GUA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO: CABALLO Y RANA

GUA DE MANEJO Y ENSAYOS DE ANIMALES DE LABORATORIO CABALLO Y RANA

En el proceso de investigacin cientfica, en el rea de las ciencias de salud, desde la antigedad se emplean animales de laboratorio. Quienes casi siempre con el sacrificio de sus vidas han dado su aporte a la generacin de nuevo conocimiento para ser aplicado al mejoramiento de la salud de los seres humanos y otros animales.

Es importante tener presente una serie de conceptos bsicos para el uso y manejo de animales de laboratorio, ya que el desconocimiento de estos factores pueden incidir negativamente en el resultado de los datos obtenidos en el laboratorio, lo cual causara imprecisiones en el conocimiento y adems elevacin de costos.

El uso de los animales para investigacin esta constituido en un tema tico controversial, hay quienes consideran que los animales son y siguen siendo necesarios e irremplazables, y otros que consideran que no deben ser utilizados como modelos de investigacin, debindose utilizar otras alternativas.

Animal de laboratorio

Es cualquier especie animal utilizada en experimentacin con fines cientficos, es decir, mantenido bajo determinadas condiciones y utilizado como instrumento de medida.

Este al ser sometido a una experimentacin, proporciona datos, los cuales son utilizados como informacin para los resultados. Como ejemplo de esos animales tenemos al ratn, la rata, el hmster, el conejo, el perro o el mono.

Otra definicin que se toma es modelo animal:

Un modelo animal es aquel que emplea animales de especies distintas a la humana, seleccionados por sus caractersticas especficas, para ser utilizados en investigacin o docencia. En el diseo de los mismos las claves son la eleccin de la especie animal y la viabilidad de extrapolacin de los datos obtenidos a la especie en que se vayan a aplicar los resultados obtenidos.

Factores a considerar en la seleccin de un modelo de experimentacin animalSe plantean factores que deben tener en cuenta, al disear un modelo experimentalanimal:

Costo y cuidado del animal.Disponibilidad.Tolerancia a la cautividad.Facilidad de Enjaular.Pocos cuidados de mantenimiento.Resistencia a Infecciones y a Enfermedades.Homogeneidad.Caractersticas biolgicas anlogas al hombre.Tamao adecuado para realizar el experimento.Tolerancia a procedimientos quirrgicos.

INFORMACIN Y CONOCIMIENTO DE LAS CARACTERSTICAS DEL ANIMAL

CABALLO

El caballoes unmamfero cuadrpedo, perisodctilo, perteneciente a la familia de losquidos. Sus principalescaractersticasfsicas son: un gran porte, aproximadamente mide 1,5 m de altura, sus patas terminan en un solo dedo que tiene una ua llamada casco, la cabeza es alargada, las orejas relativamente pequeas, su cola es larga y presenta crin en el cuello.

El tamao de los caballos vara considerablemente entre las diferentes razas y tambin en ello mucho tendr que ver la nutricin.

Existen tres tipos:pesados o de tiro(entre 163 y 183 cm),ligeros o de silla(entre 142 y 163 cm) yponis y razas miniatura(no superan los 147 cm).

La reproduccin, ambos sexos alcanzan la madurez sexual a los dos aos; sin embargo, no se emplean con fines reproductivos hasta los 3 aos. El periodo de gestacin dura unos once meses (337 a 344 das) y la hembra pare una nica cra; el nacimiento de gemelos es algo excepcional, as como los partos de tres o ms potros.La vida adulta puede extenderse hasta los 30 aos.

RANA

Las ranas son animales de piel lisa y suave, ojos saltones que pueden ver casi en cualquier direccin y tmpanos auditivos externos. Los adultos carecen de cola. La mayora de ellas tienen patas traseras largas, que les permiten dar grandes saltos, y pies palmeados que las convierten en excelentes nadadoras.

Los sistemas internos de la rana son tpicos de la mayora de los anfibios; de hecho, stos eran llamados en su origen, batracios, del griego antiguo batrachus, que significa rana.

La mayora de las ranas, en especial los machos, emiten sonidos. Al expulsar el aire de los pulmones, ste hace vibrar las cuerdas vocales de la laringe, produciendo sonidos caractersticos de las diferentes especies. Los machos de las especies que poseen un saco resonador que se hincha enormemente cuando la rana emite sonidos para atraer a su pareja producen un sonido mucho ms intenso. La lengua de la rana est fijada en la parte anterior de la boca en vez de en la parte posterior, y est cubierta de una sustancia pegajosa que la convierte en una trampa eficaz para cazar insectos.

Durante su vida la rana experimenta una metamorfosis completa, que atraviesa las fases de huevo, una fase larvaria similar aun pez y al final la fase de adulto. Ponen sus huevos en el agua, donde dan lugar a renacuajos (larvas de cuerpo corto), a principios de la primavera o el verano, fase en la que presentan branquias y cola. Al irse desarrollando, el renacuajo pierde la cola, desarrolla las patas y, finalmente, sale del agua en forma de rana adulta.

TAXONOMAGUA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO

En esta parte se explicara la taxonoma de los dos animales de los cuales hablaremos:

Taxonoma del caballo:

Reino:Metazoa Subreino:Eumetazoa Rama:Bilateria Grado:Coelomata Serie:Deuterostomia Phylum:Chordata Subphylum:Gnathostomata Superclase:Tetrapoda Clase:Mammalia Subclase:Eutheria Superorden:Laurasiatheria Orden: Perissodactyla Familia:Equidae Gnero:Equus Especie:caballus

Taxonoma de la rana: Reino:Metazoa Subreino:Eumetazoa Rama:Bilateria Grado:Coelomata Serie:Deuterostomia Phylum:Chordata Subphylum:Gnathostomata Superclase:Tetrapoda Clase:Amphibia Orden:Anura Suborden:Neobatrachia Superfamilia:Ranoidea Familia: Ranidae Gnero:Pelophylax Especie:perezi

CONSIDERACIONES FUNDAMENTALES EN EL USO DE ANIMALES DE LABORATORIO

Es sumamente importante que todos los investigadores que vayan a utilizar animales de laboratorio para sus investigaciones o lasprcticasdocentesdediquenespecialatencina:

Revisar previamente sus procedimientos experimentales y evaluar la idoneidad del protocolo a ser utilizado, con respecto a los objetivos del estudio. Estudiar y considerar las posibles estrategias experimentales alternativas a la utilizacin de animales de laboratorio y garantizar que los objetivos no pueden ser alcanzados por dichos procedimientos. (Reemplazar) Utilizar el menor nmero de animales posibles para la consecucin de los objetivos, consultando a este respecto a expertos en estadstica. (Reducir) Velar para que los animales no sufran innecesariamente y proporcionarles, cuando sea necesario, analgsicos, anestsicos y otras sustancias apropiadas. (Refinar) Controlar que los mtodos eutansicos empleados sean adecuados a la especie (consideracin tica importante) Controlar que el personal que participa en los procedimientos est debida- mente acreditado y entrenado para desempear las tareas que les corresponda. Existe prohibicin del uso de animales en los experimentos que se utilicen especies considerados en peligro de extincin, a menos, que los objetivos del experimento sean: la investigacin tendente a la proteccin de las estas especies o cuando se compruebe que estas son excepcionalmente las nicas indicadas a tal fin. En ningn caso podr utilizarse un animal ms de una vez en experimentos que conlleven dolor, estrs o sufrimiento intensos.

PERSONAL

El personal que trabaja en un bioterio de produccin o de experimentacin debe ser lo suficientemente capacitado, de acuerdo con las caractersticas de las instalaciones, nmero de animales mantenidos y la naturaleza de la investigacin que se va a realizar. Es responsable de la atencin y mantenimiento correcto de los animales asignados.

Normas de seguridad y Proteccin del Personal

El personal debe adoptar normas y formas de proteccin, para brindar buenas condiciones de mantenimiento y salud a los ratones. Para ello deber contar con procedimientos e instrucciones normalizados como:

Procedimiento de higiene de personal. Uso de la vestimenta completa. Procedimiento de ingreso al bioterio de produccin o bioterio de experimentacin. Procedimientos de limpieza de ambientes, con programas de limpieza y rotacin de desinfectantes, efectivo. Procedimientos de limpieza y desinfeccin de materiales. Procedimiento de eliminacin de desechos. Programa de control de plagas. Programa de capacitacin al personal. Flujo de personal y materiales por las zonas indicadas, para evitar diseminacin de material contaminado en zonas limpias.

Entre las normas de higiene y de seguridad ms importantes tenemos:

Uso de una vestimenta completa y de uso exclusivo en el bioterio. Todo animal encontrado en la sala, libre, debe ser eliminado y no devuelto a la colonia. Se debe trabajar con el menor ruido posible y en forma de reducir el estrs ocasionado a los animales. Uso de gafas de seguridad cuando el procedimiento de investigacin lo requiera. Tener conocimiento de la localizacin del botiqun de primeros auxilios y rutas de evacuacin ante una emergencia Utilizar guantes quirrgicos para el manejo de los animales. No llevar nada a la boca mientras se est en el bioterio. Mantener el rea limpia. Uso de equipos en buenas condiciones. Eliminacin de desechos en la forma correcta. Uso de bolsas rojas para material biolgico contaminado y bolsas de color negro para material sucio o desechos no contaminados. Rotular correctamente las jaulas, especialmente en las salas de reproductores monogmicos. Restringir el acceso a personal extrao, permitir slo el acceso apersonas autorizadas. Informar inmediatamente al jefe o coordinador, cualquier accidente. Si tiene problemas respiratorios (asma), neurolgicos o alergias infrmelo por escrito a su jefe inmediato. No debe permitirse al personal comer, beber, fumar o aplicarse cosmticos en las salas de animales. El uso de los elementos de proteccin del personal (mascarilla, guantes,gorros, etc.), los procedimientos normalizados de limpieza y desinfeccin de materiales e instalaciones conjuntamente con los flujos adecuados de personal y material, constituyen una verdadera barrera sanitaria, que se recomienda mantenerla vigente a pesar de las limitaciones en equipamiento e infraestructura.

ENTRENAMIENTO Y CAPACITACION DEL PERSONALEl grado y los requisitos del personal requerido para conducir y apoyar el programa de cuidado y uso de animales, depende de varios factores que incluyen: el tamao y tipo de institucin, la estructura administrativa para suministrar un cuidado animal adecuado, las caractersticas de las instalaciones, el nmero de animales mantenidos y la naturaleza de la investigacin cientfica, las pruebas de laboratorio y las actividades educativas.El personal que cuida a los animales debe estar entrenado apropiadamente y la institucin debe ofrecer capacitacin formal o entrenamiento durante el desempeo del trabajo, para facilitar la implementacin eficaz del programa y el cuidado y uso humanitarios de los animales. La necesidad de personal experto en otras disciplinas, tales como: crianza animal, administracin, medicina y patologa de los animales de laboratorio, salud y seguridad ocupacional, manejo de conducta, manejo gentico y otros aspectos varios de apoyo a la investigacin cientfica, ser acorde con los alcances del programa.El personal que use o cuide a los animales debe participar regularmente en actividades de educacin continua relevantes para sus responsabilidades. Se espera una participacin activa del personal en reuniones locales y nacionales de organizaciones afines. El entrenamiento durante el desempeo de sus labores debe ser parte del trabajo de todos los tcnicos y debe ser complementado con discusiones auspiciadas por la institucin, programas de entrenamiento y con materiales bibliogrficos aplicables a su trabajo y a las especies con las cuales laboran.

RIESGOS DE EXPERIMENTACIN CON ANIMALES

Al seleccionar los dispositivos de seguridad especficos para la experimentacin con agentes peligrosos en animales se debe prestar especial atencin a los procedimientos de cuidado y alojamiento de animales, almacenamiento, distribucin de los agentes, preparacin y administracin de dosis, manejo de fluidos y tejidos corporales, disposicin de los desperdicios y cadveres y proteccin del personal.

El equipo especial de seguridad se debe usar en combinacin con las prcticas de seguridad y manejo apropiados. Como regla general, la seguridad depende del personal entrenado que observa rigurosamente las prcticas de seguridad.

Son necesarias instalaciones y equipo especiales de seguridad para proteger al personal encargado del cuidado animal y de la investigacin, a otros ocupantes del edificio, al pblico, los animales y el medio ambiente, de la exposicin a agentes peligrosos fsicos, qumicos y biolgicos usados en experimentacin animal. Las instalaciones empleadas en experimentacin animal con agentes peligrosos deben estar separadas de otras reas de alojamiento animal, reas de apoyo, de los laboratorios de investigacin y clnicos, as como de las reas para la atencin de los pacientes y deben estar identificadas apropiadamente; el acceso a ellas estar limitado al personal autorizado. Tales instalaciones debern estar diseadas y construidas para facilitar la limpieza y el mantenimiento de sistemas mecnicos. Un diseo de doble corredor correctamente administrado y usado o un sistema de barrera con entrada controlada son medios efectivos para reducir la contaminacin cruzada. Los drenajes del piso siempre deben contener lquidos o sellarse eficazmente por otros medios. Se pueden colocar trampas de llenado automtico para asegurar que siempre permanezcan llenas de lquido.

Los agentes peligrosos deben ser confinados al medio ambiente en donde se realice el estudio. El control de flujo de aire (tal como el uso de gabinete de seguridad biolgica) que reduce al mnimo el escape de contaminantes es una barrera primaria utilizada para la manipulacin y administracin de agentes peligrosos y para llevar a cabo necropsias de animales contaminados.

Las barreras secundarias tales como los vestbulos ventilados, la presin de aire negativa, los filtros de aire y el equipo mecnico de respaldo con encendido automtico, estn dirigidos a evitar la liberacin accidental de los peligros fuera del medio ambiente de trabajo y de la instalacin.

Se debe limitar la exposicin a los gases sobrantes de la anestesia, esto generalmente se logra utilizando varias tcnicas de purificacin-expulsin. Si se usa ter se debe asegurarse al personal mediante el uso apropiado de letreros, equipos y procedimientos que reduzcan al mnimo los riesgos asociados con su explosividad.PROTOCOLO PARA EL CUIDADO Y USO DE LOS ANIMALESSe deben considerar los siguientes puntos para la elaboracin y revisin de los protocolos para el cuidado y uso de los animales. Razn y objetivos propuestos para el uso de los animales. Justificacin de la especie y nmero de animales requeridos. Siempre que sea posible, el nmero de animales que se requieren deber justificarse estadsticamente. La calidad del entrenamiento y experiencia del personal involucrado en los procedimientos usados Requisitos de crianza, alojamiento y manejo no usuales. Anestesia, analgesia y sedacin apropiadas, (las escalas de dolor y dao pueden ayudar en el diseo y revisin de los protocolos). La duplicacin innecesaria de experimentos. La realizacin de varias intervenciones quirrgicas mayores, en el mismo animal Criterios y mecanismos para la intervencin oportuna, retiro de los animales del experimento o eutanasia, en caso de preveer la ocurrencia de dolor o estrs grave. Cuidados despus del procedimiento Mtodos de eutanasia y eliminacin de los cadveres. Ambiente laboral seguro para el personal.Restriccin FsicaLa restriccin fsica es el uso de medios manuales o mecnicos para limitar algunos o todos los movimientos normales del animal con el propsito de examinarlo, tomar muestras, administrar medicamentos y otras manipulaciones teraputicas o experimentales. En la mayora de las ocasiones en que se aplica, los animales son inmovilizados por lapsos breves, generalmente minutos.Los movimientos del animal pueden ser restringidos brevemente ya sea en forma manual o mediante aparatos de restriccin, estos ltimos deben ser del tamao, diseo y operacin apropiados para reducir al mnimo la incomodidad o evitar lesiones al animal. Se debe evitar la restriccin prolongada, a menos que sea esencial para lograr los objetivos de la investigacin.Los sistemas menos restrictivos que no limitan la capacidad del animal para adoptar sus posturas normales, los puntales en forma de yugo para los animales de granja, deben usarse cuando sean compatibles con los objetivos del protocolo. Cuando se usen aparatos de restriccin, stos debern estar diseados especficamente, para lograr las metas de la investigacin que sera imprctico o imposible lograr por otro medio, y para evitar lesiones a los animales y al personal.A continuacin se enlistan importantes lineamientos para la restriccin de movimiento: Los aparatos de restriccin no deben considerarse como mtodos de alojamiento normales. Los aparatos de restriccin no deben usarse por simple conveniencia al manipular o manejar animales. El lapso de restriccin deber ser el mnimo requerido para alcanzar los objetivos de la investigacin. Debern tomarse las previsiones para observar al animal a intervalos apropiados. Si se observan lesiones o enfermedades asociadas con la restriccin de movimiento se debe brindar atencin mdico veterinaria. La presencia de lesiones, enfermedades o cambios de conducta severos a menudo necesitan la remocin, temporal o permanente, del animal de la restriccin.Mltiples Intervenciones Quirrgicas MayoresLa ciruga mayor penetra o expone una cavidad corporal o produce un menoscabo substancial de la funcin fsica o fisiolgica. La realizacin de varias intervenciones quirrgicas mayores, con recuperacin entre ellas, en el mismo animal no est aprobada, pero puede permitirse si el investigador la justifica cientficamente.Restriccin de Lquido o AlimentoCuando las situaciones experimentales requieran restringir la ingestin de lquido o alimento, debern brindarse, por lo menos, las cantidades mnimas para permitir el desarrollo de los animales jvenes y para mantener el bienestar a largo plazo de todos los animales. La restriccin debida a propsitos de investigacin debe estar justificada cientficamente y acompaada de un programa que verifique los parmetros fisiolgicos y de conducta e incluya criterios (tales como la prdida de peso y el estado de hidratacin) para el retiro, temporal o permanente, del animal del protocolo experimental. La restriccin es usualmente medida como un porcentaje de la ingestinad libitumo del consumo diario, o como cambio porcentual conforme al peso corporal del animal.En el caso de limitacin de lquido se deben tomar precauciones para evitar la deshidratacin aguda o crnica, incluyendo el registro diario de la ingestin de lquido y el registro, por lo menos semanal, del peso corporal.

Atencin veterinariaDebe brindarse atencin veterinaria adecuada, incluyendo a todos los animales para la evaluacin de su salud y bienestar. La misin institucional, las metas programticas y la envergadura del programa animal determinarn la necesidad de tiempo completo, tiempo parcial o servicios de asesora veterinaria. Las visitas del asesor o del veterinario de tiempo parcial debern hacerse a intervalos apropiados segn las necesidades del programa.Consideraciones ticas, humanitarias y cientficas en ocasiones requieren el uso de tranquilizantes, analgsicos o anestsicos en los animales. El veterinario responsable debe asesorar al personal de investigacin para asegurar que se cumplan las necesidades humanitarias y que a la vez sean compatibles con los requerimientos cientficos. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL ANIMALARIOSegn los parmetros establecidos por la OMS para lo que es ambiente de los animales en laboratorios, se puede agregar lo siguiente:

El empleo de animales de laboratorio con fines experimentales y de diagnstico impone al usuario la obligacin moral de adoptar todas las medidas necesarias para evitar que aqullos padezcan dolores o sufrimientos innecesarios. Hay que proporcionar a los animales un alojamiento cmodo, higinico y de dimensiones suficientes, as como agua y comida de buena calidad y en cantidad suficiente. Al final del experimento habr que sacrificarlos con el procedimiento menos cruel posible.

Por motivos de seguridad, los animales deben estar alojados en un local independiente, separado del laboratorio. Si se trata de un local contiguo, deber estar construido de tal modo que sea posible aislarlo de las partes pblicas del laboratorio en caso de necesidad, as como para las operaciones de descontaminacin y desinfestacin.

Al igual que todos los laboratorios normales, los animalarios tienen sus niveles de bioseguridad.

En cuanto a los animales que van a usarse en el laboratorio, los factores que hay que tener en cuenta son los siguientes:

1. El carcter de los animales, es decir, su grado de agresividad y tendencia a morder o araar.2. Sus endoparsitos y ectoparsitos naturales.3. Las zoonosis a las que son susceptibles.4. La posible diseminacin de alrgenos.

Como en el caso de los laboratorios, los requisitos relativos a las caractersticas de diseo, el equipo y las precauciones son cada vez ms estrictos a medida que aumenta el nivel de seguridad. Las directrices son acumulativas; es decir, cada nivel incorpora los requisitos de los niveles inferiores.

Animalarios nivel de bioseguridad 1

Este nivel es el apropiado para mantener a la mayora de los animales despus de la cuarentena (salvo los primates no humanos, respecto de los cuales debe consultarse a las autoridades nacionales) y para los animales que son inoculados deliberadamente con agentes de riesgo. Se necesitan tcnicas microbiolgicas apropiadas.El director del animalario debe determinar las polticas, procedimientos y protocolos para todas las operaciones, as como para el acceso al animalario. Se instituir un programa apropiado de vigilancia mdica para el personal y se preparar y adoptar un manual de seguridad de las operaciones.

Animalarios nivel de bioseguridad 2

Este nivel es apropiado para el trabajo con animales a los que se inoculan deliberadamente microorganismos del grupo de riesgo 2. Se aplicarn las siguientes precauciones de seguridad:

1. Se cumplirn todos los requisitos de los animalarios del nivel 1.2. Se colocarn seales de advertencia del peligro biolgico en las puertas y otros lugares apropiados.3. El local estar diseado de modo que sea fcil de limpiar y mantener.4. Las puertas deben abrirse hacia dentro y cerrarse solas.5. La calefaccin, la ventilacin y la iluminacin deben ser apropiadas.6. Si se instala ventilacin mecnica, el flujo de aire debe dirigirse hacia dentro. El aire utilizado se evacuar al exterior y no se reciclar a ninguna otra parte del edificio.7. El acceso se limitar a las personas autorizadas.8. No se admitir ningn animal distinto de los utilizados con fines experimentales.9. Existir un programa de lucha contra artrpodos y roedores.10. Si hay ventanas, estas sern seguras, irrompibles y, si se pueden abrir, llevarnrejillas a prueba de artrpodos.11. Las superficies de trabajo habrn de ser descontaminadas con desinfectantes eficaces despus del trabajo.12. Se dispondr de CSB (clases I o II) o jaulas aislantes con suministro especial de aire y evacuacin de aire a travs de filtros HEPA para aquellas tareas que puedan entraar la generacin de aerosoles.13. Se dispondr de una autoclave in situ o cerca del animalario.14. El material de los lechos de los animales se eliminar de modo que se reduzca al mnimo la produccin de aerosoles y polvo.15. Todos los materiales de desecho y de los lechos deben descontaminarse antes de ser eliminados.16. Se restringir en lo posible el uso de instrumentos punzantes o cortantes. stos se recogern siempre en recipientes resistentes y a prueba de perforacin, provistos de tapa, y sern tratados como material infeccioso.17. El material destinado al tratamiento con autoclave o a la incineracin debe transportarse sin riesgo en recipientes cerrados.18. Las jaulas de los animales se descontaminarn despus de su uso.19. Los cadveres de los animales sern incinerados.20. En el local se utilizar ropa y equipo de proteccin, que se retirar a la salida.21. Se instalarn lavabos y el personal se lavar las manos antes de salir del animalario.22. Todas las lesiones, por leves que sean, debern ser tratadas de forma apropiada, notificadas y registradas.23. Estar prohibido comer, beber, fumar y aplicar cosmticos dentro del animalario.24. Todo el personal deber recibir capacitacin apropiada.

Animalarios nivel de bioseguridad 3

Este nivel es apropiado para trabajar con animales que son inoculados deliberadamente con agentes incluidos en el grupo de riesgo 3, o cuando as lo indique la evaluacin del riesgo. Todos los sistemas, prcticas y procedimientos habrn de ser revisados y certificados nuevamente una vez al ao. Se aplicarn las siguientes precauciones de seguridad:

1. Deben cumplirse todos los requisitos correspondientes a los animalarios de los niveles de bioseguridad 1 y 2.2. El acceso debe estar estrictamente controlado.3. El animalario estar separado de otros locales del laboratorio y destinados a animales por dos puertas que formen un vestbulo o antesala.4. En el vestbulo se instalarn lavabos.5. En el vestbulo se instalarn duchas.6. Habr que disponer de ventilacin mecnica que asegure un flujo continuo de aire en todos los locales. El aire de salida pasar por filtros HEPA antes de ser evacuado a la atmsfera sin ningn tipo de recirculacin. El sistema estar diseado de tal modo que impida el flujo de retorno accidental y que haya una presin positiva en todas partes del animalario.7. Se dispondr de una autoclave situada en un lugar cmodo respecto del alojamiento de los animales y donde el riesgo biolgico est contenido. Los residuos infecciosos se tratarn en la autoclave antes de trasladarlos a otros lugares de la instalacin.8. Se dispondr de un incinerador de fcil acceso en la instalacin o se tomarn otras disposiciones al mismo efecto con las autoridades competentes.9. Los animales infectados con microorganismos del grupo de riesgo 3 estarn alojados en jaulas aisladas o en locales con salidas de ventilacin situadas detrs de las jaulas.10. Los lechos de los animales tendrn el mnimo polvo que sea posible.11. Toda la ropa protectora deber ser descontaminada antes de enviarla a la lavandera.12. Las ventanas estarn hermticamente cerradas y sern resistentes a la rotura.13. Se ofrecer al personal la posibilidad de inmunizarse, si procede.

Animalarios nivel de bioseguridad 4El trabajo que se realice en estas instalaciones normalmente guardar relacin con el del laboratorio de contencin mxima nivel de bioseguridad 4, y habr que armonizar las normas y los reglamentos nacionales y locales para aplicarlos a ambos tipos de instalaciones. Para el trabajo en laboratorios que requieren trajes especiales se utilizarn prcticas y procedimientos especiales, adems de los que se describen a continuacin.

1. Se cumplirn todos los requisitos de los animalarios de los niveles de bioseguridad1, 2 y 3.2. El acceso estar estrictamente controlado; slo tendr autorizacin para entrar el personal designado por el director del establecimiento.3. Ninguna persona deber trabajar sola: se aplicar la regla de las dos personas.4. El personal habr recibido el mximo nivel posible de formacin en microbiologa y estar familiarizado con los riesgos que entraa su trabajo y las precauciones necesarias.5. Las zonas en las que se alojen los animales infectados con agentes del grupo de riesgo 4 mantendrn los criterios de contencin descritos y aplicados en los laboratorios de contencin mxima nivel de bioseguridad 4.6. Se entrar en la instalacin por un vestbulo de cierre hermtico cuya parte limpia estar separada de la parte restringida por las instalaciones de cambio de ropa y duchas.7. El personal deber quitarse la ropa de calle al entrar y ponerse ropa protectora especial. Despus del trabajo se quitar la ropa, la separar para ser tratada en autoclave, y se duchar antes de salir.8. La instalacin estar ventilada por un sistema de evacuacin de aire con filtros HEPA que asegure una presin negativa (flujo de aire hacia el interior).9. El sistema de ventilacin estar diseado de modo que impida el flujo de retorno y la presurizacin positiva.10. Para el intercambio de materiales se dispondr de una autoclave de doble puerta con el extremo limpio situado en una sala exterior a las salas de contencin.11. Para el intercambio de materiales que no puedan ser tratados en la autoclave se dispondr de una caja de paso con cierre hermtico cuyo extremo limpio estar situado fuera de salas de contencin.12. Todas las manipulaciones de animales infectados con agentes del grupo de riesgo4 se realizarn en condiciones de contencin mxima nivel de bioseguridad 4.13. Todos los animales estarn alojados en aisladores.14. Todos los desechos y el material de los lechos de los animales se tratarn en la autoclave antes de sacarlos del animalario15. Se someter al personal a vigilancia mdica.

ENSAYOS REALIZADOS EN ANFIBIOSUno de los Phylum ms utilizados como modelos experimentales es el grupo Amphibia, ya que stos presentan unas enormes ventajas entre las que se incluyen un buen conocimiento de su fisiologa, gran diversidad taxonmica, tolerancia a grandes variaciones en el ambiente, fcil mantenimiento en cautividad y mayor similitud con los humanos en comparacin con otras especies animales utilizadas en experimentacin. Todas estas ventajas han hecho que los anfibios constituyan un tercio de los modelos animales, siendo utilizados por varios investigadores galardonados con el Premio Nobel.

Tabla1: Utilizacin de modelos animales con anfibios en las investigaciones de Premios Nobel.

FechaGalardonadosCampos de estudioEspecies utilizadas

1920A. KroghRegulacin capilarRana esculentaRana temporaria

1922A.V. HillO.F. MeyerhofMetabolismo muscularRana temporaria

1935H. SpermannCentros orgnicosTritoncristalusTritonlaeniatus

1936H. DaleO. LoewiBases qumicas en la transmisinnerviosaRana esculenta

1947B.A. HoussayRegulacin del metabolismo de carbohidratosButoarenarumRana pipiens

1963J.C. EcclesA.L. HodgkinA.F. HuxleyBase de los iones en los potenciales de accinRana esculentaRana temporaria

1991E. NeherB. SakmannFuncin de los canales inicosRana esculenta

Caractersticas especiales de los anfibios de inters como modelos animales

Los anfibios son uno de los modelos de eleccin por las siguientes razones:

Fisiologa bsica

Existen una gran cantidad de estudios que describen y explican las caractersticas anatmicas, fisiolgicas y ecolgicas de los anfibios. En muchos de ellos el objetivo es el conocimiento de los anfibios perse, ya que estos animales despiertan un gran inters por su posicin clave en la escala evolutiva. Sin embargo, los resultados aportados pueden ser utilizados en la creacin de modelos animales, extrapolables incluso a animales mamferos.

Facilidad de mantenimiento en cautividad

Los anfibios utilizados en experimentacin presentan una talla media comprendida entre 1 y 20 cm, por lo que requieren espacios relativamente pequeos para su confinamiento en jaulas; se estima que las necesidades medias son de 80 L por animal. S es importante realizar un perfecto mantenimiento de las condiciones de humedad (que ha de ser elevada) y ventilacin, para asegurar el buen estado fsico de los individuos y evitar la proliferacin de microorganismos.

Prolificidad elevada

Algunas especies exticas son poco prolficas porque tienen que llevar los huevos o renacuajos en la espalda, en bolsas de la piel, o incluso en el estmago durante una gran parte de su juventud. Sin embargo, la mayora de las especies del gnero Rana cra a principio de la primavera alcanzando los 20.000 huevos por puesta. Hay tambin dos especies de sapos, y algunas salamandras y cecilias que paren cras vivas que tienen una conformacin corporal similar a la de sus progenitores.

Elevado nmero de especies Existen 3.140 especies de anfibios conocidas que se han dividido en tres ordenes: Anura o Salientia (2660 especies de ranas terrestres y arborcolas y de sapos), Urodela, o Caudata (320 especies de salamandras) y Apoda, o Gymnophiona (160 especies de cecilias). Esta gran diversidad de especies permite realizar estudios comparativos con facilidad.

Gran diversidad de hbitats

La diversidad de especies, a su vez se traduce en una amplia distribucin geogrfica y gran capacidad de adaptacin a distintos medios naturales. As, podemos encontrar anfibios en muy diversos hbitats, adquiriendo morfologas distintas y mostrando diversas adaptaciones fisiolgicas al ambiente. Algunos, como Xenopus laevis, son completamente acuticos aunque tengan la capacidad de respirar aire directamente, lo que hace que predomine un tipo de respiracin cutnea no habiendo perdido la forma de respiracin pulmonar. Otra clase de anfibios han sido encontrados a ms de 4000 metros de altitud (Rana sauteri en Taiwan) con una gran capacidad de resistencia a las bajas temperaturas y a la concentracin reducida de oxgeno en el aire. Tambin es conocida la capacidad de sapos encontrados en altas latitudes de resistir la congelacin completa de su cuerpo. Otras especies (Rana cancrivora, o rana comedora de cangrejos), incluso han desarrollado la capacidad de hacer inmersiones en agua salada de mar consiguiendo resolver los problemas osmoreguladores que se presentan en este medio.

Modelos animales con anfibios

Para su exposicin hemos clasificado algunos ejemplos de modelos animales que utilizan distintas especies de anfibios en funcin del campo experimental en el que se resultan de aplicacin, explicando brevemente su aplicabilidad al mtodo experimental.

Tabla 2: Resumen de los modelos experimentales realizados con anfibios.

rea cientficaExperimentosEspecie anfibia

Fisiologa cardiovascularDesarrollo cardiacoAjolote (Ambystoma mexicanum)

Reparacin del dao tras infartoTritn (Notophthalmus viridescens)

Permeabilidad vascularRana africana de uas (Xenopus laevis)

Relacin con el comportamientoAnuros en general

Fisiologadel msculo esquelticoMetabolismo celularRana africana de uas (Xenopus laevis)Sapo de las Montaas Rocosas (Bufo woodhousei)Rana leopardo (Rana pipiens)

Corrientes de activacin de calcio

Canales de membrana

Cintica de alta velocidadAjolotes (Ambystoma mexicanum, Ambystomatigrinum)

Funcin renalDesarrollo del rinSapo marino (Bufo marinus)

Fisiologa sensorialCanalesinicosyconexionesneuronalesSalamandra tigre (Ambystoma tigrinum)

Evaluacin del sentido del gustoSapo moteado (Bufo punctatus)

Neurofisiologa del odo internoCoqu comn (Eleutherodactylus coqui)Salamandra olm (Proteus anguinus)

Fisiologa respiratoriaDesarrollo del sistema respiratorioSalamandras (fam. Plethodontidae)

Fisiologa reproductivaDesarrollo embrionarioCoqu comn (Eleutherodactylus coqui)

Evolucin del aparato reproductorCecilias (Gymnophiona)

Fisiologa evolutivaAdaptacin a la terrestrialidadTritn vientre de fuego chino (Cynops orientalis)

Fisiologa ambientalIndicadoresdelacalidadambientalRana de bosque (Rana sylvatica) Rana leopardo (Rana pipiens)

Ambientes extremos

CriogenizacinRana africana de uas (X. laevis)

Fisiologa del msculo esqueltico

Muchos de los estudios iniciales sobre inervacin y actividad muscular fueron realizados en anfibios, con protocolos de trabajo que hoy todava se emplean, con ciertas modificaciones, en laboratorios para docencia.La forma y la funcin del msculo esqueltico de los anfibios continan siendo un campo muy frtil, aplicando nuevos protocolos y tcnicas cientficas, para el estudio de procesos bsicos de metabolismo celular, corrientes de activacin de calcio, cintica de canales de membrana, y otros procesos ms especficos como los estudios de la cintica de alta velocidad responsable de los movimientos de la lengua. Una de las ltimas revisiones sobre la activacin muscular por calcio enfatiza el papel clave de los anfibios en la comprensin de la fisiologa muscular.

Estudios del sistema cardiovascular

En la actualidad el ajolote (Ambystoma mexicanum) se emplea frecuentemente en investigaciones sobre el desarrollo cardiaco, ya que existen individuos que sufren una mutacin que les produce una carencia de corazn; realmente, ste se desarrolla a lo largo de la vida del animal, si bien nunca llega a latir ya que sus miofibrillas estn mal organizadas. En otros vertebrados se produce tambin esta mutacin que resulta letal en estadios iniciales del desarrollo; sin embargo, el ajolote es capaz de sobrevivir y continuar su desarrollo durante varios das.

Otra caracterstica interesante de algunos anfibios es su capacidad para regenerar miocitos, a diferencia de los mamferos; esta caracterstica se est utilizando en modelos para el estudio de la recuperacin miocardial tras un infarto. Realmente los miocitos de los anfibios no se regeneran sino que tienen capacidad potencial para dividirse y repoblar la zona cardiaca daada.

Dentro de la investigacin microvascular se utilizan anfibios en el desarrollo de nuevas tcnicas para estudiar la permeabilidad vascular, basndose en el gran desarrollo de su sistema linftico, que incluye incluso un corazn linftico pulstil.

Por ltimo el estudio de la relacin entre el comportamiento y la funcin cardiovascular en anuros es de gran inters ya que son el nico grupo de animales terrestres cuya hidratacin no depende de la ingesta de agua o de su produccin a partir del metabolismo; estos animales absorben agua a travs de una zona en la piel y, mediante cambios posturales, pueden conducirla al sistema circulatorio y regular as su volumen sanguneo.

Funcin renal

Para una adecuada filtracin renal en mamferos es necesario el desarrollo del rin desde pronefros hasta el metanefros, pero el pronefros no es funcional en estadios iniciales del desarrollo y es difcil estudiar su funcionalidad in tero. En los anfibios el pronefros es funcional en estadios iniciales y sirve de rgano filtrador de sangre, lo que nos permite estudiar ms fcilmente el desarrollo de este rgano.

Fisiologa sensorial

Los anfibios han sido el modelo animal de eleccin en estudios sobre visin durante aos, y se siguen empleando en la actualidad. Las clulas retinianas de los anfibios tienen un gran tamao, lo que hace que sean el modelo ideal para estudiar la actividad de los canales y la conexin neuronal. La investigacin de otros sistemas sensoriales tambin se ha beneficiado de algunas de las caractersticas fisiolgicas de los anfibios, ya que los anfibios (como las aves) tienen la capacidad de regenerar las clulas ciliadas del odo interno, a diferencia de los mamferos, una de las principales causas de sordera en humanos. Adems, Bufo punctatus ha sido empleado para evaluar el sentido del gusto en humana, ya que este sapo que habita en zonas desrticas tiene una zona especial de la piel capaz de absorber agua y posee unos sensores que detectan la salinidad de dicho agua (para poder regular su osmolaridad).

Fisiologa respiratoria

La fisiologa respiratoria de estos animales concede un amplio campo de estudio. Los individuos adultos intercambian gases a travs de los pulmones y la piel, aunque existe un grupo de salamandras que carecen de pulmones y cuya respiracin es completamente cutnea. Las branquias estn presentes normalmente durante el desarrollo larvario y se mantienen en ciertos casos durante las fases adultas. El paso de una respiracin branquial a pulmonar se lleva a cabo durante el proceso de metamorfosis, que es sumamente interesante para el estudio del control respiratorio desde el punto de vista de la fisiologa de la evolucin, fisiologa del desarrollo y fisiologa ambiental.

ENSAYOS REALIZADOS EN CABALLOSAntes de mencionar los ensayos realizados en los caballos, explicaremos a grandes rasgos los cuidados o pautas necesarias para mantener a este animal en instalaciones adecuadas.Esto quiere justificar que a simples rasgos los caballos son animales de gran tamao con respecto a otros animales que se utilizan comnmente en los laboratorios por lo cual el alojamiento o crianza de este animal tiene que seguir algunas recomendaciones para que as los resultados obtenidos nos sean mas factible y verdicos.

Estas son las pautas ms resaltantes en el manejo de caballos:

Confinamiento o encierro primario

Una caballeriza bien iluminada y con acceso a un corral de ejercicio es deseable para que los caballos se mantengan en condiciones ptimas de salud y tono muscular. El alojamiento debe permitir un espacio adecuado en los pasillos para permitir el movimiento seguro de los caballos y sus cuidadores. En las caballerizas no debe existir ningn objeto saliente que pueda lastimar a los animales. Las paredes debern ser lo suficientemente altas para prevenir las interacciones con los caballos alojados a los lados. Es importante que las puertas tengan un ancho (1.25 m) y alto (2.25 m) adecuados para facilitar el movimiento de los animales, sin riesgo ni lesiones. Los techos tambin debern tener una altura adecuada, de 3 m para permitir al caballo asumir una postura normal y evitar lesiones en la cabeza. Los pisos debern tener una superficie durable, no resbalosa. Bajo condiciones de laboratorio o en instituciones educativas, se deber proporcionar un cuarto o rea separada de la zona de las caballerizas para realizar procedimientos de preferencia con una manga de manejo.

Temperatura

Los caballos pueden tolerar bajas temperaturas siempre y cuando exista suficiente proteccin de los vientos y lluvias extremas. De igual manera pueden tolerar temperaturas altas siempre y cuando se les proporcione sombra en praderas y una ventilacin y humedad apropiadas en las caballerizas. Debe existir suficiente agua potable y fresca disponible en todo momento., especialmente en climas calurosos. La temperatura ptima se encuentra entre 10 y 15C, aunque pueden tolerar de -7 a 29C si se alojan en caballerizas secas y libres de corrientes de aire.Ventilacin

La capacidad de ventilacin debe ser de por lo menos 2.8 m3 /min. por 450 Kg de caballo a temperaturas de -1 a 10C y deber incrementarse a medida que aumente la temperatura.Densidad de poblacin

Idealmente los caballos debern alojarse en caballerizas individuales de por lo menos 3.5 x 3.5 m, y tener acceso a un corral de ejercicio de 10 x 27.5 m mayor. Despus del destete es conveniente que cada animal tenga una caballeriza separada. En el corral de ejercicio se debe mantener una separacin por edad y compatibilidad.Cama

Se debe proporcionar suficiente cama en la forma de aserrn, paja o algn otro material adecuado. Deber existir un drenaje adecuado para evitar problemas en los cascos y que el animal se ensucie innecesariamente. El estircol y la cama mojada debern retirarse diariamente para mantener a los caballos limpios y secos, y el medio ambiente libre de olores. Los animales no debern tener acceso al estercolero para evitar infestaciones de parsitos.Se recomienda el cepillado diario, especialmente si los caballos estn alojados en caballerizas que limitan sus movimientos.

Salud Animal

Los caballos sanos estn activos, alertas y responden cuando se acerca alguien. La cabeza la traen en alto y las orejas erguidas. El pelaje est brillante y corto en el verano y grueso y suave en el invierno, especialmente si se encuentran al aire libre. Los caballos sanos comen con gusto cuando se les acerca alimento y generalmente toman agua despus de comer. Defecan heces consistentes varias veces al da y orinan cada 2 a 4 horas.

Alimento y Agua

Los caballos en confinamiento deben ser alimentados por lo menos dos veces al da. Cuando no tienen acceso al pastoreo se les debe proporcionar forraje en la forma de paja u otros materiales fibrosos para disminuir la incidencia de clicos y problemas de comportamiento tales como morder la puerta o el borde del pesebre, masticar madera o comerse su cama. Los caballos deben ser alimentados para que no estn ni bajos ni altos de peso. El agua debe estar siempre limpia y disponible a libre acceso o proporcionrselas por lo menos dos veces al da. Los requerimientos de agua dependen de varios factores, tales como la temperatura ambiental, la funcin del animal y la composicin de la dieta. Sin embargo un caballo en general requiere de 2 a 4 L de agua por cada Kg. de materia seca. Un caballo con dieta de mantenimiento en un ambiente termoneutral puede requerir de 15 a 35 L, pero uno que est trabajando y sudando o lactando puede requerir de 50 a 80 L.

Manejo y Transporte

Los caballos deben manejarse utilizando almartigones y cuerdas. Se puede obtener un mayor control pasando la cadena de la cuerda delalmartign o ronzal sobre la nariz del caballo, esto en caballos enteros. Se puede flexionar un miembro anterior (mano) para tener un mayor control. En caballos ms difciles de manejar se puede utilizar el arcial, pero siempre con cuidado y nunca por ms de cinco minutos a la vez. Las barreras fsicas pueden ser de gran ayuda. La inmovilizacin qumica es efectiva siempre que se administre por parte de una persona calificada. Drogas como acepromazina y xilazina son las ms utilizadas. Se deben utilizar analgsicos o anestsicos en el caso de procedimientos que provoquen dolor.ENSAYO REALIZADOProduccin de suero antiofdicoEl proceso de produccin del suero antiofdico antibothrops bivalente, para uso teraputico.El suero, proveniente de equinos inmunizados con dosis crecientes de venenos bothropicos activos, fue purificado mediante precipitaciones salinas, accin enzimtica y calor. De esta forma se obtiene una inmunoglobulina hipotxica e hiperinmune, capaz de neutralizar especficamente la accin de los venenos de Bothrops neuwiedi y alternates.

AnimalesEl primer lote de diez equinos fue proporcionado por el MSP. Los animales eran sanos. Jvenes entre 2 y 5 anos y de mas de 500 quilos de peso.Para las pruebas de potencia y seguridad, se utilizaron ratones blancos de 18 a 20 g de peso (Mus musculus) de ambos sexos, y libres de patgenos especficos. Para las pruebas de inocuidad y seguridad se utilizaron cobayos machos de 300 a 350 g de peso y libres de patgenos especficos.Disponibilidad de antgenosComo se careca de produccin local de veneno, en el comienzo se utilizaron venenos de Bothrops neuwiedi, y B. alternatus.

Caracterizacin de los venenos

Se sigui la metodologa aconsejada por la OPS/OMS para la elaboracin de sueros heterlogos, segn se aplica en el Instituto Malbran.Antes de comenzar la inmunizacin se determino la potencia de cada uno de los venenos, utilizando ratones de 18 a 20 g, para calcular la dosis letal 50 (DL50) aplicando mtodos estadsticos. La misma estuvo en menos de 4 ug/ml para el veneno de B. alternatus y menos de 10 J.g/ml para B. neuwiedi.Animales seroproductoresLos equinos fueron controlados por un mdico veterinario, realizndosele, a cada uno, su ficha sanitaria en la cual se anotaron las caractersticas de su pelaje, identificacin, sexo, numero, estado de las mucosas, dentadura y peso. Fueron numerados del 21 al 30. Se los vacuno contra ttanos y se desparasitaron.

Antgenos

Se preparo una solucin madre de venenos de B. alternatus y B. neuwiedi a una concentracin de 10 mg/ml, utilizando venenos completos y secos, reconstituidos. Se corrigi su pH a 7,2. Se los filtro clariesterilizante por membranas Millipor de diametro 47 mm y poros 0,8 y 0,22 (i. Se controlo la esterilidad, seleccionando medios que desarrollaran grmenes aerobios y anaerobios segn lo pautado por la OMS.Se realizaron las diluciones del veneno siguiendo el protocolo y usando como adyuvante el de Freund complete (AFC), (AFI), y solucin salina tamponada (SSB). Los mismos fueron completamente homogeneizados y conservados a 5C. Para tal fin, se idearon frascos estriles que contengan una barra magntica en su interior y cerrados hermticamente. Los componentes estriles, fueron mezclados aspticamente dentro de estos recipientes, los cuales una vez cerrados, se colocaron sobre un agitador magntico obtenindose as una correcta homogenizacin de los antgenos con los adyuvantes y evitando la contaminacin. Se mantuvieron a 5C hasta su inoculacin.

En todas estas etapas el personal tcnico uso de bata, gorro, guantes y tapabocas estriles.

Obtencin del suero Sangra

La sangra exploratoria se realizo el da 161 de la reinmunizacin, por puncin de la vena yugular del equino. El suero obtenido se titul para cada veneno por separado, mediante la tcnica de seroneutralizacin in vivo, utilizando como animal de experimentacin el ratn que fue inoculado por va intravenosa en vena de la cola. Cada ratn recibi 0,5 ml i/v de veneno a una concentracin 1/1000, mezclado con cantidades variables del suero de prueba. Se los observo durante 72 horas, al cabo de las cuales se procedi a la lectura y a realizar los clculos estadsticos correspondientes.

De los 10 equinos inmunizados, 9 tenan ttulos neutralizantes aceptables (ms de 900 g/ml). Un caballo, el numero 21, mostro una neutralizacin incompleta para el componente neuwiedi. A los diez das de la ltima inoculacin se realizaron dos sangras definitivas, separadas por 48 horas, a los 9 equinos que tenan buena respuesta inmune.

No se repuso el paquete globular por falta de estandarizacin de la tcnica. Sin embargo, el procedimiento fue muy bien tolerado por los animales. Se extrajeron 8 litros de plasma de cada uno.

Dicho plasma se recogi en damajuanas estriles de diez litros conteniendo citrato de sodio a 33%. El mismo da de la sangra se separo el paquete globular por decantacin y se obtuvo un total de 79 litros de plasma sobrenadante.

Control de sueros

El control de los sueros se lleva a cabo mediante diversas pruebas: de neutralizacin en ratones blancos, de pirogenicidad en conejos, de seguridad en cobayos y ratones, de esterilidad segn recomendaciones del National Institute of Health de E.U.A. (NJH); tambin incluye determinacin de fenol y protenas, as como una inspeccin visual por materiales en suspensin.

Una vez que los animales inmunizados han alcanzado un ttulo de neutralizacin adecuado el cual, de acuerdo con los estndares adoptados por los autores, es de 1 a 2 mg de veneno neutralizado por ml de suero para crotalinae y de 0.250 mg para Micrurus (3) se sangran en un cepo con un equipo diseado para tal efecto.

Normalmente se obtienen ocho litros diarios de sangre de cada caballo durante cuatro das, con reinoculacin de los eritrocitos al da siguiente. Este sistema proporciona alrededor de 16 litros de plasma citratado por caballo, el cual se so mete al mismo proceso 3 6 4 veces al ano. Con objeto de mantener niveles elevados de anticuerpos, los animales reciben tres dosis de refuerzo de veneno entre cada sangra.

Con respecto al suero crudo preparado en carneros, su actividad neutralizante frente a los venenos utilizados en el proceso de inmunizacin. Resta aun comprobar su eficacia contra otros venenos de serpientes del gnero Bothrops y en pruebas de campo.