Genómica de patógenos de importancia en salud …Aislados de P. multocida, de pulmones de alpacas...
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Genómica de patógenos de importancia en salud animal y salud pública en Perú Dennis Carhuaricra (1) , Susana Asencios (1) , Luis Luna (1) , Marjorie Aleman (1) , Raúl Rosadio (1) y Lenin Maturrano (1) (1) Laboratorio de Biología y Genética Molecular, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos Introducción La neumonía pasteurelosica es una las principales enfermedades junto a las infecciones entéricas que causan una alta mortalidad en alpacas jóvenes, siendo Pasteurella multocida, Escherichia coli y Clostridium perfringens los agentes bacterianos mayormente aislados. Por otro lado Salmonella Typhimurium, agente etiológico de la salmonelosis, es responsable de casi 60% de pérdidas en la producción de cuyes y puede constituir una amenaza a la salud pública. Las pérdidas debido a infecciones en estas actividades impacta en el bienestar de las familias en los andes peruanos cuya economía en muchos casos dependen de la crianza de alpacas y cuyes. A continuación presentamos avances en el estudio de estos patógenos usando tecnología de secuenciamiento masivo de Illumina y análisis bioinformático dedicados principalmente a la caracterización de patógenos, epidemiología, transmisión, estudio de resistencia antimicrobiana e identificación de blancos terapéuticos para el desarrollo de vacunas. . Metodología Cepas y secuenciamiento Aislados de P. multocida, de pulmones de alpacas muertas por neumonía en el periodo de 2007-2010 en la estación de La Raya-Puno, y de Salmonella Typhimurium de distintos órganos (hígado, vesícula, bazo) de cuyes muertos por salmonelosis en granjas de Pachacamac-Lima y Huancayo fueron seleccionados para secuenciamiento genómico usando la plataforma Illumina. Análisis Bioinformático La calidad de los reads fueron verificados con FASTQC, ensamblados con SPAdes, evaluados con QUAST y luego anotados con prokka. Otros genomas fueron descargados del NCBI para análisis comparativo. Genómica comparativa de Pasteurella multocida 345 genomas de P. multocida fueron descargados de la base de datos SRA y de genomas del NCBI para distintos hospederos y enfermedades, las primeras fueron ensamblados usando SPades y todas anotadas usando el pipeline prokka. Todas las cepas (347, incluidas unmsm y unmsm2 aislados de alpacas) se procesaron usando Roary con 50% de cobertura y 50% de identidad para la identificación de secuencias ortólogas. Un árbol filogenómico a partir del alineamiento del genoma core fue construido usando RAxML y las señales de recombinación fueron eliminadas usando Gubbins. La estructura genética fue determinada con rhierbaps y la visualización con el paquete ggtree en R. Secuenciamiento del genoma de Salmonella Typhimurium aislado de cuyes y comparación con aislados de otros hospederos Se caracterizó el genoma de S. Typhimurium VET1 usando la base de datos Mvir para genes de virulencia y CARD de resistencia a antibióticos, asimismo se identificaron las secuencias profago usando PHASTER. Luego, 23 genomas de S. Typhimurium de distintos hospederos fueron descargados del NCBI y comparados con el genoma VET1 de S. Typhimurium de cuyes. Se identifico el genotipo MLST y se construyó un árbol filogenómico. Finalmente se compararon las secuencias usando BRIG. Resultados y discusión P. multocida infecta múltiples hospederos causando diferentes enfermedades (2) , aquí mostramos con 347 genomas analizados (con 2 secuencias procedentes de alpaca) que existe diferencias genotípicas a nivel del core genoma (2A) y genoma accesorio (2B) que son responsables del agrupamiento de cepas asociadas a enfermedades y hospedero específicos. En un agrupamiento jerárquico de 50 cepas muestran genes presentes diferencialmente que explican el agrupamiento por enfermedad específica (2C). Estos genes están principalmente asociados al metabolismo de carbohidratos y evasión de la respuesta inmune por lo que pueden ser responsables de la adaptación en esta especie (3,4) . Por otro lado, la cepa VET1 de S. Typhimurium aislada de cuyes presentó 4885 CDS y los principales factores de virulencia son del grupo de proteínas del sistema de secreción tipo III, factores de adherencia y proteínas de motilidad. Asimismo, contiene el plásmido de virulencia pSLT, presente en la mayoría de las cepas de S. Typhimurium. Figura 3: A) La cepa VET1 aislado de cuy comparado con otras cepas mostrados en anillos según hospedero por colores, además se muestra el plásmido y las secuencias fago B) árbol filogenómico junto con heatmap del genoma accesorio. La cepa VET1 se encuentra más cercana filogenéticamente a la cepa LT2 de humanos Perspectiva Actualmente el Laboratorio de Biología y Genética Molecular viene siendo financiada por INNOVATEPERU contrato 288 y FONDECYT contrato 127 para el secuenciamiento de patógenos bacterianos y virales de importancia en salud animal y para el estudio del resistoma fecal de animales de producción en Lima Metropolitana. Ambos trabajos vienen siendo desarrollados usando secuenciamiento masivo de genomas completos y metagenomas usando la plataforma Illumina-Miseq. Referencias 1. Marcelo, et al. 2017. “Identificación de Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium en cuyes mediante la técnica de PCR múltiple”. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú, 28(2), 411-417. 2. Hurtado et al. 2018. ‘Pan-genomic approach shows insight of genetic divergence and pathogenic-adaptation of Pasteurella multocida’. Gene, vol 670, 193-206, 3. Richardson et al. 2018. ‘Gene exchange drives the ecological success of a multi-host bacterial pathogen. Nature Ecology & Evolution. (5), vol. 4, 45-53 4. Iraola et al. 2017. ‘ Distinct Campylobacter fetus lineages adapted as livestock pathogens and human pathobionts in the intestinal microbiota’ . Nature communications, 8(1), 1367 Póster presentado en el V Seminario Internacional de Genómica “Liberando el poder del genoma” Lima, 22 de marzo del 2019 Figura 2: A) Análisis filogenómico del core genoma usando RAxML y recombinación corregida con gubbins. Los puntos muestran los clúster según BAPS. B) Análisis de componentes principales a partir de una matriz de presencia/ ausencia del genoma accesorio C) Agrupamiento jerárquico de genes identificados por kpax2 como responsables del agrupamiento. Contrato 288-INNOVATEPERU-2017 Contrato 127-FONDECYT-2018 Contactos: Dr. Lenin Maturrano ([email protected]) Ubigem https://www.facebook.com/ubigem/ C A B Figura 1: Flujo de trabajo desde el aislamiento del patógeno hasta el secuenciamiento necropsia aislamiento secuenciamiento B A
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Genómica de patógenos de importancia en salud animal y salud pública en Perú
Dennis Carhuaricra(1), Susana Asencios (1), Luis Luna(1), Marjorie Aleman (1), Raúl Rosadio(1) y Lenin Maturrano(1)
(1) Laboratorio de Biología y Genética Molecular, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos
IntroducciónLa neumonía pasteurelosica es una las principales enfermedades junto alas infecciones entéricas que causan una alta mortalidad en alpacasjóvenes, siendo Pasteurella multocida, Escherichia coli y Clostridiumperfringens los agentes bacterianos mayormente aislados. Por otro ladoSalmonella Typhimurium, agente etiológico de la salmonelosis, esresponsable de casi 60% de pérdidas en la producción de cuyes y puedeconstituir una amenaza a la salud pública. Las pérdidas debido ainfecciones en estas actividades impacta en el bienestar de las familiasen los andes peruanos cuya economía en muchos casos dependen de lacrianza de alpacas y cuyes.A continuación presentamos avances en el estudio de estos patógenosusando tecnología de secuenciamiento masivo de Illumina y análisisbioinformático dedicados principalmente a la caracterización depatógenos, epidemiología, transmisión, estudio de resistenciaantimicrobiana e identificación de blancos terapéuticos para el desarrollode vacunas..Metodología
Cepas y secuenciamientoAislados de P. multocida, de pulmones de alpacas muertas por neumoníaen el periodo de 2007-2010 en la estación de La Raya-Puno, y deSalmonella Typhimurium de distintos órganos (hígado, vesícula, bazo) decuyes muertos por salmonelosis en granjas de Pachacamac-Lima yHuancayo fueron seleccionados para secuenciamiento genómico usandola plataforma Illumina.
Análisis BioinformáticoLa calidad de los reads fueron verificados con FASTQC, ensambladoscon SPAdes, evaluados con QUAST y luego anotados con prokka. Otrosgenomas fueron descargados del NCBI para análisis comparativo.
Genómica comparativa de Pasteurella multocida345 genomas de P. multocida fueron descargados de la base de datosSRA y de genomas del NCBI para distintos hospederos y enfermedades,las primeras fueron ensamblados usando SPades y todas anotadasusando el pipeline prokka. Todas las cepas (347, incluidas unmsm yunmsm2 aislados de alpacas) se procesaron usando Roary con 50% decobertura y 50% de identidad para la identificación de secuenciasortólogas. Un árbol filogenómico a partir del alineamiento del genomacore fue construido usando RAxML y las señales de recombinaciónfueron eliminadas usando Gubbins. La estructura genética fuedeterminada con rhierbaps y la visualización con el paquete ggtree en R.
Secuenciamiento del genoma de Salmonella Typhimurium aislado decuyes y comparación con aislados de otros hospederosSe caracterizó el genoma de S. Typhimurium VET1 usando la base dedatos Mvir para genes de virulencia y CARD de resistencia a antibióticos,asimismo se identificaron las secuencias profago usando PHASTER.Luego, 23 genomas de S. Typhimurium de distintos hospederos fuerondescargados del NCBI y comparados con el genoma VET1 de S.Typhimurium de cuyes. Se identifico el genotipo MLST y se construyó unárbol filogenómico. Finalmente se compararon las secuencias usandoBRIG.
Resultados y discusiónP. multocida infecta múltiples hospederos causando diferentesenfermedades(2), aquí mostramos con 347 genomas analizados (con 2secuencias procedentes de alpaca) que existe diferencias genotípicas anivel del core genoma (2A) y genoma accesorio (2B) que sonresponsables del agrupamiento de cepas asociadas a enfermedades yhospedero específicos. En un agrupamiento jerárquico de 50 cepasmuestran genes presentes diferencialmente que explican el agrupamientopor enfermedad específica (2C). Estos genes están principalmenteasociados al metabolismo de carbohidratos y evasión de la respuestainmune por lo que pueden ser responsables de la adaptación en estaespecie(3,4).
Por otro lado, la cepa VET1 de S. Typhimurium aislada de cuyes presentó4885 CDS y los principales factores de virulencia son del grupo deproteínas del sistema de secreción tipo III, factores de adherencia yproteínas de motilidad. Asimismo, contiene el plásmido de virulenciapSLT, presente en la mayoría de las cepas de S. Typhimurium.
Figura 3: A) La cepa VET1 aislado de cuy comparado con otras cepas mostrados enanillos según hospedero por colores, además se muestra el plásmido y las secuenciasfago B) árbol filogenómico junto con heatmap del genoma accesorio. La cepa VET1 seencuentra más cercana filogenéticamente a la cepa LT2 de humanos
PerspectivaActualmente el Laboratorio de Biología y Genética Molecular vienesiendo financiada por INNOVATEPERU contrato 288 y FONDECYTcontrato 127 para el secuenciamiento de patógenos bacterianos y viralesde importancia en salud animal y para el estudio del resistoma fecal deanimales de producción en Lima Metropolitana. Ambos trabajos vienensiendo desarrollados usando secuenciamiento masivo de genomascompletos y metagenomas usando la plataforma Illumina-Miseq.
Referencias1. Marcelo, et al. 2017. “Identificación de Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium en cuyes mediante la
técnica de PCR múltiple”. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú, 28(2), 411-417.2. Hurtado et al. 2018. ‘Pan-genomic approach shows insight of genetic divergence and pathogenic-adaptation of
Pasteurella multocida’. Gene, vol 670, 193-206,3. Richardson et al. 2018. ‘Gene exchange drives the ecological success of a multi-host bacterial pathogen. Nature
Ecology & Evolution. (5), vol. 4, 45-534. Iraola et al. 2017. ‘Distinct Campylobacter fetus lineages adapted as livestock pathogens and human pathobionts
in the intestinal microbiota’. Nature communications, 8(1), 1367
Póster presentado en el V SeminarioInternacional de Genómica
“Liberando el poder del genoma”Lima, 22 de marzo del 2019
Figura 2: A) Análisis filogenómicodel core genoma usando RAxML y recombinación corregida con gubbins. Los puntos muestran los clúster según BAPS. B) Análisis de componentes principales a partir de una matriz de presencia/ ausencia del genoma accesorio C) Agrupamiento jerárquico de genes identificados por kpax2 como responsables del agrupamiento.
Contrato 288-INNOVATEPERU-2017 Contrato 127-FONDECYT-2018
Contactos:Dr. Lenin Maturrano([email protected])Ubigemhttps://www.facebook.com/ubigem/
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A BFigura 1: Flujo de trabajo desde el aislamiento del patógeno hasta el secuenciamiento
necropsia aislamiento
secuenciamiento
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