genoma peces

Genmica de especiespisccolasInforme de Vigilancia Tecnolgica

Sector agroalimentario

Genmicade especies pisccolasInforme de VigilanciaTecnolgica

4GENMICA DE ESPECIES PISCCOLAS

El presente informe de Vigilancia Tecnolgica ha sido

realizado en el marco del convenio de colaboracin

conjunta entre Genoma Espaa y la Fundacin General

de la Universidad Autnoma de Madrid (FGUAM), entidad

que gestiona el Crculo de Innovacin en Biotecnologa

(CIBT), perteneciente al Sistema de Promocin Regional

de la Innovacin MADRID+D.

Los autores de este informe agradecen la colaboracin

ofrecida por toda la comunidad cientfica y empresarial

para la realizacin de este informe, en especial a:

- D. Mar Ajubita, D. Isabel Cano, D. David Muoz

y D. Carlos Buergo (Phyllum).

- Dra. Carmen Amaro (Univ. de Valencia).

- Dr. Julio Coll (INIA).

- Dra. Mara Amparo Estepa (Univ. Miguel Hernndez).

- Dra. Rosa Flos (Centro de Referencia en Acuicultura

de la Generalitat de Catalunya).

- Dra. Alicia Gibello (Univ. Complutense de Madrid).

- Dr. Miguel Jover (Univ. Politcnica de Valencia).

- Dr. Victoriano Mulero (Univ. Murcia).

- Dr. Lluis Tort (Univ. Autnoma de Barcelona).

- Dr. Alberto Villena (Univ. de Len).

- Dr. Jos Antonio Snchez (Univ. de Oviedo).

- Dra. Sara Isabel Prez (CIB-CSIC).

La reproduccin parcial de este informe est autorizada

bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando:

Genmica de Especies Pisccolas. GENOMA ESPAA/

CIBT-FGUAM.

Genoma Espaa no se hace responsable del uso que se

realice de la informacin contenida en esta publicacin. Las

opiniones que aparecen en este informe corresponden a los

expertos consultados y a los autores del mismo.

Copyright: Fundacin Espaola para el Desarrollo

de la Investigacin en Genmica

y Protemica/ Fundacin General de la Universidad

Autnoma de Madrid

Autores: Marta Lpez (CIBT)

Paloma Mallorqun (CIBT)

Miguel Vega (Genoma Espaa)

Edicin: Silvia Enrquez (Genoma Espaa)

Referencia: GEN-ES03003

Fecha: Noviembre 2003

Depsito Legal: M-54061-2003

ISBN: 84-607-9254-4

Diseo y realizacin: Spainfo, S.A.

ndice de contenido

RESUMEN EJECUTIVO 7

1. INTRODUCCIN A LA GENMICA Y PROTEMICA 8

2. INTRODUCCIN A LA ACUICULTURA 9

2.1. Definicin de acuicultura. 92.2. El estado mundial de la acuicultura. 10

3. ESPECIES PISCCOLAS CULTIVADAS EN ESPAA 13

3.1. Produccin de las especies pisccolas cultivadas en Espaa. 143.2. Distribucin geogrfica de las actividades de acuicultura en Espaa. 173.3. Actividades de I+D en acuicultura en Espaa. 18

4. APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGA EN LA ACUICULTURADE ESPECIES PISCCOLAS 20

4.1. Secuenciacin. 204.2. Genmica funcional. 244.3. Vacunas. 254.4. Seleccin Asistida por Marcadores. 334.5. Transgnesis. 364.6. Embriognesis y Clulas madre. 48

4.7. Clonacin reproductiva de peces. 494.8. Produccin de protenas. 504.9. Tecnologa de la PCR. 524.10. Tcnicas de control del sexo. 554.11. Probiticos. 56

5. ESPECIES PISCCOLAS CULTIVADAS EN TERRITORIO ESPAOL 57

5.1. Dorada. 575.2. Lubina y besugo. 575.3. Salmn. 585.4. Rodaballo. 585.5. Atn rojo. 595.6. Lenguado. 595.7. Trucha. 60

5.8. Anguila. 615.9. Esturin. 615.10. Tenca. 625.11. Tilapia. 625.12. Otras especies pisccolas de posible inters para la acuicultura espaola. 63

5

GENMICA DE ESPECIES PISCCOLAS

6. EL SECTOR EMPRESARIAL EN LA ACUICULTURA ESPAOLA 66

6.1. Estructura organizativa del sector de la acuicultura en Espaa. 686.2. Condicionantes de la acuicultura espaola. 69

7. LEGISLACIN RELACIONADA CON LA ACUICULTURA 72

8. EVALUACIN DE LAS CAPACIDADES TECNOLGICAS ESPAOLAS 75

9. EJEMPLOS DE GRUPOS DE INVESTIGACIN ESPAOLESEN GENMICA DE ESPECIES PISCCOLAS 76

10. CONCLUSIONES 83

11. ANEXOS 85

Anexo I: Proyectos de investigacin en Espaa sobre biotecnologa aplicada al cultivo de especies pisccolas. 85

Anexo II: Patentes publicadas o solicitadas en Espaa sobre biotecnologa aplicada al cultivo de especies pisccolas. 95

Anexo III: Clasificacin de empresas de acuicultura en Espaa por especie cultivada. 96

12. REFERENCIAS 100

GLOSARIO 104

6

La importancia de la acuicultura crece cada aodebido a la disminucin de las reservas de pescamundiales y al incremento de la demanda de losproductos del mar. Espaa posee una ampliaextensin litoral y fluvial que le han permitido, enlas dos ltimas dcadas, lograr un puestocompetitivo en la acuicultura mundial, si bienciertas amenazas se divisan sobre el horizonte.Las especies pisccolas con mayor produccin enEspaa son la trucha arcoiris, la dorada, la lubina,y el rodaballo.

No cabe duda que las tcnicas genmicas yprotemicas suponen uno de los determinantespara el desarrollo de esta industria. Algunas de lasaplicaciones mas claras son: el diseo de vacunasms efectivas que disminuyan la mortalidad de lospeces por enfermedades infecciosas y eviten laadministracin de medicamentos costosos y pocoefectivos; la caracterizacin de marcadoresgenticos asociados a caractersticas de interscomercial, que permita la seleccin dereproductores que tuvieran en su ADN lascaractersticas deseadas; las tcnicas detransgnesis que han demostrado sus aplicacionesen el diseo de peces resistentes a enfermedadesy a condiciones ambientales adversas, o cuyocrecimiento y maduracin han sido modificadoscon el fin de conseguir ejemplares mayores enmenor tiempo; y por ltimo la identificacin deespecies y la deteccin temprana de patologas.

El rodaballo es actualmente la especie con mayorproduccin acucola en Espaa, mientras que laproduccin de lubina y la dorada han sufrido unduro revs debido a la competitividad procedentede otros pases europeos.

La especie de mayor inters para la acuiculturaespaola es el lenguado, que posee grandesexpectativas de mercado si se consigue solventaralgunos de los problemas que en estos momentosdificultan su cultivo.

Como parte de la elaboracin del presenteinforme, se ha realizado un anlisis de laproduccin cientfica y tecnolgica espaola en elcampo de la biotecnologa aplicada a especiespisccolas. El resultado de dicho anlisis pone demanifiesto que el importante esfuerzo pblicorealizado (en trminos de financiacin) en losltimos aos no ha producido retornos apreciablesa la industria ni ha mejorado nuestra posicincientfica. Algunas de las causas de esta situacinse encuentran en la falta de coordinacin entre losgrupos de investigacin, la realizacin deproyectos en especies o con objetivos que carecende inters para nuestra industria y la escasafinanciacin privada para acometer investigacinen genmica de peces.

A la vista de las importantes inversiones que estnrealizando pases competidores como Chile oNoruega, no es atrevido vaticinar que Espaapodra seguir perdiendo capacidad competitiva eneste sector. La nica forma de lograr competir conxito radica en incrementar el valor de nuestraproduccin final, objetivo que puede lograrse por,entre otras, la aplicacin de nuevas tecnologascomo la genmica. Bajo esta creencia, GenomaEspaa junto con grupos cientficos, empresasprivadas espaolas, administraciones y sociosinternacionales, como Genoma Canad, ha puestoen marcha uno de los proyectos ms estratgicos,y ms ambiciosos, nunca establecido en nuestropas, sobre genmica de peces.

7


Resumen ejecutivo

La Genmica y la Protemica son dos de lastecnologas que ms inters estn despertando enlos ltimos aos. Sin embargo, todava existecierta confusin respecto a los mbitos de accinde ambas tecnologas. Mientras que la Genmicatrata el estudio del genoma en su conjunto, laProtemica se basa especficamente en el anlisisde las protenas codificadas por el genoma.

El objetivo de este informe es revisar lastecnologas biolgicas en general, y la genmica yprotemica en particular que permiten una mejoraen el cultivo de especies pisccolas marinas o deagua dulce. Por este motivo, y aunque en el textose haga referencia a esta prctica comoacuicultura en general, nos centraremos tan soloen el cultivo de peces o piscicultura.

8

1. Introduccin y objetivos del informe

2.1. Definicin de acuicultura

El trmino acuicultura engloba todas las actividades que tienen por objeto la produccin, desarrollo ycomercializacin de organismos acuticos, animales o vegetales, de aguas dulces o saladas1. Esto implica elcontrol de las diferentes etapas de su desarrollo, proporcionando a los organismos los medios adecuadospara su reproduccin, crecimiento, desarrollo y engorde.

Existe una gran variedad de trminos que se aplican indistintamente para referirse al desarrollo de prcticasde acuicultura. Sin embargo, existe una divisin de dichas actividades que se corresponden con lafragmentacin del mercado de los productos cultivados. De esta forma, podemos hablar de Marcultura oMaricultura para referirnos cultivos en agua marina, mientras que la Acuicultura continental se trata de unaacuicultura de agua dulce.

9


La acuicultura es la cra y cultivo de los organismos acuticos, ya sean peces, moluscos, crustceos oplantas acuticas. El cultivo implica algn tipo de intervencin en el proceso para incrementar laproduccin, por ejemplo el almacenamiento regular, la alimentacin, la proteccin contra losdepredadores, etc. El cultivo implica tambin la propiedad individual o colectiva del stock explotado.Con fines estadsticos, los organismos acuticos que son recolectados por un individuo o un colectivoque los ha tenido durante el periodo de cultivo contribuyen a la acuicultura, mientras que losorganismos acuticos que son explotables por todos como recurso de propiedad pblica, con o sinlicencia apropiada, constituyen la cosecha de las pesqueras.(FAO, 1997).

DEFINICIN DE ACUICULTURA SEGN LA FAO2

2. Introduccin a la acuicultura

1 Barnabe, G. (1990). Aquaculture. Ellis Horwood Books in Aquaculture and Fisheries Support. Ellis Horwood Ltd.2 FAO (1999). Desarrollo de la Acuicultura. FAO Orientaciones Tcnicas para la Pesca Responsable 5.

10

2.2. El estado mundial de la acuicultura

Durante el ao 2000, la produccin total en acuicultura, incluyendo plantas acuticas, fue de 46 millones detoneladas en peso y de un valor de 56.500 millones dlares. Cabe destacar que China fue responsable del71% de la produccin, y del 50% del valor total. Excluyendo a las plantas acuticas, China como principalpas productor en acuicultura obtuvo un volumen de produccin de 24,6 millones de toneladas durante elao 2000, mientras que en el resto del mundo esta cifra se reduce a 11 millones de toneladas.

Segn datos proporcionados por la FAO, en el ao 2000 ms de la mitad de la produccin acucola mundialproceda de aguas marinas y salobres. No obstante, se ha registrado un mayor crecimiento en los ltimos30 aos en la produccin acucola de agua dulce3.

3 El estado mundial de la pesca y la acuicultura (2002). FAO. (http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s00.htm).4 Gonzlez Laxe, F. (2001). Avances en el desarrollo de la acuicultura marina. Instituto de Estudios Econmicos Fundacin

Pedro Barri de la Maza.5 El estado mundial de la pesca y la acuicultura (2002). FAO. (http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s00.htm).6 Igor I. Solar. Biotecnologa Aplicada a la Acuicultura. Aquanoticias, 6-10. Dic. 2001-Ene. 2002.

Aguas continentales

PRODUCCIN ACUCOLA MUNDIAL

China

China

Mundial,con exclusin de China

Mundial,con exclusin de China

Aguas marinas

16

12

8

4

0

1970 1980 1990 2000

Millones de toneladas Millones de toneladas

16

12

8

4

0

1970 1980 1990 2000

A diferencia de la pesca de captura, el ritmo decrecimiento de la acuicultura a nivel mundial se havalorado en un 7,2%4 en los ltimos 30 aos,siendo China el pas con mayor crecimiento deproduccin, en torno al 11%5. Segn estos datos,la acuicultura crece con mayor rapidez que todoslos dems sectores de produccin de alimentos deorigen animal. El aumento de la produccin enacuicultura es en parte debido a la gran diversidadde especies acuticas que pueden adaptarsefcilmente a diversas condiciones de produccinen distintas regiones del mundo.

Adems, si tenemos en cuenta que la poblacinmundial experimenta una expansin continua, quesegn Naciones Unidas alcanzar los 8 milmillones en el ao 2025, y que las reservas depesca se aproximan a su vez a su lmite biolgico,umbral que se estima se alcanzar en el ao20406, la acuicultura representa una ms queinteresante oportunidad de negocio.

Fig. 1. Produccin acucola mundial en aguas marinas y continentales. Fuente: El estado mundial de la pesca y la acuicultura. 2002. FAO (http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s00.htm).

La consideracin de series estadsticas desde el ao 1996 sobre produccin y consumo de pescado a nivelmundial, arroja un importante aumento tanto de las producciones acucolas como del consumo de pescadopor persona y da, as como estancamiento de las capturas marinas.

11


1996 1997 1998 1999 2000 2001*

(millones de toneladas)

PRODUCCIN

CONTINENTAL

Captura 7,4 7,5 8,0 8,5 8,8 8,8

Acuicultura 15,9 17,5 18,5 20,1 21,4 22,4

Continental total 23,3 25,0 26,5 28,6 30,2 31,2

MARINA

Captura 86,1 86,4 79,3 84,7 86,0 82,5

Acuicultura 10,8 11,1 12,0 13,3 14,2 15,1

Marina total 96,9 97,5 91,3 98,0 100,2 97,6

Captura total 93,5 93,9 87,3 93,2 94,8 91,3

Acuicultura total 26,7 28,6 30,5 33,4 35,6 37,5

Total de la pesca mundial 120,2 122,5 117,8 126,6 130,4 128,8

UTILIZACIN

Consumo humano 88,0 90,8 92,7 94,4 96,7 99,4

Usos no alimentarios 32,2 31,7 25,1 32,2 33,7 29,4

Poblacin (miles de millones) 5,7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,1

Suministro de pescado comoalimento por persona (kg)

15,3 15,6 15,7 15,8 16,0 16,2

Con exclusin de las plantas acuticas.* Estimacin preliminar.

PRODUCCIN PESQUERA MUNDIAL Y SU UTILIZACIN

Tabla 1. Produccin pesquera mundial y su utilizacin (Fuente: El estado mundial de la pesca y la acuicultura. 2002. FAO)(http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s00.htm).

12

Los datos relativos a la produccin de Acuicultura procedentes de los Estados miembros de la Unin Europeadurante el ao 2000 indican una aportacin de tan solo el 1,1% en acuicultura continental, y un 7,24% enacuicultura marina. Otro dato relevante es la disminucin en la produccin de acuicultura continental ypesca en comparacin con los datos referentes al ao 1996.

PRODUCCIN PESQUERA DE LA UNIN EUROPEA,BALANCE DE ALIMENTOS Y COMERCIO

2000199619921988

Produccin de la acuicultura

Continental (miles de Tm) 195 226 250 240

Porcentaje del total mundial 2,7 2,4 1,6 1,1

Marina (miles de Tm) 714 686 889 1 049


Produccin de la pesca

Continental (miles de Tm) 97 96 104 86


Marina (miles de Tm) 7.037 6.570 6.507 5.861


Produccin de la pesca y la acuicultura

Suma total (miles de Tm) 8.043 7.578 7.750 7.236


Balance de alimentos

Suministro alimentario total (millones de Tm) 7.795 8.358 8.805

Suministro per cpita (kg) 21,5 22,7 23,5

Proporcin del pescado en las protenas animales (%) 9,3 9,9 10,3

Comercio de productos pesqueros

Importaciones totales (millones $) 12.261 17.270 19.352 19.609


Exportaciones totales (millones $) 6.400 8.580 11.000 11.398


Tabla 2. Produccin pesquera de la Unin europea, balance de alimentos y comercio (Fuente: El estado mundial de lapesca y la acuicultura. 2002. FAO) (http://www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s00.htm).

Espaa es uno de los pases con mayor consumo de pescado en el mundo, segn datos pertenecientes alao 1995 Espaa importaba una media de un milln de toneladas de pescado por ao. La produccinacucola nacional se encuentra en el orden de 0,25-0,3 millones de toneladas anuales7. El mejilln, la truchaarcoiris, la dorada, la lubina y el rodaballo, son las especies de mayor produccin en Espaa.

Las caractersticas geogrficas de Espaa, con gran extensin de litoral aunque con un limitado nmero debahas, e importantes ncleos urbanos y tursticos en la costa, obligan a realizar la mayor parte de lasactividades de acuicultura en mar abierto8.

13


3. Especies pisccolas cultivadas en Espaa

Disminucin de capturas.

Dimensin del mercado espaol.

Cambio de hbitos alimenticios.

Tendencia a mayor elaboracin de los productos.

La costa y su climatologa.

Mejora en la eficacia del sistema de transportes.

Apoyo IFOP9.

Nmero suficiente de empresas con tamao y tecnologa adecuada, la calidad de sus productos ysu conocimiento sobre los mercados locales.

PRINCIPALES ASPECTOS QUE FAVORECEN LAS EXPECTATIVASDE CRECIMIENTO DE LA ACUICULTURA MARINA PISCCOLA EN ESPAA

(Fuente: Acuicultura [1999] Documentos COTEC sobre necesidades tecnolgicas).

7 Coll Morales, J. (2002). Development of Aquaculture in Spain. Aquaculture Europe 33, 3-8.8 11 Acuicultura (1999). Documentos COTEC sobre necesidades tecnolgicas.9 IFOP: Instrumento Financiero de Orientacin de la Pesca http://europa.eu.int/scadplus/leg/es/lvb/l60017.htm

3.1. Produccin de lasespecies pisccolascultivadas en Espaa

Las especies con produccin de al menos 10.000toneladas por ao son el mejilln, la truchaarcoiris, la dorada, el rodaballo y la lubina. Estaproduccin significa ms del 18% de la pescaespaola, el 25% de la acuicultura de Europa y el3% de la acuicultura del mundo. Espaa continasiendo el mayor productor de mejilln con unporcentaje del 32,7% del total mundial, y uno de

los principales en el cultivo de la trucha, con un7,1% del total.

La siguiente tabla contiene una relacin de lasespecies pisccolas que han sido cultivadas enterritorio espaol, y su estado comercial y dedesarrollo. Estos datos provienen de Fishbase10, basede datos desarrollada por el WorldFish Center encolaboracin con la Organizacin de las NacionesUnidas para la Agricultura y la Alimentacin (FAO)11,con el apoyo de la Comisin Europea.

14

PECES CULTIVADOS EN ESPAA

Nombre cientfico Nombre local Uso Origen

Acipenser naccarii Esturin del Adritico experimental cuestionable

Anguilla anguilla Anguila comercial nativo

Dentex dentex Dentn comercial nativo

Dicentrarchus labrax Lubina comercial nativo

Lampetra planeri Lamprea de arroyo experimental cuestionable

Oncorhynchus mykiss Trucha arcoiris comercial introducido

Oreochromis ssp. Tilapia roja comercial introducido

Salmo salar Salmn del Atlntico comercial nativo

Scophthalmus maximus Rodaballo comercial nativo

Seriola dumerili Seriola experimental nativo

Solea solea / Senegalensis Lenguado comercial nativo

Sparus auratus Dorada comercial nativo

Thunnus thynnus Atn comercial nativo

Tinca tinca Tenca comercial nativo

PECES POTENCIALMENTE CULTIVABLES EN ESPAA

Acipenser baerii Esturin siberiano introducido

Acipenser sturio Esturin comn nativo

Alburnus alburnus Albur introducido

Ameiurus melas Pez gato introducido

Ameiurus nebulosus Pez gato introducido

10 FishBase (http://www.fishbase.org).11 Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin http://www.fao.org

15


Carassius auratus Pez rojo introducido

Carassius carassius Carpin nativo

Coryphaena hippurus Dorado nativo

Cyprinus carpio Carpa introducido

Diplodus sargus Sargo nativo

Esox lucius Lucio introducido

Hucho hucho Salmn del Danubio introducido

Ictalurus punctatus Pez gato introducido

Liza aurata Galupe nativo

Liza ramada Capitn nativo

Liza saliens Gala blanca nativo

Megalops atlanticus Pez lagarto nativo

Micropterus salmoides Black-bass introducido

Mugil cephalus Albur nativo

Pagrus pagrus Pargo nativo

Perca fluviatilis Perca europea introducido

Pleuronectes platessa Solla nativo

Pomatomus saltatrix Anchoa de banco nativo

Pseudocaranx dentex Jurel dorado nativo

Rutilus rutilus Rutilo introducido

Salmo trutta Trucha comn nativo

Salvelinus alpinus Salvelino nativo

Salvelinus fontinalis Salvelino introducido

Sander lucioperca Lucioperca introducido

Scardinius erythrophthalmus Escardino introducido

Scomber japonicus Caballa nativo

Silurus glanis Siluro introducido

Solea impar Lenguado nativo

Trachinotus ovatus Palometa blanca nativo

Tabla 3. Peces cultivados en Espaa y potencialmente cultivables en Espaa (Fuente: Froese, R. and D. Pauly. Editors.2003; FishBase. World Wide Web electronic publication. http://www.fishbase.org version 10 Septiembre-June 2003).

PECES POTENCIALMENTE CULTIVABLES EN ESPAA (Continuacin)

500.000

Toneladas

450.000400.000350.000300.000250.000200.000150.000100.00050.000

0GRECIA ESPAA CHILE NORUEGA

1988

1996

2000

Segn datos procedentes de la Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos (JACUMAR)12, la produccin en acuicultura espaola en el 2001 fue superior a las 313.000 toneladas, de las que casi 257.000corresponden a produccin de moluscos, 56.000 toneladas a peces y el resto a crustceos. En el siguientegrfico se puede observar la predominancia del cultivo de la trucha arcoiris en Espaa, con un 11% de laproduccin total acucola, seguida de lejos por la dorada, con un 3%, y en menos medida por tnidos,rodaballo y lubina.

16

12 Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos, JACUMAR (http://www.mapya.es/jacumar).13 Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos, JACUMAR (http://www.mapya.es/jacumar), segn datos de la FAO.14 Arnal, J. I. (1980). Posibilidades de la Acuicultura en el litoral espaol. Beca Rumasa de Investigacin. Anlisis

Econmicos S.A. 1:1-337.

80%

3%

11%

Mejilln

Trucha Arcoiris

Dorada

Tnido

Ostras

Almeja

Rodaballo

Lubina

Berberecho

Otros

Fig. 2. Produccin en Espaa en el 2001 por especie (Tm). Fuente: JACUMAR, http://www.mapya.es/jacumar

El desarrollo de la acuicultura en Espaa ha sidosobrepasado en los ltimos aos por varios pasesque han sufrido un rpido progreso. Este es elcaso de Noruega y Chile, mientras que otrospases con menor produccin total sonimportantes competidores en el cultivo dedeterminadas especies, como por ejemplo Grecia.

En 1997 Espaa alcanz el 1% de la produccinmundial en volumen y el 20% de la produccin dela Unin Europea. Al ao siguiente, la acuiculturaespaola ocupaba el primer puesto en produccindentro del Unin Europea13. En 1999 Noruega secolocaba por delante, mientras que Francia estaba

situada en un puesto inferior a poca distancia deEspaa. En este ao Espaa se situ en el puesto11 del ranking mundial de productores. Pese a quela produccin total espaola en acuicultura haaumentado en los ltimos aos, se observa unaprdida de competitividad con respecto al ao1997.

La capacidad mxima de produccin de especiespisccolas en Espaa se estima en 600.000toneladas. La mitad de las ComunidadesAutnomas todava no han explorado susposibilidades en la acuicultura, por lo que todavaexiste un amplio margen de crecimiento14.

PRODUCCIN ACUCOLA EN TONELADAS

Fig. 3. Produccin en acuicultura de Grecia, Espaa, Chile y Noruega. Fuente: JACUMAR, http://www.mapya.es/jacumar

3.2. Distribucin geogrfica de las actividades de acuiculturaen Espaa

Segn las caractersticas de cada zona geogrfica, se ha apostado por el cultivo de especies que se adaptenmejor a las condiciones de determinadas zonas. Del mismo modo, el desarrollo de los sistemas de cultivo hasido diferente en funcin de las necesidades de cultivo de dichas especies y las caractersticasbiogeogrficas de la zona.

Catalua y Andaluca lideran la produccin de acuicultura de especies pisccolas en la regin mediterrnea ysur-atlntica, principalmente mediante el cultivo de lubina y dorada. En la zona cantbrica y del norte delatlntico, en especial Galicia, predomina el cultivo del rodaballo como principal especie acucola. En la ltimadcada, la acuicultura marina espaola ha sufrido un crecimiento significativo.

17


Regin o zona Especies Comentarios

Cantbrico y Galicia

Moluscos (mejilln, ostra,almeja, berberecho).

Rodaballo.

Salmn.

Pulpo, besugo.

Lubina y dorada.

rea mediterrneo ySur-atlntica Ostras, almejas, mejilln

(langostino en menor medida).

Atn rojo, pulpo, dentn ylenguado.

Lubina y dorada.Canaria y Balear

Anguila.Valencia y zona sur

Atn.

Sin zona especfica

Bateas, parques de cultivo.

Instalaciones en tierra.

En regresin (no compite con industriasms maduras del norte europeo).

Cultivos experimentales.

Jaulas flotantes o estanques de cultivo(antiguas explotaciones salineras de laregin sur-atlntica).

Mar abierto.

En un futuro.

Jaulas flotantes.

Besugo, dentn, pulpo.

Almeja y moluscos pectnidos.

Nuevas tecnologas.

Inters por su produccin.

Langostino.Produccin limitada, sin gran xitoempresarial.

Engorde de animales capturados vivos.

Produccin limitada, satisface lademanda nacional.

DISTRIBUCIN GEOGRFICA DE LA ACUICULTURA MARINA EN ESPAA

Tabla 4. Distribucin geogrfica de la acuicultura marina espaola (Fuente: JACUMAR; http://www.mapya.es/jacumar;Libro Blanco de Acuicultura en Espaa. MAPyA, 2001).

Por lo que respecta al cultivo de especies continentales, la primera especie es la trucha arcoiris, cultivada entanques de cultivo, cuya cra se centra principalmente en Galicia, y en un segundo nivel, en Castilla-LaMancha, Castilla y Len, Navarra, Asturias, Catalua, Andaluca y La Rioja.

18

Regin o zona Especies Comentarios

Perodo Programa

Tramos altos de ros con caudales elevados,constantes, y con pequeas fluctuaciones detemperatura, y cierta alcalinidad.Fuentes de agua oxigenadas y aprovechadasmediante recirculacin.

Trucha arcoiris Tanques de cultivo.

Lagos y embalses de Extremadura,y Castilla y Len en menor medida.

Tenca Consumo local.

Baleares.

Casi todos los ros de la pennsula.

Carpa

Cangrejo rojo

Pequea produccin.

Cuenca del Guadalquivir. Esturin Intento de cultivo.

Intento de freno mediantela introduccindel cangrejo seal.

1982-1988 1.er Programa de I+D en acuicultura.

1988 Plan de Cultivos Marinos.

1988-1991 Programa Nacional de Recursos Marinos y Acuicultura.

1992-1999 Programa Nacional de Ciencias Agrarias (Subprograma de Ganaderas y Acuicultura).

1996-1999

1988-1999

Programa Nacional de Ciencia y Tecnologa Marinas.

Programas en transferencia de resultados de investigacin y dotacin de infraestructuras.

DISTRIBUCIN GEOGRFICA DE LA ACUICULTURA CONTINENTAL EN ESPAA

Tabla 5. Distribucin geogrfica de la acuicultura continental espaola (Fuente: JACUMAR; http://www.mapya.es/jacumar;Libro Blanco de Acuicultura en Espaa. MAPyA, 2001).

3.3. Actividades de I+D en acuicultura en Espaa

Espaa ha invertido desde sus primeros planes en

acuicultura en 1982 alrededor de 70 millones de

euros en el desarrollo de tecnologa propia con

aplicaciones en acuicultura. Ms de 20 especies

distintas se encuentran actualmente en distintas

fases de desarrollo15.

Desde 1982, fecha en la cual se puso en marcha

el primer programa de I+D en acuicultura en

Espaa, se han desarrollado diversos programas

hasta la actualidad.

PROGRAMAS NACIONALES ESPAOLES EN ACUICULTURA

Tabla 6. Programas Nacionales espaoles en acuicultura (Fuente: Coll Morales, J. (2002). Development of Aquaculture inSpain. Aquaculture Europe 33, 3-8, tomado de: Libro Blanco de Acuicultura en Espaa. MAPyA, 2001).

15 Coll Morales, J. (2002). I Reunin de la Red Nacional sobre Biologa Molecular de Peces. INIA Investigacin y Desarrollon2, 12-15, tomado de: Libro Blanco de Acuicultura en Espaa. MAPyA, 2001.

Los proyectos de investigacin que sedesarrollaron durante estos periodos tuvieronlugar principalmente en varios centrospertenecientes al CSIC, el Instituto EspaolOceanogrfico (IEO), el Instituto deInvestigaciones Agrarias y Alimentarias (INIA), ydistintas universidades y empresas16.

En el ao 2001 tuvo lugar la primera reunin de laRed Nacional sobre Biologa Molecular de Pecesentre un grupo de laboratorios espaolesparticipantes en la red17. En esta reunin seelabor un listado de aquellas herramientas otecnologas clave en el desarrollo de la I+D en laacuicultura espaola:

Estudio y caracterizacin de la regulacin de latranscripcin en las especies seleccionadas(identificacin de factores de transcripcin,promotores, amplificadores).

Obtencin de libreras genmicas y cDNA deespecies seleccionadas mediante diversastecnologas de genmica y protemica(microarrays de ADN y protenas, mapeo degenes, etc.).

Desarrollo de mtodos de transfeccin dezigotos e identificacin de marcadoresmoleculares de los transgenes insertados.

Mejora en la integracin controlada del ADN enlos genomas de especies seleccionadas.

Desarrollo de un banco de clulas (lneascelulares, clulas madre).

En diciembre del ao 2002 tuvo lugar una sesinpreparatoria para la elaboracin de un proyecto detres aos de duracin sobre biotecnologa aplicadaa genmica de peces, dirigida por GenomaEspaa18 en colaboracin con Genome Canad19,su homloga canadiense. Los representantes delsector empresarial expusieron sus necesidades enel sector de la acuicultura, mientras que losinvestigadores explicaron qu posibles solucionespodan ofrecer desde su experiencia investigadora.Como consecuencia de esta reunin se lleg a unaserie de preacuerdos con distintas empresas ygrupos de investigacin, quienes consideraronprioritaria la investigacin en peces planos, esdecir, rodaballo y lenguado. Los proyectospresentados se centran en la identificacin de ETSo Expressed Sequence Tags, con aplicaciones enembriologa, inmunologa y crecimiento.Asimismo, dejaron constancia de la importanciadel estudio de peces modelo, como son el pezcebra y el pez fugo. Es interesante sealar la faltade inters por parte de las empresas en especiesantes consideradas en auge, en concreto la doraday la lubina, ya que la baja superviviencia dealevines y la competencia procedente de otrospases mediterrneos ha obligado a buscar otrasopciones ms rentables.

En el ANEXO I del presente informe se recogen loscentros de investigacin espaoles queactualmente tienen en marcha proyectos deinvestigacin financiados con fondos pblicos,relacionados con las tcnicas de genmica yprotemica aplicadas a la acuicultura de especiespisccolas.

19


16 Coll Morales, J. Desarrollo futuro de la acuicultura en Espaa. Noticia: El Correo Agrario 09/06/01.17 Coll Morales, J. (2002). I Reunin de la Red Nacional sobre Biologa Molecular de Peces. INIA Investigacin y Desarrollo

n2, 12-15, tomado de: Libro Blanco de Acuicultura en Espaa. MAPyA, 2001).18 Genoma Espaa http://www.gen-es.org19 Genome Canad http://www.genomecanada.ca

Una especie modelo para ser cultivada seraaquella que obtenga un alto precio en un mercadoestablecido, elevada tasa de crecimiento,resistencia a enfermedades, requerimientosbiolgicos o ambientales no demasiado estrictos, yque sus primeros estados de vida sean fciles deobtener, tanto a partir de animales capturados enel medio natural como a travs de la cria encautividad.

El presente informe pretende realizar un anlisisnicamente de las tcnicas que la genmica yprotemica proporcionan como herramientas parael desarrollo de la acuicultura. Por este motivo, elresto de tcnicas de mejora gentica, como son lamanipulacin cromosmica y los sucesivoscruzamientos entre miembros de la misma odiferente especie, tan solo sern tratadas en laintroduccin como tcnicas complementarias.

4.1. Secuenciacin

El genotipado sistemtico y la secuenciacin delgenoma proporcionan el acceso a todos los genes deuna determinada especie, lo que permite la seleccinde especies pisccolas en funcin de sus caractersticasgenticas (seleccin en base al genotipo), y no slo enfuncin de su aspecto o circunstancias particulares(seleccin en base al fenotipo) tal y como se venarealizando hasta la fecha.

La seleccin en base al genotipo tiene entre susprincipales ventajas la rapidez y la eficacia,permitiendo la obtencin del producto en untiempo considerablemente menor (ej. progenie depeces). Hasta la fecha, la seleccin en base algenotipo es marginal puesto que se trata de unatcnica nueva y adems requiere del desarrolloprevio de nuevos conocimientos. No obstante, lagran mayora de pases competidores con Espaaen el sector de la acuicultura ya han introducido laseleccin en base al genotipo en sus programas demejora y/o de introduccin de nuevas especies.

Las estrategias seguidas por el principal consorciode Secuenciacin del Genoma de Pez cebra son laSecuenciacin de libreras genmicasaleatorias y la secuenciacin clon por clon.

20

4. Aplicaciones de la biotecnologaen la acuicultura de especies pisccolas

SECUENCIACIN DE LIBRERAS GENMICAS ALEATORIAS

El genoma completo es multiplicado y fragmentado muchas veces al azar en millones de pedazosdel ADN no mayores a 500 bases cada uno.

La secuencia de bases que forma cada fragmento es determinada mediante un proceso conocidocomo secuenciacin.

Mediante un programa informtico se comparan las secuencias de millones de fragmentos,identificando los segmentos superpuestos.

Los segmentos superpuestos forman segmentos de mayor tamao que son ensamblados para darlugar a la secuencia del genoma completo.

SECUENCIACIN CLON POR CLON

Determinacin de las secuencias del ADN de los genes expresados (ESTs20). Estos marcadores sonutilizados para dividir cada cromosoma en pequeas regiones (mapeado).

Cada segmento localizado entre dos marcadores es multiplicado y fragmentado al azar.

La secuencia es determinada mediante regiones superpuestas, como ocurra en el mtodo anterior.

20 EST: Expressed Sequence Tag o identificador de una secuencia expresada (consultar el siguiente cuadro para obtenerms informacin).

Realmente ninguna de estas estrategias porseparado puede dar paso a una secuenciaconsenso convincente del genoma del pez deinters, por lo que en ltimos aos los proyectosde secuenciacin de organismos superiores hanempleado las dos estrategias para llegar a lacompleta secuenciacin de los genomas. Losproyectos de secuenciacin necesitan el apoyo deiniciativas que permitan el acceso pblico a losresultados, tales como las secuencias de genesque se recopilan en GenBank21, o en bases dedatos ESTs.

21


EST (Expressed Sequence Tag)

Los genes presentes en el ADN son expresados en ARN mensajero (ARNm) a travs del proceso detranscripcin. El ARNm es luego traducido en protenas a travs del proceso de traduccin. Laconstruccin de ESTs de realiza mediante la copia de ARNm en fragmentos de ADN complementario(cADN) por la enzima transcriptasa inversa. Los ESTs son por tanto una representacin de los genesque se estn transcribiendo en un tejido en un momento determinado y en una especie concreta.

Aplicaciones de las bases de datos de ESTs:

Identificacin de genes que se transcriben en un determinado momento.

Deteccin de genes que se transcriben en un tejido.

Identificacin de posibles genes.

Caracterizacin de los lmites de un gen e intrones.

Secuenciacin de genes en especies donde no se dispone del genoma completo secuenciado.

21 GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html

Las especies cultivadas en acuicultura pertenecen en

su mayora a especies prximas entre s, como es el

caso de la dorada, lubina y besugo. Este es el motivo

por el cual se elige generalmente una especie para

realizar un anlisis de su genoma, y posteriormente

trasladar la informacin al resto de especies

relacionadas. El estudio de sus genes es sin embargo

necesario a nivel de especie, ya que los genes de

inters no suelen encontrarse en las zonas

conservadas de estas especies.

Actualmente se dispone del genoma completo

secuenciado del pez fugo (Fugu rubripes), y existen

numerosas iniciativas de secuenciacin de diferentes

especies pisccolas en distintos pases22. Tanto al pez

fugo como al pez cebra (Danio rerio) se les considera

peces modelo, puesto que los resultados obtenidos

en la secuenciacin de su genoma podran explicar

muchos procesos biolgicos caractersticos de las

especies pisccolas, tales como la reproduccin, el

crecimiento o la supervivencia a enfermedades o

condiciones climticas entre otros. Adems, estos

resultados son altamente extrapolables a otras

especies de inters comercial, sirviendo as a mejorar

la produccin y/o la productividad de las granjas

pisccolas.

A partir de estas secuencias completas se pretende

la caracterizacin de secuencias gnicas, la

identificacin de marcadores genticos de inters en

acuicultura y la bsqueda de nuevas dianas

teraputicas para el desarrollo de nuevos frmacos

veterinarios.

22

ADN DEL PEZ ADN DEL PEZ

SECUENCIA DE ADN DEL PEZ SECUENCIA DE ADN DEL PEZ

11 32 4 5 6

2

1 3 5 7

4 6

2

6

4

5 7

3 1 2

6

4

5 7

3

SECUENCIACIN aleatorias SECUENCIACIN clon por clon

Fragmentacin en segmentos de pequeo

tamao al azar

Fragmentacin en segmentos ordenados

mediante enzimasde restriccin

Fragmentacin de cadasegmento en secuencias

de pequeo tamao

Secuenciacin de cadafragmento de ADN

Ensamblajede los fragmentos segn orden conocido

Secuenciacin de cadafragmento de ADN

Ensamblajede los fragmentos superpuestos Secuenciador

de ADN

1 32 4 5 6 7

Fig. 4. Mtodos de secuenciacin del genoma (Fuente: adaptado de, Genoma Humano: el Negocio de la Vida. InstitutoPanamericano de Alta Direccin de Empresa. Tecnologas que rompen esquemas. Qu est pasando? Poltica de empresa,Continuidad 2000-2001).

22 The Zebrafish Information Network , ZFIN (http://zfin.org). Fugu Genome Project http://www.fugu-sg.org

23


Organismo Institucin Financiacin Base de datos Estatus

Daniorerio(pez cebra)

Washington UnivSanger Institute

NHI23

NCBI24

Washington University25

University of Oregon26

Fishman-MGH27

Carnegie Institute ofWashingtonStanford University28

Sanger Institute29

Incompleta

Oreochromisniloticus (tilapia)

Univ. of NewHampshire

Roslin Institute30 Incompleta

Salmosalar(Salmn Atlntico)

Genome BritishColumbia

Genome BCGenomeCanadaRoslinInstitute

Genome BC/GenomeCanada31

Roslin Institute32Incompleta

Takifugurubripes(pez fugo)

InternationalCollaboration33

MRC34

DOE35

HGMP-RC36

Joint Genome Institute37

Sanger Institute38

Institute of Molecular andCell Biology39

Completa

Tetraodonnigroviridis(Pez globoverde)

GenoscopeWhitehead Institute

NHGRI40Genoscope41

Whitehead Institute42Incompleta

Oryzias latipes(medaka)

Medaka GenomeInitiative

Japanesegovernment

Medaka fish43

Medaka GenomeInitiative44

Incompleta

PROYECTOS DE SECUENCIACIN DEL GENOMA DE ESPECIES PISCCOLAS

23 National Institutes of Health, US Department of Health and Human Services (http://www.nih.gov).24 National Center for Biotechnology Information,USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Zebrafish Genome resources (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish/index.html).25 WashU-Zebrafish Genome Resources Project (http://zfish.wustl.edu).26 ZFIN: Zebrafish information network (http://zfin.org).27 MGH / CVRC Zebrafish Server (http://zebrafish.mgh.harvard.edu).28 Stanford Genome Evolution Center (http://cegs.stanford.edu/index.jsp).29 ZFIN: Zebrafish information network (http://zfin.org).

Zebrafish Genome resources (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish/index.html).30 Tilapia mapping database (http://www.thearkdb.org/browser?species=tilapia).31 GRASP, Genomic Research on Atlantic Salmon Project, Genome BC/Genome Canada (http://web.uvic.ca/cbr/grasp).32 Salmon mapping database (http://www.thearkdb.org/browser?species=salmon).33 International Fugu Genome Consortium: Institute of Molecular and Cell Biology (Singapore), Joint Genome Institute

(U.S. Department of Energy), Human Genome Mapping Project (UK), Institute for Systems Biology (USA)(http://www.fugu-sg.org/project/info.html).

34 MRC, Medical Reseach Council, UK (http://www.mrc.ac.uk).35 DOE, US Department of Energy (http://www.doe.gov) of California for The US Department of Energy.36 HGMP-RC, The Fugu Genomics Project, Medical Reseach Conuncil, UK (http://fugu.hgmp.mrc.ac.uk).37 Puffer fish project, EEUU, Joint Genome Institute, DOE (http://www.jgi.doe.gov/fugu).38 Fugu rubripes Sequencing Project (http://www.sanger.ac.uk/Projects/F_rubripes).39 Fugu genome project, Institute of Molecular and Cell Biology, Singapur (http://www.fugu-sg.org).40 NHGRI, National Human Genome Research Institute , USA (http://www.genome.gov).41 Tetraodon nigroviridis Genome Anlisis, Francia (http://www.genoscope.cns.fr/externe/tetraodon).42 Tetraodon nigroviridis genome at Whitehead, EEUU (http://www-genome.wi.mit.edu/annotation/tetraodon).43 Medaka fish, Japn (http://biol1.bio.nagoya-u.ac.jp:8000).44 Medaka Genome Initiative (http://medaka.dsp.jst.go.jp/MGI).

Tabla 7. Proyectos de secuenciacin del genoma de especies pisccolas. Fuente: elaboracin propia, tomado de: GOLDTM

Genomes OnLine Database, http://wit.integratedgenomics.com/GOLD

4.2. Genmica funcional45

La informacin procedente de la secuenciacin de genomas de peces, como el pez cebra, medaka y pezfugo, proporciona la identificacin de genes que potencialmente posean caractersticas ventajosas odeseables comercialmente. El paso siguiente a esta identificacin de secuencias gnicas es lo quecomnmente se conoce por anlisis de la expresin y regulacin de los genes. Dicho anlisis nosacerca al conocimiento de la funcin de los genes de inters y de cmo estos se activan o se inhiben.

24

Identificacin de marcadores genticos.

Diseo de vacunas ms efectivas.

Desarrollo de peces transgnicos.

PRINCIPALES OBJETIVOS DEL ANLISIS DE LA EXPRESIN GNICA EN PECES

Generalmente el anlisis de la expresin gnica se

realiza mediante separacin de protenas por

medio de electroforesis en geles bidimensionales,

seguida de la secuenciacin de las protenas por

espectrometra de masas46. Mediante estas

herramientas se elaboran mapas de protenas y

fragmentos peptdicos, los cuales se emplean para

detectar la presencia y analizar la expresin de

protenas implicadas en la regulacin de diversos

procesos, tales como el desarrollo del pez y la

resistencia a las enfermedades ms comunes.

Sin embargo, existen otras tcnicas como los

microarrays o chips de ADN, que permiten el

anlisis de la expresin gnica de miles de genes

simultneamente mediante la evaluacin de los

niveles de ARNm47. En la actualidad, tan solo se

estn realizando este tipo de estudios por medio

de microarrays de ADN en pez cebra, especie

para la que se conocen un gran nmero de

ESTs48. Debido al incremento de ESTs

identificados en los ltimos aos (ver seccion

anterior), en un futuro cercano ser posible

realizar el anlisis de la expresin gnica de

otras especies de inters en acuicultura. El

lenguado49, carpa, tilapia, y trucha son algunas

de las especies pisccolas de las que se dispone

actualmente de un mayor nmero de secuencias

expresadas50. Sin embargo, es necesaria la

puesta en marcha de proyectos de investigacin

espaoles que permitan identificar un gran

nmero de ESTs en peces. Como consecuencia

directa se obtendra una informacin muy valiosa

que sera empleada en la mejora del crecimiento,

engorde, y reproduccin de las especies con

mayor potencial en acuicultura.

45 Genmica funcional: comprende la utilizacin de los conocimientos resultantes del estudio del genoma para obtenercantidades masivas de datos sobre la regulacin y la expresin en sistemas celulares completos.

46 Para ms informacin consultar las fichas tecnolgicas del I Informe de Prospectiva Tecnolgica sobre el Impacto de laBiotecnologa en el Sector Sanitario, realizado por Genoma Espaa y el OPTI, y que puede obtenerse gratuitamente en lapgina web: http://www.gen-es.org

47 Lpez, M.; Mallorqun, P.; Vega, M. (2002). Informe de Vigilancia Tecnolgica: Microarrays y biochips de ADN. CIBT-FGUAM/Genoma Espaa.

48 EST (Expressed Sequence Tag): secuencia parcial de un cDNA clonado. Expressed Sequence Tags database, NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST).

49 En Japn se est desarrollando un chip de cDNA para el lenguado japons. 50 Melamed, M., et al. (2002). The potential impact of modern biotechnology on fish aquaculture. Aquaculture 204, 255-269.

25


4.3. Vacunas

Las enfermedades infecciosas son la causamayoritaria de las prdidas econmicas enAcuicultura. La prdida se estima en un 10% delos peces cultivados que mueren al ao, causandoalgunas de estas enfermedades mortalidadessuperiores al 90%51.

La primera vacuna comercializada contra unaenfermedad propia de peces cultivados sali almercado en 1976 en Estados Unidos52, por lo queel desarrollo de vacunas para peces todava esuna ciencia joven. Desde entonces, se hanconseguido grandes avances que adems han sidointroducidos en la industria de la acuicultura conxito. Actualmente, gran parte de lasinvestigaciones en vacunas pisccolas se llevan acabo por grupos de investigacin de la Universidadcon departamentos de I+D de empresascomerciales que quieren aumentar la eficacia de lavacunacin.

Durante los ltimos 20 aos la vacunacin ha sidouno de los mtodos preventivos ms efectivos enel control de enfermedades infecciosas en lospeces cultivados, principalmente en el salmn.

Las ventajas principales del uso de vacunas son lareduccin en la mortalidad debido a enfermedadesinfecciosas, y la reduccin en el empleo deantibiticos53 ya que disminuye la aparicin deresistencias y efectos secundarios54.

Para desarrollar una vacuna pisccola esimprescindible establecer e identificar los factoresde virulencia o agente patgeno, y losmecanismos de respuesta del pez a nivel celular yhumoral. Adems, la induccin del sistema inmunedebe ser optimizada de tal forma que los pecesvacunados sean capaces de desarrollarmecanismos de proteccin inmune contra elagente patgeno.

El sistema inmune innato es el primer mecanismo de defensa de los peces, el cual incluye barrerasfsicas como las mucosas y piel, leucocitos, y sustancias que inhiben inespecficamente el crecimientode microorganismos infecciosos.

El sistema inmune adaptativo posee dos estrategias de defensa, la respuesta humoral(reconocimiento y unin de antgenos55 solubles con clulas B, quienes secretan anticuerpos contraestos antgenos) y la respuesta celular (reconocimiento de antgenos de superficie celular por clulas T), por la cual se eliminan las clulas infectadas.

LA RESPUESTA INMUNE DE LOS PECES

51 Fernndez-Alonso, M.; Estepa, A.; Coll, JM. Vacunas DNA en Acuicultura. Revista AquaTIC, n 4, Septiembre 1998.52 Vacuna contra la ERM (enteric mouth disease), causada por la bacteria Yersinia ruckeri.53 Vinitnantharat, S.; Gravningen, K.; Greger, E. (1999). Fish Vaccines. Advances in Veterinary Medicine. Vol. 41, 539-550.54 Heppell, J.; Davis, H. L. (2000). Application of DNA vaccine technology to aquaculture. Advanced Drug Delivery

Reviews 43, 29-43.55 Antgeno: sustancia que induce la formacin de anticuerpos, debido a que el sistema inmune la reconoce como una

amenaza.

a) Mtodos de vacunacin

Factores tan importantes como la temperatura, laedad de los peces a vacunar, va deadministracin, dosis, estacionalidad y el estadoinmunolgico del pez, pueden influir en lainduccin de una determinada respuesta inmune ypor tanto en el proceso de vacunacin.

Los peces pueden ser inmunizados mediante tresmtodos, inyeccin intramuscular ointraperitoneal, inmersin y administracin oral,que ofrecen distintos niveles de proteccin yeficiencia para cada tipo de vacuna. Hasta elmomento, tan solo la inyeccin y la inmersin hansido desarrollados para su uso en una escalaindustrial.

Existen varios tipos de vacunas orales que estnsiendo aplicadas en fase experimental en peces decultivo, con varias patentes concedidas56, pero porel momento no es una opcin tan efectiva comolos otros mtodos de vacunacin.

Dentro de la acuicultura se han realizadodiferentes estudios para obtener vacunas oraleseficaces frente a patgenos como Y. ruckerii parael que existe una vacuna oral comercial eficaz enel tratamiento de la enfermedad entrica de laboca roja en trucha aro iris, V. anguilarum, V. vulnficus, A. salmonicida, A. hydrophila entreotros57. En Espaa, podemos destacar eldesarrollo de la vacuna oral para anguilasVulnivacuna58, por parte del departamento deMicrobiologa y Ecologa de la Facultad de Biologade la Universidad de Valencia.

26

56 Oral vaccines. WO03020040 57 AquaVacTM. Schering-Plough Animal Health/Aquaculture Vaccines Ltd. (http://www.avl.co.uk).58 Esteve-Gassent, M. D.; Barrera, R.; Fouz, B.; Amaro, C. (2003). Effectiveness of oral re-immunisation after vaccination

against Vibrio vulnificus serovar E in farmed European eel. Aquaculture In press. Vaccine against vibriosis produced byVibrio vulnificus biotype 2 in eels. ES2127702.

Inmersin Inyeccin Oral

Aplicacin

Nivel de estrs

Laboriosidad

Eficacia

Duracin de la proteccin

Control de la dosis

Coste

Sencilla

Bajo

Moderada

Buena

3-12 meses

Impreciso

Bajo

Moderada

Moderado

Alta

Muy buena

12-24 meses

Preciso

Alto

Muy sencilla

ninguno

Baja

Baja

2-4 meses

Impreciso

Bajo

COMPARACIN DE LOS MTODOS DE ADMINISTRACINDE VACUNAS MS COMUNES EN PECES

Tabla. 8. Comparacin de los mtodos de administracin de vacunas ms comunes en peces (Fuente: Vinitnantharat, S.,et al. (1999). Advances in Veterinary Medicine. Vol. 41, 539-550; Heppell, J., et al. (2000). Adv. Drug Deliv. Rev. 43, 29-43).

27


Segn la mayora de expertos consultados, parece necesario avanzar en el conocimiento del consumo yabsorcin de las vacunas incorporadas a los piensos secos, y desarrollar sistemas de proteccin quepermitan la absorcin efectiva de dichos antgenos.

b) Tipos de vacunas

El primer paso en el desarrollo de vacunas pisccolas consiste en la identificacin de factores de virulencia delorganismo infeccioso, es decir, los antgenos responsables de desencadenar la infeccin. Una vez realizada estacaracterizacin, la induccin de la respuesta inmune debe ser optimizada de modo que el animal vacunadodesarrolle una respuesta inmune de larga duracin contra el patgeno del que procede el factor de virulencia59.

Existen dos tipos de vacunas pisccolas, las vacunas tradicionales (inactivadas o vivas), y las nuevasvacunas desarrolladas mediante ingeniera gentica (recombinantes y de ADN).

VACUNAS TRADICIONALES

Vacunas inactivadas o muertas60: procedentes de extractos bacterianos, son las denominadasbacterinas61, que generalmente se administran mediante mtodos de inyeccin e inmersin.Efectivas en varias enfermedades infecciosas provocadas por bacterias, con pocos efectossecundarios. Necesitan coadyuvantes en caso de ser administradas mediante inyeccin.

Vacunas vivas o atenuadas: organismo patgeno vivo atenuado. Tienen la capacidad de distribuirel antgeno a toda la poblacin mediante la administracin de la vacuna en dosis bajas, y estimulanla respuesta celular del sistema inmune de los peces.

NUEVAS VACUNAS

Vacunas recombinantes62: insercin de genes codificantes de antgenos en bacterias, virus olevaduras para conseguir la expresin de la protena antignica que ser usada como vacuna.

Vacunas ADN: plsmido que contiene un gen codificante para protenas antignicas.

59 Factor de virulencia: cualquier factor que aumenta la capacidad de un agente infeccioso de infectar un organismohospedador (protenas externas, toxinas, etc).

60 Prepn of deactivated dual vibrio vaccine for sea fish. CN1360948. 61 Bacterinas: son un tipo de vacunas compuestas por bacterias inactivadas o muertas mediante la accin de agentes

fsicos, agentes qumicos o de ambos conjuntamente.62 Tecnologa de ADN recombinante: tecnologa molecular que hace posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un

organismo para introducirlo en otro.

Patgeno

Gen codificantedel antgeno

Expresin de la protenaen un vector

Purificacinde la protena

antignica

Vacunacin

VACUNA DE ADN VACUNA RECOMBINANTE

Gen codificantedel antgeno insertado

en un plsmido

Fig. 5. Desarrollo de vacunas recombinantes y de ADN (Fuente: elaboracin propia).

Actualmente slo varias enfermedades causadaspor bacterias se han podido controlar utilizandovacunas tradicionales inactivadas o atenuadas.Por este motivo, la posibilidad de introducir en elmercado nuevas vacunas ms eficientes y eficaceses necesaria en acuicultura.

La investigacin sobre vacunas recombinantespisccolas se centra en las vacunas vricas, aunque sehan desarrollado diversas vacunas contra infeccionesbacterianas de salmnidos63. Hasta el momento, lanica vacuna vrica recombinante autorizada enacuicultura en Estados Unidos se utiliza para vacunarsalmones mediante inyeccin contra la necrosisinfecciosa pancretica (consultar tabla de la presenteseccin). Una de las vas de investigacin msprometedoras en la obtencin de vacunasrecombinantes es la expresin de protenaspatgenas en levaduras64 o plantas transgnicas, quepermitiran la produccin de protenas antignicas agran escala. Esta tecnologa an no se ha aplicado ala piscicultura por lo que es una investigacin abiertaque ya se ha propuesto a la UE65.

Por otro lado, se han obtenido resultados positivoscon vacunas de ADN contra la Septicemiahemorrgica viral (VHS) y la Necrosis infecciosahematopoytica (IHN) en salmnidos66. Elprincipal mtodo de administracin de ADN sueleser la inyeccin en peces lo suficientementegrandes, aunque en la actualidad, se estnexperimentando otras tcnicas ms novedosas,como pueden ser el bombardeo con partculas deoro o tungsteno que llevan adheridas ADN,ultrasonidos, electroporacin (sistemas libres deaguja), tecnologa MircoPorTM, intestinal o a travsde las branquias67. Otras alternativas que se estninvestigando son la administracin oral porinmersin mediante complejos de ADN-liposomas

y ADN microencapsulado en truchas68. Laintroduccin de ADN por medio de tcnicas desonicacin es una de las ltimas aternativas quese encuentran en desarrollo. Esta tcnica empleaultrasonidos administrados de forma continua, enpulsos, o ms frecuentemente de manera conjuntacon mtodos de inmersin, para introducir conxito ADN en peces69.

28

63 A vaccine against piscirickettsia salmonis based on a recombinant 17 kd protein. CA2281913. Fish vaccine againstpiscirickettsia salmonis. EP1282710.

64 Yeast Derived Vaccine Against Ipnv. WO0238770. 65 Rocha A.; Coll, JM. Investigacin actual en vacunas para la acuicultura. Revista AquaTIC, n 11, Octubre 2000.66 Prieto, A. (2002). La prevencin y el control de enfermedades en el cultivo de peces. Aspectos a considerar. CIVA 2002

(http://www.civa2002.org), 583-605.67 Workshop on DNA vaccination 19 th june 2001.5th Nordic Symposium on Fish Immunology, 19th June 2001.68 Variables en Vacunacin DNA en el Modelo Trucha-Rabdovirus, Fernndez-Alonso, M.; Coll, J. M.; Invest.

Agr.: Prod. Sanid. Anim. Vol. 14 (1, 2 y 3), 1999.69 Zhou, Y-C., et al. (2002). Ultrasonic immunization of sea bream, Pagrus major (Temminck & Schlegel), with a mixed

vaccine against Vibrio alginolyticus and V. Anguillarum. Journal of Fish Diseases Vol 25. 6, 325.Fernndez-Alonso, M.; Rocha, A.; Coll, J. M. (2001). DNA vaccination by immersion and ultrasound to trout viralhaemorrhagic septicaemia virus. Vaccine 19: 3067-3075.

29


En la siguiente tabla se comparan las principales ventajas y desventajas de cada uno de los tipos devacunas descritos anteriormente.

COMPARACIN DE LOS TIPOS DE VACUNAS EN ACUICULTURA

Tipo de vacuna Ventajas Desventajas

Vacunas inactivadas(muertas)

Pocos efectos secundarios.

Administracin con coadyuvantes(pueden causar alteraciones enlas vsceras).

Slo estimulan la respuestainmune humoral.

El antgeno puede perder suconformacin.

Vacunas atenuadas(vivas)

Estimulan la respuesta inmunehumoral y celular (mayormemoria y eficacia).

Bajas dosis de vacuna.

Riesgo de dispersin incontrolada. Posibles efectos secundarios.

Vacunasrecombinantes

Sin efectos secundarios.

Slo una vacuna autorizada hastael momento.

Costosas de producir en grado depureza y cantidad suficiente.

No son capaces de evitar lainfeccin y la generacin deportadores asintomticos.

Slo estimulan la respuestainmune humoral.

Vacunas de ADN

Sin efectos secundarios.

Estimulan la respuesta inmunehumoral y celular (mayormemoria y eficacia).

Inmunidad de larga duracin.

Tecnologa aplicable a todas lasenfermedades.

Presentacin del antgeno en laconformacin adecuada.

Actividad adyuvante del ADN(presencia de dinucletidos CpGrepetidos en el ADN bacteriano).

Termoestables y capaces de serutilizadas en cualquier especie yedad.

Posibilidad de fabricar vacunasmultivalentes contra variospatgenos en el mismo o endiferentes plsmidos.

Slo estudiada para vacunasvricas.

Posible riesgo de integracin delplsmido de ADN en el genomadel hospedador.

Tabla 8. Ventajas y desventajas de los diferentes tipos de vacunas en acuicultura (Fuente: elaboracin propia).

c) Principales enfermedades infecciosas de especies pisccolas

La mayora de las vacunas comerciales para pecesestn diseadas contra enfermedades bacterianas.Actualmente no existen vacunas contra patgenosparsitos, y muy poca como tratamientopreventivo en enfermedades vricas. Las razonesde esta escasez de vacunas son el alto coste dedesarrollo de nuevos productos, unido al tamaorelativamente pequeo de la industria enacuicultura, as como el bajo precio de los pecescultivados. Por otra parte, muchas vacunas seencuentran en desarrollo experimental y sinembargo no son viables comercialmente debido asu alto coste y baja rentabilidad, insuficienteproteccin, o falta de seguridad70. No obstante,entre los expertos consultados, no cabe duda queestas vacunas tendrn una importancia crecienteen el futuro.

Las parasitosis71 propias de las especiespisccolas no tienen tratamientos eficaces,especialmente contra las que pueden considerarsems patgenas, como la escuticociliatosis y lamixosporosis72. Slo en el caso de ciertosectoparsitos se conocen algunos tratamientos

eficaces, pero son caros y su aplicacin en laprctica est limitada por su elevado coste y porlas normas legales vigentes, cada vez msrestrictivas en estos aspectos. Algunos de estostratamientos se basan en la inyeccin decompuestos inhibitorios de la sntesis de laquitina, componente principal de la envolturaexterna de estos parsitos73. La obtencin devacunas contra parsitos est limitada pornumerosos factores, incluyendo entre otros lacomplejidad de los ciclos y la variabilidadantignica de los parsitos. En el caso de lospeces, hay que considerar tambin el escasoconocimiento de su respuesta inmunitaria a losparsitos.

En el caso de los virus, no hay medidasteraputicas efectivas ni han podidocomercializarse an vacunas tiles y eficaces. Losmayores esfuerzos en la investigacin de viruspropios de peces se han realizado con aquellosvirus que afectan a las especies de mayor interscomercial, y que ocasionan por ello grandesprdidas a la industria del sector. Debido a esteinters, se sabe ms sobre virus de salmnidosque del resto de especies pisccolas74.

30

70 Heppell, J.; Davis, H.L. (2000). Application of DNA vaccine technology to aquaculture. Advanced Drug Delivery Reviews 43, 29-43.

71 Parasitosis: enfermedad por la simbiosis de un organismo, parsito, que vive a expensas de otro, hospedador,causndole algn tipo de patologa.

72 Pellitero, P. A., et al. Parsitos del rodaballo: Un nuevo reto para su cultivo. Biopress.net 6 enero.73 Control of parasitic infestations in farmed and wild fish. WO9963824. 74 Prez Prieto, S. I.; Rodrguez Saint Jean, S. (2002). Virus en la acuicultura de peces Telesteos y su impacto en

instalaciones espaolas. Biopress.net 6 enero.

Necrosis pancretica infecciosa (IPNV): responsable de la mayor parte de las infeccionesvricas en truchas en Espaa.

Necrosis hematopoytica infecciosa (IHNV): afecta a varias especies de salmnidos, dereciente introduccin en Europa.

Septicemia hemorrgica viral (VHSV): en la actualidad prcticamente erradicado.

Necrosis nerviosa viral o encefalopata viral (NNV): producida por un nodavirus, afectando acultivos europeos, aunque no se ha registrado en Espaa todava.

Enfermedad del pncreas (PD): producida por un togavirus, afecta al salmn atlntico.

Anemia infecciosa del salmn (ISA): producida por un ortomixovirus, afecta al salmn atlntico.

PRINCIPALES ENFERMEDADES VRICAS QUE AFECTANA DIVERSAS ESPECIES DE SALMNIDOS

31


La importancia de estas enfermedades sobre laprdida de produccin y sus consecuenciaseconmicas llevaron a la UE a la puesta en marchade un programa de erradicacin de rabdovirus entodos los pases miembros, basado en laaplicacin de mtodos de diagnstico rpido ysensible que permiten detectar el virus en pecesenfermos y en peces portadores, evitando ladiseminacin de estos patgenos. Por otra parte,algunos virus con escasa virulencia puedenconvertirse en patgenos altamente virulentoscuando los peces se someten a condiciones destress o malas condiciones ambientales.

Las vacunas contra enfermedades bacterianassuelen estar formadas por bacterias inactivadas, yel mtodo de administracin ms comn esmediante inmersin o inyeccin junto conadyuvantes oleicos. La investigacin en Espaa encuanto a vacunas contra enfermedades

bacterianas en peces es una de las ms activas,destacando la presencia de varias patentes sobredesarrollo de vacunas contra vibriosis, por partede grupos de investigacin procedentes de laUniversidad de Santiago de Compostela y laUniversidad de Valencia (ver siguiente tabla). ElInstituto Nacional de Investigacin y TecnologaAgraria y Alimentaria (INIA) posee a su vez dospatentes en trmite relacionadas con el virus de lasepticemia hemorrgica de la trucha, as como unnuevo vector para vacunas de ADN (ver ANEXOII). Las especies pisccolas que centran la atencinde los investigadores espaoles son los salmonesy truchas en su mayora, seguidos de la anguila, elrodaballo y la dorada (ver ANEXO I).

La siguiente tabla recoge las vacunasdesarrolladas o que actualmente se encuentran envas de desarrollo para las enfermedades demayor incidencia en acuicultura.

Tipo de vacuna Patgeno Enfermedad EstadoEspecies pisccolas

ms afectadas

Bacteriana(inactivada oatenuada)

V. anguillarum75

V. ordaliiV. salmonicida

V. viscosus

Vibriosis(70% mortalidad)

lcera de invierno

Empleadas desdehace tiempo

Experimental76

Anguila, dorada,lubina, rodaballotrucha

Saln y trucha depases fros

V. vulnificusVibriosisPatgeno humanooportunstico

Experimental77

(bacterinatoxoide)

Anguila

A. salmonicida FurunculosisVacunasinyectables usadascon xito78

Principalmentesalmnidos y otrasespecies de aguadulce en menormedida

P. piscicida PasteurelosisPseudotuberculosis Experimental79 Salmnidos, lubina,

dorada

S. parauberis EstreptocociasEnterocisis

Vacunasinyectables usadascon xito80,81

Rodaballo, truchaarcoiris, tilapia

E. ictaluri Septicemiaentrica

Experimental(resultadospobres)

Pez gato

F. maritimus Flexibacteriosis Experimental82 Rodaballo, salmn

L. garvieae Lactococis Experimental83 Trucha arcoiris

COMPARACIN DE LOS TIPOS DE VACUNAS EN ACUICULTURA

75 Anti-Vibrio anguillarum vaccine (gava-3) for the prevention of the vibriosis disease in the turbot and salmonidae, andpreparation process. EP1001016, WO9955835 (desarrollada en la Univ. de Santiago de Compostela).Fish vaccine comprising an avirulent, invasive bacterium. WO8909616

76 Vinitnantharat, S.; Gravningen, K.; Greger, E. (1999). Fish Vaccines. Advances in Veterinary Medicine. Vol. 41, 539-550. 77 Collado, R.; Fouz, B.; Sanjun, E.; Amaro, C. (2000). Effectiveness of different vaccine formulations against vibriosis caused by

Vibrio vulnificus serovar E (biotype 2) in European eels Anguilla anguilla. Diseases of Aquatic Organisms. 43:91-101.Vaccine against vibriosis produced by Vibrio vulnificus biotype 2 in eels. ES2127702 (desarrollado en la Univ. de Valencia).

(Continan citas en pg. sig.)

(Contina en pg. sig.)

32

Viral(inactivadas oatenuadas)

Viral(recombinante)

Parastica(atenuada)

Rhabdovirus

Rhabdovirus

Iridovirus

Rhabdovirus

Birnavirus

Rhabdovirus

Rhabdovirus

C. salmositica

L. salmonis

Septicemiahemorrgica viral(VHS)

Necrosishematopoyticainfecciosa (IHNV)

Enfermedadhemorrgica de lacarpa (GCHV)

Viremia Primaveralde la carpa (SVC)

Necrosis infecciosapancretica (IPNV)

Necrosishematopoyticainfecciosa (IHNV)

Septicemiahemorrgica viral(VHS)

Criptobiosis

Piojo del salmn

Experimental

Experimental

Producidacomercialmenteen China84

Vacunasinyectables usadascon xito

Usada enNoruega, y EEUU85

Experimental86

Experimental87

Experimental88

Futuro

Trucha, salmn

Trucha, salmn

Carpa herbvora

Carpa, tenca

Trucha, salmn

Trucha, salmn

Trucha, salmn

Trucha

Salmn

Tipo de vacuna Patgeno Enfermedad EstadoEspecies pisccolas

ms afectadas

COMPARACIN DE LOS TIPOS DE VACUNAS EN ACUICULTURA (Continuacin)

Tabla. 9. Comparacin de los mtodos de tipos de vacunas en acuicultura (Fuente: elaboracin propia, adaptado de:Gudding et al. (1999) Veterinary Immunology and Immnunopathology 72, 203-212).

78 Gudmundsdottir, B. K.; Gudmundsdottir, S. (1997). J. Fish Dis. 20, 343.Salmonicida iron regulated protein and lipopolysaccharide vaccine. US5702708.Attenuated aeromonas strains; fish vaccine NZ237421.Attenuated strains of Aeromonas salmonicida useful as fish vaccines. US549841.Fish vaccine for aeromonas salmonicida infection. WO9221370.

79 Fish vaccine. EP1200121.Attenuated Pasteurella piscicida vaccine for fish. US6350454.Vaccine. WO0110459.Procedimiento de obtencin de la vacuna anti-Pasteurella piscicida (DI) para la prevencin de la enfermedadpasteurelosis en dorada y lubina. ES2115550 (desarrollada en la Univ. de Santiago de Compostela).

80 Gudding, R.; Lillehaug, A.; Midtlyng, P. J.; Brown, F. (1997). Fish vaccinology. Dev. Biol. Stand. Karger, Basel, pg. 490.Chondroitinase attenuated Edwardsiella ictaluri and a vaccine for prevention of enteric septicemia (es) in fish.US5536658.

81 Anti-Enterococcus sp. (ET-2) vaccine for the prevention of enterococcal disease in turbot and process for obtaining itWO9955835 (desarrollada en la Univ. de Santiago de Compostela).

82 Vacuna anti-Flexibacter maritimus (FM-95) para la prevencin de la enfermedad flexibacteriosis marina en rodaballo y pecessalmnidos, y procedimiento de obtencin. ES2139549 (desarrollada en la Univ. de Santiago de Compostela).

83 Dra. Alicia Gibello, Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid (mediante comunicacin personal).84 Dixon, P. (1997). En: Gudding, R.; Lillehaug, A.; Midtlyng, P. J.; Brown, F. Fish vaccinology, Dev. Biol. Stand., Karger,

Basel, 191.Vaccine and diagnostic agent for iridovirus infectious disease for fish and production of the same and the like. JP9176043.

85 Frost, P. & A. Ness 1997. Vaccination of Atlantic salmon with recombinant VP2 of infectious pancreatic necrosis virus(IPNV), added to a multivalnet vaccine, suppresses viral replication following IPNV challenge. Fish and ShellfishImmunology 7: 609-619.Vaccine for immunizing fish against infectious pancreatic necrosis virus. US5165925.Fish pancreatic disease virus. EP0712926.

86 Vaccine to control the viral infection of fish. US5354555.87 Recombinant polypeptides of the haemorrhagical septicemia virus in fish. EP0377349.88 li, S.; Woo, P.T.K. (1997). J. Fish Dis. 20, 369.

33


Las vacunas hasta ahora mencionadas sonmonovalentes, es decir, proporcionan proteccincontra una nica enfermedad. Sin embargo, esposible administrar vacunas polivalentes, params de una enfermedad, debido a los fenmenosde reactividad cruzada. Los niveles deproteccin frente a algunas enfermedades sonmayores cuando se suministran vacunas convarios antgenos procedentes de varios patgenosrelacionados, en vez de suministrados porseparado89. De esta forma, un mismo anticuerposera capaz de reconocer antgenos procedentesde patgenos diferentes, ya que comparten ciertosdeterminantes antignicos. Se ha observado queel sistema inmune de los peces se encuentramenos diversificado que el de los mamferos, y lasvacunas polivalentes han presentado una mayorcapacidad de induccin de la respuesta inmuneque las vacunas monovalentes. De esta forma seha establecido que vacunas con antgenos deVibrio anguillarum, Vibrio salmonicida yAeromonas salmonicida han dado mayores nivelesde proteccin frente al proceso de la Forunculosisque aquellas vacunas monovalentes empleadasfrente a este proceso. Esto puede deberse a laexistencia de reacciones cruzadas entre Vibrio yAeromonas.

4.4. Seleccin Asistida porMarcadores

Los peces pasan un periodo relativamente largohasta la maduracin sexual, y por ello los mtodosde seleccin gentica tradicionales hanevolucionado de forma mucho ms lenta que en elsector ganadero, as por ejemplo en salmn tansolo se han estudiado 10 generaciones en 20 aosde investigacin. Por este motivo, las tcnicasmoleculares de seleccin asistida por marcadores,se estn convirtiendo en una herramientaimprescindible para acelerar la produccin deprogenies de peces con caractersticas ventajosaso deseables comercialmente.

Seleccin de reproductores:

Mayor tamao y conversin alimenticia

Resistencia a enfermedades

Resistencia a stress

Asignacin de parentesco entre los peces cultivados para evitar problemas de endogamia.

Identificacin de secuencias susceptibles de ser empleadas en la elaboracin de transgnicos.

APLICACIONES DE LOS MARCADORES GENTICOS EN ACUICULTURA

89 Gudmundsdottir, B. K.; Gudmundsdottir, S. (1997). J. Fish Dis. 20, 343.

Los marcadores genticos son fragmentos o secuencias de ADN que se pueden relacionar con un rasgogentico. Estos marcadores se distinguen por ser variaciones genticas que caracterizan poblaciones ysubpoblaciones, los llamados polimorfismos90. Cuando varios marcadores moleculares se asocianinequvocamente con un rasgo gentico, se dice que forman un QTL91 (loci de rasgos cuantitativos ocuantificables). Estas regiones del genoma pueden controlar caracteres cuantitativos tales como resistenciasa enfermedades, tolerancia a condiciones ambientales extremas, produccin, calidad, y en general todacaracterstica que posea una base gentica. Estos marcadores se utilizan para realizar Mapas genticospor ligamiento, los cuales aunque no proporcionan informacin de la secuencia del genoma, permitenlocalizar QTLs de inters en el genoma.

34

Polimorfismos del tamao de los fragmentos de restriccin (RFLP92): tcnica de deteccinde fragmentos de ADN de distinto peso molecular, generados mediante la digestin con enzimas derestriccin.

Perfiles mltiples arbitrarios de amplificacin: tcnicas que emplean oligonucletidosarbitrarios para generar patrones genticos.

RAPD93 (Polimorfismo del ADN amplificado con cebadores arbitrarios): amplificacin por PCR dereas especficas distribuidas al azar por el genoma. Mtodo sencillo, que no requiereconocimientos previos sobre la secuencia. No da informacin sobre el nmero de copias de lasecuencia amplificada, y los fragmentos amplificados no suelen corresponder a ADN ligado aalgn carcter.

SSCP94 (Polimorfismo en la conformacin de las cadenas sencillas de ADN): anlisis delpolimorfismo a travs de las diferencias de conformacin de fragmentos de ADN de cadenasencilla. Puede llegar a distinguir cambios de pocos nucletidos.

AFLP95 (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados): combina el uso de enzimasde restriccin y oligonucletidos para PCR, de manera que se obtienen marcadores molecularesmuy especficos sin necesidad de conocer la secuencia con anterioridad. Capaz de generarmuchos marcadores moleculares en una sola reaccin.

Polimorfismos de repeticin: nmero variable de repeticiones en tandem o VNTR96.

Microsatlite (STR97): repeticin en tandem de secuencias de entre 2 y 5 nucletidos.Distribuidos de forma casi homognea por todo el genoma y con alta heterozigosidad.

Minisatlite: repeticin en tandem de secuencias de unos pocos nucletidos. Presentan elinconveniente de que no estn distribuidos por todo el genoma.

Otros marcadores:

SNP98 (Variaciones de una sola base nucleotdica).

EST99 (Fragmentos de genes expresados): a diferencia de los anteriores, este tipo de marcadores dependiente de secuencia.

POLIMORFISMOS EMPLEADOS COMO MARCADORES GENTICOS

90 Polimorfismo: existencia de dos cromosomas alelos de un gen presentes en una poblacin, en una frecuenciasignificativa.

91 QTL = Quantitative Trait Loci.92 RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism.93 RADP = Random Amplified Polymorphic DNA.94 SSCP = Single-Stranded Conformational Polymorphism.95 AFLP = Amplified fragment lenght polymorphism.96 VNTR = Variable Number of Tandem Repeats.97 STR = Short Tandem Repeat.98 SNP = Single Nucleotide Polymorphism. 99 EST = Expressed Sequence Tag.

35


Fig. 6. Identificacin de genes de inters a partir de marcadores (Fuente: adaptado de Houdebine, L. M. (2002).Transgenesis to improve animal production. Livestock Production Science 74 255-268).

TG TG TG TG TG TG TG TG TG TG TG TG TG TG TG TG TG TG

Gen a identificar

Cromosoma

Gen a identificar

microsatlites

Seleccin mediante microsatlites

Banco de vectores con fragmentos de cADN Identificacin del gen medianteanlisis de la expresin gnica

Clonacin del gen Secuenciacin de EST

36

4.5. Transgnesis

La seleccin de especies pisccolas se ha venidorealizando tradicionalmente por medio desucesivos cruces e hibridaciones, por los cualesera posible conseguir individuos con mutacionesnaturales. No obstante, la transferencia delmaterial gentico no se puede dirigir ni controlarmediante estas tcnicas, por lo que actualmentese estudian otras tcnicas de mejora genticatales como la transgnesis.

La aplicacin de las tecnologas de transgnesisen el cultivo de especies pisccolas escomplementaria a la utilizacin de otras tcnicasmoleculares de seleccin, diagnstico o ingenierade vacunas.

La transgnesis se puede definir como la introduccin de ADN forneo en un genoma, de modoque se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las clulas en los organismosmulticelulares. El ADN forneo o transgen se introduce en cigotos por medio de diferentes mtodos.Los embriones que hayan integrado el ADN extrao en su genoma producirn un organismotransgnico, de modo que el transgen pasar a las siguientes generaciones a travs de la lneagerminal (gametos).

PASOS A REALIZAR EN LA ELABORACIN DE UN PEZ TRANSGNICO

1. Eleccin del gen que se quiere introducir.

2. Obtencin del cADN del gen/Clonacin del gen que codifica la protena a insertar.

3. Preparacin de la construccin gentica a clonar.

4. Insercin de la construccin gentica en un plsmido bacteriano.

5. Insercin del plsmido en una cepa bacteriana y amplificacin del nmero de copias del vectormillones de veces.

6. Aislamiento de los plsmidos y fragmentacin del segmento que contiene nicamente el trasgn.

7. Insercin de millones de copias del transgn en cada huevo fecundado.

8. Incubacin y cultivo de los alevines resultantes.

9. Identificacin y seleccin de los transgnicos que expresen la caracterstica deseada.

10. Establecimiento de un programa de cultivo para estabilizar el transgn en sucesivas generaciones.

11. Aprobacin legal para su comercializacin.

Fig. 7. Pasos a realizar en la elaboracin de un pez transgnico (Fuente: elaboracin propia, tomado de, Matheson, J. C.(1999) Transgenic Fish Developments: Are Transgenic Catfish in Our Future? Catfish Farmers of America Annual Meeting,New Orleans. http://www.fda.gov/cvm/biotechnology/catfish).

37


La introduccin del ADN forneo en el genomapuede realizarse mediante varios mtodos, siendolos principales la microinyeccin, transferenciamediante vectores virales y manipulacin declulas embrionarias. No obstante, existen otrosmtodos alternativos que estn siendoperfeccionados en la actualidad tales como laelectroporacin (emisin de pulsos elctricos dealto voltaje y corta duracin), siendo el msnovedoso la electroporacin con radiofrecuencia100.

100 Hostetler, H. A., et al. (2003). High efficiency production of germ-line transgenic Japanese medaka (Oryzias latipes) byelectroporation with direct current-shifted radio frequency pulses. Transgenic Research 12:413-424.

Descripcin Ventajas Desventajas

Microinyeccinde ADN

Transferenciamediante vectores

virales

Transgnesis pormanipulacin

de clulasembrionarias

Microinyeccin directa de ungen determinado o de unacombinacin de genes de unmiembro de la misma o dedistinta especie, en el proncleode un vulo fecundado in vitro.Una vez realizada lamicroinyeccin, los vulos seintroducen en las hembras.

Los retrovirus son capaces detransportar la secuencia gnicaque se quiera insertar hasta elncleo de las clulasreceptoras.

Introduccin de ADN forneo enlugares especficos del genomade clulas embrionariasmediante electroporacin,transfeccin o microinyeccin.Las clulas transfectadas sonreintroducidas en un embrinque se reimplanta en unahembra.

Fcilmente aplicablea una ampliavariedad deespecies.

El transgn sueleestar presente entodas las clulas delos individuostrangnicos,incluyendo tambina la lnea germinal.

El gen se inserta enlugares especficosdel genoma.

El gen se inserta alazar en el genoma.

El gen se inserta alazar en el genoma.

Todos losindividuostransgnicos sonquimeras (slo uncierto porcentajede sus clulasportan eltransgn).

PRINCIPALES TCNICAS DE TRANSGNESIS

Tabla 10. Principales tcnicas de Transgnesis (Fuente: elaboracin propia).

Las aplicaciones de las tcnicas de transgnesis en organismos acuticos estn dirigidas por un lado adisminuir los costes de produccin derivados de las actividades de acuicultura, y por otro a reducir loscostes asociados al empleo de antibiticos y mortalidad debido a enfermedades infecciosas.

38

Mejora de la tasa de crecimiento.

Control de la maduracin, diferenciacin sexual y esterilidad.

Mejora de la supervivencia por medio de la resistencia a enfermedades.

Adaptacin a condiciones medioambientales.

Alteracin de la composicin nutricional de la carne.

Alteracin de determinadas capacidades metablicas: biofactoras.

PRINCIPALES OBJETIVOS DE LA GENERACIN DE PECES TRANSGNICOS

La transgnesis como tcnica de mejora genticaanimal presenta todava una serie de problemasque todava no estn resueltos. Uno de losprincipales problemas consiste en la posibilidad deocasionar algn tipo de impacto en funcionesbiolgicas controladas por mltiples genes. Sinembargo, esto no quiere decir que tan soloaquellos genes que controlan caractersticasmonognicas pueden ser objeto de transgnesis.Los genes implicados en el crecimiento ydesarrollo se encuentran regulados por un grannmero de genes, y su expresin tiene lugar por

medio de complejas cascadas de sealizacin. Sinembargo, la sobreexpresin de la hormona delcrecimiento es un ejemplo claro de transgnesisen especies pisccolas, la cual se explicar msadelante.

Las especies de peces sobre los que se handesarrollado un mayor nmero de especiestransgnicas han sido la trucha, el salmn, el pezgato, la tilapia y la carpa dorada. En Espaa laindustria no utiliza estas tcnicas y tan solo sedesarrollan a nivel cientfico.

Especie Gen forneo Efecto Estatus Pas

Salmn atlntico

AFP

AFPSalmn GH

Tolerancia al fro.

Aumento decrecimiento yconversinalimenticia.

En faseexperimental

En espera deaprobacinMtodo patentado

EEUU, Canad

Salmn cohoSalmn chinookGH+AFP

Tras un ao,aumento delcrecimiento en unfactor de 10-30.

En faseexperimental

Canad

Salmn chinookAFPSalmn GH


En faseexperimental

Nueva Zelanda

Salmn

Gen lisozima dela trucha arcoirisy gen de lapleurocidina dellenguado.

Resistenciaenfermedades.

En faseexperimental

EEUU, Canad

PECES MODIFICADOS GENTICAMENTE EN DESARROLLO

(Contina en pg. sig.)

39


Especie Gen forneo Efecto Estatus Pas

Trucha arcoirisAFPSalmn GH


En faseexperimental

EEUU, Canad

TruchaCutthroat

Salmn chinookGH+AFP

Aumento decrecimiento.

En faseexperimental

Canad

TilapiaAFPTilapia GH


Herencia estable.

En faseexperimental

Canad, ReinoUnido

Tilapia Tilapia GHAumento decrecimiento yherencia estable.

En espera deaprobacin

Cuba

Tilapia

Gen modificadode produccinde insulina entilapia

Produccin deinsulina humanapara diabticos.

En faseexperimental

Canad

Lubina rayadaGenesprocedentes deinsecto

Aumento decrecimiento yconversinalimenticia(factor de 2-30).

Herencia estable.

En faseexperimental

EEUU

Misgurnusmizolepis

(mud loach)

Pez gato

Mud loach GH+y promotes degenes de mudloach y ratn

GH

Mejora delcrecimiento encultivo del 33%.

Mejora delcrecimiento encultivo del 150%.

Mejora de laresistenciaenfermedades.

Tolerancia a bajosniveles deoxgeno.

En faseexperimental

En faseexperimental

China, Corea

EEUU

Carpa comnGH de salmn yhumano

Aumento decrecimiento.

En faseexperimental

China, EEUU

Carpa mayor dela India GH AFP

GH de humanoAumento decrecimiento.

En faseexperimental

India

Pez dorado AFP Tolerancia al fro.En faseexperimental

China, Canad

Abaln GHAumento decrecimiento.

En faseexperimental

EEUU

PECES MODIFICADOS GENTICAMENTE EN DESARROLLO (Continuacin)

Tabla 11. Peces Modificados Genticamente en desarrollo (Fuente: Elaboracin propia, tomado de, Diouf, J. (2000)Genetically Modified Organisms and Fisheries. FAO Report; Future Fish: Sigues in Science and Regulation of TransgenicFish (2003) Pew Initiative on Food And Biotechnology).GH - Hormona del crecimiento / AIP - Protena Anticongelante.

Algunas de las aplicaciones de la transgnesis enacuicultura que poseen un mayor desarrollotecnolgico son las siguientes:

a) Control de la maduracin

La mayora de las especies pisccolas no madurannormalmente en condiciones de cautiverio,especialmente cuando las variables ambientalesque condicionan el desarrollo gonadal y lamaduracin de gametos estn alteradas oausentes. En ciertas circunstancias es necesarioacelerar o retrasar la maduracin, a fin deoptimizar y sincronizar la produccin de gametosde machos y hembras, de adelantar o desfasar eldesarrollo embrionario y la produccin dejuveniles, o facilitar la hibridizacin de especies ocepas que difieren en sus perodos de maduracin.

Las estrategias reproductivas de las especiespisccolas consisten generalmente en laproduccin de una enorme cantidad de huevos, loque implica un gran desarrollo de las gnadas,que pueden llegar a suponer un importanteporcentaje del peso corporal. Esto da lugar a queen la poca de maduracin sexual se paralice casipor completo el crecimiento del animal. Dado quepara las especies cultivadas el principal inters seencuentra en la carne, a los productores lesinteresa controlar el momento en el que seproduce la maduracin sexual. El esturin es unaexcepcin ya que lo que se pretende es que lamaduracin tenga lugar, al ser el caviar elproducto que tiene valor comercial.

Tradicionalmente el control de la maduracin se haconseguido mediante la administracin decompuestos bioactivos anlogos a hormonas demamferos o peces, que son efectivos en pecestelesteos, tales como extractos degonadotropina, o compuestos que estimulan lasntesis y liberacin de gonadotrofina endgena.

El desarrollo de tcnicas de induccin demaduracin ha superado varias etapas, desde eluso de preparaciones crudas de extractospituitarios conteniendo gonadotrofinas,preparaciones de gonadotrofinas semipurificadas,hasta el uso de compuestos que estimulan lasntesis y liberacin de gonadotrofina endgena.

En la actualidad se est investigando la creacinde peces transgnicos estriles cuya actividadreproductiva pueda ser activada por medio depromotores inducibles. Como consecuencia, seconseguira no slo controlar la reproduccin y elcrecimiento ptimo de los peces, sino que en casode fuga no sera posible el cruzamiento conespecies salvajes. Hasta el momento estaestrategia tan solo ha sido demostrada enmamferos101.

La tcnica ms prometedora para controlar laexpresin de genes consiste en la tecnologaantisentido. Esta tcnica se basa en la introduccinen la clula de pequeas secuencias de ADN o ARNque bloquean la expresin de una protenadeterminada mediante la unin a ADN de cadenadoble o a ARN mensajero. Basndose en estatcnica, se ha desarrollado un promotor del gen de lahormona liberadora de gonadotropina (GnRH)fusionada con la secuencia antisentido de este gen.Este fragmento es introducido en el genoma de latrucha arcoiris, permitiendo la expresin de ARNantisentido en cerebro, y observndose unareduccin en la produccin de esperma102.

Una alternativa al uso de tecnologa antisentido esla introduccin de un transgen codificante pararibozimas, secuencias catalticas de ARNm quecortan la secuencia de ARN de manera selectiva.En peces todava no se ha desarrollado estatecnologa.

b) Crecimiento y conversin alimenticia

Prcticamente la mitad de los costes operativos enacuicultura se atribuyen a la alimentacin, y portanto uno de los principales intereses de laindustria de acuicultura consiste en acelerar elcrecimiento y mejorar la tasa de eficiencia en laconversin alimenticia de las especies cultivadas.

Los niveles endgenos de hormona de crecimiento osomatotropina (GH) son inferiores a los necesariospara el mximo crecimie

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