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1 GLORIA GUTIÉRREZ-VENEGAS CRISTINA HERNÁNDEZ-BERMÚDEZ 2011
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GLORIA GUTIÉRREZ-VENEGAS
CRISTINA HERNÁNDEZ-BERMÚDEZ
2011
2
Procedimientos Experimentales del Laboratorio de Bioquímica.
Primera Edición 2011.
Gloria Gutiérrez Venegas , Cristina Hernández – Bermúdez.
Gestor de Derechos Autorales: Universidad Nacional Autónoma de México.
El campo de la salud está en un continuo cambio. A medida que surgen nuevas investigaciones que aportan información para ser utilizada en la práctica clínica, se propician cambios y adaptaciones a los libros de texto. Los autores de esta obra han revisado que los contenidos sean verificables. Sin embargo, sugerimos se consulten otras obras.
Proyecto Financiado por PAPIME (PE-203810) Dirección General de Asuntos del Personal Académico UNAM.
Editorial Buena Onda.
3
Índice
Tema Página
Introducción _________________ 5
Presentación de Equipo ________ 7
Titulación Ácido – Base _________ 10
Cromatografía de Aminoácidos __ 18
Cuantificación de Proteínas _____ 33
Actividad de la Amilasa Salival __ 39
Velocidad de Recambio Salival y
Cuantificación de Carbohidratos _
46
Electroforesis de Proteínas ______ 51
Aislamiento de ácidos nucleicos _ 57
Transformación, Aislamiento de
Plásmido y Digestión __________
61
Aislamiento de Plásmido _______ 65
4
Digestión y Electroforesis de
Plásmido ____________________
67
Titulación de Saliva ____________ 71
Cinética de Lisozima Salival _____ 73
Relación de la Caries con las UFC
de Lactobacillus acidophillus en
saliva _______________________
76
Operón Lac __________________ 79
Ficha Bioseguridad Ácido
clorhídrico ___________________
81
Hidróxido de Sodio ____________ 85
Ninhidrina ___________________ 89
Bromuro de Etidio _____________ 95
Términos y Definiciones ________ 98
Bibliografía _________________ 103
5
Introducción.
La asignatura de Bioquímica se imparte en el Primer año de la Carrera de
Odontología en la UNAM. La importancia de esta asignatura radica en
que está relacionada con todas aquellas transformaciones que se
realizan en lo seres vivos y debido a que abarca el estudio en las
diferentes células, tejidos y órganos en diferentes especies, su estudio es
de gran importancia en la práctica Odontológica. Así mismo, existe una
estrecha interrelación entre el contenido temático de esta asignatura
con las materias que conforman al grupo de materias Básicas, Preclínicas
y Clínicas.
En el curso teórico, además de los contenidos temáticos relativos con la
Bioquímica se revisan otros temas como la composición química de la
saliva, los procesos de mineralización dental, la estructura y composición
del periodonto y la bioquímica de dos de las enfermedades dentales que
tienen una gran prevalencia; a saber, la caries y la enfermedad
periodontal.
El estudio de la Bioquímica en la Facultad de Odontología, ha tenido un
avance continuo, desde que se instaló el laboratorio de Bioquímica en el
año de 1996, se han realizado mejoras sustantivas tanto en la
infraestructura y como en el Manual de Prácticas. Lo que permite que se
revise aunque de manera somera las principales herramientas que se
utilizan en el ámbito de Bioquímica. Por otra parte, se ha buscado que
los contenidos temáticos del Manual de Prácticas de Bioquímica, estén
6
en estrecha relación con muestras biológicas obtenidas de la cavidad
oral.
El impulso del laboratorio de Bioquímica ha permitido introducir a los
estudiantes de la Facultad de Odontología en el manejo del Método
Científico y en fomentar su participación en una actividad alternativa a
su práctica profesional que consiste en formar a futuros científicos o
profesionales que tengan una necesidad de búsqueda de nuevos
conocimientos. De igual manera, nos hemos propuesto la
responsabilidad de participar en consolidar la preparación en el ámbito
de las ciencias básicas a los Cirujanos Dentistas.
Por otra parte, el laboratorio de Bioquímica tiene la necesidad de iniciar
a los alumnos en el manejo de las herramientas fundamentales de la
Bioquímica, aclarando dudas e invitándolos a reflexionar sobre los
tópicos que se analizan en Bioquímica y su relación con el campo
Odontológico. Nuestra intención es ayudar a los estudiantes en
fomentar el aprendizaje autónomo.
Finalmente, este texto titulado “Procedimientos Experimentales de
Laboratorio de Bioquímica” y está dirigido a los profesores que imparten
la enseñanza experimental en Bioquímica y tiene el objetivo de
introducirlos de manera directa en los temas que se revisarán en clase y
mostrar los cálculos y volúmenes que se requieren la preparación de los
reactivos que se utilizan en las prácticas y los resultados esperados en
cada una de ellas.
7
Presentación de Equipo y Cálculo de
Factores de Dilución.
Diluciones:
Considérese el caso de una solución salina a la que se le medirá su
concentración de cloruro, calcio y magnesio. A la que le realizarán
diluciones antes de conocer la concentración de los componentes.
Para la realización este procedimiento se tomarán 50 ml de la solución y
se depositarán en un matraz aforado y que la muestra se diluye hasta
completar un volumen final de 500 ml con agua destilada, (a esta
disolución se denominará Solución A). La solución A, se homogeniza y se
toman 10 ml de esta solución en un matraz aforado y se diluyen
nuevamente con agua destilada a 250 ml, (Solución B). Si posteriormente
se realizan las determinaciones sobre la solución B y se encuentra que en
ella las concentraciones para calcio, magnesio y cloruro son
respectivamente 15, 45 y 85 ppm, ¿cual será entonces la concentración de
estos elementos en la muestra original?
Si se toman 10 ml de la solución A y se diluyen a un volumen de 250 ml
con agua destilada, todas las substancias que se hallaban disueltas en A,
estarán ahora en la solución B, 25 veces mas diluidas. En general, en las
operaciones de dilución, el volumen final al cual se lleva una dilución,
dividido por el tamaño de la alícuota, se conoce como el “Factor de
Dilución”. El factor de dilución es el número por el cual se debe
multiplicar la concentración de un soluto en una solución diluida, para
reproducir la concentración de la muestra original.
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Volumen total Factor de dilución = --------------------------- Volumen de alícuota
Así, el factor de dilución para pasar de la muestra original a la Solución A,
será igual a 250 mls / 25 mls = 10. A su vez, el factor de dilución para
pasar de la Solución A, a la Solución B, sería igual a 250 mls / 10 mls = 25.
Por lo tanto, el factor de dilución para pasar de la muestra original a la
Solución B, será igual a 10 x 25 = 250. Esto significa que la concentración
en la muestra original es 250 veces mayor que la concentración en la
solución B, donde se realiza la medida.
Realización de diluciones centesimales:
Si el factor de dilución es de 1/100. Se toma una parte de la solución
original, y 99 partes del disolvente. Si se desean realizar 10 ml de una
dilución centesimal se procede de la siguiente forma:
Se toma 0,1 ml de la solución madre y se pone en un tubo, y se añade 9,9
ml del disolvente (se realiza una regla de tres: 100 es a 1 de planta, y 10 ml
es a X.
Se tapa y se agita 100 veces. Obtendremos así la primera dilución
centecimal (CM). La 1ª CM se vuelve a tomar 0,1 ml. Al tubo con la 1ª CM,
y se añade 9,9 ml de disolvente.
Se agita 100 veces y obtenemos la 2ª CM; así sucesivamente, hasta la
dilución deseada.
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Realización diluciones decimales:
El factor de dilución es de 1/10. Se toma una parte de la solución madre y
9 partes del disolvente. Para realizar 10 ml de una dilución decimal, se
procede de la siguiente forma:
Se toman 10 ml de la solución madre y se ponen en un tubo; al que se
añade 9 ml de disolución. (10 es a 1, y 10 es a X.). Se toma 1 ml de
solución madre y 9 partes del disolvente.
Se agita 10 veces, y obtendremos la primera dilución decimal, la primera
dilución (1DH).
De la primera dilución (1DH), se toma 1ml que se pone en otro tubo, al
que se añade 9ml de disolvente; obteniendo la segunda disolución
(2 DH), y así sucesivamente.
Elaboración de Reactivos.
Preparación de la solución de NaCl
9.05 mg disolver en 31 mL de agua destilada
Reactivos Por equipo Por todos los grupos
Cloruro de sodio (NaCl) 5mM 0.2 mL 31 mL
Azul de timol 5% 0.5 mL 77.5 mL
Agua destilada 1.8 mL 279 mL
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Titulación Ácido – Base.
La titulación, es una metodología ampliamente utilizada en el ámbito de la
química analítica. Consiste en la realización de un método de análisis
volumétrico que se utiliza para establecer la concentración de las
sustancias que están presentes en una muestra. Es una metodología
ampliamente utilizada tanto para las reacciones ácido-base como de
oxidación-reducción.
En la titulación ácido – base se produce una reacción de neutralización,
cuyo producto final consiste en la formación de una sal y agua, lo que
conlleva a que se establezca el equilibrio químico ácido – base conjugado.
Un ventaja importante de la titulación ácido – base consiste en determinar
la concentración del compuesto que habrá de ser titulado. Para conocer la
concentración de un ácido debe medirse cuidadosamente el volumen del
ácido (matraz aforado) y debe vaciarse en un vaso de precipitados al cual
se le adicionan unas gotas de indicador, posteriormente en la bureta se
coloca una concentración conocida de base estándar. Se adicionan
volúmenes conocidos de la base al ácido y se mide el pH y se reportan las
diferencias en la coloración. Cuando se presenta igual concentración del
ácido y de la base, la titulación ha alcanzado el punto de equivalencia, es
decir es el punto en el que las concentraciones del ácido y la base son
iguales.
Un indicador adecuado para evaluar el punto de equivalencia es la
fenolftaleína, que a pH fuertemente ácido es naranja, a pH de 0 a 8.2 es
11
incolora y vira a rosa cuando se encuentra en un medio básico, finalmente
a pH superior a 12 es nuevamente incolora. La concentración del ácido o
de la base se calcula utilizando la relación entre el producto del volumen
por la normalidad, que es igual para todas las soluciones que reaccionan
completamente.
V ácido x N ácido = V base x N base
Esta ecuación es una expresión del principio de equivalencia .
Recordemos que:
Normalidad = Núm. equivalente
Volumen
Puesto que un equivalente de cualquier ácido neutralizará el equivalente
de cualquier base, se comprende que cualquier número de equivalentes
de ácido neutralizará exactamente el número de equivalentes de una
base.
Núm. Equivalente ácido = Núm. Equivalente base
El número de equivalentes de una sustancia en solución es igual a la
normalidad por el volumen .
Núm. Equivalente = N x V
La ecuación del Principio de equivalencia nos permite el cálculo de la
normalidad o del volumen de un ácido o una base.
Para determinar la concentración de un ácido se mide con cuidado un
volumen específico de la solución mediante una bureta y se coloca en un
matraz. Después se le adicionan unas gotas de indicador ácido-base.
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Posteriormente se le agrega, desde otra bureta, de forma cuidadosa y con
lentitud, una base de concentración conocida, llamada "base estándar",
hasta que una gota adicional de base modifica el color del colorante
indicador. Éste es el punto final de la titulación. El punto donde han
reaccionado cantidades estequiometrícamente iguales de ácido y base se
conoce como "punto de equivalencia". (El punto final y el punto de
equivalencia no son forzosamente iguales y varía según el compuesto se
vaya a titular). Es preciso seleccionar un indicador apropiado para la
titulación, de modo que el punto final esté tan cerca al punto de
equivalencia como sea posible. Un ejemplo es la fenolftaleína, que pasa de
color rosa en medio básico a incolora en medio ácido. En el punto de
viraje, llamado "punto final", se considera que el número de moles de
ácido monoprótico y de base monohidroxílica que han reaccionado es el
mismo.
Selección del indicador: En esta reacción el punto de equivalencia tiene
un pH = 7, por lo que el indicador adecuado sería el azul de bromotimol
(cuyo rango de 6.0 a 7.6); sin embargo se usa el anaranjado de metilo (3.2
a 4.4) debido al rango de vire, ya que de esta manera se evitan errores al
pasarse de volumen durante la titulación, puesto que el azul de
bromotimol reacciona con el CO2 del medio cambiando continuamente el
pH de la solución y aparentando no llegar nunca al punto final (el color
cambia constantemente de azul, punto final, a amarillo y viceversa) Tabla
I.
13
Tabla I Indicadores de pH
Indicador Color a pH ácido Intervalo de pH Color a pH básico
Rojo para-metileno Incoloro 0.1 – 0.8 Amarillo
2,6 Nitrofenol Incoloro 2.0 – 4.0 Amarillo
Azul de Bromofenol Amarillo 3.0 – 4.0 Azul púrpura
Verde de Bromocresol Amarillo 3.8 – 5.4 Azul
Rojo de Metileno Rojo 4.2 – 6.2 Amarillo
Azul de Bromotimol Amarillo 6.0 – 7.6 Azul
Azul de Timol Amarillo 8.0 – 9.6 Azul
Fenolftaleína Incoloro 8.0 – 9.8 Rojo – violeta.
¿ Cuál es el volumen de ácido clorhídrico HCl 0.5 N que se requiere para
neutralizar 20 ml de una solución 0.3 N de hidróxido de sodio NaOH?
Datos.
NHCl = 0.5 eq. / l Fórmula: Sustitución
VHCl = ? Va x N a = V b x N b V HCl =20 ml x 0.3 eq. / l
0.5 eq. / l
V NaOH = 20 ml Despeje: V HCl = 12 ml
N NaOH = 0.3 eq. / l Va = V b x N b N a
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Preparación de Reactivos.
Reactivos Por equipo Por todos los grupos
Ácido acético (CH3COOH) 5 mL 775 mL
Ácido Clorhídrico (HCl) 5 mL 775 mL
Hidróxido de sodio (NaOH) 1M
15 mL* 1 L*
Azul de bromotimol al 1% 2 gotas 320 gotas
*Dividir en dos porciones de 15 mL cada una
Preparación de la solución de NaOH 1 M
Cantidad de NaOH a pesar para preparar 1L de solución 1 M
Disolver en agua destilada y aforar a 1L
Preparación de la solución de Ácido acético (CH3COOH) y Ácido
clorhídrico (HCl) Preparación de la solución de Ácido acético (CH3COOH) y Ácido
clorhídrico (HCl)
Ácido clorhídrico (HCl)
Medir 37.86 mL de HCl y agregar 775 mL de agua.
Se sugiere poner primero el agua e ir goteando poco a poco el acido debido a la reacción exotérmica que se genera.
Ácido acético (CH3COOH)
Medir 23.3 mL de Ácido acético (CH3COOH) y agregar 775 mL de agua destilada
Valoraciones experimentales llevadas a cabo en el Laboratorio de Bioquímica. Unidad de Posgrado e Investigación. Facultad de Odontología
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Valoraciones experimentales llevadas a cabo en el Laboratorio de Bioquímica. División de Estudios de Posgrado e Investigación. Facultad de Odontología
16
Titulación de ácido clorhídrico (HCl)
pH
Volumen de NaOH ( mL )
Titulación HCl
Vol. (mL) NaOH pH
0 0.83
1 0.84
2 0.86
3 0.88
4 0.91
5 0.96
6 1.03
7 1.13
8 1.25
9 1.48
10 2.01
11 11.53
11.5 11.84
12 12.02
12.5 12.21
13 12.3
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Titulación de ácido acético (CH3COOH)
pH
Volumen NaOH ( mL )
Titulación CH3COOH
Vol. (mL) NaOH pH
0 2.44 1 2.91 2 3.29 3 3.55 4 3.74 5 3.91 6 4.05 7 4.17 8 4.3 9 4.4
10 4.53 11 4.67 12 4.8 13 4.94 14 5.1 15 5.32 16 5.67 17 6.93
17.5 10.87 18 11.49
18.5 11.86 19 12.1
18
Cromatografía de Aminoácidos.
La cromatografía es una técnica de separación de moléculas que presenta
distintas variantes. En términos generales, en toda separación
cromatográfica hay dos fases una móvil (sólida, líquida o gas) y otra
estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un
contacto íntimo. La muestra comprende la fase móvil y los componentes
de la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil. Los
componentes presentes en la mezcla que se van a separar, deberán
recorrer la fase estacionaria a diferentes tiempos, con lo que se produce la
separación. Así mismo la separación de la muestra va a estar en relación a
las propiedades de la fase estacionaria. Así como de los tiempos de
retención, ya que un componente que está la mayor parte del tiempo en
la fase móvil se moverá más rápidamente, mientras que si se encuentra la
mayor parte en la fase estacionaria, el producto queda retenido y su salida
es mucho más lenta.
Clasificación Fase Estacionaria Fase Móvil
Líquido - Sólido Sólido inerte (gel,
sílice, alúmina)
Disolventes.
Intercambio iónico Resina (Alúmina) Soluciones acuosas.
Líquido – Líquido Líquido absorbido en
un soporte sólido
Líquido.
Gas – Líquido Capa líquida absorbida
en un soporte sólido
Gas.
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La más utilizada en química orgánica es la cromatografía líquido-sólido en
sus dos variantes: cromatografía en columna (CC) y cromatografía de capa
fina (TLC).
Cromatografía líquido-sólido
La cromatografía en capa fina consiste en la utilización de una capa,
uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro
soporte. Se requieren placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las
placas durante la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una
cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también
poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para
activarlas (en la caso de la sílicagel).
La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase
estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general
menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que
se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.
Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:
hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < aldehído
aldehído < éster < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas
Ventajas de la cromatografía en capa fina
La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a
otros métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa)
ya que es más precisa y más simple. El tiempo que se necesita para
conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es
generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre
20
papel destruirían el cromatograma. El método es simple y los resultados
son fácilmente reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado
para fines analíticos.
Adsorbentes
Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño
de las partículas del adsorbente, cuanto más finamente dividido esté
mayor será su adhesión al soporte, aunque también se le puede añadir un
adherente (yeso). Algunos de los adsorbentes más utilizados son:
Celulosa
Almidón
Azúcares
Gel de sílice (silicagel)
Óxido de aluminio (alúmina)
Carbón activo (carbón en polvo)
Kieselguhr
Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de
plantas y animales.
Silicagel
Se denomina también gel de sílice o ácido silícico es uno de los más
utilizados, presenta un pH débilmente ácido, que oscila entre 4 - 5. Por lo
que no deberá ser utilizado en sustancias que se corrompan o son
inestables a pH ácido. Los geles de sílice normales suelen contener
21
impurezas de hierro y/o aluminio, este factor también se debe tener en
cuentas respecto al uso de componentes. El tamaño del grano suele ser de
10 a 40 micras y el tamaño de poro varía de 20 a 150Å.
Generalmente para su uso se agrega un agente aglomerante, yeso (sulfato
de cálcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente.
También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o
por separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de sílice.
Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con
hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga apto
para separar componentes lipófilos (esteroides, ácidos grasos, ceras,
vitaminas liposolubles, etc). A este proceso se le denomina cromatografía
de fase reversa (silanizado).
Alúmina
La alúmina u óxido de aluminio es un compuesto básico que se extrae a
partir de la bauxita y el pH básico se debe a que quedan algunas moléculas
de hidróxido de aluminio adheridas a la alúmina.
La alúmina puede ser tratada químicamente para conseguir alúminas
ácidas, básicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores
ultravioletas. Es un adsorbente de carácter polar, de tal forma que
retendrá con mayor avidez a los componentes polares.
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Preparación de placas.
El adsorbente se debe hidratar en agua y esta mezcla forma una
suspensión por lo que debe agitarse de manera mecánica. La proporción
de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Por lo general se
utilizan dos partes de agua y una de adsorbente pueden tomarse como
norma general, no obstante, habrán de consultarse la instrucciones del
fabricante.
Como soporte se pueden utilizar láminas de vidrio, pero en la actualidad
también se utilizan láminas de otros compuestos orgánicos más flexibles
como el aluminio. Dependiendo del tipo de separación que se desee
(cualitativa o preparativa) se utilizará un tamaño de placa u otro. En
general para realizar una separación preparativa de un gramo de muestra
es necesario una placa de vidrio de 20 x 20 cm, 35 gramos de adsorbente y
80 ml. de agua destilada.
Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la
adición de compuestos tales como disoluciones amortiguadoras. En la
preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores
fluorescentes o aglomerantes.
Se puede adicionar nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le
denomina argentación, y se utiliza para separar componentes insaturados.
El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa,
en general suele ser de:
0.1 - 0.2 mm para separaciones analíticas.
0.5 - 2 mm para separaciones preparativas.
23
Es importante que la mezcla quede homogénea ya que la placa debe
quedar libre de grumos y rugosidades, que afectarían al desarrollo de la
cromatografía. Existen aparatos que tienen función extensora y que se
utilizan para crear placas homogéneas del espesor deseado. Si no se
dispone de extensor, el proceso a seguir es el siguiente:
1. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.
2. Agitar enérgicamente.
3. Extender la mezcla es un extremo de la placa.
4. Utilizar el extensor para aplicarla de manera homogénea en la
placa.
5. Reporsar y en ocasiones para su activación la placa deberá ser
horneada como se describe a continuación.
Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo
después de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metálicas. En este
momento puede activarse el agente adsorbente, bien dejando las placas
reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien calentándolas
durante 30 - 60 minutos a 105 - 110 centígrado. Es importante mencionar
que las placas de celulosa se deben calentar menos de 10 minutos y a una
temperatura máxima de 105 grado centígrados para expulsar el aire. Es
conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire, para evitar los
agrietamientos que se producirían por efecto del cambio de temperatura.
Aplicación de las muestras
Las muestras deberán estar en solución, y de preferencia en un disolvente
orgánico no polar que tenga un punto de ebullición bajo para que se
evapore después de la aplicación. Sin embargo a menudo se necesitan
disolventes polares; la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva.
24
Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar
2 µl resulta en la carga 20 µg de producto sólido. Muchos reactivos de
revelado llegan a detectar 0.1 µg de material; por esto con esta carga
puede llegarse a observar un 5% de impurezas.
Para la aplicación se recomienda la utilización de micropipetas y
microjeringas o bien tubos capilares. La muestra se aplica tocando la
punta del capilar (micropipeta, jeringa, etc) sobre la placa preparada. Es
importante que la muestra se aplique dejando una distancia al borde
inferior de un centímetro aproximadamente. Aplicada la muestra se deja
secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedará
la muestra a analizar.
Elección de la fase móvil
La elección de la fase móvil dependerá del componente que se va a
separar y del material en que la separación se lleva a cabo.
Principales eluyentes utilizados como fase móvil en orden creciente de
polaridad:
Éter de petróleo.
Éter dietílico.
Ciclohexano.
Acetato de etilo.
Tetracloruro de carbono.*
Piridina.
Benceno.*
Etanol.
Cloroformo.*
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Metanol.
Diclorometano.
Agua.
Ácido acético.
*compuestos cancerígenos.
En la elección del eluyente influyen varios factores:
Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la
polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez más polares.
a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.
b) Aplicando un eluyente poco polar.
c) Aplicando un eluyente más polar.
Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir
utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares, hasta
determinar el o los más apropiado.
Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar
varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo
capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite
26
desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se
aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera más
eficaz.
Desarrollo de la cromatografía
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente
por el método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda
por una placa casi en vertical, por la acción de la capilaridad. La
cromatografía se realiza en una cámara para cromatografía. Para
conseguir la máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara, las
paredes se tapizan con papel impregnado del eluyente.
Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del
desarrollo, para permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo de
desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una
cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el
tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de horas.
Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que
se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se
hace para estandarizar los valores de Rf. Frecuentemente esta distancia es
de 10 cm.; parece ser la más conveniente para medir valores de Rf.
Después del desarrollo, las placas pueden secarse rápidamente con una
corriente de aire caliente.
La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio
entre el origen y el frente de elución, ya que permite separar las
impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente de
elución nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.
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Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz, se secará en una
cámara que contenga un gas inerte o aislada de la luz.
Localización de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la
posición de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de métodos:
Métodos químicos.
Métodos físicos.
Métodos químicos
Consisten en realizar una reacción química entre un reactivo revelador y
los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los
reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera
de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido.
Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. Si el reactivo
revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverización deberá realizarse
en una vitrina de gases bien ventilada.
La pulverización se realizará poco a poco. En cromatografía en capa fina
no puede realizarse el bañado del cromatograma.
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma
complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-
marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es
conveniente señalar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que
reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras.
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El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de
componente separado.
Además de estos reveladores generales, existen otros más específicos
como:
2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehídos y cetonas).
Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos).
Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
Ninhidrina (para aminoácidos).
Métodos físicos.
El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente.
De tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y
dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas
fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos
aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes.
Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal)
con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de
ultravioleta.
29
Constantes de Factor de Corrimiento: Rf
La constante Rf (Ratio of Front) es una manera de expresar la posición de
un compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la
retención de un componente. Se define como:
La distancia recorrida por el compuesto (se mide generalmente desde el
centro de la mancha), los cálculos se simplifican si el denominador es 10.
Para que los Rf sean reproducibles deben ser fijadas una serie de
condiciones (Espesor de la placa, fase móvil, fase estacionaria, cantidad de
muestra). El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es
un Rf entre 0.65 y 0.7.
Cromatografía de aminoácidos.
La reacción con ninhidrina se emplea para detectar y valorar
cuantitativamente los aminoácidos en cantidades pequeñas. La calefacción
con exceso de ninhidrina origina un producto purpúreo con todos los
aminoácidos que poseen un grupo α-amino libre, mientras que se forma un
producto amarillo cuando se trata de prolina, aminoácido en el que el grupo
amino se halla sustituido.
30
Preparación de Reactivos:
Acetona: Ácido acético: Agua 13:2:4
Reactivos Por equipo Por todos los grupos Acetona (CH3CO)CH3 3.25 mL 528 mL Acido acético (CH3COOH) 0.5 mL 88 mL Agua destilada 1 mL 168 mL Aminoácidos ( 0.1 mg /ml) 0.2 mL 31 mL Ninhidrina 1% 1 mL 150 mL Solución problema ------------------ ------------------
Preparación del eluyente mezclar: 3.25 mL de acetona + 0.5 mL de ácido acético + 1 mL de agua. ( se prepara al momento)
La Ninhidrina se aplica cpb para que se moje todo el papel filtro.
Protocolo experimental realizado en el Laboratorio de Bioquímica. División de Estudios de Posgrado e Investigación. Facultad de Odontología.
Los aminoácidos utilizados en este protocolo fueron diluidos 1:10 es decir 100 µL en 900 µL de agua destilada.
31
Resultados Esperados. Cromatograma:
Sellar el vaso de precipitados sellado con Kleen-pack.
1 Alanina 2 Leucina. 3 Glicina
1 2 3 4
1 Leucina 2 Triptófano 3 Arginina 4 Prolina
32
Stock de cada aminoácido 5 mg/ml. En solución (1:1) de ácido
clorhídrico (HCl) 0.01N / Etanol 90%
33
Cuantificación de Proteínas.
La determinación de la concentración de proteínas en una muestra
biológica es un procedimiento rutinario que se realiza en un laboratorios
de investigación y que es de gran utilidad para los procedimientos de
western-blot, purificación de proteínas, diagnóstico de enfermedades y
para otra serie de propósitos.
Existen muchos métodos para la cuantificación de proteínas. Entre los que
se encuentran: la absorbencia en luz UV; formación de derivados
químicos; la unión de proteínas con los colorantes.
Entre los métodos colorímetros para la detección de proteínas se
encuentran: Biuret, Lowry, ácido bicinconínico (BCA); así como los
derivados fluorimétricos como o-ftalaldehído.
En estos métodos la intensidad de la coloración de directamente
proporcional a la cantidad de proteínas. Estas reacciones son bastante
específicas y existen un grupo limitado de reactivos que interfieren con
ellas. La elección de los métodos varía de acuerdo a la sensibilidad de la
reacción y la cantidad de proteína presente en la muestra que se desea
evaluar.
Identificación de proteínas mediante la reacción el Biuret
La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante
la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene sulfato de cobre
(CuSO4) en medio alcalino (hidróxido de sodio (NaOH), tartrato de sodio
34
potasio o hidróxido de potasio (KOH)). La reacción se basa en la
formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un
complejo de coordinación entre los iones cobre (Cu2+) y los pares de
electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces
peptídicos.
La reacción debe su nombre al Biuret, una molécula formada a partir de
dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva
esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o más
enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.
Método Bradford.
Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva
Blue) a las proteínas. Este colorante, en solución ácida, existe en dos
formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para
formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción
mayor que el colorante libre. Este método es sensible (detecta 1 - 15 μg),
simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación.
Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones
básicas.
Ácido Bicinconínico:
El ácido bicinconínico (sal sódica), es un compuesto capaz de formar un
complejo púrpura intenso con iones Cu+ en medio alcalino. Este reactivo
forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso
producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino
(reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo
proporciona un método para la cuantificación de proteínas, es sencillo,
35
rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos
que afectan a otros métodos.
Método Lowry.
Este procedimiento involucra la formación de un complejo Cobre-proteína
en un medio alcalino. El complejo reduce al reactivo fosfomolíbdico-
fosfotungstato lo que produce una coloración azul. Este método de
cuantificación muestra interferencias con detergentes iónicos y sulfato de
amonio.
Curva Patrón.
Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de
una sustancia (por ejemplo la albúmina sérica bovina) que se utiliza para
determinar la cantidad de proteínas presente en una muestra incógnita.
En determinaciones colorimétricas, se cumple una relación proporcional
entre la magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad
del reactivo que la provoca. La intensidad de color se mide con un
espectrofotómetro o colorímetro en función de las concentraciones
crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad
de proteína, mayor cantidad de producto de reacción y por lo tanto,
mayor intensidad de color.
La absorbencia de una muestra es el resultado tanto de la concentración
de muestra sujeta a estudio como de los otros componentes presentes en
la solución. Por lo general, a esos otros componentes se les denomina
interferencias, a fin de descartar las interferencias es necesario hacer una
solución que contenga a todos los componentes con excepción del que se
desea medir. A esta muestra se le denomina blanco y la absorbancia de
36
éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el
blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de
transmitancia.
37
Preparación de Reactivos
Reactivos Por equipo Por todos los grupos Solución salina al 38% 1.5 mL 232.5 mL Suero Albumina stock 10mg/mL 3 mL 465 mL Agua destilada 4.5 mL 697.5 mL Reactivo de Biuret 36 mL 5.600 L Saliva --------------- -----------
Preparación del Reactivo de Biuret 1L
Disolver 1.50 g de Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 * 5 H2O) y 6.0 g de Tartrato de sodio-potasio (NaKC4O6* 4 H2O)4 en 500 mL de agua desionizada. Adicionar 300 mL de Hidróxido de sodio (NaOH) al 10 %, aforar a 1L
Para la preparación de los 5.6 litros pesar lo siguiente:
Disolver 8.4 g de Sulfato de cobre pentahidratado y 33.6 g de Tartrato de sodio-postasio en 2.8 L de agua desionizada. Adicionar 1,680 mL de Hidróxido de sodio al 10% aforar a 5.6 L
Preparación de Hidróxido de sodio (NaOH) al 10%
Disolver 30 g de hidróxido de sodio (NaOH) en 300 mL de agua destilada.
Protocolo experimental realizado en el Laboratorio de Bioquímica. División de Estudios de Posgrado e Investigación. Facultad de Odontología.
38
Resultados Esperados.
Laboratorio de Bioquímica. Posgrado e Investigación. Facultad de Odontología. Espectrofotómetro SEQUOIA del laboratorio S-1 Facultad de Odontología.
Cálculo para obtener la concentración de Proteína en la muestra a partir de la curva patrón.
Ecuación de la recta
Despeje de la ecuación
Ejemplo:
Concentración de proteína en la muestra 1
X = 0.39 mg/mL
y = 0.687x + 0.0622 R² = 0.9425
AB
S
Suero albúmina de bovino (mg/mL)
Curva patrón para la cuantificación de proteínas
Tubo ABS Conc. mg/mL
1 0 0 2 0.15 0.2 3 0.366 0.4 4 0.501 0.6 5 0.67 0.8 6 0.685 1
Muestras 7 0.206 0.209 8 0.09 0.041 9 0.572 0.738
39
Actividad de la Amilasa Salival.
Almidón.
Es un hidrato de carbono complejo, inodoro e insípido. El almidón es el
principal carbohidrato de reserva en la mayoría de las plantas y semillas.
En las hojas el almidón se acumula en los cloroplastos, donde es un
producto directo de la fotosíntesis. En los órganos de almacenamiento, se
acumula en los amiloplastos, en los cuales se forma después de la
translocación de sacarosa u otro carbohidrato provenientes de las hojas.
En los vegetales, el almidón se encuentra en uno o más granos amiláceos
en un plastidio. La cantidad de almidón en diversos tejidos depende de
muchos factores genéticos y ambientales. El almidón se acumula a la luz
del día cuando la fotosíntesis excede las tasas combinadas de respiración y
translocación, después parte del almidón es utilizado durante a noche.
Se presentan dos tipos de almidón: amilosa y amilopectina, ambos
compuestos por unidades de d-glucosa unidas por enlaces -1, 4. Las
uniones -1, 4 hacen que las cadenas de almidón se enrollen en forma de
hélices. La amilopectina consta de moléculas muy ramificadas, cuyas
ramas se localizan entre el C-6 de una glucosa de la cadena principal y el
C-1 de la primera glucosa en la cadena que forma la rama (enlaces -1, 6).
La amilosa es más pequeña y contiene de cientos a miles de unidades de
glucosa, número que depende de la especie y las condiciones ambientales.
La formación de almidón ocurre sobre todo por un proceso que implica la
40
donación repetida de unidades de glucosa provenientes de un azúcar
nucleotídico similar al UDPG y que se denomina difosfoglucosa de
adenosina, ADPG.
Hidrólisis d el almidón.
La hidrólisis implica la ruptura de un enlace mediante la adición en medio
del mismo de los elementos del agua. Los polisacáridos de la dieta se
metabolizan mediante hidrólisis a monosacáridos.
La mayoría de los pasos de la degradación de almidón a glucosa pueden
ser catalizados por tres enzimas distintas, si bien hay otras más que se
necesitan para completar el proceso. Las primeras enzimas son una -
amilasa, y almidón fosforilasa. Al parecer solo la -amilasa puede atacar
gránulos de almidón intactos, por lo que cuando participan la -amilasa y
la almidón fosforilasa, es probable que actúen sobre los primeros
productos liberados por la -amilasa. La -amilasa ataca de manera
aleatoria enlaces -1,4 en las moléculas de amilosa y amilopectina, al
principio creando huecos al azar en los granos de almidón y liberando
productos que aun son grandes. En cadenas de amilosa no ramificadas, el
ataque repetido por la -amilasa produce maltosa, un disacárido que
contiene dos unidades de glucosa. Sin embargo, la -amilasa no puede
atacar los enlaces 1,6 localizados en los puntos de ramificación de la
amilopectina, por lo que la digestión de amilopectina cesa cuando aun
quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Muchas -
amilasas son activadas por Ca++, lo cual es una de las razones por las que el
calcio es un elemento esencial.
La -amilasa hidroliza al almidón en -maltosa; la enzima actúa primero
41
solo sobre los extremos no reductores. La ð-maltosa cambia con rapidez,
por mutarrotación, para formar las mezclas naturales de isomeros y .
La hidrólisis de amilosa por la -amilasa es casi completa, pero la
degradación de amilopectina es incompleta porque no son atacados los
enlaces de los puntos de ramificación. La actividad de ambas amilasas
implica la incorporación de una molécula de H2O por cada enlace roto, por
lo que son enzimas hidrolasas. Las reacciones hidrolíticas no son
reversibles, de modo que no se pueden detectar síntesis de almidón por
amilasas. Las amilasas están diseminadas en diversos tejidos pero son mas
activas en las semillas que están germinando, ricas en almidón. Es
probable que la -amilasa tenga más importancia que la -amilasa para la
hidrólisis de almidón. Gran parte de la -amilasa se localiza dentro de los
cloroplastos, muchas veces unida a los granos de almidón que atacara.
Actúa tanto en el día como por la noche aunque, por supuesto, durante la
luz de día hay producción neta de almidón por la fotosíntesis.
La amilopectina solo es degradada parcialmente por la acción del almidón
fosforilasa. La reacción procede de manera consecutiva a partir del
extremo no reductor de cada cadena principal o cadena ramificada hasta a
unos residuos de glucosa de las uniones -1,6 de las ramificaciones, por lo
que de nuevo que dan dextrinas. La amilosa, que tiene pocas
ramificaciones, se degrada casi por completo, por eliminación repetida de
unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. La
almidón fosforilasa esta ampliamente distribuida en la planta y a veces
resulta difícil determinar que enzima digiere la mayor parte del almidón
en las células de interés.
42
Método de Tinción con Lugol:
Este método se usa para identificar polisacáridos (almidón y
glucógeno). El lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) de color
pálido, al reaccionar con un polisacárido, toma un color violeta. En
realidad no se produce un cambio químico, sino de conformación
molecular, el yodo del lugol se introduce entre las diferentes ramifi-
caciones del almidón, modificando su absorbancia vira a una
coloración violeta.
En el último paso del protocolo, al calentar y enfriar, hacemos que varíe
la estructura molecular del almidón, al enfriarse, la configuración varía
liberándose el yodo y perdiendo así el color característico, al
volver a calentar, reaparece el color, pues la estructura molecular se
recompone.
43
Preparación de Reactivos.
Reactivos Por equipo Por todos los grupos Lugol 1.5 mL 232.5 mL Agua 12.5 mL 2 L Almidón 0.5 mL 77.5 mL
Preparación de Lugol
Disolver 1g de Yodo (I) + 2 g de Yoduro de potasio (KI), en 300mL de agua.
Preparación de la solución stock de almidón la cual se preparará durante la clase debido a que se contamina fácilmente.
Pesar 100 mg de almidón y disolverlos en 1 mL de agua.
v
100 mg/mL
0.5 mL/1mL
50 mg/mL 25 mg/mL 10 mg/mL 5 mg/mL
0.25 mL/1mL
0.1 mL/1mL
44
Resultados Esperados.
Cursos Temporales. ( Absorbencia vs. Tpo )
y = -0.0013x + 0.3734 R² = 0.9898
y = -0.0009x + 0.4394 R² = 0.9891
y = -0.001x + 0.5118 R² = 0.9769
45
y = 3.7094ln(x) + 8.6255
R² = 0.8827
vo
( m
g/
mL
/ m
in )
Concentración de Sustrato ( M )
Series1
Logarítmica(Series1)
[S] (mg/mL) Vo
(mg/mL/min)
Almidón Vo
(mg/mL/min)
0.5 4.8
1 10
2.5 13
5 13.5
46
Velocidad de Recambio Salival y
Cuantificación de Carbohidratos.
La saliva es un fluído de suma importancia en la cavidad oral ya que sirve
entre otras funciones para la formación del bolo alimenticio y otra serie de
efectos no por ello menos importantes y que se describen a continuación.
Lubricación : el serosidad de la saliva es muy eficaz para comida masticada
y la formación del bolo, lo que permite que los alimentos se
deslicen de forma eficaz a través del esófago, sin ocasionar ningún
tipo de ulceración. Así mismo a los alimentos secos los solubiliza.
Mantiene la higiene oral: El flujo de saliva permite que se mantenga
limpia la cavidad oral debido a que entre sus constituyentes se
encuentra la lisozima que degrada la pared celular de los
microorganismos y de esta forma impide la colonización de los
diferentes tejidos.
Inicia digestión del almidón: las células acinares serosas secretan alfa-
amilasa que pueden comenzar a digerir el almidón en maltosa dieta.
La amilasa no está presente, o presente sólo en cantidades muy
pequeñas, en la saliva de los carnívoros o ganado.
Presenta función de amortiguamiento del pH: mantiene el pH constante
y de esta forma la ingesta de alimentos ácidos no provocan daños
en el esmalte dental.
47
Enfriamiento por evaporación: la saliva ayuda en la evaporación de
líquidos, tal función es de gran importancia en la fisiología de los
caninos.
La caries dental es una enfermedad que representó un problema
importante de salud pública a finales del siglo XIX y se recrudeció
en la década de los cincuenta. Es una enfermedad transmisible e
irreversible que afecta al 90% de la población. Entre los factores de
riesgo se encuentran: un alto riesgo por Streptococcus mutans, alto
gradod e infección por Lactobacillus, experiencia anterior de caries,
dificiente resistencia del esmalte, deficiente capacidad de
mineralización, mala higiene bucal, baja capacidad amortiguadora
dieta cariogénica.
En cuanto a la dieta cariogénica es uno de los principales factores
promotores de la caries. Se debe considerar el contenido de azúcar,
características físicas de alimnto, solubilidad, retención, capacidad
para estimular el flujo salival y cambios químicos en la saliva, la
textura, la frecuencia y horario de su consumo y tiempor de
permanencia en la boca; todos estos parámetros afectan la baja
capacidad amortiguadora salival. Así mismo la saliva viscosa es
menos efectiva en el aclaramiento de carbohidratos, favoreciendo
la desmineralización.
48
Preparación de Reactivos.
Reactivos Por equipo Curva patrón Por todos los grupos Reactivo de arsenomolibdato
8 mL 12 mL 1,420 L
Reactivo de cobre mezclado
8 mL 12 mL 1,420L
Solución stock de glucosa ------------ 1.5m mL 30 mL Agua desionizada 6.5 mL 10.5 1,165 L Muestra de saliva -------------- --------------
Preparación del reactivo de arsenomolibdato 1, 500 L
Disolver 75 g de molibdato de amonio ((NH4)6Mo7O24*4H2O) en 1,356 L de agua destilada y agregar 64 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado. Agregar 3g de Na2HAsO4*7H2O disueltos en 80 mL de agua.
El reactivo se debe de guardar en un frasco color ámbar e incubar a 37° C de 24-48 hrs.
Debido a que la mezcla de ácido sulfúrico (H2SO4) con agua es una reacción exotérmica, se recomienda poner gota a gota el ácido sulfúrico (H2SO4) en el agua y no el agua en ácido sulfúrico (H2SO4).
Preparación del reactivo de cobre mezclado 1, 500 L
Disolver 42 g de Na2 HPO4 anhidro y 6 g de tartrato de sodio y potasio en aproximadamente 1,050 L de agua destilada. Agregar 150 mL de Hidróxido de sodio (NaOH) 1N agitando y 120 mL de Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 * 5H2O) al 10%. Una vez homogenizada la mezcla agregar 270 g de Sulfato de sodio (Na2SO4) anhidro y diluir a 1,500 L de agua destilada.
Dejar reposar el reactivo 24 hrs y luego decantar el sobrenadante.
Preparación de la solución de Hidróxido de sodio (NaOH) 1N
Disolver los 6 g de Hidróxido de sodio en 150 mL de agua destilada
Dado que el Hidróxido de sodio tiene solo 1 equivalente la normalidad y molaridad es igual.
Preparación de la solución de Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 * 5H2O) al 10%
Disolver 12 g de Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 * 5H2O) en 120 mL de agua destilada
49
Cálculo para obtener la concentración de Glucosa en la muestra a partir de la curva patrón.
Ecuación de la recta
Despeje de la ecuación
Ejemplo:
Concentración de carbohidratos en la muestra 1
X 0.47 mg/mL
y = 0.359x + 0.0543 R² = 0.945
Ab
sorb
an
cia
Concentración Almidón ( mg/mL )
Cuantificación de Carbohidratos Concentración Absorbancia
0.1 0.102
0.2 0.124
0.3 0.147
0.4 0.187
0.5 0.25
Muestras
1 0.124
2 0.883
3 0.196
50
HISTOGRAMA
51
Electroforesis de Proteínas.
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente
eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga
eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
Fue empleado por primera vez por en el año 1937, pero su importancia vino a
incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius ,
impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separación de
materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este
término se limitó originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas ,
se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de
bajo peso molecular.
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un
campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee
carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas
positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas
positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).
Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la acrilamida por
acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes,
capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles
transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y
que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado.
Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede
modificar de manera controlada en el tamaño del poro.
La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la acrilamida y
la bis-acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por la
tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio.
52
El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de
acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al
azar por la bisacrilamida, formándose así una red de porosidad bastante uniforme,
que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones
de los monómeros.
En el gel separador, la movilidad es restringida por el tamaño del poro, el cual
depende de la concentración de monómeros del gel. Así, si se requiere resolver
componentes de muy alto PM, se utilizan geles al 5% o al 7,5%, mientras que los geles
de poro menor, ej. 15-20% son útiles en la separación de péptidos y proteínas
pequeñas. Los geles de poro intermedio (10-12%) proveen una separación adecuada
para proteínas de ~10.000-90.000 daltons.
Factor de Corrimiento.
La movilidad electroforética relativa (Rf) es inversamente proporcional al logaritmo del PM. Trazando un gráfico con estándares de PM conocido, se obtiene una línea de referencia en la cual se puede interpolar muestras de PM desconocido. El Rf se calcula dividiendo la distancia (mm) recorrida por la banda en cuestión, entre la distancia recorrida por el colorante azul de bromofenol (u otro punto de referencia arbitrario). E Determinación del peso molecular de una proteína "incógnita", mediante SDS-PAGE. Las muestras fueron reducidas con 2-mercaptoetanol, y corrida en un gel al 12% de concentración.
53
________________________________________________________________ Marcador PM Distancia (mm) Rf (vs.70 mm) ______________________________________________________________________ Albúmina bovina 66.000 6,5 0,092 Ovalbúmina 45.000 13,0 0,186 Gliceraldeh-3-P-DH 36.000 18,0 0,257 Anhidrasa carbónica 29.000 25,0 0,357 Tripsinógeno 24.000 28,5 0,407 Inhibidor de tripsina 20.100 38,0 0,543
-Lactalbúmina 14.200 50,0 0,714 Banda incógnita 44,0 0,623 _____________________________________________________________________
Para la gráfica de los pesos moleculares se recomienda utilizar papel semilogarítmico (X = Rf y y= Log PM). La muestra problema se interpola por regresión lineal en los puntos adecuados.
PM (Kda)
Movilidad Relativa ( Rf)
y = -26.96ln(x) + 3.2352 R² = 0.9636
54
Elaboración de Reactivos.
Elaboración del Gel de Acrilamida al 10% por grupo
GEL SEPARADOR Reactivos Por grupo Por todos los grupos Bis acrilamida 1666 µL 25 mL Trisma base pH 8.8 1875 µL 28 mL Agua 1425 µL 21.3 mL TEMED 5 µL 0.008 mL Persulfato de amonio 25 µL 0.375 mL Dodecil sulfato de sodio (SDS) 150 µL 2.25 mL
GEL CONCENTRADOR Bis acrilamida 1250 µL 19 mL Trisma base pH 6.8 1875 µL 28 mL Agua 4200 µL 63 mL TEMED 7.5 µL 0.12 mL Persulfato de amonio 25 µL 0.39 mL Dodecil sulfato de sodio (SDS) 75 µL 1.1 mL
Preparación de la solución de Acrilamida al 30% Bis acrilamida 8%.
Pesar 15 g de acrilamida y 4 g de Bis-acrilamida. Disolver los reactivos en 15 mL de agua y aforar a 50 mL
Preparación de la solución Trisma base 1.5 M pH 8.8
Disolver 5 g de Tris en poco de agua destilada, ajustar el pH 8.8 y llevar a un volumen de 28 mL
Preparación de la solución Trisma base 0.5 M pH 6.8
Disolver 1.7 g de Tris en un poco de agua destilada, ajustar el pH 6.8 y llevar a un volumen de 28mL
Preparación del persulfato de amonio.
Pesar 12.4 g de persulfato de amonio y disolverlo en 124 mL de agua destilada
Preparacion del Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10 % para un total de 4 mL
Pesar 0.4 Dodecil sulfato de sodio y disolverlo en 4 mL de agua.
55
Solución amortiguadora para las muestras 5x.
Tris 0.226 g
Glicerol 3.75 mL
Azul de Bromofenol 0.25 % 1.5 mL. Para la preparación de Azul de Bromofenol pesar 6.25 mg de azul de Bromofenol y disolver en 2.5 mL de agua.
Pesar y medir cada uno de los reactivos indicados y aforar a un volumen de 7.8 mL.
A cada una de las muestra se le agregara 10 µL de solución amortiguadora
Buffer de corrida
Tris 12.13 g
Glicina 57.63
Dodecil sulfato de sodio 4.0 g
Pesar las cantidades indicadas disolver en un poco de agua y ajustar el pH 8.3 aforar a 1L de agua.
Solución Teñidora de proteínas.
Preparar 100 mL
Preparación de la solución de azul de coomasie al 2 %
Pesar 0.6 g de azul de Coomasie y disolverlos en 30 mL de agua destilada.
Agregar 30 mL de Ácido sulfúrico (H2SO4), mezclar y dejar reposar.
La solución anterior se filtra con papel Whatman no 1 y se le agregan 10 mL de hidróxido de potasio (KOH) 10 N, la solución debe de virar a un color púrpura oscuro.
A esta solución se le agregarán 30 mL de TCA 100% y la solución azul queda lista con un volumen final de 100 mL
56
Resultados Esperados.
1 2 3 4
1 Marcadores de Peso molecular.
2,3,4 Muestras de paciente
57
Aislamiento de Ácidos Nucleicos.
El proceso de aislamiento del ácido desoxirribonucleico (ADN) depende
del tamaño de la muestra y la fuente. Aunque los métodos de extracción
varían en principio comparten algunas de las etapas del proceso de
extracción.
La extracción del ADN es ampliamente utilizada para el análisis genético,
para fines científicos, médicos o forenses. Los científicos usan el ADN para
obtención de genes, análisis y mecanismos de control. Por otra parte, en
el ámbito de la medicina forense es de gran utilidad para la identificación
de cadáveres, como evidencias en delitos y en pruebas de paternidad.
Durante el proceso de aislamiento del DNA, deben ser eliminadas otras
moléculas como las proteínas, lípidos, polisacáridos y en l a medida en la
que todos estos componentes se eliminen se obtendrá un DNA más puro y
la calidad de los ensayos y sus resultados serán más certeros.
El DNA se puede obtener de cualquier muestra y las fuentes de obtención
diversa como la sangre, el cabello, huesos, uñas, saliva, células epiteliales,
orina etc. Al ser tan variada la muestra de la cual se puede extraer el DNA
los métodos de obtención deben ajustarse a la muestra en donde se
encuentra el DNA.
El proceso de aislamiento del DNA comienza con la lisis de tejidos o
células, con los cual se permite la desnaturalización de proteínas,
58
degradación de membranas y liberación de ácido nucleicos. La lisis se
realiza en soluciones contienen sales, detergentes y proteasas. Otras
muestras, como las plantas requieren ser congeladas en nitrógeno
líquidos y posteriormente pulverizadas en polvo fino. O bien en los huesos
debe eliminarse el mineral antes de extraer el DNA. Las soluciones de lisis
contienen por lo general cloruro de sodio, tris, etilendiaminotetra-ácetico
(EDTA), dodecil sulfato de sodio y la proteinasa K. Los compuestos
orgánicos son disueltos en disolventes orgánicos como fenol, cloroformo,
alcohol isoamílico.
La obtención del DNA de muestras obtenidas en hisopos bucales se
procesan en tubos eppendorf y las muestras son sometidas a
desnaturalización con hidróxido de sodio o por ebullición a 100 grados
centígrados, ambos procesos son seguidos de equilibrar el pH de la
solución con amortiguador de acetato de potasio.
59
Elaboración de Reactivos.
Reactivos Por equipo Por todos los grupos Solución SAS* 20 mL 3. 100 L Tris 0.4 M pH 8.5 5 mL 775 mL Lauril sulfato de sodio al 4%
5 mL 775 mL
EDTA salino* 0.5 mL 77. 5 mL Solución CSC* 11 mL 1.70 L Etanol 3 mL 465 Ml *SAS (Tris 0.01 M, Sacarosa 0.3 M, Cloruro de magnesio 0.005M y β-mercaptoetanol 0.005M)
Preparación de la solución Tris (C4H11NO3) 0.01 M
Preparación de la solución de sacarosa (C12H 22O 11) 0.3 M
Preparación de la solución de Cloruro de Magnesio (MgCl2) 0.005 M
Preparación del β-mercaptoetanol (C2H6OS) 0.005 M
Disolver las cantidades indicadas de cada uno de los reactivos en 1.5 L de agua y aforar a 3.1 L de agua destilada
Preparación de la solución Tris (C4H11NO3) 0.4 M pH 8.5
Disolver 37.6 g de Tris en 775 mL de agua. Dependerá del pH inicial que tenga la solución para ajustar este a pH 8.5 con ácido clorhídrico (HCl) o Hidróxido de Sodio (NaOH).
Preparación de la solución de Lauril Sulfato de Sodio (NaC 12 H 25SO 4) al 4%
Pesar 31 g de Lauril Sulfato de sodio (NaC 12 H 25SO 4) y disolverlo en 775 mL de agua destilada.
*EDTA salino (EDTA 0.1 M y Cloruro de sodio 0.15 M pH 8.0)
60
Preparación del EDTA 0.1 M
Preparación de la solución de cloruro de sodio (NaCl) 0.15 M pH 8.0
Disolver las cantidades indicadas de cada uno de los reactivos indicados en 77.5 mL de agua destilada. Determinar el pH inicial de la solución y ajustar el pH con ácido clorhídrico (HCl) o Hidróxido de Sodio (NaOH) según sea el caso.
*CSC (Citrato de sodio 0.15M y Cloruro de sodio 1.5 M)
Preparación de citrato de sodio (C6H5Na3 O7) 0.15 M
Preparación de la solución de cloruro de sodio (NaCl) 1.5 M
Disolver las cantidades indicada de cada uno de los reactivos en 1.7 L de agua destilada
61
Transformación, Aislamiento de Plásmido
y Digestión.
En este laboratorio se realizará transformación genética en cepas de E. coli . La transformación genética ocurre cuando una célula incorpora dentro de ella y expresa un nuevo pedazo de material genético ( DNA). Esta nueva información genética muchas veces provee al organismo de una nueva característica que se puede identificar luego de ocurrida la transformación.
En este laboratorio se utilizará un procedimiento de transformación para incorporar en la bacteria E. coli con un plásmido que contiene el gene que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP). Este gene ha sido extraído de una medusa o “agua viva” que es fluorescente y bioluminiscente, su nombre: Aequorea victoria. La proteína fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, bajo la acción de un inductor específico la bacteria expresa el gene de medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta. En esta actividad se realizará el proceso de mover un gene de un organismo a otro con la ayuda de un plásmido. Las bacteria demás de poseer un cromosoma grande, comúnmente poseen pequeños pedazos circulares de DNA llamados plásmidos (uno o más de estos). El ADN del plásmido usualmente contiene genes para una o más características que pueden ser beneficiosa para la sobre vivencia de la bacteria. En la naturaleza las bacterias pueden transferir plásmidos entre ellas permitiendo así compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. En este ejercicio usted utilizara el plásmido pIVEX que contiene el gene para hacer la GFP. Usted introducirá el pIVEX a la bacteria E coli (C41).
Los plasmidos pIVEX contienen además un gene de resistencia al antibiótico ampicilina (amp). pIVEX también incorpora un sistema especial de regulación genética. Este sistema puede ser usado para el control de la expresión de la proteína fluorescente en células transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en células
62
transformadas al añadir isopropil-β-D-1-tiogalactósido (IPTG) al medio de cultivo donde crecen las células.
Luego de realizar la transformación se crecen las células en medio
LB y en presencia de ampicilina. La ampicilina evita que bacterias no transformadas crezcan en el plato de cultivo. Las colonias de células transformadas aparecen de color blanco en los platos que contienen medio LB y ampicilina. Para inducir la expresión del gene de GFP tenemos que crecer las bacterias en presencia de arabinosa. Las bacterias crecidas en LB con IPTG y con ampicilina se verán fluorescentes de color verde en lugar de blancas.
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Elaboración de Reactivos.
Medio Luria Bertani (líquido).
Reactivo Por equipo Por Grupo Para todos los grupos.
Medio Líquido Luria-Bertani
2mL 20 mL 250 mL
Cloruro de Calcio (1 M)
0.02 0.2 2.5
Medio Líquido Luria Bertani.
Medio Luria- Betani. g/ 250 mL
Triptona 2.5 g
Extracto de levadura 1.25 g
NaCl 1.25 g
CaCl2 CaCl2 (110.98) 1 M esterilizar en autoclave aparte. Pesar 16.64 g de CaCl2 y aforar disolver en 150 mL de agua.
Medio Luria-Bertani / CaCl2.
Procedimiento: Adicionar 1.25 g de Triptona y 0.75 g de extracto de levadura a 250 mL de agua. Esterilizar en autoclave. En condiciones estériles adicionar 2.5 mL de cloruro de calcio (CaCl2).NOTA: Indicar en la etiqueta que se le adicionó calcio.
Medio Luria – Bertani (sólido) g/L
10 g de triptona
5 g de Extracto de levadura
5 g de cloruro de sodio
1 mL de 1N NaOH
15 g de Agar.
Solución Stock Amplicilina ( 1000 x)
Por cada litro de medio adicionar 1 mL de la solución estéril de ampicilina. Nota: se adiciona cuando el medio alcance una temperatura de 45 grados centígrados, se homogeniza la solución y se vierten 20 mL por cada caja petri.
64
Solución Stock IPTG (1000 x)
Por cada litro de medio adicionar 1 mL de la solución estéril de IPTG. Nota: se adiciona cuando el medio alcance una temperatura de 45 grados centígrados; se homogeniza la solución y se vierten 20 mL por cada caja petri.
Reactivo Por equipo Por grupo Por todos los grupos.
Medio LB/sólido 20 mL 200 mL 2.5 L Medio LB/ sólido (Ampicilina + IPTG)
20 mL 200 mL 2.5 L
Ampicilina (1000 x) 20 µL 200 µL 2.5 mL IPTG ( 1000x) 20 µL 200 µL 2.5 mL
65
Aislamiento de Plásmido.
Los plásmidos se encuentran en bacterias y constituyen moléculas de DNA extracromosómico circular y por lo general son estructuras pequeñas. Una de sus características es que se pueden replicar de manera autónoma e independiente del DNA genómico. Aunque no son estructuras necesarias para que la bacterias puedan sobrevivir si son indispensables para conferirles a las bacterias ventajas adaptativas.
Los plásmidos son herramientas en estudios de biología molecular y de ingeniería genética porque se utilizan como vectores de clonación por la sencillez de su estructura. La estrategia en términos generales consiste en clonar un gene de interés en el plásmido, formando un vector recombinante.
Para que los plásmidos puedan ser utilizados como vectores de clonación deben incluir algunas características entre las que se encuentran que contengan su propio origen de replicación, debe poseer sitios de clonación múltiple y un mapa de restricción característico. Se igual forma debe contener marcadores genéticos que permitan seleccionar a las bacterias que contienen al vector recombinante.
Por las propiedades físico-químicas de los plásmidos se procederá a su aislamiento mediante la técnica de hidrólisis alcalina.
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Elaboración de Reactivos.
Medio LB + Ampicilina ( 100 mL). 1.0 g. de triptona. 0.5 g de extracto de levadura 0.5 g de cloruro de sodio
Solución GTE (Glucosa/ Tris/ EDTA)
50 mM Glucosa 25 mM Tris-Cl pH 8.0 10 mM EDTA.
Amortiguador TE
10 mM Tris-Cl pH 7.5 1mM EDTA pH 8.0
Solución de Acetato de Potasio pH 4.8
29.5 mL de ácido acético Pastillas de KOH hasta ajustar el pH 4.8 Aforar con agua a 100 mL. Almacenar a temperatura ambiente no autoclavar.
Etanol 70%. Tomar 90 mL de etanol absoluto y aforar a 300 mL con agua.
Reactivo Por equipo Por grupo Por todos los grupos.
Medio LB/sólido 2.0 mL 20 250 mL NaOH/SDS 200 µL 2000 µL 25 mL Ampicilina (1000 x) 2.0 µL 20 µL 250 µL Acetato de Potasio 150 µL 1500 µL 20 mL Buffer TE 50 µL 500 µL 10 mL Isopropanol 400 µl 4000 µl 60 mL Etanol 70% 200 µL 2000 µL 30 mL
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Digestión y Electroforesis de Plásmido.
Las enzimas de restricción, de denominan también endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de secuencias de reconocimiento, cortan el ácido desoxirribonucleico (DNA) de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
Las endonucleasas fueron descubiertas por Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por lo que en el año 1978 obtuvieron el premio Nobel. Y gracias a sus hallazgos se desarrolló el campo de la tecnología del ADN recombinante.
Se purifican de organismos procarióticos (bacterias), actúan como un mecanismo de defensa, degradan material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
· Existen 3 tipos de enzimas de restricción: 1. Tipo I y Tipo III:
a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modifican (metilan).
b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despúes de la secuencia que reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
68
2. Tipo II: a. Sólo tienen actividad de restricción. b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la
secuencia que reconocen. c. Sólo requieren Mg++ como cofactor. d. No necesitan ATP.
Designación
· Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej:
Eco RI E = género Escherichia co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa
· Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos
de cortes: Rasos o Extremos cohesivos.
Las enzimas de restricción son ampliamente utilizadas en la elaboración
de mapas de restricción de plásmidos, obtención de fragmentos para
ensayos de Southern o Northern Blot. Clonación de Fragmentos.
69
Preparación de Reactivos.
Digestión de Plásmidos.
Reactivos Por grupo Por todos los grupos
1 2 3 4 1 2 3 4
H2O (L) 31 30 30 29 310 300 300 290
Buffer de Digestión
(10x)
4 4 4 4 40 40 40 40
DNA (PIVEX) 5 5 5 5 50 50 50 50
Bgl I (1 U/L) ___ 1 ___ 1 __ 10 ___ 10
Pst I (1 U/L) ___ __ 1 1 ___ ___ 10 10
VOLUMEN TOTAL 40 40 40 40 400 400 400 400
SE SUGIERE QUE SE REALICE LA DIGETIÓN PARA UNA MUESTRA Y SI AL
OBSERVAR EN AGAROSA LA DIGESTIÓN ES ADECUADA, PREPARAR LA DIGESTIÓN
PARA TODA LA GENERACIÓN.
SE SUGIERE INCUBAR 1 HR A 37 GRADOS CENTÍGRADOS.
Electroforesis.
Reactivos Por grupo Por todos los grupos Agarosa 1% 20 mL 300 Bromuro de etidio 10 µg 150 µg Buffer TBE pH 8.2 500 mL 7.5 L
Preparación de agarosa al 1%
Pesar 1 g de agarosa y disolver en 100 mL de Buffer TBE 1x.
Preparación del Buffer TBE 1x para todos los grupos
Tris base 76.5 g
EDTA 6.9 g
Ácido Bórico 41.2 g
Disolver en un poco de agua destilada, ajustar el pH 8.2 y aforar a 7.5 L
70
DIGESTIÓN DE PIVEX
Marcadores:
1.- Hypper ladder I
2.- BglII (lineal)
3.- PstI (lineal)
4.- SalI (lineal)
5.- BglII+PstI (3,385+992 bp)
6.- BglII+SalI (3,402+975 bp)
7.- Sin digerir
71
Titulación de Saliva.
La caries dental es una enfermedad que se produce por las
características inherentes al huésped y a la presencia de los
mircroorganismos de la placa dentobacteriana, lo que conlleva a la
destrucción del diente. Entre los factores involucrados en el desarrollo
de la caries se encuentran los microorganismos, el medio ambiente, la
susceptibilidad del huésped y el tiempo.
Desde hace muchas décadas, el estudio de la saliva ha sido motivo de
gran interés debido a que se ha descubierto que este fluído tiene
propiedades muy importantes que contribuyen a la homeostasis de la
cavidad bucal. Entre las múltiples funciones de la saliva es encuentra su
capacidad para interferir en la adherencia bacteriana y mantenimiento
del pH bucal.
El pH de la cavidad bucal y de la placa dentobacteriana están
relacionados porque la saliva contiene un par ácido – base que le
permite tener una amplia capacidad de amortiguamiento. Entre los
sistemas amortiguadores se encuentra el de bicarbonatos y fosfatos.
Aunque es importante resaltar que la presencia de amoniaco y proteínas
contribuyen a la capacidad amortiguadora. Así mismo a pH ácido los
cristales de hidroxiapatita se disuelven y los individuos son más
propensos al desarrollo de caries.
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Preparación de Reactivos.
Reactivos Por equipo Por todos los grupos
Ácido láctico(H3C-CH(OH)-COOH) 0.05N
25 mL 3.8 L
Hidróxido de sodio (NaOH) 0.05N 25 mL 3.8 L Azul de Bromotimol 10% 0.5 mL 77.5 mL
Preparación de la solución de Ácido láctico 0.05N
Disolver los 17.1 g de Ácido Láctico en 3,8 L de agua destilada.
Preparación de la solución de Hidróxido de sodio (NaOH) 0.05N
Disolver los 7. 6 g de Hidróxido de sodio en 3.8L de agua destilada.
Preparación del azul de Bromotimol al 10%
Pesar 10 g de azul de Bromotimol y disolverlo en 100 mL de agua
73
Cinética de la Lisozima Salival.
La pared celular de las bacterias Gram-positivas está compuesta de un gran número de capas de peptidoglicano, que constituye el 90% de la estructura de las paredes celulares. El peptidoglicano es un polímero
formado unidades alternas de -(1-4)-N-acetil-D-glucosamin y de ácido N-acetilmurámico conformando un polímero lineal y algunas ramificaciones de tetrapéptidos formados por L-alanina, D-glutámico, L-lisina y D-alanina. Los entrecruzamientos de los tetrapétidos permiten la formación de una estructura en forma de malla que rodea la membrana plasmática.
En el caso de los organismos Gram-negativos, la pared está rodeada de una membrana de fosfolípidos presenta algunas otras estructuras como lipopolisacáridos.
Por otra parte, la lisozima es una proteína formada por una cadena
polipeptídica de peso molecular de 143 kD, que hidroliza el enlace (1-4) entre el N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina. Las bacterias Gram-positivas son más susceptibles a la hidrólisis porque presentan paredes muy voluminosas. Las bacterias Gram-negativas son menos susceptibles debido a la presencia de una membrana externa, sin embargo las hidrólisis se puede realizar si las células se tratan con un agente quelante como el ácido etilendiaminotetra-acético (EDTA), ya que quela los iones metálicos de las membrana externa.
La actividad de la lisozima está en función tanto del pH como de la fuerza iónica. El rango de pH de actividad máxima de la enzima se encuentra en el rango de 6 a 9 y en un valor de pH igual 6.2 se presenta su máxima actividad y en lo que se refiere a la fuerza iónica el margen de actividad oscila entre 20 y 100 mM.
Para el procedimiento de lisis de la pared celular es conveniente preparar soluciones de lisozima que contengan 500,000 unidades/mL en 10mM Tris-HCl, pH 8.0
74
La enzima es soluble en agua y estable por un mes en rangos de
temperatura de 2 a 8 grados C . Si se utilizan 25 L de esta solución lisar Escherichia coli de un mL de medio de cultivo que ha sido resuspendido
en 350 L de 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 con 0.1 M NaCl, 1mM EDTA y 5% (p/v) de Tritón x-100. Incubando a 37 grados centígrados por 30 minutos.
75
Preparación de Reactivos:
Preparación del amortiguador de fosfatos 0.1 M pH 7.0
8.0 g de NaCl
0.2 g de KCl
11.5 g de Na2HPO4
2g de KH2PO4
Pesar las cantidades indicadas de cada uno de los reactivos disolver en 500 mL de agua destilada y ajustar el pH 7.0 aforar a 1 L con agua destilada.
Preparación de la solución de cloruro de sodio (NaCl) 0.15M
Reactivos Por equipo Por grupo Amortiguador de fosfatos 0.1 M pH 7.0
41 mL 6.4 L
NaCl 0.15 M 6 mL 930 mL Lisozima 0.5 mL 77.5 mL
76
Relación de la caries con las unidades formadoras de colonias de
Lactobacillus acidophillus en saliva.
Una meta importante en los trabajadores de la salud es la prevención de enfermedades y el ámbito de la odontología no es la excepción. El riesgo de que ocurra la caries en la población mexicana es elevada.
La evaluación de la probabilidad de que la población desarrolle caries requiere de la vigilancia permanente en la salud dental. Lo que conlleva a la identificación de pacientes que requieren de servicios preventivos así como la detección temprana de los individuos que tengan alto de desarrollar la caries. La ventaja de detectar a tiempo la caries se refleja tanto en términos de salud bucal como en la economía.
Por lo que apenas resulta necesario hallar métodos predictivos que permitan la identificación de individuos con alto riesgo de desarrollar caries dental, y de esta forma aplicar medidas preventivas. De igual manera abocarse en el cuidado más intensivo para el grupo de alto riesgo.
Entre los estudios se han realizado, se encuentran los hábitos dietéticos, el control de placa, pruebas bacteriales. Son estas últimas las buscan relacionar la incidencia de la caries con las unidades formadoras de colonias de microorganismos altamente cariogénicos a saber Streptococcus mutans y Lactobacillus.
77
Preparación de Reactivos.
Medios de Cultivo Bacteriano
Por equipo Por todos los grupos
Medio Bacto mitis salivarius
2 caja Petri con 20 mL de medio
310 cajas petri con 20 mL de medio
Medio de cultivo Rogosa 2 cajas Petri con 20 mL de medio
310 cajas petri con 20 mL de medio
Preparación de Medio de Bacto mitis salivarius 1L, el cual alcanzará para preparar 40 cajas por grupo.
Bacto triptona………..10 g
Bacto peptona………….5g
Bacto dextrosa………….1g
Bacto sacarosa……….50g
Dipotasa………………….4g
Tripan azul……..0.0075g
Cristal violeta...0.0008 g
Bacto agar……………..15g
pH final 7.0
Disolver en 1L de agua destilada y agregar 150 g de sacarosa (enriquece el medio).
Calentar el medio hasta que se disuelva, al calentar cuidar que este no hierva por que tiende a desparramarse
Esterilizar 15 minutos a una presión de 15 libras y una temperatura de (121-124°C)
Cuando alcance una temperatura de 45 °C adicionar 1 mL de telurito- Bacitracina.
Vaciar 20 mL de medio por cada caja petri, dejar que solidifique y guardar en el refrigerador hasta que sean usadas.
Preparación Medio de cultivo Rogosa
Bacto triptona…………………10 g
Extracto de levadura…………5 g
Bacto dextrosa…………………10 g
Bacto arabinosa………………..5 g
78
Bacto sacarosa…………………..5 g
Acetato de sodio……………….15 g
Citrato de amonio……………..2 g
Fosfato monobásico…………..6 g
Sulfato de magnesio……...0.57 g
Sulfato ferroso………………0.03 g
Monoelato de sorbitol…………1 g
Bacto agar……………………….15 g
pH final 5.4
Por cada 1000 mL, de agua bidestilada, se agregan 75 g del medio Rogosa.
Se homogeniza en un agitador magnético y se calienta hasta hervir.
Se deja enfriar a 45 °Cy se adicionan 1.32 mL de ácido acético y se vuelve a hervir de 2 a 3 minutos.
Vaciar en cajas petri 20 mL de medio, dejar que solidifique y guardar en el refrigerador hasta que sean usadas
79
Operón de Lactosa de
Lactobacillus acidophillus
En la década de los sesenta gracias a las valisas investigaciones
realizadas por Francis Jacob y por Jaques L. Monod nos permitieron
aclarar que la síntesis de proteínas no esta circunscrita al RNA
ribosómico. Estos investigadores predijeron que las células tenían un
RNA mensajero que se sintetizaba a partir de un DNA que actuaba como
molde.
Jacob y Monod utilizaron como modelo de estudio a la bacteria
Escherichia coli y el objetivo de su estudio consistió en determinar como
las bacterias degradaban el carbohidrato lactosa como fuente de
carbono. Encontraron que el metabolismo de lactosa estaba controlado
por tres enzimas y que los genes que codificaban para estas proteínas
están agrupados en forma consecutiva en le genoma bacteriano. A este
conjunto de genes se les denominó operón.
Los elementos del Operón Lac está constituido por tres genes
estructurales.
Gen lac z: codifica para la enzima -galactosidasa, cuya función es la
catálisis de la lactosa en glucosa y galactosa.
Gen lac y: codifica para el transportador denominado galactósido
permeada, cuya función es el ingreso de -galactósidos en el citoplasma
bacteriano.
80
Gen lac a: codifica para la enzima tiogalactósido transferasa, que cataliza
la transferencia de grupo acetil del acetil Coenzima A al grupo hidroxilo
en posición 6 de un aceptor tiogalactósido.
Así mismo en el operon, encuentran otras regiones que funcionan en la
regulación de la transcripción.
Promotor: región del DNA, precedente a los genes estructurales y es el
sitio de reconocimiento de la RNA polimerasa para llevar a cabo la
transcripción.
Operador: región del DNA localizada ente el promotor y el comienzo de
los genes estructurales. Es el sitio de reconocimiento de la proteína
represora Lac I.
Gen represor: llamado también lac I, codifica para la proteína represora
Laci I, esta proteína reconoce a la región operadora e impide la
transcripción de los genes que están bajo el control de este promotor
pero estimula la unión de la RNA polimerasa formando un Complejo
Cerrado. El represor se retira en presencia del inductor que es la lactosa ,
lo que ocasiona que RNA polimerasa forme un Complejo Abierto y de
esta forma iniciar la transcripción.
81
Preparación de Reactivos.
Reactivos Por equipo Por todos los grupos
Solución de glucosa al 10% 1 mL 155 mL Solución de lactosa al 10% 1 mL 155 mL Solución de sorbitol al 10% 1 mL 155 mL Buffer de fosfatos pH 7 1 mL 155 mL SDS al 1% 0.5 mL 77.5 mL Cloroformo 0.5 mL 77.5 mL o-nitrofenil-β-galactosido al 1% 0.5 mL 77.5 mL Carbonato de sodio (Na2CO3) 1M
1 mL 155 mL
Preparación de la solución de Glucosa al 10%
Pesar 15.5 g de glucosa y disolverlos en 155 mL de agua destilada
Preparación de la solución de Lactosa al 10%
Pesar 15.5 g de lactosa y disolverlos en 155 mL de agua destilada
Preparación de la solución de sorbitol al 10%
Pesar 15.5 g de sorbitol y disolverlos en 155 mL de agua destilada
Preparación del Buffer de fosfatos pH 7 Preparación de la solución Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) al 1%
Pesar 0.775 g de Dodecil Sulfato de Sodio y disolver en 77.5 mL de agua destilada.
Preparación de o-nitrofenil-β-galactosido al 1%
Pesar 0.775 g de o-nitrofenil-β-galactosido y disolver en 77.5 mL de agua destilada.
Preparación del Carbonato de sodio (Na2CO3)1 M
Pesar la cantidad indicad de reactivo y disolverlo en 155 mL de agua destilada.
82
Ficha de Bioseguridad.
Acido Clorhídrico. ( HCl )
83
84
85
86
Hidróxido de Sodio ( NaOH)
87
Hidróxido de Sodio ( NaOH )
88
89
90
91
Ninhidrina
92
93
94
95
96
Bromuro de Etidio.
97
98
Términos y Definiciones:
Ácido Débil: se disocia sólo parcialmente y en el equilibrio, existen en la solución tanto
el ácido como su base conjugada.
Ácido Fuerte: se disocia completamente en agua; un mol de un ácido fuerte HA se
disuelve en agua produciendo un mol de H+ y un mol de su base conjugada, A-, y nada
del ácido protonado HA.
Ácido según Arrhenius: sustancia que aumenta la concentración de catión hidronio,
H3O+, cuando se disuelve en agua.
Ácido según Bronsted – Lowry: es una especie que dona un protón a una base.
Ácido según Lewis: especie que acepta un par de electrones de otra especie; es un
aceptor de par de electrones.
Acidos nucléicos: biomoléculas formadas por macropolímeros de nucleótidos, o
polinucleótidos. Está presente en todas las células y constituye la base material de la
herencia que se transmite de una a otra generación. Existen dos tipos, el ácido
desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucléico (ARN).
ADN = Acido Desoxirribonucleico: ácido nucleico formado por nucleótidos en los que el
azúcar es desoxirribosa, y las bases nitrogenadas son adenina, timina, citosina y
guanina. Excepto en los retrovirus que tienen ARN, el ADN codifica la información para
la reproducción y funcionamiento de las células y para la replicación de la propia
molécula de ADN. Representa la copia de seguridad o depósito de la información
genética primaria, que en las células eucarióticas está confinada en la caja fuerte del
núcleo.
ADN desnudo: ADN desprovisto de cubierta proteínica o lipídica. Para la transferencia
de genes, suele estar constituida por un plásmido bacteriano que contiene el gen a
transferir. Se inyecta directamente en el tejido objetivo donde se expresa generalmente
sin integrarse en el genoma de las células huésped.
Alícuota: fracción exacta de una solución cuyo volumen se conoce también con
precisión.
Aminoácido: molécula orgánica que contiene los grupos amino y carboxilo. Son los
99
monómeros de las proteínas. De su diversidad como del enorme número de
combinaciones y longitudes resulta la enorme variedad de proteínas existentes.
Analito: Son especies químicas cuya presencia o concentración se desea conocer. El
analito es una especie química que puede ser identificado y cuantificado, es decir,
determinar su cantidad y concentración en un proceso de medición química, constituye
un tipo particular de mensurando en la metrología química.
Biología Molecular: parte de la biología que trata de los fenómenos biológicos a nivel
molecular. En sentido restringido comprende la interpretación de dichos fenómenos
sobre la base de la participación de las proteínas y ácidos nucleicos.
Conjugación bacteriana: Transmisión de caracteres genéticos de una bacteria a otra,
de una «donante» o «macho» a una bacteria «aceptora» o «hembra» (Hayes). La
presencia en una bacteria de una variedad de plásmido, el factor F, afirma el carácter
"macho” de esta bacteria. Conceptos relacionados: plásmido, factor F, factor R.
Constante de Equilibrio: K es una expresión de las concentraciones del equilibrio de las
moléculas o iones en solución.
Cromatografía: es un método muy utilizado en todas las ramas de la ciencia y que
permite la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en
mezclas complejas.
Cromatograma. gráfico que analiza los compuestos que se separan por cromatografía.
Enzimas de restricción: enzimas bacterianas sintetizadas como reacción defensiva
frente ala invasión de ADN extraño, como, por ejemplo, bacteriófagos ADN, a los que
degrada mientras que el propio está protegido por metilaciones específicas. Cada una
de estas enzimas escinden el ADN siempre en el mismo sitio, en loci específicos o
secuencias objetivo. Son las tijeras de la ingeniería genética que abrieron las puertas a
la manipulación genética.
Estandarización o normalización: proceso mediante el cual se determina la
concentración a la solución estándar. Se utiliza para titular una muestra de patrón
primario.
exactitud; se mide con una pipeta.
Exones: secuencias de ADN específicas de genes, que codifican secuencias de
aminoácidos en las proteínas.
100
Gen operador: el que pone en funcionamiento el gen estructural.
Gen regulador: el que modifica la acción del operador.
Gen represor: el que reprime el operador.
Gen: unidad física y funcional del material hereditario que determina un carácter del
individuo y que se transmite de generación en generación. Su base material la
constituye una porción de cromosoma (locus) que codifica la información mediante
secuencias de ADN.
Genoma: conjunto de todos los genes de un organismo, de todo el patrimonio genético
almacenado en el conjunto de su ADN o de sus cromosomas.
Huésped: animal o vegetal que alberga o nutre otro organismo (parásito). En
manipulación genética, organismo de tipo microbiano, animal o planta cuyo
metabolismo se usa para la reproducción de un virus, plásmido o cualquier otra forma
de ADN extraño a ese organismo y que incorpora elementos de ADN recombinado.
Indicador: reactivo auxiliar que exhibe un cambio como consecuencia de los cambios
en concentración de las especies químicas.
Intrones: secuencias de ADN que no codifican genes y cuya función es desconocida. El
90% del genoma humano no es codificante.
Kilobase (Kb): unidad empleada para medir la longitud de los fragmentos de ADN
constituidos por una serie de bases. 1 Kb = 1.000 bases.
Manipulación genética: formación de nuevas combinaciones de material hereditario
por inserción de moléculas de ácido nucleico, obtenidas fuera de la célula, en el interior
de cualquier virus, plásmido bacteriano u otro sistema vector fuera de la célula. De esta
forma se permite su incorporación a un organismo huésped en el que no aparecen de
forma natural pero en el que dichas moléculas son capaces de reproducirse de forma
continuada. Al referirse al proceso en sí, puede hablarse de manipulación genética,
ingeniería genética o tecnología de ADN recombinante. También admite la
denominación de clonación molecular o clonación de genes, dado que la formación de
material heredable puede propagarse o crecer mediante el cultivo de una línea de
organismos genéticamente idénticos.
Ninhidrina: La ninhidrina es el hidrato de tricetohidrindeno, y es un oxidante muy
fuerte que provoca la descarboxilación oxidativa y desaminación del aminoácido,
formando el aldehído correspondiente, CO2, amonio y una forma reducida de la
101
ninhidrina llamada hidrindantina.
Nucleósido: combinación de un azúcar pentosa con una base nitrogenada púrica o
pirimidínica.
Nucleótido: monómero de los ácidos nucleicos, integrado por la combinación de una
base nitrogenada (purina o pirimidina), un azúcar (ribosa o desoxirribosa) y un grupo
fosfato. Se obtiene como producto de la hidrólisis de ácidos nucleicos por acción de
nucleasas.
Operador: segmento especial del DNA adyacente al promotor que forma parte de la
región controladora de la transcripción de un operón. El operador interacciona con la
proteína represora regulando de esta manera el proceso de la transcripción
sincronizada del operón correspondiente.
Operón: conjunto del gen operador con los genes estructurales que controla la
expresión de genes.
Plásmido: moléculas formadas de ADN se naturaleza extracromosómica, de forma
circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico.
Plásmido: forma no celular de vida, fragmento circular de ADN bicatenario que
contienen unos cuantos genes y se encuentran en el interior de ciertas bacterias.
Actúan y se replican de forma independiente al ADN bacteriano y pueden pasar de
unas bacterias a otras. Igual que los provirus no producen enfermedades pero inducen
pequeñas mutaciones en las células. Se utilizan como vectores en manipulación
genética.
Proteína: biomoléculas formadas por macropolímeros de aminoácidos, o
macropolipéptidos. Actúan como enzimas, hormonas y estructuras contráctiles que
atribuyen a los organismos sus propias características de tamaño, potencial
metabólico, color y capacidades físicas.
Punto de equivalencia: momento en que se completa la reacción entre el analito y el
titulante, se completa la reacción.
Punto final: momento en que se juzga que se completó la reacción entre el titulante y
el analito, se observa un cambio asociado al punto de equivalencia.
Solución estándar o patrón: solución de concentración conocida. Es estable, reacciona
con el analito en forma rápida, completa y selectiva.
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Tiempo de retención en cromatografía: en la cromatografía: tiempo que transcurre
después de la inyección de la muestra hasta que el pico de concentración del analito
alcanza el detector; es el tiempo que tarda un compuesto en salir de la columna; es el
tiempo que tarda en aparecer el máximo de un pico.
Tiempo Muerto en Cromatografía: tiempo necesario para que la especie no retenida
alcance el detector; es el tiempo de migración de la especie no retenida; es el tiempo
necesario para que, por termino medio, una molécula de la fase móvil pase a través de
la columna.
Titulación directa: se añade titulante hasta que la reacción se completa.
Titulación en retroceso: la muestra se trata con un exceso de solución de
concentración conocida y luego con otra solución patrón se determina el exceso
Transformación Bacteriana:
Transformación bacteriana: uno de los procesos naturales de transferencia de material
genético de una bacteria a otra, junto con la conjugación y la transducción, que es una
integración directa del ADN. experimentalmente consiste en hacer penetrar un
fragmento de ADN en una bacteria para provocar en ella una recombinación genética.
Por extensión (abusiva) se habla a veces de transformación para designar un proceso
idéntico que afecta a las células eucarióticas (levaduras, células animales y vegetales).
Valoración o titulación: proceso en el que se determina el volumen de solución
estándar que reacciona con el analito.
Vector: portador, que transfiere un agente de un huésped a otro. Sistema que permite
la transferencia, la expresión y la replicación de un ADN extraño en células huésped
para una posterior clonación o transgénesis. Se trata de una molécula de ADN
(plásmido bacteriano, microsoma artificial de levadura o de bacteria) o de un virus
defectuoso. Por extensión, un vector designa todo sistema de transferencia del gen, por
ejemplo, un sistema sintético como el de los liposomas.
Volumetría: Es la parte del análisis que se basa en la reacción entre volúmenes de dos
soluciones, una de las cuales es de concentración conocida.
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