FUNDAMENTOS EN CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN. ACOPLAMIENTO A DETECTORES DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Manuel Gayo González

Responsable de Ventas Universidad

Consultor LCQQQ&GCQQQ

Universidad Europea de Madrid, 15 de Octubre de 2010

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

En cromatografía de liquidos, los componentes a separar se distribuyenentre dos fases: una fase estacionaria y una fase móvil .

Los componentes se separan debido a la diferencia de migración entre la fase estacionaria y la fase movil.La fase móvil introduce los analitos en la columna y a través del sistema.

Como fáse móvil se utilizan líquidos.

Definición de Cromatografía de Líquidos

COMPONENTES

•Disolventes•Bomba•Sistema de Introducción de la Muestra•Columna•Detector•Adquisición de Datos

COMPONENTES: DISOLVENTES PARA HPLC

•Pureza•Viscosidad•Índice de Refracción•Punto de Ebullición•Toxicidad•Trasparencia UV•Solubilidad

Tener en cuenta:

La alta viscosidad de las

mezclas metanol/agua

(máximo a 40/60)

3 3

η

0 20 40 60 80

1

2

1

2

Vis

cosi

dad

[cP]

a 20º C

USO PREFERENTE DE ACETONITRILO

100%

n-Propanol

Etanol

MetanolAcetonitrilo

Perfiles de Presión con Gradientes Concentración

Perfil de Concentración

Presión CH3-CN / H2O

Presión CH3OH / H2O

El gráfico de viscosidad “vs” % orgánico es útil para poder calcular relaciones aproximadas de viscosidad entre

distintas composiciones de eluyentes y poder calcular presiones equivalentes:

p.e. 100 bars con ACN/H20 70/30 equivalen a 100 x (1.3/0.6) = 217 bars con CH3OH/H20 70/30

η ~ 0.6

η ~ 1.3

70/30 org. /agua

CH3OH

CH3CN

% Orgánico [w/w]

70%CH3OH 59%ACN permite Flujo x 1.9

poder eluotrópico equivalente

COMPONENTES: BOMBA DE HPLC

Gradiente a alta PresiónGradiente a baja Presión

BOMBA BINARIABOMBA CUATERNARIA

COMPONENTES: SISTEMA DE INTRODUCCIÓN DE LA MUESTRA

•Disolver la muestra en la fasemóvil o en un disolvente miscible

•Disolver la muestra en la mínimacantidad posible de disolvente

COMPONENTES: COLUMNA

•Tipo de Fase Estacionaria•Dimesiones

•Tamaño de partícula:

-0.0005

0.0000

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0030

0.0035

0.0040

0.0045

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

5.0 m

3.5 m

1.8 m

2mL/min 5.0 mL/min

HETP

(cm

/pla

te)

Interstitial linear velocity (ue- cm/sec)

Mayor Velocidad

• Inyecciones en columnas

mas cortas con menores

tamaños de partícula a

mayores velocidades

• Ganancias en velocidad:

5-10x

Pérdidas de

eficiencia con

incrementos de

flujo

Eficiencias

comparables

en zona de bajo

flujo

Particula Hmin

5.0 μm 9.3 μm

3.5 μm 6.0 μm

1.8 μm 3.8 μm

Importancia del tamaño de partícula

Selección del D.I. de la Columna según Tipo de Sistema de Bombeo

Flujotípico

Ganancia Teórica en Sensibilidad UV

Selección de la Longitud Columna y Tamaño de Partícula del Relleno “versus” Eficacia

• La Eficacia aumenta con la reducción del tamaño de partícula ( N= f(L / 2dp) )

• El tiempo de análisis se reduce acortando la longitud de la columna. ( Tr = f(L / F) )

• Reduciendo Longitud y Tamaño de partícula, pero manteniendo flujo y nº platos proporcionados por la columna,

se conseguirá reducir el tiempo de análisis y consumo de disolvente sin perder Resolución.

• Permite trabajar a flujos mayores.

• Aumenta el “poder de elución” de la fase móvil.

• Aporta un parámetro adicional para cambiar la selectividad y

mejorar la resolución en la separación de algunos compuestos.

• Traslada el flujo óptimo a valores mayores.

• Reduce la pérdida de eficacia al trabajar a flujos elevados.

Aportaciones de la Temperatura en HPLC

Reducción del Tiempo de Análisis mediante Incremento de la Temperatura

Trabajar a temperaturas más altas

permitirá reducir considerablemente los

tiempos de análisis y en ocasiones

cambiar la selectividad de la separación.

Optimización

Método

Alta

Temperatura

Baja

Temperatura

Columna: Zorbax SB-C18, 4.6 x 75 mm, 5 μmEluyente: 74% 7.4 mM hexano sulfonato y

0.07% ácido fosfórico

26% MeOH

Flujo: 1 mL/min (constante)

Detección: UV 280 nm

Muestras: Vitaminas B

min.

Acorta a 1/3 el tiempo análisis

Efecto de la Temperatura en la Viscosidaddel Eluyente y Presión de Trabajo

-35%

-55%

-65%

Reducción viscosidad

Reducción de los Tiempos y Cambios de Selectividad con la Temperatura. Efecto de laTemperatura en Tiempo Retención y Resolución

COMPONENTES: DETECTORES

•Sensible•Selectivo•Lineal•Información cuantitativa•Fiable•Facil de usar•Universal

Características del detector ideal:

COMPONENTES: DETECTORES

•Detectores de UV-Vis:

Detector de longitud de onda variable

Detector de Diode Array

PARAMETROS DEL DETECTOR: Frecuencia de Adquisición

Rojo: 13 puntos medida/pico

Azul: 50 puntos

Verde: 125 puntos

S/N= 7.5

S/N= 2.5

N

S

RSD% requerido Mín. S/N (p/p)

1% 100

2% 50

5% 20

10% 10

Una pequeña pérdida en resolución mejora considerablemente la sensibilidad

PARAMETROS DEL DETECTOR: Ajuste Frecuencia de Adquisición

MODOS DE OPERACIÓN EN HPLC

ACOPLAMIENTO DE DETECTORES DE ESPECTROMETRIA DE MASAS

SI¿Sabemos lo que

Buscamos?

Necesitamos

masa exactaMATRIZ SUCIA?

No

Menor de 5 pgEn columna? QQQ

No

Necesitamos

Qualifiers

Ions/Spectrum?

Si-spectrum

or MS/MS qualifiers

Trampa

No

SI

No

o Multi ion SIM

CONCENTRACIÓN?

Bbaja concentración

QQQ

SI

No

>1 ng en columna

No

Aceptable%RSD: >8%

No

SI

Q

SI

Necesitamos MS/MS?

No

Q

SITrampa

MUESTRA

.

SI

QQQQ

TOF

$$$> $$> $

CUANTITATIVO CUALITATIVO

SI

TOF

TOF

¿PERO QUÉ DETECTOR?

ESQUEMA DEL DETECTOR DE CUADRUPOLO SIMPLE

API

Fuente

Detector

El cuadrupolo monitoriza de

modo secuencial todas las m/z en

el rango seleccionado por el

usuario

Modos de trabajo. Cuadrupolo Simple: Full Scan MS

La mejor sensibilidad para cuantificación

Buena selectividad

La cromatografía puede mejorar la especificidad

No proporciona información estructural

API

Fuente

Detector

Guía de iones hacia el cuadrupolo

El cuadrupolo solo deja pasar

(transmite) iones de una unica m/z

hacia el detector

Formación de iones +/- y de

especies neutras

Modos de trabajo.Cuadrupolo Simple: Trabajo en SIM

Modos de trabajo. Cuadrupolo Simple: CID en la fuente

Fuentes en LCMS

Aplicabilidad relativa de las técnicas de ionización

LC/MS

Pes

o M

ole

cula

r

Polaridad del analito/

Solubilidad en Agua

API-

Electrospray

Particle

Beam

APCI1000

100,000

10,000

Thermospray

no polar muy polar

GC/MS

FAB

API-Electrospray:• La técnica de ionización más suave.

• Ideal también para compuestos lábiles.

• Interfase con mayor sensibilidad y aplicabilidad.

• Válida para compuestos de baja-media a muy

alta polaridad que se puedan ionizar en solución.

• Mediante la formación de iones con múltiples

cargas, permite el análisis de compuestos de muy

elevado peso molecular.

APCI:• Válida para compuestos de baja a alta polaridad;

no se requiere que estén ionizados en solución.

• Requiere compuestos con una cierta volatilidad.

• Buena sensibilidad para compuestos de polaridad

y peso molecular intermedios.

• Técnica que complementa a API - Electrospray

para el análisis de analitos poco polares.

APPI:• Válida para compuestos de muy baja a alta polaridad;

no requiere que estén ionizados en solución.

• Requiere compuestos con una cierta volatilidad.

• Posibilita el análisis de compuestos apolares.

Las interfases LC/MS tipo API (Electrospray

/APCI) son hoy en día las más utilizadas

APPI

Capillary

HPLC inlet

Nebulizer

Drying gas

Corona needle

ESI Zone

APCI Zone

Thermalcontainer

IR emitters

Chargingelectrode

Reversing electrode

Sensor for vapor temperature

APCI counterelectrode

En la zona ESI se crea un aerosol cargado cuya

dirección es ortogonal a la entrada del capilar MS

El aerosol es secado por lámparas de IR (no

contracorriente de N2) produciendo los iones ESI

El aerosol y los iones pasan con el gas de nebulización

de la zona ESI a la zona APCI

Las lámparas IR vaporizan de modo completo a analito y

disolvente en la zona APCI

APCI corona se produce entre la aguja y el

contraelectrodo y el disolvente se ioniza

El disolvente ionizado transfiere carga al analito

vaporizado produciendo iones de analito

Los iones ESI pasan al lado contrario del separador y

son apartados de la zona de APCI corona

Un sensor controla la temperatura del vapor de forma

que las lámparas IR mantienen la temperatura constante

Finalmente los iones ESI y APCI entran

simultáneamente al capilar y al MS (US patent 6,646,257)

video

Fuente Multimodo

Después de 635 inyecciones de una muestra con alta

concentración sales (%)

Limpieza de la Fuente

Robustez y Facilidad de uso

RESUMEN: Ventajas del acoplamiento LCMS

1973

• Operación robusta

• Identificación y confirmación

• Sensibilidad y Especificidad

• Facilidad de Uso

• Tecnología asequible

LCMS6120LCMS 6150

¡GRACIAS!