1

GENETICA MOLECULAR

2

3

Genes identificados 19073

Genes secuencia conocida 12527 Descripción fenotípica 374 Otros 6172

4

717

617 429 532 683 508406 427 413 717 601

206 356 328443 664 160 727 277 139 286

641

45

1097

Los números del genoma humanoLos números del genoma humano

Total de genes estimado 20.000-25.000

Genes con localización física 11419

Genes mitocondriales 37

13 / 11 / 2008

Gen

es lo

caliz

ados

por

cro

mos

oma

Características de los genes humanos que codifican proteínas.Características de los genes humanos que codifican proteínas.

Característica Mediana Promedio Tamaño muestra 

Tamaño exones 122 bp 145 bp 43.317

Número exones 7 8.8 3.501

Tamaño intrones 1.023 bp 3.365 bp 27.238

3’ UTR 400 bp 770 bp 689 (crom. 22)

5’ UTR 240 300 463 (crom. 22)

Secuencia codificadora 1.100 bp 1.340 bp 1.804

(CDS) 367 aa 447 aa  

Extensión genómica 14 kb 27 kb 1.804

5

Los genes humanos varían enormementeLos genes humanos varían enormementeen tamaño y cantidad de exonesen tamaño y cantidad de exones

6

Región del HLA de tipo III en el cromosoma 6p21.3

Gen de la distrofina en el cromosoma Xp21

La densidad de genes no es homogéneaLa densidad de genes no es homogénea

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6p21.3 Xp21

oscuras

Comparativamente ricas en ATInsensibles a la DNAsaCondensación temprana en el ciclo celularReplicación tardíaBaja densidad génicaRicas en secuencias repetidas

Claras

Comparativamente ricas en GCSensibles a la DNAsaCondensación tardía en el ciclo celularReplicación tempranaAlta densidad génicaPobres en secuencias repetidas

La densidad génica se correlaciona con el bandeo cromosómicoLa densidad génica se correlaciona con el bandeo cromosómico

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BANDAS GBANDAS G

A) Región del HLA de tipo III en el cromosoma 6p21.3

B) Intrón 26 del gen de la neurofibromatosis tipo 1

Aunque es raro, existen genes solapados y anidados Aunque es raro, existen genes solapados y anidados

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El tamaño de los genomasEl tamaño de los genomas

No existe una buena correlación entre el tamaño del genoma y complejidad genética

Existe una tamaño mínimo del genoma necesario para incrementar la complejidad

Se detecta una gran variación en el tamaño del genoma dentro de un mismo phylum

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Secuencias de DNA repetitivasSecuencias de DNA repetitivas

Generalmente, los genes son codificados por secuencias únicas de DNA

Los genomas más grandes dentro de un mismo phylum no contienen necesariamente más genes

Una gran parte del ADN repetitivo puede proceder de los elementos transponibles

Derivados de elementos transponibles

Pseudogenes procesados

Repeticiones de secuencias sencillas

Duplicaciones segmentales 10-300 kb

Bloques de secuencias repetidas en tándem (centrómeros, telómeros,...)

Derivados de trasposones

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Contenido en repeticiones del genoma humanoContenido en repeticiones del genoma humano Contenido en repeticiones del genoma humanoContenido en repeticiones del genoma humano

Elementos H. sapiens D. melanogaster C. elegans A. thaliana

LINE/SINE 33.40% 0.70% 0.40% 0.50%

LTR 8.10% 1.50% 0.00% 4.80%

DNA 2.80% 0.70% 5.30% 5.10%

 Total 44.40% 3.10% 6.50% 10.50%

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Contenido en repeticiones del genoma humanoContenido en repeticiones del genoma humano Contenido en repeticiones del genoma humanoContenido en repeticiones del genoma humano

ORGANIZACION ORGANIZACION GENERAL DEL GENERAL DEL

GENOMA HUMANOGENOMA HUMANO

GENOMAMITOCONDRIAL

GENOMANUCLEAR

ADN extragénico75%

genes y secuenciasrelacionadas

25%

Moderada o altamenteRepetido

30%

Secs. únicas obajo número de copias

45%

Repetidos dispersos12%

Repetidos en tándem o agrupados

18%

No codificante22.5%

Codificante 2.5%

PseudogenesFragmentos

génicosIntrones, secuencias

no traducidas

35000 genes proteínas

500 RNA funcionales

>500 otros RNA funcionales

>40 tRNA

4 genes rRNA Satélite

Minisatélites

Microsatélite

Cortos (SINEs) Largos (LINEs)

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15

INGENIERIA GENETICA

Deberán quedar bien claros los siguientes puntos:

•¿Cómo se manipula el DNA?•Las endonucleasas (enzimas) de restricción• Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores•Vectores eucarióticos•Organismos transgénicos•Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto •Mapas de restricción•Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción•La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)•La secuenciación del DNA

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Manipulación del DNA

Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de secuencias.

Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA específico

Esta tecnología se denomina:Tecnología del DNA recombinante, clonación

génica o ingeniería genética

Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica

Propiedad básica del DNA que permite su manipulación:

El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado

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Herramienta básica

Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato.

•Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar)

•Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes

5´-GGATCC- 3´

3´-CCTAGG- 5´

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EcoRI: E. ColiBamHI: Bacillus amyloliquefaciens

Dos tipos de cortes:

•Corte plano: extremos romos

•Corte escalonado:extremos pegajosos o cohesivos

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Herramienta básica

Las enzimas de restricción tipo II:

Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos

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Clonación del DNA

•DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)

•Vector de clonación (vehículo)

•Organismo huésped (E. Coli)

•Selección de vectores

Vector híbrido

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Vectores de clonación

•Fago (2 sitios de corte) < 24 kb

•Cromosomas artificiales P1 (derivados del bacteriófago P1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb

Clonación del DNA

Fago

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Vectores de clonación•Cósmido: extremos cos + DNA plásmido (origen replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb

•BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido F, insertos de 150-300 kb. Usados en la secuencia de genomas

Clonación del DNA

Cósmido

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Huésped: E. coli

Inserción del vector híbrido en el huésped:

•Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma

•Fago (transducción, inserción en DNA huésped)

•Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido)

Clonación del DNA

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Selección de vectores híbridos

•Plásmido: resistencia a antibióticos

•Fago : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de si contiene el inserto foráneo)

Clonación del DNA

25

Clonación del DNA

Obtención de la secuencia que se clona

•Un gen •Aislamiento a partir del mRNA (ya no tiene intrones): uso de la transcriptasa inversa que hace cDNA (por ejemplo, 1982 primera insulina humana recombinante en bacterias)

•Síntesis automatizada de DNA in vitro: a partir de la secuencia aminoacídica se puede hacer DNA con la ayuda del código (no región promotora ni controladora de la expresión) ~100bp

•Fragmentos del genoma por digestión con enzimas de restricción (aleotoria o perdigonada, Shotgun)

•Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos clonados del genoma del organismo

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Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas

•Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs):

Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura)Puede incorporar más de 500 kb de DNA

Vectores eucarióticos

Origen de replicación del DNA de levadura

(ARS)

Región centromérica (CEN)

Resistencia a antibiótico (p.e., ampr)

Origen de replicación bacteriano (ori)

CEN ARSampr ori TelómeroTelómero

Linealización (con endonucleasas) y

adición de extremos teloméricos

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Separación fragmentos

Reptación de los

fragmentos a través del gel de agarosa

28

DNA teñido con

bromuro de etidio emite fluorescencia con luz UV

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Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos

Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda

•Transferencia en Southern (Southern blotting)•Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA

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Mapas de restricciónmediante

enzimas de restricción

31

La reacción

en cadena de la

polimerasa (PCR)

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33

34

•Secuenciación

•DNA fósil (evolución,

arqueología, historia) DNA

traza

Fósiles

Mamut lanudo (40000

años)

Abraham Lincoln

(síndrome de Marfan,

afecta tejido conectivo,

fribrilina)

Hombre Neandertal ->

Hablaba como

nosotros? Color

cabello?

•Huellas dactilares del DNA (DNA

forense)

Usos de la PCR

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Secuenciación de DNA

La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA permite un conocimiento más completo de la estructura y función de un gen.

Métodos:Secuenciación manual (inicial)

Químico (Maxam y Gilbert 1977)Didesoxi (Sanger 1977)

Secuenciación automatizada (1986,…) Didesoxi

Disoxi

•La base molecular de mutaciones específicas en un gen pueden investigarse•Las secuencias del DNA han revelado regiones reguladoras comunes a todos los genes•La comparación de secuencias de diferentes especies provee estimas de las tasas de evolución molecular•Secuenciación de genomas: estructura del genoma

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Secuenciación del DNA

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Secuenciación automatizada del DNA

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