentes en dicha fraccin) y muchas veces de las globulinas, cuando el organismo atacado se restablece y obtiene una verdadera resistencia a lainfeccin.

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Proteinogramas normales y patolgicos en distintas especies

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8. TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTAL

PROTEINOGRAMA ELECTROFORETICO

En la prctica se separarn por electroforesis las diferentes fracciones proteicas del suerousando como soporte una lmina de acetato de celulosa y como buffer veronal sdico (pH 9,2).

Finalizada la separacin, la lmina de acetato de celulosa se tie con un colorante (AmidoSchwartz) con el fin de que las distintas fracciones puedan observarse y determinarsecuantitativamente.

Para la determinacin cuantitativa se corta la tira ya teida para separar las distintas

fracciones, luego se sumerge cada una de ellas en solucin eluyente y se realizan las lecturasfotocolorimtricas respectivas.

1. Material biolgicoSuero sanguneo no bemolizado.

2. Reactivosa) Solucin reguladora de pH 9,2

Dietilbarbiturato de sodio (veronal sdico) p.a. 8,24 gAgua destilada c.s.p. 1.000 ml

b) Solucin colorante

Amido Schwartz 10 B p.a. 5 gMetanol puro 450 mlAcido actico glacial puro 100 mlAgua destilada 450 ml

c) Solucin eluyente

Acido actico glacial puro 80 mlAgua destilada 20 ml

d) Solucin lavadora

Metanol puro 475 mlAcido actico glacial puro 50 mlAgua destilada c.s.p. 1.000 ml

e) Solucin para preteido del sueroAzul de bromofenol puro 0,1 gEtanol puro (96% V/V) c.s.p. 100 ml

f) Solucin para conservar las tiras

Metanol puro 80 mlAgua destilada 120 ml

3. Material de laboratorio1 gradilla para tubos de ensayo6 tubos de ensayo

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1 varilla de vidrio1 pipeta graduada de 10 ml (1/10)

1 pipeta capilar o sembrador1 policubeta o portaobjetos1 tijera1 tira de acetato de celulosa

4. Aparatos e instrumentosLos equipos utilizados para electroforesis estn constituidos por una fuente de poder que

suministra la fuerza electromotriz necesaria y una cuba electrofortica.Durante el trabajo prctico experimental se usarn tambin un transformador de corriente

(220-110 voltios) y un fotocolormetro.

5. TcnicaCarga de los compartimientos electrdicos: Colocar la cantidad apropiada de solucin buffer depH 9,2 en los compartimientos electrdicos, cuidando que el nivel del lquido llegue en amboscasos hasta la misma altura.Preparacin de las tiras de acetato de celulosa: Sumergir las tiras de acetato de celulosa de 2,5cm de ancho y 8,5 cm de largo en solucin buffer de pH 9,2 durante 10 minutos para que seimpregnen bien con la misma. Retirar las tiras y eliminar el exceso de lquido secndolo conpapel de filtro (*). Inmediatamente, colocarlas sobre el soporte de la cuba electrofortica tratandode que queden bien tensas y que sus extremos se hallen sumergidos en cada uno de loscompartimientos.Preparacin de la muestra: Colocar dos gotas del colorante indicador (azul de bromofenol) en un

portaobjetos o policubetas. Inflamar hasta evaporar el solvente (etanol), dejar enfriar y agregardos gotas de suero sobre el residuo slido del colorante. Mezclar hasta que el conjunto tome colorazul bien homogneo. Este preteido servir como indicador del avance del frente de protenas (osea de la albmina).Siembra de la muestra: Cargar el sembrador con la mezcla de suero y colorante. Retirar el excesode suero y apoyarlo suavemente del lado no brillante de la tira a 2 cm del compartimientocatdico.

Esperar 3 minutos para que la muestra sea completamente adsorbida por el soporte y taparla cuba.

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Ajuste de la intensidad de corriente: Conectar la cuba electrofortica a la fuente de tensin demanera que el ctodo se halle del lado que se sembr la muestra. Mediante el control de ajuste de

la corriente, aumentar la diferencia de potencial hasta que el miliampermetro marque unaintensidad de corriente correspondiente a 1,5 - 2,0 miliamperes por tira. Mantener el sistema enestas condiciones hasta que la albmina, que corre coloreada, se desplace de 35 a 45 mm(aproximadamente 45 minutos).Coloracin de las fracciones proteicas: Una vez finalizada la separacin electrofortica,sumergir las tiras en el reactivo colorante de 3 a 5 minutos (no ms). Eliminar el exceso decolorante mediante sucesivos lavados con la solucin lavadora hasta que sta permanezcaincolora (generalmente bastan 3 lavados).

(*) IMPORTANTE: Debe tenerse especial cuidado en evitar que las tiras quedenexpuestas al aire sin estar en contacto con el buffer. La deshidratacin de las mismas puede

alterar irreversiblemente al acetato de celulosa.

6. Valoracin cuantitativa:La valoracin cuantitativa de las fracciones puede realizarse por dos mtodos:

densitometra y elucin.

6.1. Densitometra (no se hace en este trabajo prctico experimental).El aparato utilizado en este caso es un densitmetro que mide la intensidad del color de

cada zona por transparencia o reflexin.Primero la tira debe ser sometida a un tratamiento qumico que la transparenta sin alterar

la intensidad de la tincin de cada fraccin proteica.

Tcnica de transparentacin: Se sumerge la tira lavada 1 en metanol anhidro durante 1 minuto,y 2 en una solucin formada por: metanol (85 ml), cido actico (14 ml) y glicerina (1 ml),durante 2 minutos. Luego se coloca sobre una placa de vidrio y se deja en estufa a 70C (o bajolmpara) durante unos minutos hasta transparencia completa. Se invierte la placa de vidrio sobreel papel de filtro, se deja enfriar 20 minutos como mnimo y se separa la tira transparentada.

Luego se la coloca en el densitmetro, que esencialmente funciona como unfotocolormetro. La tira trasparentada se desplaza (como una diapositiva en un proyector)perpendicularmente a un haz de luz. A medida que este haz intercepta las franjas coloreadas, lasabsorbancias producidas son traducidas al movimiento de una pluma o aguja registradora que

va graficando el densitograma sobre un papel milimetrado que se desplaza sincrnicamente conla tira electrofortica.

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La superficie de cada "pico" del densitograma (o forograma) obtenido representa lacantidad de protenas en la fraccin respectiva.

Dicha superficie puede medirse mediante varios mtodos que no se describirn en estecurso.

El porcentaje proteico de cada fraccin se calcula mediante simples reglas de tres; porejemplo para globulina:

%100

%

.

.

totalSup

Supo bien

mlTPg

mlg

totalSup

Sup

100..100

.

.

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En el segundo caso es necesario valorar protenas totales (g%) por cualquier otro mtodo(por ejemplo utilizando la reaccin del Biuret).

Las ventajas principales del densitograma son que, conociendo bien la forma de la curvanormal, permite visualizar rpidamente alguna posible alteracin patolgica sin necesidad derecordar cifras y que pueden informarse o archivarse junto con el proteinograma el cual, estandotransparentado, se conserva indefinidamente.

La desventaja reside en que el densitmetro es costoso, tiene una calibracin algoengorrosa y requiere adems proteinogramas muy bien corridos (sin manchas ni franjas curvadaso deformadas).

6.2. Elucin.Es el mtodo que se utilizar en el trabajo prctico experimental.Para ello rotular seis tubos de ensayo: B, Alb., 1, 2, y globulinas, colocar en cada

uno 2 ml de solucin eluyente.

Seleccionar la tira de manera que las fracciones queden separadas. Esto se logra cortandopor la parte media de la zona ms clara que separa a las fracciones, como se indica en la figura.

Utilizar como blanco una seccin de la misma tira de una superficie equivalente a la decualquiera de las fracciones y que no contenga colorante. Colocar los recortes as obtenidos enlos tubos de ensayos correspondientes. Dejar en contacto y agitar repetidamente durante eltiempo necesario para que la tira y el colorante sean disueltos por la solucin eluyente.

Realizar la lectura fotocolorimtrica contra un blanco a 620 nm.

7. Clculos:Una vez realizadas las lecturas en el fotocolormetro se tendrn cinco valores de absorbancia:

AAlb, A1, A2, A y A. Sumando todas ellas obtenemos At, que representa la absorbancia total: AAAAAA albt 21

Para obtener la concentracin relativa de cada una de las fracciones tendr que tenerse encuenta que At representa 100%. Por lo tanto conociendo la absorbancia de cada fraccin, porregla de tres puede realizarse el clculo. Calcular tambin la concentracin absoluta de lasdistintas fracciones teniendo en cuenta que la concentracin de protenas totales representa el100% y conociendo la concentracin relativa de cada fraccin por regla de tres puede realizarseel clculo. Volcar estos resultados en el cuadro del informe. Luego hallar el cociente proteicocomo se indica en el informe.

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Apellido y nombre:

Comisin:Fecha:

INFORME DEL TRABAJO PRACTICO EXPERIMENTALPROTEINOGRAMA ELECTROFORETICO

1. Objetivo y fundamento

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2. Resultados

Fraccin Absorbancia corregida Concentracin relativa(%)

Concentracinabsoluta (g%)

Albmina

1 globulina

2 globulina

globulina

globulina

Globulinas Totales

Protenas totales 100

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En general es muy utilizado el llamado cociente proteico que est dado por la relacin

Albmina/Globulinas.

GlobulinasdeinConcentrac

aAlbdeinConcentracPC

..

min....

Este cociente tiene importancia diagnstica en situaciones patolgicas.

3. Conclusiones

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BIOENERGETICA

TEMARIO

1. Definicin.

2. Principios de la Termodinmica. Primer principio de la termodinmica. Segundo principiodelatermodinmica.

3. Variacin de energa libre. Direccin de las reacciones qumicas. Energa libre estndar.Relacin entre la variacin de energa libre estndar y la constante de equilibrio. Reaccionesacopladas.

4. Carga energtica de la clula.

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1. DEFINICIONLa bioenergtica es el campo de la Bioqumica que estudia la transferencia y uso de la

energa por los sistemas biolgicos.El universo se define como el sistema ms el medio ambiente. Un sistema termodinmico

puede ser una reaccin qumica, una clula o un organismo entero. Los sistemas pueden serabiertos, cerrados o aislados. Los sistemas biolgicos se consideran sistemas abiertos, o sea, quepueden intercambiar materia y energa con su medio ambiente.

2. PRINCIPIOS DE LA TERMODINAMICA

2.1. Primer Principio de la Termodinmica

Establece que la energa total de un sistema y su medio ambiente es constante. Si a unsistema con determinada cantidad de energa se le suministra cierta cantidad de calor Q, el calorsuministrado al sistema puede aparecer como un cambio en la energa interna del sistema (E), como una cantidad de trabajo (W) realizado por el sistema sobre el medio ambiente:

Q=E + W W = P VEl flujo de calor entre el sistema y el ambiente debe ser acompaado por un cambio que lo

compense en el contenido energtico del sistema o en el trabajo realizado por el sistema sobredicho ambiente.Casi todos los procesos biolgicos ocurren a presin constante

Qp = E + P Vdonde Qp es el calor consumido en el proceso a presin constante. E, P,V y Qp son funciones deestado.

El calor liberado o absorbido en un proceso que se produce a presin constante es el cambiode entalpa ( H) para la reaccin.

H = E + P VLa entalpa es tambin una funcin de estado, o sea su valor es dependiente solamente de las

diferencias en el contenido de calor entre los estados inicial y final del sistema, independiente delcamino del proceso dentro del sistema. Un proceso es exotrmico cuando el sistema libera calor ylo entrega al medio ambiente, el valor de H < 0. Un proceso es endotrmico cuando el calor esabsorbido por el sistema desde el medio ambiente, el valor de H > 0.

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2.2. Segundo Principio de la Termodinmica

Establece que el desorden del universo se incrementa en cada proceso. Proporciona uncriterio para predecir el sentido de cualquier proceso. Reconoce un estado o condicin de la materiay de la energa llamada entropa, que se puede definir como dispersin o desorden; es la fraccin dela energa que no puede ser utilizada para desarrollar trabajo til. Establece que los procesos fsicosy qumicos se desarrollan en el sentido en que la dispersin o la entropa del universo alcanza unmximo; en este punto tiene lugar el equilibrio. El segundo principio afirma que ningn procesoespontneo puede realizarse de modo que la entropa del universo disminuya. Los procesos queimplican un aumento de entropa son, de este modo irreversibles, o sea nunca volvernespontneamente a su estado inicial. Desde el punto de vista terico, la entropa del universo puedepermanecer constante durante un proceso, y cuando esto sucede se dice que el proceso esreversible.

Un sistema est en equilibrio con su medio ambiente cuando la entropa se increment a unmximo y no existe energa disponible para manejar los procesos. As, la tendencia a incrementarla entropa acta como una fuerza que maneja los sistemas hacia el equilibrio con su medioambiente. Cuando un organismo est en equilibrio con su medio ambiente, est muerto.

3. VARIACION DE LA ENERGIA LIBRE

3.1. Direccin de las reacciones qumicas

La habilidad de un sistema para realizar trabajo disminuye a medida que se aproxima alequilibrio, y en el equilibrio no hay energa disponible para realizar trabajo. La energa libre deGibbs (G) es una funcin termodinmica de estado que define la condicin de equilibrio entrminos de la entalpa y entropa de un sistema a presin y temperatura constantes:

G = H - TSDonde G es el cambio de energa libre de Gibbs, H es el cambio de entalpa, T es la temperaturaabsoluta y S es el cambio de entropa. Si G es negativo, el proceso es espontneo; si G espositivo, el proceso no es espontneo; si G es cero, el sistema est en equilibrio.

Los sistemas biolgicos (por ej. clulas, organismos, poblacin) son sistemas abiertos, o sea

que pueden intercambiar materia y energa con su medio ambiente; los cambios de energa y deentropa sern de importancia para determinar la direccin de los procesos termodinmicamentefavorables. Las clulas vivas, son sistemas abiertos de evolucin irreversible que se encuentran enun estado estacionario dinmico. Un sistema abierto en el estado estacionario es capaz de realizartrabajo, porque est alejado de su condicin de equilibrio.

El criterio para que un proceso sea favorable a T y P constantes es que G < 0.G se puede definir como la fraccin de la energa capaz de realizar trabajo til.

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3.2. Energa libre estndar

La energa libre estndar de una sustancia (G) se define para una solucin 1 M, exceptopara iones hidrgeno en estado estndar biolgico que es 10-7 M, a una presin de 1 atm y 298K.La energa libre (G) de una solucin de una sustancia A est relacionada a su energa libre estndar(G):

GA = GA + 2,303 RT log [A] = GA + RT ln [A] (1)Cuando la concentracin de A es 1 M, el trmino log es cero, y GA es igual a G

oA. Bajo otras

condiciones, sin embargo, GA y GoA tienen valores diferentes.

Si se considera la reaccin:

aA +bB cC + dD (2)

El cambio de energa libre para la reaccin es:

GR = Gp Gr = (cGC + dGD) - (aGA + bGB) (3)Reemplazando la expresin para la energa libre estndar de cada componente de la reaccinanterior, se obtiene:

GR = (cGC + dGD - aGA- bGB) + 2,303 R T log [C]c [D]d[A]a [B]b (4)

El trmino entre parntesis en la ecuacin (4) es el cambio de energa libre estndar para lareaccin, G mientras que el segundo trmino depender de la relacin X tal que :

X = [C]c [D]d

[A]a [B]b

Las condiciones estndares para definir el G se establecen en P = 1 atm, T = 298K,concentraciones de reactivos y productos = 1 M, pH = 0 en sistemas fsico-qumicos o pH = 7 ensistemas biolgicos. Se diferenciarn ambas situaciones colocando un apstrofe () en caso detratarse de sistemas biolgicos ( G' ).

3.3.1. Relacin entre G' (variacin de energa libre estndar) y KeqEn el equilibrio, el cambio de energa libre es cero y X es la constante de equilibrio o Keq

para la reaccin.0 = G'+ RT ln {[C]c.[D]d}eq (5)

{[A]a.[B]b} eq

G' = -RT ln Keq (6)

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La ecuacin (6) establece la importante relacin entre la variacin de la energa libreestndar y la constante de equilibrio de una reaccin.

La variacin de energa libre estndar (G) de una reaccin da la mxima cantidad detrabajo til que la reaccin puede producir a T y P constantes en esas condiciones. De acuerdo a laecuacin (6), cuando la Keq es > 1, significa que la reaccin tiende a completarse en la direccinen que se ha escrito, la variacin de energa libre estndar es negativa; es decir que la reaccin sedesarrolla en condiciones estndares con un descenso de energa libre, y por eso esenergticamente favorable en esas condiciones. Cuando la Keq es < 1, la variacin de energa libreestndar es positiva, la reaccin no es energticamente favorable en condiciones estndares.

Las reacciones que se producen con una variacin de energa libre estndar negativa sedenominan exergnicas; cuando la variacin de energa libre estndar es positiva las reacciones sedenominan endergnicas.

3.3.2. Variacin de energa libre en sistemas biolgicos

Las clulas son sistemas abiertos de evolucin irreversible que se encuentran en un estadoestacionario dinmico.

Los metabolitos difcilmente se encuentren en las clulas en concentraciones estndar. Paracalcular la variacin de la energa libre de una reaccin qumica a concentraciones diferentes de lasestndar se necesita conocer las concentraciones iniciales de reactivos y productos y la G' de lareaccin.

G = G + RT ln [C]c [D]d (7)[A]a [B]b

El valor de Gpara una reaccin puede ser mayor, menor o igual que G segn lasconcentraciones de los reactantes y de los productos. El criterio de espontaneidad para unareaccin es G, no G. Este concepto es importante porque las reacciones que no sonespontneas basadas en su G pueden transformarse en espontneas ajustando lasconcentraciones de los reactantes y de los productos. Esta condicin es la base del acoplamientoentre las reacciones para formar las vas metablicas. En los sistemas biolgicos, el conjunto dereacciones que forman una va metablica debe ser termodinmicamente favorable.

3.4. Reacciones acopladas

Los cambios de energa en las reacciones metablicas estn con frecuencia acoplados.El caso ms simple de acoplamiento de energa se produce cuando dos reaccionesmetablicas comparten un intermediario comn.

K1A + B C G1 = +10 Kcal/mol

K2C + D E G2 = -30 Kcal/mol

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La constante de equilibrio de la reaccin final (K3) es igual al producto de las constantes de

equilibrio de las reacciones individuales.

K3A + B + D E K3 =K2 . K1

El cambio de energa libre estndar total (G 3) para una serie de reacciones qumicamenteacopladas, es igual a la suma algebraica de la variacin de energa libre estndar de las etapasindividuales.

G3 = G1 + G2 = [+10 + (-30)] Kcal/mol = -20 Kcal/molSi la reaccin para la produccin de C es endergnica (G1> 0) y el equilibrio se desplaza

hacia la izquierda, la reaccin neta puede todava ser exergnica, resultando en la formacin netade E. Esto ocurre si el cambio de energa libre estndar para la formacin de E es losuficientemente exergnico como para sobrepasar el cambio de energa libre estndar para laproduccin de C. Las dos reacciones estn acopladas y la segunda reaccin provee la fuerzatermodinmica necesaria para impulsar la primera reaccin.

El flujo de energa en el metabolismo se produce mediante reacciones acopladas en lascuales participa como intermediario el ATP. La mayora de las reacciones acopladas en las queparticipa el ATP involucran la transferencia del grupo fosfato a partir del ATP a otras sustancias, oa partir de un metabolito rico en energa al ADP formando ATP.

As, el fosfoenolpiruvato (PEP), que tiene un alto potencial de transferencia fosfato (62kJ/mol), es capaz de agregar un grupo fosfato al ADP en un proceso termodinmicamentefavorecido:

(1) Hidrlisis defosfoenolpiruvato (PEP) PEP + H2O > piruvato + Pi G10'= -14,0 Kcal/mol(2) Fosforilacin de ADP ADP + Pi > ATP + H2O G20'= + 7,3 Kcal/mol______________________ ____________________________ _________________

(1) + (2): Fosforilacin PEP + ADP > piruvato + ATP GT0'= -6,7 Kcal/molacoplada de ADP por PEP

Por otro lado, el ATP puede ceder el fosfato a la glucosa, ya que el potencial detransferencia de fosfato de la glucosa 6-fosfato se encuentra todava en un valor ms bajo en laesca