ResumenEsta revisión presentará una actualización so-

bre la orquestación de la respuesta inmune alrededor de los gangliósidos, así como, de

las inmunoterapias contra el cáncer basadas en gangliósidos, con especial énfasis en las vacunas moleculares producidos por el Centro de Inmuno-

logía Molecular (La Habana, Cuba). El proyecto comprende las vacunas de N-acetil-N-o glycolyl-

neuraminic ácido gangliósido GM3 incorporado en muy pequeña proteoliposomes. La elaboración de

estos preparados de vacuna modelos preclínicos de melanoma, de mama y el cáncer de pulmón para la

investigación se resume. Una breve discusión sobre los avances y limitaciones de los actuales ensayos clí-nicos y las perspectivas de futuro también se incluye.

Palabras Clave: Gangliósidos, vacunas, inmunosupresión, Cáncer de mama, melanoma.

Mulens et al, Cancerología 4 (2009): 155-167

Gangliósidos en la Biologíae Inmunoterapia del Cáncer:

la Experiencia Cubana

Lic. Vladimir Mulens Arias1, Patricia Marinello2, Adriana Carr4, Zaima Mazorra1 , Luis E. Fernández3

1 Departamento de Inmunología Clínica, Dirección de Investigaciones Clínicas, CIM2 Departamento, Dirección de Investigaciones Clínicas, CIM

3 Departamento de Vacunas, Dirección de Investigaciones y Desarrollo, CIM4 Departamento de Gerencia, CIM

Correspondencia:Lic. Vladimir Mulens AriasDepartamento de Inmunología Clínica, Dirección de Investigaciones Clínicas, CIM Calle 216 Esq. a Ave. 15, Atabey, Playa, Ciudad de La Habana, CP 16040, Habana 11600.e-Mail: vladimir@cim.sld.cu

155

AbstractThis review will present an update in anticancer gangli-

oside-based immunotherapies and ganglioside-driven immunological response orchestration, with particular

emphasis on molecular vaccines produced by the Center of Molecular Immunology (Havana, Cuba). The project comprises vaccines of N-acetyl- or N-glycolylneuraminic acid GM3 ganglioside incorporated into very small pro-teoliposomes. Development of these vaccine preparations

from preclinical models of melanoma, breast and lung cancer to human investigation is summarized. A brief

discussion on the progress and limitations of present-day clinical trials and future prospects is also included.

Key words: Gangliosides, vaccines, immunosuppression,Breast Cancer, melanoma.

Gangliósidos en la Biología e Inmunoterapia del Cáncer

156

IntroducciónEl significado más reciente del término de vacuna involucra cualquier antígeno o fragmento de antíge-no, o cualquier grupo de antígenos, que sean usados juntos o separados con el objetivo de modificar la respuesta inmune. La aplicación de este concepto a la terapia contra el cáncer devino crucial una vez que se revolucionó el campo del estudio de antígenos moleculares diferencialmente expresados en los teji-dos malignos, identificándose una serie de antígenos asociados a tumores (1). Dentro de esta revolución, las estructuras de naturaleza carbohidrática han de-venido en antígenos potenciales para la obtención de formulaciones vacunales para inmunoterapia contra el cáncer (2). Se han descrito, para ciertos tipos de cáncer, cambios en el patrón de expresión de carbo-hidratos asociados con transformación maligna (3).

Se han identificado una gran cantidad de gangliósi-dos, de estructuras químicas de naturaleza liposa-cáridas, que se expresan diferencialmente en tejidos malignos, respecto a los tejidos normales, ya sea porque no se expresan en el tejido normal, o porque existan diferencias cuantitativas de expresión entre ambos. Pese a esta potencialidad de los gangliósidos, se conoce que son moléculas poco inmunogénicas debido a su naturaleza química y a su condición de antígenos propios, por lo que generalmente inducen una respuesta Timo-independiente característica (4). Sin embargo, se ha detectado la presencia de linfocitos T específicos al gangliósido, el cual no está presentado en moléculas de MHC clásico, sino en una familia de moléculas presentadoras no conven-cionales denominadas CD1 (5, 6). En pacientes de cáncer, se ha reportado una inmuno-supresión avanzada, incluso, en tumores de estadios primarios (7). Los mecanismos que median esta in-munosupresión, aunque no dilucidados totalmente, dependen en gran medida de la inestabilidad genética de las células tumorales (8), que proporciona al tumor la capacidad de evolucionar a características que el sis-tema inmune no es capaz de contrarrestar (Inmuno-edición). Diversas causas hacen del microambiente tumoral altamente inmunosupresor. En primer lugar,

vale señalar el estado no respondedor de los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL, del inglés tumor-infil-trating lymphocyte) inducido por este (9). Por otra parte, la inhibición por factores solubles, liberados por el tumor, de la maduración de células dendríticas a fe-notipo activo, así como la inducción de apoptosis o la sensibilización a sufrirla en los TILs o en los linfocitos periféricos (10), contribuyen a tal efecto.

Los gangliósidos, en muchos casos, tienen propie-dades inmunosupresoras (11). Muchos de ellos son sobre-expresados y liberados por diferentes tumores, actuando a nivel local sobre las células del sistema in-mune. El mecanismo de acción de los gangliósidos va desde la inserción en la membrana citoplasmáti-ca, por su naturaleza química, la regulación de la fun-ción de varios tipos de receptores, hasta la inducción de la expresión de moléculas que participan en cas-cadas de señalización. Teniendo en cuenta esto, una vacuna que use un gangliósido como inmunógeno, ha de ser capaz de abrogar en cierta medida el efecto inmunosupresor de las entidades moleculares del gangliósido liberado por el tumor.

Se han llevado a cabo varios ensayos clínicos basados en la inmunoterapia activa con formulaciones que usan moléculas de gangliósido, como son los llevados a cabo con el GM2 (12), el NeuAcGM3 (13).

En esta revisión científica será presentada una ac-tualización de las inmunoterapias basadas en gan-gliósidos que el Centro de Inmunología Clínica ha llevado a cabo en los últimos años, desde estudios pre-clínicos hasta los estudios clínicos más avanza-dos. El proyecto incluye las vacunas ácido N-acetil-neuramínico (NAcGM3) y ácido N-glicolil-neura-mínico (NeuGcGM3), ambos embebidos en VSSP (del inglés, very small size proteoliposome).

Estructura y FunciónLos gangliósidos pertenecen a un grupo de lípidos de membrane (glicoesfingolípidos) constituidos por una porción lipídica, ceramida (esfingosina más ácido gra-so), y una porción sacarídica (Figura 1). Las diferentes subclasificaciones se derivan de las variaciones estructu-

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rales en las tres entidades químicas que los constituyen. La nomenclatura de estas moléculas se basa en la com-posición sacarídica, secuencia de azúcares y uniones anoméricas. Se caracterizan por la presencia de uno o más cadenas de ácido siálicos. Los gangliósidos contie-nen dos variantes de ácido siálico: la variante N-acetilada (NeuAc) y la N-glicolilada (NeuGc). Aunque los teji-dos normales de la mayoría de los mamíferos contienen las dos variantes, los tejidos humanos normales expre-san solamente formas N-acetiladas (14), debido a que la enzima NeuAc hidroxilasa, clave en la biosíntesis de residuos hidroxilados, se encuantra inactivada (15-17).

A los gangliósidos les han sido atribuidas múltiples funciones en los sistemas biológicos, tales como re-ceptores de variadas toxinas (18), virus (19), proteí-nas adhesivas (20) e interferón (21). Adicionalmen-te, se consideran reguladores de eventos relacionados con el crecimiento y la diferenciación celular (22), mediadores de la adhesión celular (23), trasmisores de señales intracelulares (24) y agentes inmunorre-guladores (25). Los gangliósidos juegan un rol fun-damental en la formación de los cuerpos celulares neuronales (26,27) y son muy importantes como moléculas señalizadoras, pues se ha constatado que la adición de gangliósidos como GM3 o GM1 a cé-lulas en crecimiento puede inhibir la fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (28).

Gangliósidos como Antígenos TumoralesEl análisis de la respuesta inducida en pacientes con me-lanoma maligno, inmunizados con células tumorales o sus lisados, ricos en proteínas, glicoproteínas y ganglió-sidos, mostra que los únicos antígenos reconocidos

por el suero de más de un paciente fueron el GM2 y el GD2. Otros estudios desarrollados en pacientes con melanoma metastásico mostran que los melanocitos normales contienen predominantemente GM3, mien-tras que el GD3 aumenta durante la transformación oncogénica, verificándose un cambio importante en la relación GM3:GD3 cuando el melanoma progresa hacia variantes altamente metastásicas (29).

Aunque la porción hidrofóbica de los gangliósidos es poco inmunogénica, cualquier cambio en la misma puede variar la orientación o el ángulo de la cadena saca-rídica, exponiéndola para la neosíntesis o la degradación por las enzimas glicosiltransferasas y desglicosilantes, lo cual puede crear nuevos determinantes antigénicos en la superficie de las células tumorales (21,30).

Varios gangliósidos han sido reportados como antígenos de diferenciación expresados en la superficie celular de melanomas humanos y otros tipos de cáncer (31-34).

Durante la transformación neoplásica, se detectan alte-raciones en la densidad y distribución en la superficie celular (15), lo que podría influir en el enlazamiento de anticuerpos a las mismas en diferentes tejidos normales y tumorales (35). Igualmente se ha reportado la expre-sión de moléculas de este tipo que normalmente no se encuentran o que están expresadas en pequeñas canti-dades en las células progenitoras de las tumorales, y que pueden ser expresados en otros tejidos normales (34).

Existen reportes de diferentes grupos sobre la pre-sencia de gangliósidos N-glicolilados a nivel tisular en pacientes con cáncer de colon, melanoma, retino-

blastoma y cáncer de mama, ajustándose esta molécula a la definición de antíge-no tumor específico (36-38).

La existencia de gangliósidos N-glicolilados en tejidos tumorales ha sido bastante discutida y aunque los resul-tados experimentales indican que la vía fundamental de síntesis por hidroxilación del CMP-NeuAc no ocurre

α2-8

α2-3

β1-4

NHAc NHAc

NH

OH

O Ácido Graso

Esfingosina

Figura 1 ■Ilustración esquemática de la estructura

general de los glicoesfingolípidos. Se muestra la mitad lipídica, ceramida (Ácido graso más Esfingosina), y la

cadena sacarídica.

Gangliósidos en la Biología e Inmunoterapia del Cáncer

158

en el hombre, no se puede obviar la existencia de otras vías minoritarias (15). Recientemente se ha sugerido la incorporación en la dieta del hombre como una vía potencial para la adquisición por parte de muchas célu-las del organismo de entidades de NeuGc. A través de procesos de endocitosis los glicoconjugados alcanzan estructuras lisosómicas, que los degrada hasta unidades libres de NeuGc. Estas unidades son incorporadas a es-tructuras moleculares dentro del citoplasma (39).

Inmunogenicidad e Inmunosupresión Inducida por Gangliósidos

Los cambios que ocurren en la expresión de los gan-gliósidos durante las transformaciones oncogénicas los convierte en candidatos atractivos para la inmu-noterapia del cáncer. Sin embargo, la inmunización con antígenos sacarídicos desarrolla una respuesta de anticuerpos de baja afinidad y de corta duración, en la que predomina el isotipo IgM a pesar de repe-tidas inmunizaciones, catalogándose esta respuesta como timo independiente (4). Esta última defini-ción se ha vuelto controversial en los últimos años, al demostrarse la presencia de células T específicas contra los gangliósidos. En este caso, se ha detectado la presencia de linfocitos T específicos al gangliósi-do, el cual no está presentado en moléculas de MHC clásico, sino en una familia de moléculas presentado-ras no convencionales llamadas CD1 (5, 6).

La poca inmunogenicidad de los gangliósidos está asociada en primer lugar a su naturaleza química oligo-sacarídica, carente de epítopes T para la cooperación T-B durante la respuesta inmune. Estas moléculas son generalmente autoantígenos debido a su presencia en tejidos normales, lo que determina que sean tolerados inmunológicamente en mayor o menor medida. Esta tolerancia se refuerza durante el crecimiento tumoral debido a que cantidades cada vez mayores del antíge-no son liberadas por las células tumorales hacia el mi-croambiente de las mismas y hacia la circulación sis-témica. Los gangliósidos liberados pueden interactuar con las células del sistema inmunológico e inactivarlas. Además, la presencia en las células tumorales de otros autoantígenos rodeando a los gangliósidos refuerza la pobre inmunogenicidad de estos últimos (40).

La posibilidad de romper esta tolerancia en individuos normales y en pacientes con melanoma ha sido seña-lada por la presencia en el suero anticuerpos naturales específicos contra estos autoantígenos y de las células B que los producen, lo que indica que los linfocitos B anti-gangliósidos no han sido clonalmente eliminados y se encuentran funcionalmente silentes (41-43).

El uso de diferentes adyuvantes inmunológicos y el acoplamiento covalente a proteínas transportadoras han sido algunos de los métodos más empleados para aumentar la inmunogenicidad de estas moléculas (44). Otro acercamiento empleado para potenciar la inmu-nogenicidad de los gangliósidos incluye el uso de los liposomas. Estas estructuras biodegradables, no tóxi-cas e inmunológicamente inertes pueden mejorar la presentación de los antígenos tumorales, incorpora-dos en ellos, a las células del sistema inmune (21, 45).

Se ha observado que los gangliósidos tienen la capa-cidad de inhibir la respuesta linfoproliferativa de lin-focitos humanos a mitógenos y antígenos (46), y de la proliferación de células dependiente de IL-2 (47), la inhibición de funciones efectoras citotóxicas (48), y la unión de esta molécula a células auxiliadoras y modulación de la expresión de la molécula CD4 (49). Se ha reportado, por ejemplo, que gangliósidos como el GM3 y el GD3 inhiben la proliferación de linfocitos humanos inducidos por fitohemaglutinina e IL-2. De igual forma, se ha observado que el GM3 inhibe significativamente la proliferación de linfoci-tos de sangre periférica inducida por Concanavalina A50. Por otra parte se ha demostrado el efecto inhi-bitorio dosis dependiente de la adición de gangliósi-dos exógenos como el NeuAcGM3 y GD3 sobre la citotoxicidad de las células NK (48).

Uno de los mecanismos mediante el cual los tumores escapan de la vigilancia inmunológica es la liberación o “shedding” de los gangliósidos. Este fenómeno con-siste en la secreción continuada de estas moléculas del tumor hacia el microambiente del mismo, y hacia la circulación sistémica, lugares donde pueden interac-tuar con las células del sistema inmune e inactivarlas.

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Gangliósidos como VacunasUn ensayo clínico aleatorizado que comenzó al final de la década de 1980 en el Centro de Cáncer Memorial Sloan-Kettering, usando GM2+BCG después de ci-clofosfamida (baja dosis, como inmunomodulador), demostró una inducción de IgM anti-GM2 en el 80 % de los pacientes. Al comparar la evolución clínica de los respondedores contra los no respondedores, los autores concluyeron que la presencia de anticuerpos anti-GM2 representaba un factor de pronóstico favorable.

La vacuna con el gangliósido GM2, ha sido desa-rrollada hasta fase III en tres ensayos (12,51,52). La primera formulación fue probada con BCG. Pese a que la mayoría de los pacientes mostraron títulos específicos de IgM asociado con una tendencia a la prolongación del intervalo libre de enfermedad y de la supervivencia, comparándolo con el control que solo se le administró BCG, la vacuna no mostró di-ferencias significativas respecto al este control. Pos-teriormente, se diseñó una nueva formulación en la que se conjugó GM2 con KLH en adyuvante QS-21. Esta formación resultó ser ineficaz comparada con la terapia de altas dosis de IFN-2α en pacientes de me-lanoma (51). En el Cuadro 1 se muestran algunos de los ensayos clínicos llevados a cabo fuera de Cuba con gangliósidos como blancos terapéuticos.

La experiencia del CIMInmunosupresión inducida

por el gangliósido NeuGcGM3Entre las influencias supresoras de la variante acetilada del gangliósido GM3 (NAcGM3) sobre la función de las células T, se encuentra la inducción de la modula-ción negativa de la expresión del coreceptor CD4. Considerando la similitud de estructura ente la varian-te acetilada y la glicolilada (NeuGcGM3), se analizó la posibilidad de que esta última tuviera efectos similares a NAcGM3. Efectivamente, la adición del gangliósido NeuGcGM3 exógenamente induce la modulación negativa de la expresión del coreceptor CD4 tanto en células linfocitarias murinas como humanas (53). Notablemente, este efecto depende de la inserción del gangliósido en la membrana citoplasmática linfocita-ria, demostrándose una correlación inversa entre los

niveles de expresión del CD4 y los niveles de inserción del gangliósido NeuGcGM3 en membrana.

Mientras el gangliósido NeuGcGM3 induce la mo-dulación negativa de la expresión del CD4 tanto en poblaciones linfocitarias CD4+CD25- como CD4+CD25+, la capacidad inhibitoria y proliferativa de estas últimas no es afectada cuando se estimulan con anti-CD3 e IL-2 en presencia del gangliósido. Por el contrario, cuando las células T CD4+CD25- son co-incubadas con células dendríticas autólogas y anti-CD3, y, además, con el gangliósido, su capacidad proliferativa se ve marcadamente inhibida, así como, su perfil de secreción de citoquinas que cambia a un patrón anti-inflamatorio con la secreción de altas con-centraciones de IL-4 e IL-10 y reduciendo la secre-ción de IFN-γ comparada a las propias células cuando no son co-incubadas con el gangliósido (59).

En otro orden de cosas, cuando precursores de mé-dula ósea se cultivan para diferenciarlas en células dendríticas, el número de células recuperadas y su perfil de activación varia notablemente cuando al cultivo se le adiciona NeuGcGM3 (50 μM), media-das por la baja expresión de CD40, CD80 y CD86 y la alta expresión y secreción de IL-10 (59).

Todo esto coadyuva a pensar que la variante glico-lilada del gangliósido GM3 (NeuGcGM3) pue-de comportarse como un mediador potente de la inmunosupresión inducida por varios tipos de tumores afectando, así, los mecanismos de inmu-novigilancia a diferentes niveles: la diferenciación de células dendríticas, maduración en un contexto pro-inflamatorio, y la estimulación de células T que no han encontrado el antígeno. Notablemente, no parece afectar el comportamiento de células regula-doras (Figura 2).

El VSSP como Adyuvante:Enfoque Preclínico

El descubrimiento y caracterización de adyuvantes que promuevan inmunidad dependiente de una res-puesta celular Th1 ha sido por los últimos años un área importante de investigación. En este sentido, el

Gangliósidos en la Biología e Inmunoterapia del Cáncer

160

Cuadro 1■Diversos ensayos clínicos que se han llevado a cabo con las vacunas basadas en gangliósido.

Cuadro 2■Reporte de eventos adversos en los distintos ensayos clínicos que se han llevado a cabo con las vacunas basadas en gangliósido en Cuba.

Tumor

MM

MM

MM, SM

MM

MM

MM

SCLC

GM

Antígeno

GM2 (Control:sin GM2)

GM2-KLH

GM2/GD2-KLH

BivalenteGM2-KLH

± IFN-α

GM2-KLH (vs. Altas dosis

de IFN-α)

GM2-KLH vs. Sin

antígenoFucosil-GM1-

KLH

GD2-KLH

Adyuvante

BCG

QS-21

QS-21

QS-21

QS-21 (grupo control

sin QS-21)

QS-21 (grupo control sin QS-21)(52)

QS-21

Monofosforil-lípido A

No. Pacientes

122

52

31

107

880

1300

13

7

Vía

id

sc

sc

sc

sc

sc

sc

sc

Reacciones adversas

In�amación Local

Reacciones sitio de inyección,

�ebre, escalofríosReacciones sitio de

inyección, �ebre, escalofríos

Aumento severo de enzimas hepáticas,

granulocitopenia, fatiga.In�amación Local, efectos

neurológicos, síntomas parecidos a la gripe

Eritema local, síntomas leves gripales, diarrea,

neuropatíaReacción tipo 4 local

Efectos

54 meses seguimiento, mejoró SLR con 18% (NS), y la SG con un 11% en el

grupo vacunado (12)

IgG (71%) e IgM (88%) anti-GM2 (54)

IgG y/o IgM anti-GM2 (98%); anti-GD2 (48%)(55)

IgM (90 %) e IgG (>92 %) anti-GM2 independiente de IFN-α;

SLR más largo sin IFN-α (56)Tiempo de seguimiento medio: 16 meses;

SLR 22.5 meses (vacunados) vs. No alcanzado (control); SG a los dos años:

73% vacunados vs. 78% control (51)

Respuesta de IgG e IgM (57)

No indujo respuesta anti-GD2 humoral (58)

MM (Melanoma maligno); SM (Sarcoma maligno); GM (Glioma maligno); SCLC (Carcinoma de células pequeñas de pulmón);sc (Subcutáneo); id (Intradérmico); BCG (Bacillus Calme�e-Guerin); NS (No signi�cativo)

Eventos adversosDolor en el sito de inyección

Eritemas, EndurecimientoFiebre

MialgiaEscalofríos

AstemiaAnorexia

Náusea y VómitoAumento enzimas hepática

Aumento de bilirrubinaLeucopenia

Dolor de cabezaDolor abdominal

Vitiligo y despigmentación de la piel

EstudioCancer

FormulaciónMáximo grado

Dosis/# Pctes

Fase Ib/IIaMelanoma

NeuGcGM3/IMII

200 μg/12100825231010113

Fase Ib/IIaMelanoma

NeuGcGM3/IMIII

400 μg/109687

10538221710

Fase IMama

NeuGcGM3/IMII

200 μg/212120212

15__73_28__

Fase IMelanoma

NeuAcGM3/IMIII

120-360 μg/26_

ReportadoReportado

_Reportado

_________

NeuGcGM3/IM: Consiste en NeuGcGM3 embebido en VSSP e inyectado intramuscularmente con igual volumen de Montanide ISA51NAcGM3/IM: Consiste en NeuGcGM3 embebido en VSSP e inyectado intramuscularmente con igual volumen de Montanide ISA5

proteoliposoma de muy bajo tamaño, obtenido a par-tir de la membrane externa de Neisseria meningitidis, ha demostrado ser un potente adyuvante pro-Th1 (60). La co-incubación de células dendríticas muri-nas derivadas de médula ósea y de células dendríticas

humanas derivados de monocitos, con VSSP induce el aumento de expresión en membrana de MHC-II y de moléculas co-estimulatoria importantes para la función presentadora como CD80, CD86 y CD40. Notablemente, no existen diferencias significativas

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entre las propiedades estimulantes del VSSP y el li-popolisacárido de bacteria, corrientemente utilizado como control positivo de activación de células den-dríticas. Por otra parte, el aumento de la producción de IL12, citoquina pivote en la respuesta celular tipo 1 (Th1), por parte de las células dendríticas tras es-timulación con VSSP realza la capacidad de inducir este tipo de respuesta. Por otra parte, el VSSP induce preferentemente la secreción de IL-6 por células mo-nonucleares de sangre periférica humana (62).

Aún más, las células dendríticas murinas maduradas

con VSSP son capaces de inducir un patrón celular Th1 en células murinas CD4+ T específicas para OVA teniendo en cuanta la alta secreción de IFN-γ, IL-2 y la disminución de la secreción de IL-4, siendo compara-ble al efecto producido por el lipopolisacárido (60).

En concordancia con esto, ratones inmunizados con células irradiadas de CT26, o F3II, conjuntamente con VSSP, seguido por la inoculación de alta dosis de las células tumorales competentes son capaces de mostrar actividad antitumoral, no siendo así para aquellos rato-nes inmunizados solo con células tumorales irradiadas (61). Cuando se inmunizan ratones con OVA adyu-vada con VSSP, se observa, igualmente, un aumento de las células T CD8 específicas contra el péptido de OVA, SIINFEKL, así como un aumento de la secre-ción de las células T CD8 ante estimulación con el propio péptido comparado con aquellos ratones que no recibieron inmunizaciones adyuvada con VSSP.

NeuGcGM3 y NAcGM3en la Inmunoterapia del Melanoma

En años recientes, se han llevado a cabo estudios de ac-tividad antitumoral y toxicológica de las formulaciones NAcGM3/VSSP y NeuGcGM3/VSSP usando dife-rentes modelos animales. La actividad antitumoral del preparado vacunal NAcGM3/VSSP más Montanide ISA51TM (SEPPIC, Inc, Paris, Francia) fue evaluado en el modelo de melanoma murino B16 (63). La vacuna fue administrada intramuscularmente cada 14 días, en tanto, las células de B16 fueron inoculadas subcutá-neamente en el flanco derecho de ratones C57BL/6. El esquema demostró ser capaz de demostrar una su-presión significativa y un aumento de la supervivencia se constató en aquellos animales, a los que se les inocu-ló menos de 104 células de B16, que al menos habían recibido 4 inmunizaciones. La vacunación también redujo el crecimiento tumoral en animales a los se le inocularon altos niveles de células B16 o la varian-te agresiva B16-F1. Por otra parte, la vacunación con NAcGM3/VSSP después de la escisión quirúrgica del tumor primario aumenta la sobrevida de los ratones.

La actividad antitumoral del preparado NAcGM3/VSSP contra el modelo de melanoma B16 fue alta-

NeuGcGM3 NAcGM3

CD4

CélulasDéndríticas

IL-10CD80CD86IL-12 �0

�2 �3

Figura 2■Esquema general de los mecanismos propuestos para la inmunosupresión inducida por los gangliósidos NeuGcGM3 y NAcGM3. La liberación de gangliósido por las células tumorales aumenta su concentración en el microambiente tumoral. El gangliósido liberado afecta directamente a las células dendríticas y precursores que infiltran el tumor impidiendo su diferenciación y/o maduración a células dendríticas pro-inflamatorias. Estas células dendríticas tienen baja expresión de CD80, CD86, CD40, e IL-12, y alta expresión de IL-10, una citoquina anti-inflamatoria. Estas células inducen un patrón Th2 en las células T activadas por ellas, con alta secreción de IL-4 e IL-10, y bajos niveles de IFNγ. Igualmente, el gangliósido puede insertarse directamente en la membrana de los linfocitos T e inducir la modulación negativa de la expresión del coreceptor CD4, aparejado con un cambio de secreción de citoquinas a Th2. Como resultado, aún en un ambiente pro-inflamatorio, las células tumorales inducen una respuesta anti-inflamatoria.

Gangliósidos en la Biología e Inmunoterapia del Cáncer

162

mente específica, dependiente del adyuvante y no tran-siente. La vacuna indujo una considerable respuesta humoral específica contra el gangliósido NAcGM3, de isotipo IgM e IgG (con predominio del subtipo IgG2b e IgG3), en ratones. Adicionalmente, una fuer-te citotoxicidad mediada por completo contra células B16 se indujo con la vacunación. La reactividad de la IgG sérica de ratones vacunados fue confirmada por un ensayo sensible basado en inmunoperoxidasa en especímenes de B16 de ratones portadores del tumor, así como, por ensayo de reconocimiento citométrico. Tal efecto antitumoral demostró ser dependiente de la expresión de gangliósidos en la superficie de las célu-las B16, teniendo el componente siálico un rol central en la inmunidad humoral en ratones vacunados.

Un punto clave en el desarrollo de estrategias vacuna-les en la actualidad, es extender su uso a la inmunote-rapia profiláctica. El éxito de las vacunas profilácticas del cáncer dependería de que los antígenos nomina-les seleccionados sean esenciales para el crecimiento y progresión tumoral. Esto último hace del gangliósido GM3 un candidato ideal dado su expresión (Figura 3) y rol importante en la progresión del melanoma (64). La vacunación con una formulación basada en GM3 de ratones completamente sanos C57BL/, pre-viene, en la mayoría de ellos, el crecimiento de células de melanoma B16 positivas al GM3. Esta protección tumoral, de ratones inmunizados profilácticamente, demostró estar asociada a la presencia de anticuer-pos IgG específicos contra el GM3. Notablemente, la actividad antitumoral en estas condiciones dependió de la presencia de células T CD8, no siendo el caso para las células NK1.1+ y las células T CD4, sugirien-do que, pese a la naturaleza glicosídica del antígeno nominal, la respuesta inmune celular está involucra-da en el mecanismo de esta vacuna (64).

En un estudio clínico fase I, 26 pacientes con con-firmación histológica de melanoma maligno, 23 en estadío IV y 3 en estadío III, fueron incluidos en diferentes niveles de dosis e inmunizados por vía subcutánea con NAcGM3/VSSP (120, 240 y 360 μg) en las semanas 0, 2, 4, 6, 8, 16, 20 y 24 (65). Los efectos adversos se limitaron a aparición de de endu-

recimientos e inflamaciones en el sitio de inyección asociado con fiebre y escalofríos en la mayoría de los casos. Exceptuando dos pacientes (de los niveles de dosis de 120 μg y 240 μg, respectivamente) (Cuadro 2), los linfocitos de sangre periférica aislados post-vacunación, demostraron un índice de proliferación superior al de los linfocitos de sangre periférica pre-vacunación, además de un aumento consistente de la secreción de IFN-γ tras estimulación con NAcGM3/VSSP (5 μg/ml de NAcGM3). La inducción de la respuesta humoral de tipo IgG e IgM fue mayor para los pacientes vacunados con 360 μg de NeuGcGM3, lo que sugiere la dependencia de la respuesta humo-ral con la dosis administrada de la vacuna (65).

Notablemente, de 17 pacientes evaluados, los sueros post-tratamiento de 5 de ellos mostraron inmunoreactividad contra la línea de melanoma humana A375 comparado con los respectivos sueros pre-tratamiento, que no reco-nocieron o lo hicieron en menor medida. Teniendo en cuenta que los sueros no muestran inmunoreactividad contra células mononucleares periféricas heterólogas y que la línea tumoral A375 no expresa NAcGM3, tal inmunoreactividad apunta a antígenos tumorales bona fide distinto del blanco nominal. De manera similar, ocho pacientes fueron evaluados en la capacidad de sus sueros de mostrar inmunoreactividad contra tejido de melanoma autólogo embebido en parafina. Los sueros post-tratamiento de tres de ellos, reconocieron intensa-mente el tejido autólogo de melanoma comparado a los sueros pre-tratamiento respectivos (Figura 3).

Entre los 23 pacientes incluidos en este estudio, 12 habían recibido quimioterapia previa (DTIC y/o Cisplatino), 12 se habían tratado con IFN-α, 4 en combinación con radioterapias, y 1 paciente había recibido terapia de perfusión de miembro. Un pa-ciente del nivel de dosis de 120 μg presentó al mo-mento del tratamiento múltiples masas tisulares no medibles y una masa tumoral periaórtica. La evalua-ción del mismo paciente después de la sexta dosis arrojó una reducción del 62 % de la masa mediasti-nal comparada con la precedente en pre-tratamien-to. Este paciente fue clasificado que tuvo respuesta parcial que duró hasta los 4 meses desde el comien-

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zo de la inmunoterapia, momento en el cual nuevas lesiones dérmicas aparecieron. Un segundo paciente del nivel de dosis de 360 μg, al momento de la inclu-sión, tenía múltiples sitios metastásicos clasificado en progresión al momento de la inclusión. Durante la terapia con NAcGM3/VSSP experimentó una

estabilización de su enfermedad. Aunque estas le-siones no eran medibles, una reducción en tamaño fue aparente al momento del examen clínico, con la concurrente aparición de vitíligo alrededor de estas lesiones. Estuvo libre de síntomas de progresión por 28 meses después de su inclusión en el estudio.

En otro estudio realizado66, Fase Ib/IIa, 22 pacientes de melanoma maligno avanzado se inmunizaron con el preparado vacunal NeuGcGM3/VSSP con Mon-tanide ISA51 por vía intramuscular, 12 con una dosis de 200 μg y 10 con 400 μg. Todos los pacientes mos-traron eventos adversos asociados a la vacunación de grado I y II. Los principales eventos adversos observa-dos fueron dolor, endurecimiento y eritema en el sitio de inyección, en tanto, a nivel sistémico se desarrolla-ron síntomas asociados a gripe como fiebre, mialgia, escalofríos, dolor de cabeza, así como cambios a nivel de la piel como halo de despigmentación y vitíligo. Solo 6 pacientes presentaron eventos adversos de grado III, todos controlados exitosamente sin con-secuencias para el paciente. Todos los pacientes del nivel de dosis de 200 μg generaron respuesta de anti-cuerpos IgG e IgM contra el antígeno nominal, Neu-GcGM3, en un rango de títulos máximos de 1:2560 a 1:5120. Similarmente, los inmunizados con 400 μg, desarrollaron respuesta de anticuerpos IgG e IgM con títulos máximos de hasta 1:10240. Igualmente, se observó una respuesta de anticuerpos IgA específi-ca contra el gangliósido NeuGcGM3. Solo el nivel de respuesta humoral de tipo IgM alcanzó significación estadística al comparar los niveles de dosis, siendo mayores los títulos máximos alcanzados en el nivel de dosis superior. Los niveles de respuesta celular, me-didos por DTH, fue de un 45.5 % (5/11) en el nivel de dosis inferior, y de un 77.8 % (7/9) en el superior. Pese al estado avanzado de la enfermedad, 7 pacien-tes, de los 22 incluidos en el estudio, y que recibieron más de 15 dosis de la vacuna, sobrevivieron más de 2 años desde el momento de la inclusión. Un pacien-te tuvo respuesta parcial de su metástasis de pulmón que duró 12 meses, y 5 pacientes tuvieron estabiliza-ción de su enfermedad. Notablemente, 3 pacientes del nivel de dosis inferior mostraron evidencias de autoinmunidad al detectárseles despigmentación al-

a)

b)

Figura 3■Reconocimiento de tejido de melanoma autólogo por suero pre (a) y post-vacunación (b) de un paciente inmunizado con NAcGM3/VSSP. Guthmann M.D. et al., J Immunother 2004;27:442–451.

Gangliósidos en la Biología e Inmunoterapia del Cáncer

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rededor de lesiones primarias, dos de cuyos pacientes desarrollaron vitíligo generalizado (Figura 4).

NeuGcGM3 en laInmunoterapia del Carcinoma Mamario

Los perfiles de inmunogenicidad y toxicidad de la vacuna NeuGcGM3/VSSP fueron evaluados en

pacientes de cáncer de mama avanzado. Veintiún pa-cientes fueron incluidos en un estudio Fase I y vacu-nados cada dos semanas por los dos primeros meses (fase de inducción), luego mensualmente hasta com-pletar 15 inmunizaciones. El evento adverso más fre-cuente fue el dolor en el sitio de inyección con corta duración. Reacciones locales de la piel como infla-

Figura 4■(a), Piel normal que no muestra reactividad con el anticuerpo monoclonal 14 F7 específico por NeuGcGM3, 10x. (b), La células tumorales de una metástasis subcutánea de melanoma muestran reacción intensa con el anticuerpo monoclonal 14F7, Hematoxilina/Eosina, 6.23x. Osorio M et al.,

Cancer Biology & Therapy 7:4, 488-495; April 2008. Aparición de vitíligo en paciente inmunizado subcutáneamente con NeuGcGM3/VSSP en el área de la cara (c), y en la región que rodea una lesión previa de melanoma (d). Osorio M et al., Cancer Biology & Therapy 7:4, 488-495; April 2008.

a)

c)

b)

d)

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mación, endurecimiento y eritema, ocurrieron en el sitio de inyección, todas resueltas de 1 a 3 días. Otro efecto fue la fiebre (grado I o II, de acuerdo a los cri-terios de OMS) que desapareció espontáneamente o por uso de tratamiento antipirético (67).

Tras la inmunización, altos niveles de anticuerpos IgM contra el gangliósido NeuGcGM3 fue determi-nado en los sueros de pacientes de cáncer de mama estadío III (máximo título alcanzado varió desde 1:10000 a 1:164000), en tanto solo la mitad de las pacientes en estadío IV de la enfermedad desarrolló títulos máximos de IgM mayores que 1:10000. Altos títulos de anticuerpos IgG contra NeuGcGM3 se indujeron en el 90 % de los pacientes en estadío III de la enfermedad (máximo título alcanzado varío desde 1:10240 a 1:164000), en tanto, el 33 % de los de estadío IV demostró tener respuesta humoral IgG superior a 1:10000. Estos resultados sugieren que el esquema de vacunación en el escenario adyuvante podría ser más efectivo debido a la alta inmunogeni-cidad inducida en los pacientes con cáncer de mama en estadío III de la enfermedad, comparados con los de estadío IV. En este sentido, actualmente el CIM lleva a cabo un ensayo clínico Fase III en pacientes de cáncer de mama en estadío II-III de la enfermedad.

En otro ensayo clínico fase II con la formulación NeuGcGM3/VSSP, que siguió un esquema de in-munización similar al fase I, 79 pacientes fueron alea-torizados en grupo vacunado y grupo control. De los 30 pacientes evaluables del grupo vacunado, 27 (90 %) desarrollaron respuesta de anticuerpos específi-cos contra el gangliósido NeuGcGM3. Las media-nas de los máximos títulos fueron 1:2560 y 1:1280 para IgM e IgG, respectivamente. De forma notable, los sueros hiperinmunes (de mayor título alcanzado post-tratamiento) fueron capaces de interferir con la ocultación del CD4 inducida por el gangliósido Neu-GcGM3 in vitro (Artículo en preparación).

ConclusionesPese a la naturaleza de los gangliósidos, múltiples estrategias vacunales se han llevado a cabo con el propósito de hacerlos inmunogénicos, y, por ende,

eficaces. La tecnología del proteoliposoma de muy bajo peso de membrana de Neisseria meningitidis ha demostrado ser efectiva en este sentido. La se-lección del antígeno para la estrategia vacunal, se ha enfocado en la importancia relativa del mismo para el crecimiento y progresión de las células malignas. Dado las potencialidades como inmunosupresor de los gangliósidos NAcGM3 y NeuGcGM3, y su im-portancia en el desarrollo tumoral, los ha converti-do en probados blancos terapéuticos. No solo han sido eficaces en modelos animales, sino también han demostrado beneficios clínicos palpables en varios ensayos clínicos conducidos hasta la fecha. Sin lugar a dudas, los actuales ensayos clínicos darán mayores informaciones en cuanto al beneficio clínico y al me-canismo de acción de estos productos.

Referencias1. Lage A., Pérez R.,y Fernández L.E. Therapeutic Cancer Vaccines: At Midway Between Immunology and Phar-macology. Current Cancer targets, 2005. 5:611-627■2. Livingston PO, Ragupathi G, y Messelle C. Autoimmune and antitumor consequences of antibodies against antigens shared by normal and malignant tissues. J Clin Immunol, 2000. 20: 85-93 ■3. Hakomori S. Aberrant glycosilation in cancer cell membranes as focused on glycolipids: Overview and perspectives. Cancer. 1985. Res 45: 2405-2412■4. Livingston PO. Approaches to augmenting the immunogeni-city of melanoma gangliósidos: From whole cells to gangliósido-KLH conjugate vaccines. Immunol Rev; 1995. 145:148-66■5. De Libero, G y Mori L. Recognition of lipid antigens by T cells. Nat Rev Immunol, 2005. 5: 485-496■6. Gadola, SD et al. Structure of human CD1b with bound ligands at 2.3 Å. Nat Immunol, 2002. 3: 721-726■7. Staveley-O´Carroll K, Sotomayor E, Montgomery J, et al. Induction of antigen-specific T cell anergy: An early event in the course of tumor progression. Proc Natl Acad Sci USA. 1998. 95. 1178-1183■8. Kudo D et al. Gangliosides expressed by renal cell car-cinoma cell line SK-RC-45 are involed in tumor-induced apoptosis of t cells. Cancer Res,2003. 63: 1676-1683■9. Uzzo RG et al. Mechanisms of apoptosis in T cells from patients with renal cell carcinoma. Clin Cancer Res, 5: 1219-1229■10. Thornton M et al. Degradation of NF-κB in T cells by gangliosides expressed on renal cell carcinomas. J Im-munol, 2004. 172: 3480-3490■11. Ladisch S et al. Modulation of the immune response by gangliósidos. Inhibition of adherent monocyte acces-sory function in vitro. J Clin Invest, 1984. 74: 2074-2081■12. Livingston PO, et al. Improved survival in stage III melanoma patients with GM2 antibodies: a randomized trial of adjuvant vacci-nation with GM2 ganglioside. J Clin Oncol. 1994. 12: 1036-1044■

Gangliósidos en la Biología e Inmunoterapia del Cáncer

166

13. Alonso D.F., et al. A novel hydrophobized GM3 gangliosi-de/Neisseria meningitidis outer-membrane-protein complex vaccine induces tumor protection in B16 murine melanoma. Internacional Journal of Inmunology. 1999. 15: 56-66■14. Kawachi, S., Saida, T., Huara, H., Vemura, K., Take-tomi, T., Kano, K. () Heterophile Hanganutziu-Deicher antigen in gangliosides fraction on human melanoma tis-sues, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1988. 85: 831■15. Irie, A., Koyama, S.,Kosutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki A. The Molecular Basis for the Absence of N-Glycolylneu-raminic Acid in Humans. J.Biol. Chem. 1998. 273:15866■16. Chou, H-H., Takematsu, H., Diaz, S., Iber, J., Nicker-son, E., Wright, K. L., Muchmore, E. A., Nelson, D. L., Warren, S. T. and Varki, A. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan di-vergence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95: 11751■17. Olson, M. V. and Varki, A. Sequencing the chimpan-zee genome: insights into human evolution and disease. Nature Rev. Genetics. 2002. 4: 20■18. Takamizawa, K., Iwamori, M., Kozaki, S., Sakaguchi, G., Ta-naka, R., Takayama, H., Nagai, Y. TLC-Immunostaining charac-terization of Clostridium botulinum type A neurotoxin binding to gangliosides and free fatty acids. FEBS lett. 1986. 201: 229■19. Markwell, N.A., Svennerholm, L., Paulson, J. C. Spe-cific gangliosides as hoat cell receptors for Sendai virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. 78: 5406■20. Polley, M. J., Phillips, M. L., Wayer, E., Nudelman, A., Singhal, K., Hakomori, S., Paulson, J. C. CD62 and endothelial cell leuko-cyte adhesion molecule 1 (ELAM-1) recognize the same ligand, sialyl Lewis X. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. 88: 6224■21. Wiegandt, H. Gangliosides, en Glicolipids. ed. Wie-gandt, H. Elsevier Science Publishers, Amsterdam. 1985■22. Hakomori, S. Glycosphingolipids in cellular inte-raction, differentiation, and oncogenesis. Ann. Rev. Bio-chem. 1981. 50:733■23. Shnaar, R. L. Glycosphingolipids in cell surface re-cognition. Glycobiology. 1991. 1: 477■24. Gouy, H., Debre, P., Bismuth, G. Triggering of sus-tained calcium response through a P56 lck- dependent pathway by exogenous ganglioside GM1 in human T lymphocytes. J. Immunol. 1995. 155: 5160■25. Esselman, W. J., Miller, H. C. (1977) Modulation of B cell responses by glycolipid released from antigen-stimu-lated T cells. J. Imunol. 1994. 19■26. Kracum, Y., Rosner, H., Cosovic, C., Stavljenic, A. To-pographical atlas of the gangliosides of the adult human brain. J. Neurochem. 1984. 43: 979■27. Kotani, M., Kawashima, Y., Ozawa, H., Terashima, T., Tai, T. Differential distribution of major gangliosides in rat central nervous system detected by specific monoclo-bnal antibodies. Glycobiology. 1993. 3: 137■28. Bremer, E. G., Schelessinger, J., Hakomori, S. Gan-glioside- mediated modulation of cells. Specific effects of GM3 on tyrosine phosphorylation of the epidermal growth factor receptor. J. Biol. Chem. 1986. 261: 2434■29. Ravindranath, M. H., Tsuchida, T., Morton, D. L., Irie,

R. F. Ganglioside GM3:GD3 ratio as an index for the ma-nagement of melanoma. Cancer. 1991. 67: 3029■30. Nudelman, E., Hakomori, S., Kannagi, R., Levery, S., Yeh, M., Hellström, K. E., Hellström, I. Characterization of a hu-man melanoma-associated ganglioside antigen defined by monoclonal antibody. J. Biol. Chem. 1982. 257: 12752■31. Portoukalian, J., Zwingelstein, G., Dorre, J. Lipid com-position of human malignant melanoma tumors at various levels of malignant growth. Eur. J. Biochem. 1979. 94: 19■32. Dippold, W. G., Lloyd, K. O., Li, L. T. C., Ikeda, H., Ortega, H. F. y Old, L. J. Cell surfaces antigens of human malignant me-lanoma: Definition of six antigenic systems with monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. 77: 6114■33. Hamilton, W. B., Helling, F., Livingston, P. O. Gan-glioside expression on sarcoma and small cell lung carci-noma compared to tumors of neuroectodermal origin. Proc. Amer. Assoc. Cancer. Res. 1993. 34: 491■34. Tsuchida, T., Ravindranath, M. H., Saxton, R. E., Irie, R. F. Gangliosides of human melanoma: altered expres-sion in vivo and in vitro. Cancer Res. 1987. 47: 1278■35. Hirabayashi, Y., Hamaoka, A., Matsumoto, M., Matsuba-ra, T., Tawaga, M., Wakabayashi, S., y Tanigushi, M. Syngenic monoclonal antibody against melanoma antigen with inters-pecies crossreactivity recognized GM3, a prominent gan-glioside of B16 melanoma. J. Biol. Chem. 1985. 260: 1328■36. Higashi, H., Sasabe, T., Fukui, Y., Maru, M. y Kato, S. De-tection of ganglioside as N-glycolil neuraminic acid-specific tumor-associated Hanganutziu-Deicher antigen in human re-tinoblastoma cells. Jpn. J. Cancer Res. (Gann), 1988. 79: 952■37. Devine, P. L., Clark, B. A., Birrel, G. W., Layton, G. T., Ward, B. G., Alewood, P. F. The breast tumor-associated epitope defined by monoclonal antibody 3E1.2 is an O-linked mucin carbohydrate containing N-glycolylneura-minic acid. Cancer Res. 1991. 51: 5826■38. Marquina, G., Waki, H., Fernández, L. E., Kon, K., Carr, A., Valiente, O., Pérez, R. y Ando, S. Gangliosides expressed in human breast cancer. Cancer Res. 1996. 56: 5165■39. Bardor M, Nguyen DH, Díaz S, y Varki A. Mecha-nism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem.; 2005. 280(6):4228-4237■40. Livingston PO, Ragupathi G. Carbohydrate vaccines that in-duce antibodies against cancer. Part II: previous experience and future plans. Cancer Immunol Immunother. 1997. 45: 10-19■41. Watanabe, T., Pukel, C. S., Takeyama, H., Lloyd, K. O., Shiku, H., Li, L. T. C., Travassos, L. R., Oettgen, H. F., Old, L. J. Human melanoma antigen AH is an autoantigen gan-glioside related to GM2. J. Exp. Med. 1982. 156: 1884■42. Cohan, L. D., Irie, R. F., Singh, R., Cassidenti, A., Paul-son, J. C. (Identification of a human neuroectodermal tumor antigen (OFA-I-2) as ganglioside GD2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. 79: 7629■43. Furukawa, K., Yamaguchi, H., Oettgen, H. F., Old, L. J., Lloyd, K. O. Two human monoclonal antibodies reac-ting with the mayor gangliosides of human melanomas and comparisson with the corresponding mouse mono-

Mulens et al, Cancerología 4 (2009): 155-167

167

clonal antibodies. Cancer Res. 1989. 49: 191■44. Helling F, Shang A, Calves M, Zhang S, Ren S, Yu RK, Oettgen HF, Livingston, PO. GD3 Vaccines for Melanoma: Superior Immunogenicity of Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Conjugate Vaccines. Cancer Res. 1994. 54: 197-203■45. Alfonso, M., Vázquez, A. M., Carr, A., Haerslev, T., Fernández, L. E., Lanio, M. E., Alvarez, C., Zeuthen, J., Pérez, R. T cell- inde-pendent B cell response to self monosialogangliosides: Primary response monoclonal antibodies. Hybridoma. 1995. 14: 209■46. Ladisch, S., Kitada, S., and Hays, E. F. Gangliosides shed by tumor cells enhance tumor formation in mice. J. Clin. Investig. 1987. 79: 1879–1882■47. Merrit, W. D., Bailey, M., Pluznik, D. H. Inhibition of interleukin-2 dependent cytotoxic T-lymphocyte growth by gangliosides. Cell Immunol. 1984. 89: 1■48. Prokazova, N. V., Dyatlovitskaya, E. V., Bergelson, L. D. Sialylated lactosylceramides. Possible inducers of non-specific immunosupression and atherosclerotic le-sions. Eur. J. Biochem. 1988. 171: 1■49. Kawaguchi, T., Nokakuma, H., Kagimoto, T., Shirono, K., Horikawa, K., Hidaka, M., Iwamori, M., Nagai, Y., Takat-suki, K. Characteristic mode of action of ganglioside in selective modulation of CD4 on human T lymphocytes,. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. 158: 1050■50. Portoukalian. J. Immunoregulatory activity of gangliosi-des shed by melanoma tumors. En: H. F. Oettgen (Ed), Gan-gliosides and Cancer. VCH Publishers, New York. 1989. 207■51. Kirkwood JM, et al. High-dose interferon alfa-2b signi-ficantly prolongs relapse-free and overall survival compared with the GM2-KLH/QS-21 vaccine in patients with resected stage 11B-III melanoma: Results of intergroup trial E1694/S9512/C509801. J Clin Oncol. 2001. 19: 2370-2380■52. Eggermont AM, Keilholz U, Testori A, et al. The EORTC melanoma group translational research program on prognostic factors and ultrastaging in association with the adjuvant therapy trials in stage II and stage III melano-ma. European Organization for Research and Treatment of Cancer. Ann Surg Oncol 2001; 8 (9 Suppl.): 38S-40S■53. De León J., Fernández A., Mesa C., Clavel M. y Fer-nández L.E. Role of tumour-associeted N-glycolylated varient of GM3 ganglioside in cancer progression: effect over CD4 expression on T cells. Cancer Immunol Im-munother. 2006. 55: 443-450■54. Chapman PB, Morrissey DM, Panageas KS, et al. Induction of antibodies against GM2 ganglioside by im-munizing melanoma patients using GM2-keyhole limpet hemocyanin + QS21 vaccine: a dose-response study. Clin Cancer Res 2000; 6 (3): 874-879■55. Chapman PB, Morrisey D, Panageas KS, et al. Vaccina-tion with a bivalent G(M2) and G(D2) ganglioside conjuga-te vaccine: a trial comparing doses of G(D2)- keyhole limpet hemocyanin. Clin Cancer Res 2000; 6 (12): 4658-4662■56. Kirkwood JM, Ibrahim J, Lawson DH, et al. High-dose in-terferon alfa-2b does not diminish antibody response to GM2 vaccination in patients with resected melanoma: results of the Multicenter Eastern Cooperative Oncology Group Phase II

Trial E2696. J Clin Oncol 2001; 19 (5): 1430-1436■57. Dickler MN, Ragupathi G, Liu NX, et al. Immuno-genicity of a fucosylGM1-keyhole limpet hemocyanin conjugate vaccine in patients with small cell lung cancer. Clin Cancer Res 1999; 5 (10): 2773-2779■58. Becker R, Eichler MK, Jennemann R, et al. Phase I clini-cal trial on adjuvant active immunotherapy of human gliomas with GD2-conjugate. Br J Neurosurg 2002; 16 (3): 269-275■59. de León J, Fernández A, Clavell M, Labrada M, Be-belagua Y, Mesa C, Fernández LE. Differential influence of the tumour-specific non-human sialic acid containing GM3 ganglioside on CD4+CD25- effector and naturally occurring CD4+CD25+ regulatory T cells function. Int Immunol. 2008 Apr, 20(4):591-600■60. Mesa C, de León J, Rigley K, Fernández LE. Very small size proteoliposomes derived from Neisseria me-ningitidis: an effective adjuvant for Th1 induction and dendritic cell activation. Vaccine 22. 2004. 3045–3052■61. Mesa C, de León J, Fernández LE. Very small size pro-teoliposomes derived from Neisseria meningitidis: An effective adjuvant for generation of CTL responses to pep-tide and protein antigens. Vaccine 24. 2006. 2692–2699■62. Venier C, Guthmann MD, Fernández LE and Fain-boim L. Innate-immunity cytokines induced by very small size proteoliposomes, a Neisseria-derived immuno-logical adjuvant. British Society for Immunology, Clinical and Experimental Immunology. 2007. 147: 379–388■63. A. Carr, Z. Mazorra, D. F. Alonso, C. Mesa, O. Valien-te, D. E. Gomez, R. Perez and L. E. Fernandez. A purified GM3 ganglioside conjugated vaccine induces speci®c, adjuvant-dependent and nontransient antitumour acti-vity against B16 mouse melanoma in vitro and in vivo. Melanoma Research 2001, 11, pp. 219-227■64. Mazorra Z, Mesa C, Fernández A, Fernández LE. Immunization with a GM3 ganglioside nanoparticula-ted vaccine confers an effector CD8(+) T cells-mediated protection against melanoma B16 challenge. Cancer Im-munol Immunother. 2008 Dec; 57(12):1771-1780■65. Guthmann MD,Bitton RJ,Carnero AJL, Gabri MR, Cinat G, Koliren L, Lewi D, Fernandez LE, Alonso DF, Gómez DE, and Fainboim L. Active Specific Immunotherapy of Melano-ma with a GM3 Ganglioside-Based Vaccine. A Report on Safe-ty and Immunogenicity. J Immunother 2004; 27: 442-451■66. Osorio M, Gracia E, Rodríguez E, Saurez G, Arango MC, Noris E, Torriella A, oan A, Gómez E, Anasagasti L, Gonzá-lez JL, Melgares MA, Torres I, González J, Alonso D, Rengifo E, Carr A, Pérez R and Fernández LE. Heterophilic Neu-GcGM3 ganglioside cancer vaccine in advanced melanoma patients. Cancer Biology & Therapy2008. 7:4, 488-495■67. Adriana Carr, Edmundo Rodrı´guez, Marı´a del Carmen Arango, Rolando Camacho, Marta Osorio, Ma-riano Gabri, Guido Carrillo, Zolidina Valde´s, Yanı´n Be-belagua, Rolando Pe´rez, and Luis Enrique Ferna´ndez. Immunotherapy of Advanced Breast Cancer With a He-terophilic Ganglioside (NeuGcGM3) Cancer Vaccine. J Clin Oncology 2003. Vol 21, 6: 1015-1021■