Universidad Nacional de Córdoba

Facultad de Ciencias Agropecuarias

Escuela para Graduados

Instituto de Reproducción Animal Córdoba (IRAC)

FRECUENCIAS ALÉLICAS DEL GEN COQ9 Y

RELACIÓN GENOTÍPICA CON PARÁMETROS

REPRODUCTIVOS EN UNA POBLACIÓN DE

GANADO HOLSTEIN.

Néstor Gerardo Michel Regalado

Trabajo Final

Para optar al Grado Académico de

ii

Especialista en Reproducción Bovina

Córdoba 2019

INDICE

1. RESUMEN ................................................................................................................................................. iii

2. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................... 4

HIPÓTESIS ......................................................................................................................................................... 7

OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................................................... 7

3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................... 8

3.1 DESCRIPCIÓN DE LA POBLACIÓN ANIMAL .................................. ¡Error! Marcador no definido.

3.2 TOMA DE MUESTRAS SANGUÍNEAS Y EXTRACCIÓN DE ADN ............................................... 9

3.3 ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR-RFLP................................................................... 9

3.4 OBTENCIÓN DE LAS VARIABLES REPRODUCTIVAS................................................................ 10

3.5 ESTIMACION DE FRECUENCIAS GENOTÍPICAS Y GÉNICAS .................................................. 11

3.6 RELACIÓN DE LOS GENOTIPOS CON LAS VARIABLES REPRODUCTIVAS ......................... 11

3.7 CÁLCULO DE LOS EFECTOS DE ADITIVIDAD Y DOMINANCIA POR MODELO DE

REGRESIÓN .................................................................................................................................................... 12

4. RESULTADOS ......................................................................................................................................... 12

4.1 ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA .......................................................................................... 12

4.2 FRECUENCIAS GENOTÍPICAS Y GÉNICAS .................................................................................. 14

4.3 EFECTOS DEL POLIMORFISMO EN EL DESEMPEÑO REPRODUCTIVO ................................. 15

4.4 EFECTOS DE ADITIVIDAD Y DOMINANCIA ............................................................................... 16

5. DISCUSIÓN ............................................................................................................................................. 17

6. CONCLUSIONES .................................................................................................................................... 19

7. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................................... 20

iii

1. RESUMEN

El SNP (por sus siglas en inglés Single Nucleotide Polymorphism, 18:25527339, Pub

Med) del gen COQ9 en el ganado Holstein se caracteriza por una sustitución de una

adenina por una guanina. Esta sustitución genera un cambio en la estructura terciaria de la

proteína traducida por el gen. La coenzima Q9 es una molécula precursora de la coenzima

Q, componente en la cadena de transporte de electrones de la mitocondria. El alelo A ha

sido asociado con un mejor desempeño reproductivo para tasa de preñez, días abiertos y

número de servicios. En el presente trabajo se estandarizó la técnica de diagnóstico

molecular por medio de PCR-RFLP (por sus siglas en inglés: Polymerase Chain Reaction –

Restriction Fragment Length Polymorphism) para genotipificar los alelos A y G del gen

COQ9, se calcularon las frecuencias genotípicas y génicas en una población de ganado

Holstein. Se creó una base de datos con las variables reproductivas: intervalo del parto al

primer celo, días abiertos y número de servicios por concepción. Para la asociación de los

genotipos con las variables se formaron 4 grupos de acuerdo al número de lactancia (1, 2, 3,

4) en que se encontraban las vacas y tres grupos para genotipo (AA, AG, GG), se

analizaron los datos por medio del procedimiento MIXED del programa estadístico SAS

mediante un modelo estadístico de efectos mixtos. Los resultados encontrados demuestran

un efecto de significancia estadística para las vacas heterocigóticas AG y la variable

número de servicios por concepción, por lo que éste polimorfismo podría utilizarse como

un marcado de selección molecular para mejorar el desempeño reproductivo en los establos

lecheros.

Palabras clave

Fertilidad, Bovino, Coenzima Q9, PCR- RFLP

4

2. INTRODUCCIÓN

La selección del ganado lechero y la alta especialización para la producción de leche han

derivado en una disminución significativa en el desempeño reproductivo de los hatos

lecheros (Veerkamp et al., 2003). Desde el año 1989, investigadores de la Universidad de

Cornell daban cuenta de la asociación entre la creciente producción lechera y el constante

decremento en la tasa de preñez, atribuyendo principalmente ésta reducción al balance

energético negativo de la vaca en el postparto, situación que genera un ambiente similar al

de la subnutrición y que inhibe la respuesta a las gonadotropinas para la liberación

preovulatoria de la hormona luteinizante (Wathes et al., 2007).

En un estudio retrospectivo, evaluando los datos productivos y reproductivos durante un

periodo de 10 años (1991- 2000) en la región del noreste de España, López-Gatius (2002)

encontró que la producción lechera anual incrementó de 7,800 kg por vaca en 1991 a

10,200 kg en el año 2000, los análisis de regresión revelaron que por cada 1,000 kg de

aumento en producción lechera, había un decremento de entre un 3.2 a 6% en la tasa de

preñez, de 4.4 a 7.6% en la ciclicidad y un incremento en la incidencia de ovarios inactivos

de entre 4.6 a 8%.

Una situación similar fue reportada en una población de ganado en el Reino Unido

(Royal et al., 2000), utilizando determinaciones de progesterona en leche, se compararon

los parámetros reproductivos tomados en el periodo de 1975- 1982, con los del periodo

1995-1998. Se encontró que existía un decremento porcentual promedio de un punto por

año en la tasa de preñez, incrementándose la proporción de perfiles hormonales atípicos.

Este decremento en el desempeño reproductivo se puede atribuir a que la selección

genética ha sido principalmente orientada hacia rasgos productivos, es por esto que es

necesaria una herramienta para identificar polimorfismos que tengan una relación positiva

directa con el desempeño reproductivo (Beuzen et al., 2000).

5

Debido a esto, las técnicas de selección tradicionales que se basaban en mediciones

fenotípicas del comportamiento de la progenie respecto a los parámetros de interés, se han

complementado con el uso de evaluaciones genómicas, las cuáles reducen el intervalo

generacional de manera notable y permiten trabajar con rasgos de baja heredabilidad, como

es el caso de la fertilidad, éstas pruebas han incrementado la precisión de las evaluaciones.

Se ha reportado una reducción del intervalo generacional en sementales, de 7 a menos de

2.5 años en el ganado Holstein a partir del uso de las evaluaciones genómicas en los hatos

lecheros de Estados Unidos de Norteamérica (García-Ruiz et al., 2016).

A la fecha, se han identificado diversos marcadores moleculares basados en haplotipos

(Sahana et al., 2013; Fritz et al., 2013) o conjuntos de polimorfismos de nucleótido único

(por sus siglas en inglés: Single Nucleotide Polymorphism) que generan mutaciones letales

para los embriones, éstas investigaciones se basan en la búsqueda de genotipos que después

de la segregación no se encuentran en la población, en base a ellos y sustentados en los

registros reproductivos se calcula la asociación con infertilidad. Algunos otros

polimorfismos no son letales para los embriones y es posible asociarlos con mejores

desempeños reproductivos (Hax et al., 2017; Homer et al., 2013; Khatib et al., 2008;

Nicolini et al., 2013; Ortega et al., 2017; Schneider et al., 2013).

Un ejemplo es el gen que codifica para la proteína de biosíntesis ubiquinona Q9

(COQ9), que participa en la vía de producción de la ubiquinona Q10 (COQ10), la cual es

componente importante en el sistema de transporte de electrones de la mitocondria, éste

sistema produce el adenosin trifosfato (ATP), biomolécula que proporciona energía a la

célula para realizar sus funciones metabólicas. Se ha identificado una mutación que

modifica la estructura terciaria de la proteína COQ9 producida por el gen debido a un

cambio conformacional en la estructura de diversas alfa- hélices. Esta mutación se asocia

con menores tasas de respiración mitocondrial (Ortega et al., 2017).

Por lo anterior, los ovocitos tienen menor capacidad energética para realizar sus

funciones metabólicas y son menos viables. Se ha demostrado en los mamíferos que la

proteína COQ9 interacciona con la proteína ubiquinona Q7 (COQ7) para dar origen al

aceptor de electrones COQ10, deficiencias en cualquiera de estas moléculas interfieren con

la producción normal de ATP en la mitocondria (García-Corzo et al., 2012). La función

6

precisa de la COQ9 se desconoce aún, pero se sabe que forma parte de un complejo

multienzimático encargado de realizar metilaciones, descarboxilaciones e hidroxilaciones

hasta formar la estructura quinona funcional, por lo tanto, una deficiencia en alguna de

éstas enzimas, como la COQ9, suprimirán la función de la COQ10 (Duncan et al., 2009).

Ortega et al., (2017) señalan una relación entre el polimorfismo y tres parámetros de

fertilidad en ganado lechero Holstein: tasa de preñez, servicios por concepción e intervalo

entre parto.

Si bien es cierto que se han identificado y relacionado diversos polimorfismos con

rasgos de fertilidad (Ortega et al., 2017; Hax et al., 2017; Homer et al., 2013; Khatib et al.,

2008), hasta el momento no se han reportado estudios donde se muestreen individuos en la

región del estado de Jalisco, por lo que éste estudio permitirá estimar la frecuencia alélica

del gen COQ9 en una población de bovinos lecheros de ésta región.

La detección de estos polimorfismos por medio de PCR-RFLP y su asociación con

rasgos reproductivos permitirá establecer una herramienta de selección asistida por

marcadores moleculares al alcance de los productores, lo que se verá reflejado en una

probable mejoría de la fertilidad global y aumentará las ganancias económicas derivadas de

éste concepto, como lo pueden ser el incremento en la producción de leche del hato por una

reducción del intervalo entre partos, una reducción en el número de vacas que se desechan

por causas reproductivas y un menor gasto de alimentación para animales improductivos

(Chebel y Ribeiro, 2016).

7

HIPÓTESIS

El alelo A del gen COQ9 se relaciona con parámetros reproductivos en una población de

ganado Holstein.

OBJETIVO GENERAL

Estimar las frecuencias alélicas del gen COQ9 y la relación de los genotipos con

parámetros reproductivos en una población de ganado Holstein.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1 Implementar el diagnóstico molecular (PCR) para la genotipificación de los alelos

del gen COQ9.

2 Estimar las frecuencias génicas y genotípicas del gen COQ9.

3 Identificar la relación entre los genotipos del gen COQ9 y los parámetros

reproductivos: intervalo del parto al primer celo, días abiertos y número de

servicios.

4 Estimar los efectos de aditividad y dominancia para los alelos del gen COQ9 y los

parámetros reproductivos.

8

3. MATERIALES Y MÉTODOS

La toma de muestras se realizó en una unidad de producción lechera tecnificada, en el

municipio de San Juan de los Lagos, Jalisco. Previo al muestreo se identificó a los

individuos y se agruparon de acuerdo a la lactancia en que se encontraba cada vaca,

formándose 4 grupos: grupo 1 primera lactancia; grupo 2 de segunda lactancia; grupo 3

vacas de tercera lactancia y grupo 4 aquellas que se encontraban en cuarta lactancia

respectivamente, cada grupo se conformó con mínimo 25 animales.

3.1 MANEJO REPRODUCTIVO DE LAS VACAS

Las vacas recibieron una pre sincronización del ciclo estral con una doble inyección de

prostaglandinas espaciada 14 días a partir del día 40 postparto, doce días después (día 66

postparto) de la segunda dosis de prostaglandina (Giordano et al., 2016) se comenzó con

un protocolo convencional Ovsynch (Figura 1). El diagnóstico de gestación se realizó por

medio de palpación rectal a los 45, 70 y 105 días después de la inseminación artificial.

Figura 1. Protocolo utilizado para sincronización de la ovulación. Se enumeran los días a

partir del comienzo del protocolo. PGs (Análogo de prostaglandina F2α, cloprostenol

sódico, 526 mcg, Sincrocio®, Ourofino; GnRH (Análogo de la hormona liberadora de

gonadotropinas, acetato de buserelina, 0.01 mg, Sincroforte®, Ourofino); IATF

Inseminación artificial a tiempo fijo.

9

3.2 TOMA DE MUESTRAS SANGUÍNEAS Y EXTRACCIÓN DE ADN

Las muestras de sangre se tomaron por medio de punción de la vena coccígea media, previa

limpieza del área anatómica con toallas de papel, cada muestra se colectó en un tubo

vacutainer® que contenía EDTA, los tubos se rotularon con el número de registro del

animal y se conservaron bajo refrigeración (4 a 6°C) hasta su transporte al laboratorio. La

temperatura de las muestras se ajustó por medio del uso de refrigerantes y un termómetro

de alcohol para medir la temperatura.

Se tomaron 100 µl de sangre y se mezclaron con 900 µl de buffer A (sacarosa, 0.32 M; Tris

HCI, 10 mM; MgCl2, 5 mM; Triton X-100,1%), posteriormente la mezcla se centrifugó a

13,000 revoluciones por 2 minutos y se retiró el sobrenadante, éste proceso se repitió hasta

obtener un botón celular blanco.

Posteriormente se añadió una solución de proteinasa K (8 mg/ml) en buffer D (KCl, 50

mM; Tris HCl, 10 mM; MgCl2, 2.5 mM; NP-4º, 0.455 Tween 20, 0.45%) y se incubó la

muestra por un periodo de 60 minutos a una temperatura de 50°C, una vez terminada la

digestión se inactivó la proteinasa K incubando la muestra a una temperatura de 90°C

durante 10 minutos (Ayala-Valdovinos et al., 2007).

3.3 ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR-RFLP

A partir de la secuencia de ADN reportada para el gen COQ9 (NCBI Secuencia de

referencia: AC_000175.1) se diseñaron un par de oligonucleótidos iniciadores para

amplificar una secuencia que contenga el sitio de localización del polimorfismo (Software

Primer-BLAST-NCBI).

Se realizó un primer ensayo (PCR gradiente) con el objetivo de determinar la temperatura

óptima de alineación de los cebadores. De acuerdo al programa “gradiente” del equipo

termociclador Techne® modelo TC–5000 (Techne Inc., Burlington, NJ, USA), las

temperaturas fueron las siguientes: 50.2°C, 50.8°C, 52.3°C, 54°C, 55.5°C, 57.2°C, 58.8°C,

60.7°C, 62.2°C, 63.9°C, 65°C. La mejor temperatura de alineación se determinó por

10

análisis de los fragmentos amplificados en el fotodocumentador (Kodak Gel Logic 100

System, USA).

Posterior a la amplificación del fragmento por PCR, se adicionó la endonucleasa de

restricción MboI (Thermo Scientific®), las muestras se incubaron a 37°C por 1 hora en el

termociclador Applied Biosystems 2720 (Thermo scientific®, Waltham, Massachusetts,

USA).

Para el análisis de los fragmentos se colocó la totalidad de la mezcla PCR-RFLP en un gel

de agarosa al 4 % teñido con GelRed® en buffer TBE 1X, se corrieron las muestras en la

cámara de electroforesis a 70 volts durante 50 minutos y posteriormente se fotografiaron las

bandas bajo luz ultravioleta por medio de un fotodocumentador (Kodak Gel Logic 100

System, USA).

3.4 OBTENCIÓN DE LAS VARIABLES REPRODUCTIVAS

De acuerdo a los genotipos encontrados se formaron tres grupos:

Grupo GG. Individuos homocigóticos para el alelo mutante.

Grupo AG. Individuos heterocigóticos.

Grupo AA. Individuos homocigóticos para el alelo silvestre.

Las variables se calcularon para cada grupo genético de la siguiente manera (Wall et al.,

2003):

Intervalo del parto al primer celo: Días transcurridos del parto al primer celo en

cada vaca.

Días abiertos: Días transcurridos del parto hasta la concepción en cada vaca.

Número de servicios: Suma de servicios de inseminación artificial en cada vaca

hasta quedar preñada.

Para el cálculo de las variables se utilizaron los siguientes datos por cada vaca: fecha de

parto, fecha del primer celo exitoso y subsecuentes, fecha de todos los servicios de

inseminación hasta el servicio fecundante y fecha del diagnóstico de preñez.

11

3.5 ESTIMACION DE FRECUENCIAS GENOTÍPICAS Y GÉNICAS

Para la estimación de frecuencias genotípicas y génicas se utilizó el método de conteo

directo (Baltian et al., 2017).

Frecuencias genotípicas:

f (AA)= n°. De individuos con tipo AA f (GG)= n°. De individuos tipo GG

n°. Total de individuos n°. Total de individuos

f (AG)= n°. De individuos con tipo AG

n°. Total de individuos

Frecuencias génicas:

f(A)= f(AA)+1/2 f(AG) f(G)= 1- f(A)

Considerando lo esperado en equilibrio de H-W se realizó una prueba de Chi-cuadrada

(P<0.05) para una muestra empleando el programa estadístico POPGENE32.

3.6 RELACIÓN DE LOS GENOTIPOS CON LAS VARIABLES

REPRODUCTIVAS

Los datos fueron analizados con un modelo mixto, incluyendo como efectos fijos el

genotipo (con 3 niveles: AA, AG y AG) y el número de lactancia (con 4 niveles: 1ª

lactancia, 2ª, 3ª y 4ª lactancia), y como efecto aleatorio el animal:

Yij= µ + GENOTIPOi + LACTANCIAj + animal+ Ɛij

Donde:

Y= valor observado del parámetro reproductivo en cuestión (días transcurridos del parto al

primer celo en cada vaca, días abiertos y número de servicios).

µ= la media general para el parámetro evaluado.

GENOTIPO= el genotipo para el gen COQ9 al que pertenece cada animal (AA, AG y GG).

LACTANCIA= efecto del número de lactancia del animal (1ª, 2ª, 3ª o 4ª lactancia).

animal= componente genético aleatorio de cada animal.

Ɛ= error experimental.

12

Se estimaron las diferencias entre genotipos y lactancias con el método de Tukey (P<0.05)

y los análisis estadísticos se efectuaron con el PROC MIXED del Sistema de Análisis

Estadísticos (SAS, 2003).

Previamente se evaluó el efecto de interacción entre el genotipo y lactancia, ésta no resultó

significativa, por lo que fue excluida del modelo estadístico.

3.7 CÁLCULO DE LOS EFECTOS DE ADITIVIDAD Y DOMINANCIA POR

MODELO DE REGRESIÓN

Para ajustar el modelo de regresión a los efectos de aditividad se creó una base de datos

donde se asignó el valor de +1 a los individuos homocigóticos AA (alelo mejorante), -1 a

los homocigóticos GG (alelo mutante) y 0 para los heterocigóticos AG. Para los efectos de

dominancia se asignó el valor de 1 para los individuos homocigóticos AG y 0 para los

homocigóticos AA y GG, se utilizó el programa estadístico SPSS (Óvilo et al., 2002).

4. RESULTADOS

4.1 ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA

En el cuadro 1 se muestran los oligonucleótidos diseñados para la amplificación del

fragmento del gen COQ9, el programa utilizado para la prueba fue el siguiente: temperatura

de desnaturalización inicial 94°C por 3 minutos, seguido de 32 ciclos de amplificación con

94°C por 20 segundos, 54°C por 20 segundos, 72°C por 35 segundos y una temperatura de

extensión final de 72°C por 5 minutos.

Cuadro 1. Oligonucleótidos iniciadores diseñados para la prueba de PCR.

Oligonucleótidos Secuencia 5´ - 3´ Tamaño del fragmento

Delantero 5´- AGTTTCTGTTTCAGTGCCCCG- 3´ 202 pares de bases

Reverso 5´- GCAGGTGTTCTGATGCCTACC- 3´

13

La temperatura de alineación óptima para los oligonucleótidos (primers) diseñados se

determinó mediante un programa de PCR gradiente en un termociclador Techne® modelo

TC-5000. En la imagen (Figura 1) se muestran las diferentes temperaturas a las que se

sometió la misma muestra de DNA (bovino control). Se observa un amplio margen de

amplificación en la temperatura de alineación para los primers diseñados (Figura 1, carriles

2 – 9). Para la selección de la mejor temperatura se consideró la amplitud y luminiscencia

de la banda, así como la ausencia de amplificaciones inespecíficas en el carril. En base a

éstos resultados se determinó 54°C como la temperatura de alineamiento para el

diagnóstico de los individuos en el estudio.

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa del fragmento de DNA amplificado mediante

los primers diseñados en el estudio, se muestran las temperaturas de alineamiento para

cada carril.

Mediante la prueba de PCR- RFLP se logró amplificar un fragmento de DNA de 202 pares

de bases (Cuadro 2) y generar un patrón de bandeo para identificar los genotipos de los

individuos muestreados. Los patrones específicos (Figura 2) fueron fragmentos de 82 y 109

pb para el genotipo GG, 82, 109 y 120 pb para el genotipo GA y para el genotipo AA

fragmentos de 82 y 120 pb.

Cuadro 2. Región amplificada del gen COQ9. (G) Localización del polimorfismo;

(negritas) Oligonucleótidos delantero y reverso; (GATC) Sitios de corte

identificados por la enzima MboI (NCBI secuencia de referencia: AC_000175.1).

Fragmento del gen COQ9

AGTTTCTGTTTCAGTGCCCCGCTGCCGACCAGCCCTGGCCCCACGTGCCTTCC

GTGCTTCAGCTATGCAGCTAAGGTCTTTGGATCAGCAGAAGATCAACCCCCGC

CCTCTTCTTCTCAGCAACAGTCTGAGGCGCAGGGCGCAGAGGAACCCAATCCA

GAGGCTCTGCGTTCACCCCCCAGGTAGGCATCAGAACACCTGC

14

Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa al 4% del fragmento del gen COQ9

amplificado por PCR- RFLP y digerido con enzima MboI. Carril 1, se muestra el

marcador molecular (25 pb, Thermo Scientific®); Carriles 2,3 y 4, muestras controles

para cada genotipo; Carril 5, muestra blanco sin DNA; Carriles 6 a 12, muestras de

individuos analizadas en el estudio.

4.2 FRECUENCIAS GENOTÍPICAS Y GÉNICAS

En el cuadro 3 se presentan las frecuencias genotípicas y génicas del polimorfismo

(18:25527339). La frecuencia génica mayor fue la del alelo mutante G, con 0.5359 y

0.4641 para el alelo A. Las frecuencias genotípicas fueron 0.1830, 0.5620 y 0.2549 para

AA, AG y GG respectivamente (Cuadro 3).

Cuadro 3. Frecuencias genotípicas y génicas

Frecuencia genotípica

Genotipo Número de animales Frecuencia

AA 28 0.1830

AG 86 0.5620

GG 39 0.2549

Frecuencia génica

Alelo A 0.4641

Alelo G 0.5359

El valor calculado para la prueba de Chi-cuadrado fue menor que el valor obtenido en

tablas con un nivel de confianza del 95% y 1 grado de libertad, por lo que se acepta la

15

hipótesis nula que la población está en equilibrio Hardy-Weinberg, razón por la cual, no

existe diferencia significativa entre las frecuencias observadas y esperadas (Cuadro 4). Lo

que indica que en la población estudiada no han sucedido fenómenos de selección,

mutación, flujo génico y deriva génica lo suficientemente penetrantes para generar

fluctuaciones de consideración estadística en las frecuencias alélicas del gen COQ9.

Cuadro 4. Equilibrio de Hardy Weinberg para las frecuencias genotípicas

Chi cuadrado calculada 2.459046

Grados de libertad 1

Valor de Chi-cuadrado tablas 3.84

Probabilidad 0.1169

(P>0.05)

4.3 EFECTOS DEL POLIMORFISMO EN EL DESEMPEÑO REPRODUCTIVO

En el cuadro 5 se presentan las medias de mínimos cuadrados para cada variable analizada

con respecto a cada genotipo y el número de lactancia No se encontró relación significativa

entre el genotipo y las variables intervalo del parto al primer celo y días abiertos.

Cuadro 5. Medias de mínimos cuadrados para el promedio de días entre el parto y el

primer celo (IP1C), días abiertos (DIAB) y número de servicios (NUSE) de acuerdo al

genotipo y número de lactancia de las vacas.

Factor Niveles IP1C (días)±EE

Genotipo (NS) AA 72.9 5.1a

AG 69.2 4.2a

GG 69.2 4.6a

Lactancia (*) L1 73.9 7.1a

L2 71.3 5.3a

L3 75.8 3.9a

L4 60.9 3.8b

Factor Niveles DIAB±EE

Genotipo (NS) AA 127.6 12.7a

AG 103.5 7.5b

GG 128.7 9.7a

Lactancia (NS) L1 126 11.1a

L2 116 8.7a

16

L3 122.2 12.3a

L4 115.3 12.4a

Factor Niveles NUSE±EE

Genotipo (*) AA 3.6 0.5a

AG 2.5 0.3b

GG 3.7 0.4a

Lactancia (NS) L1 3.4 0.4a

L2 3.1 0.3a

L3 3.1 0.5a

L4 3.4 0.5a

(NS)= no significativo (P>0.05); (*)= significativo (P<0.05); (**)= altamente

significativo (P<0.01); EE= error estándar de la media; diferentes literales por columna

son diferentes, para cada variable (P<0.05) usando el método de Tukey.

4.4 EFECTOS DE ADITIVIDAD Y DOMINANCIA

No existieron efectos de aditividad significativos para ninguna de las variables del estudio,

razón por la cual, no se identificó una influencia directa para estos rasgos a través de los

genotipos homocigóticos en vacas AA y GG, para los efectos de dominancia, se encontró

significancia estadística al nivel de P<0.05 para las variables de días abiertos y número de

servicios, lo que implica una mejora para estos parámetros en vacas heterocigóticas AG

(Cuadro 6).

Cuadro 6. Análisis de regresión para efectos de aditividad y dominancia

Aditividad

(Efecto AA)

Dominancia

(Efecto AG)

Variable Coeficiente Valor P Variable Coeficiente Valor P

IP1C 2.16 0.33 IP1C -0.06 0.98

DIAB -3.77 0.62 DIAB -7.64 0.02*

NUSE -0.23 0.46 NUSE -1.14 0.007*

* (P<0.05); IP1C= Intervalo del parto al primer celo; DIAB= Días abiertos; NUSE= Número de

servicios.

17

5. DISCUSIÓN

El pobre desempeño reproductivo y los factores que se ven implicados en éste fenómeno

han sido profundamente investigados, para examinar la posibilidad de que algunos rasgos

reproductivos son asociados con la presencia de un polimorfismo, se estandarizó la prueba

de PCR-RFLP y se investigó la asociación estadística entre 3 variables reproductivas

(intervalo del parto al primer celo, días abiertos y número de servicios) con los diferentes

genotipos en el gen de la coenzima Q9.

El gen COQ9 produce una molécula esencial para la síntesis de ATP mitocondrial y otros

procesos metabólicos, las mutaciones en los genes que participan en la biosíntesis de la

COQ generan deficiencia de ésta molécula y conducen a estados patológicos o deterioros

en algunos sistemas (García-Corzo et al., 2012).

Ortega et al., (2017) evaluaron los efectos del polimorfismo (18:25527339) en el

comportamiento reproductivo de 2,273 vacas Holstein localizadas en los estados de Florida

y California. Ellos encontraron que las vacas con el genotipo homocigótico AA tuvieron

mayor tasa de preñez, requirieron menor número de servicios por concepción y tuvieron

menos días abiertos (P<0.05) en comparación con las vacas del genotipo GG.

Adicionalmente midieron la expresión de transcritos de COQ9 en células del cumulus y en

ovocitos, encontrando un efecto de dominancia, ya que el genotipo heterocigótico AG

presentó mayor abundancia en los ovocitos (P<0.05), no así en las células del cumulus. En

el caso de los homocigóticos, la abundancia fue menor y no se encontraron diferencias

entre ellos. Una situación similar fue encontrada cuando recuperaron complejos cumulus

oophorus y midieron concentraciones de la hormona antimulleriana, siendo los

heterocigóticos los que presentaron los mayores valores (P<0.05).

En el presente estudio se encontró un efecto favorable del genotipo AG para la variable

número de servicios (P< 0.05), siendo los heterocigóticos quienes demostraron el mejor

desempeño reproductivo. Ésta información concuerda con los resultados del análisis de

regresión para los efectos de dominancia donde existió significancia estadística (P<0.05)

para el número de servicios y días abiertos.

Se han reportado los efectos de la parición en el subsecuente intervalo del parto a la primera

ovulación, siendo las vacas primíparas las que presentan el intervalo más largo comparado

con las multíparas, sin que este comportamiento sea asociado a un cambio en la condición

corporal (Tanaka et al., 2008), en el presente estudio no se encontró un efecto favorable de

algún genotipo para la variable intervalo del parto al primer celo, en el caso de la lactancia

4 se encontró una asociación significativa con un menor intervalo del parto al primer celo,

18

coincidiendo estos datos con los reportados por Tanaka et al., (2008). Una hipótesis que

surge, es que la expresión del gen es diferente para cada lactancia, por lo que sería

interesante en un estudio posterior evaluar el desempeño de las mismas vacas en sus

diferentes lactancias.

Aunque en esta investigación no se realizaron mediciones de hormona antimulleriana

(AMH por sus siglas en inglés) ni se realizó un conteo de la población folicular, el efecto de

sobredominancia encontrado en el estudio de Ortega et al., (2017) es interesante ya que se

ha demostrado que los altos niveles de AMH se relacionan con una mayor población

folicular, una mayor longevidad en el hato y un mejor desempeño reproductivo (Jimenez-

Krassel et al., 2015), por lo que sería de gran importancia realizar éstas mediciones en

estudios posteriores para determinar si existe tal relación.

El hecho de que los heterocigóticos demuestren un comportamiento superior respecto del

alelo mejorante encontrado en este estudio y en el de Ortega et al., (2017) puede ser debido

a un efecto de sobredominancia, donde las diferentes moléculas producidas tengan

propiedades distintas en cuanto a su actividad, estabilidad en ciertas condiciones,

sensibilidad para trabajar, entre otras. Esto genera un desempeño más versátil y menos

susceptible al deterioro comparado con los homocigóticos, un ejemplo de una situación

similar fue encontrado en ovejas con una mutación en el gen FecX1, los heterocigóticos

tuvieron una mayor tasa de ovulación comparado con los homocigóticos silvestres,

mientras que los homocigóticos mutantes fueron infértiles (Smith et al., 1997) .

Las frecuencias genotípicas encontradas en el presente estudio coinciden con las reportadas

por Ortega et al., (2016) ya que se encontró una mayor frecuencia para los heterocigóticos

(0.562 y 0.482 respectivamente), seguido de los homocigóticos mutantes (0.254 y 0.273) y

en menor grado los homocigóticos silvestres (0.1830 y 0.244). Esta situación puede ser

generada por el efecto de sobredominancia mencionado anteriormente, donde la frecuencias

genotípicas tienden a mantenerse en equilibrio sin que exista fijación para cierto alelo a lo

largo de diversas generaciones.

Hasta el momento no existen otros estudios donde se reporten las frecuencias y los efectos

del gen en México, la técnica que se desarrolló para genotipificar a las vacas en el presente

trabajo puede ser implementada en el laboratorio sin la necesidad de equipos y reactivos

costosos. Si bien se encontró asociación estadística con una de las variables analizadas, es

necesario realizar más estudios en diferentes poblaciones y con un número mayor de

individuos para poder determinar si éstos resultados son reproducibles en los diferentes

sistemas de producción.

19

6. CONCLUSIONES

Por medio de la técnica de PCR-RFLP fue posible genotipificar los alelos A y G del

polimorfismo 18:25527339 en una población de ganado Holstein.

El alelo mutante G tuvo mayor frecuencia génica que el alelo deseable A, a pesar de esto, la

mayor frecuencia genotípica observada fue la de los individuos heterocigóticos.

El genotipo heterocigótico AG mostró una relación favorable para la variable número de

servicios, además existe un efecto de dominancia significativo para las variables días

abiertos y número de servicios.

Los resultados encontrados en el presente estudio sugieren que el polimorfismo

(18:25527339) del gen COQ9 puede ser de utilidad en posteriores estudios como un

marcador de selección molecular para mejorar el desempeño reproductivo en los establos

lecheros.

20

7. BIBLIOGRAFÍA

Ayala, V. M. A., Villagomez, D. A. F., Galindo, G. J., Sánchez, C. D., y Ávila, F. D., 2007.

Anatomopathologic, cytogenetic and molecular studies of the freemartin syndrome

in cattle (Bos taurus). Redvet. 9, 1-15.

Baltian, L. R., Ripoli, M. V., Aida, Y., Takeshima, S., y Giovambattista, G. 2017.

Estimación de las frecuencias alélicas del gen BoLA-DRB3 en una población de

ganado Holstein de La Pampa mediante secuenciación directa. Ciencia

Veterinaria, 13(1) 66-69.

Beuzen, N. D., Stear, M. J., y Chang, K. C., 2000. Molecular markers and their use in

animal breeding. The Veterinary Journal, 160(1), 42-52.

Chebel, R. C., y Ribeiro, E. S., 2016. Reproductive systems for North American dairy cattle

herds. Veterinary Clinics: Food Animal Practice, 32(2), 267-284.

Duncan, A. J., Bitner-Glindzicz, M., Meunier, B., Costello, H., Hargreaves, I. P., López, L.

C., Hirano, M., Quinzii, C.M., Sadowski, M.I., Hardy, J., Singleton, A., Clayton,

P.T., y Rahman, S., 2009. A nonsense mutation in COQ9 causes autosomal-

recessive neonatal-onset primary coenzyme Q10 deficiency: a potentially treatable

form of mitochondrial disease. The American Journal of Human Genetics, 84(5),

558-566.

Fritz, S., Capitan, A., Djari, A., Rodriguez, S. C., Barbat, A., Baur, A., y Klopp, C., 2013.

Detection of haplotypes associated with prenatal death in dairy cattle and

identification of deleterious mutations in GART, SHBG and SLC37A2. PloS

one, 8(6), e65550.

García-Corzo, L., Luna-Sánchez, M., Doerrier, C., García, J. A., Guarás, A., Acín-Pérez, R.

y Acuña-Castroviejo, D., 2012. Dysfunctional COQ9 protein causes predominant

encephalomyopathy associated with CoQ deficiency. Human Molecular

Genetics, 22(6), 1233-1248.

García-Ruiz, A., Cole, J. B., VanRaden, P. M., Wiggans, G. R., Ruiz-López, F. J., y Van

Tassell, C. P., 2016. Changes in genetic selection differentials and generation

intervals in US Holstein dairy cattle as a result of genomic selection. Proceedings of

the National Academy of Sciences, 201519061.

Giordano, J. O., Thomas, M. J., Catucuamba, G., Curler, M. D., Wijma, R., Stangaferro, M.

L., y Masello, M., 2016. Effect of extending the interval from Presynch to initiation

21

of Ovsynch in a Presynch-Ovsynch protocol on fertility of timed artificial

insemination services in lactating dairy cows. Journal of Dairy Science, 99(1), 746-

757.

Hax, L. T., Schneider, A., Jacometo, C. B., Mattei, P., da Silva, T. C., Farina, G., y Corrêa,

M. N., 2017. Association between polymorphisms in somatotropic axis genes and

fertility of Holstein dairy cows. Theriogenology, 88, 67-72.

Homer, E. M., Derecka, K., Webb, R., y Garnsworthy, P. C., 2013. Mutations in genes

involved in oestrous cycle associated expression of oestrus. Animal Reproduction

Science, 142(3), 106-112.

Jimenez-Krassel, F., Scheetz, D. M., Neuder, L. M., Ireland, J. L. H., Pursley, J. R., Smith,

G. W., Tempelman, R. J., Ferris, T., Roudebush, W. E., Mossa, F., Lonergan, P.,

Evans, A. C. y Ireland, J. J., 2015. Concentration of anti-Müllerian hormone in dairy

heifers is positively associated with productive herd life. Journal of Dairy

Science, 98(5), 3036-3045.

Khatib, H., Monson, R. L., Schutzkus, V., Kohl, D. M., Rosa, G. J. M., y Rutledge, J. J.,

2008. Mutations in the STAT5A gene are associated with embryonic survival and

milk composition in cattle. Journal of Dairy Science, 91(2), 784-793.

López-Gatius, F., 2003. Is fertility declining in dairy cattle? : A retrospective study in

northeastern Spain. Theriogenology, 60(1), 89-99.

Nicolini, P., Carriquiry, M., y Meikle, A., 2013. A polymorphism in the insulin-like growth

factor 1 gene is associated with postpartum resumption of ovarian cyclicity in

Holstein-Friesian cows under grazing conditions. Acta Veterinaria

Scandinavica, 55(1), 11.

Ortega, M. S., Wohlgemuth, S., Tribulo, P., Siqueira, L. G., Null, D. J., Cole, J. B. y

Hansen, P. J., 2017. A single nucleotide polymorphism in COQ9 affects

mitochondrial and ovarian function and fertility in Holstein cows. Biology of

Reproduction, 96(3), 652-663.

Ortega, M. S., Denicol, A. C., Cole, J. B., Null, D. J., y Hansen, P. J., 2016. Use of single

nucleotide polymorphisms in candidate genes associated with daughter pregnancy

rate for prediction of genetic merit for reproduction in Holstein cows. Animal

Genetics, 47(3), 288-297.

Óvilo, C., Oliver, A., Noguera, J. L., Clop, A., Barragán, C., Varona, L., Rodríguez, C.,

Toro, M., Sánchez, A., Pérez-Enciso, N. y Silió, L., 2002. Test for positional

22

candidate genes for body composition on pig chromosome 6. Genetics Selection

Evolution, 34(4), 465.

Sahana, G., Nielsen, U. S., Aamand, G. P., Lund, M. S., y Guldbrandtsen, B., 2013. Novel

harmful recessive haplotypes identified for fertility traits in nordic Holstein

cattle. PLoS One, 8(12), e82909.

Schneider, A., Corrêa, M. N., y Butler, W. R., 2013. Association between growth hormone

receptor AluI polymorphism and fertility of Holstein cows. Theriogenology, 80(9),

1061-1066.

Smith, P., 0, W. S., Corrigan, K. A., Smith, T., Lundy, T., Davis, G. H., y McNatty, K. P.,

1997. Ovarian Morphology and Endocrine Characteristics of Female Sheep Fetuses

that are Heterozygous or Homozygous for the Inverdale Prolificacy Gene. Biology

of Reproduction, 57(5), 1183-1192.

Tanaka, T., Arai, M., Ohtani, S., Uemura, S., Kuroiwa, T., Kim, S., y Kamomae, H., 2008.

Influence of parity on follicular dynamics and resumption of ovarian cycle in

postpartum dairy cows. Animal Reproduction Science, 108(1-2), 134-143.

Veerkamp, R. F., Beerda, B., y Van der Lende, T., 2003. Effects of genetic selection for

milk yield on energy balance, levels of hormones, and metabolites in lactating

cattle, and possible links to reduced fertility. Livestock Production Science, 83(2),

257-275.

Wathes, D. C., Fenwick, M., Cheng, Z., Bourne, N., Llewellyn, S., Morris, D. G., Jenny,

D., Murphy, J. y Fitzpatrick, R., 2007. Influence of negative energy balance on

cyclicity and fertility in the high producing dairy cow. Theriogenology, 68, S232-

S241.

Wall, E., Brotherstone, S., Woolliams, J. A., Banos, G., y Coffey, M. P., 2003. Genetic

evaluation of fertility using direct and correlated traits. Journal of Dairy

Science, 86(12), 4093-4102.