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Tesis de Posgrado

Fisiología y desarrollo de sistemasFisiología y desarrollo de sistemasgenéticos en Thiobacillusgenéticos en Thiobacillus

ferrooxidans y cepas relacionadasferrooxidans y cepas relacionadaspara aplicación en procesospara aplicación en procesos

biometalúrgicosbiometalúrgicos

Paños, Nora Hilda

1991

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Paños, Nora Hilda. (1991). Fisiología y desarrollo de sistemas genéticos en Thiobacillusferrooxidans y cepas relacionadas para aplicación en procesos biometalúrgicos. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2408_Panos.pdf

Cita tipo Chicago:Paños, Nora Hilda. "Fisiología y desarrollo de sistemas genéticos en Thiobacillus ferrooxidans ycepas relacionadas para aplicación en procesos biometalúrgicos". Tesis de Doctor. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1991.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2408_Panos.pdf

Universidad de Buenos Aires

Facultad de Clenclas Exactas y Naturales

Instituto de Investigaciones en Ingenieria Genéticay Biologia Molecular (INGEBl-CONICET)

Ing. Nora Hilda Paños

FISIOLOGIA Y DESARROLLO DE SISTEMAS GENETICOS

EN THIOBACILLUS FERROOXIDANS Y CEPAS RELACIONADAS

PARA APLICACION EN PROCESOS BIOMETALURGICOS

Director: Dr. Héctor N. Torres

Tesis presentada para optar por el título de

Doctor en Ciencias Qulmicas //55/5 ­

¿W737

1991 7 ’2

A mis Padres

A Víctor

A Brenda y Emiliano

AGRADECIMIENTOS

A los integrantes del Consejo del Instituto por haberme permitidorealizar este trabajo en el INGEBI.

Al Dr. Héctor N. Torres por haber estado siempre abierto a ladiscusión de problemas científicos y por su apoyo frente a in­quietudes nuevas.

Al Dr. Alejandro Mentaberry por su desinteresada dedicación alminucioso trabajo fotográfico que realizó y por su disposición ala discusión científica.

Al Dr. Guillermo Taccioli por su invalorable ayuda en experimen­tos de genética bacteriana.

A la Dra. Mirtha Flawiá por su constante apoyo y por estar siem­pre atenta a nuestras necesidades.

A la Dra. Maria T. Téllez-Iñón por su excelente disposición y porsu cooperación en ensayos de determinación de proteínas.

A los Dres. Gerardo Glikin, Alberto Kornblihtt y Luis Jiménez deAsúa por el interés y apoyo brindados durante esta etapa.

Al Dr. Alejandro Paladini por su constante cooperación en el mon­taje y acondicionamiento de instalaciones especiales requeridaspara nuestro trabajo.

Al Dr. José La Torre, al Sr. Natalio Divichenzo y al Servicio deMicroscopía de la Facultad de Odontologia por el asesoramiento ycooperación brindados para las observaciones por microscopía descanning.

A la Lic. Mabel Tudino y al Servicio de Análisis a Terceros delLaboratorio de Análisis de Trazas de la Facultad, por haber acce­dido muycordialmente a realizar determinaciones analíticas porespectrometria de absorción atómica.

Al Servicio Geológico y Minero de la Subsecretaría de Mineria dela Nación por haber cooperado constantemente proporcionándomemuestras de minerales y especimenes naturales.

A todo el personal administrativo y de maestranza del INGEBI,quede una u otra forma facilitaron el trabajo diario.

A Norberto Malarini por su buen humor y su ayuda en la compagina­ción de esta tesis.

A Adriana Urmanpor su calidez y por su excelente disposición pa­ra la transcripción de esta tesis.

A mis compañeros: Omar Coso, Alejandro Schijman, Mercedes Goin,Fernando Bravo, Andrés Muro, Rosana Celnik, María Laura Gómez.Laura Moratinos, Patricia Levy-Yeyati, Pablo Rabinowicz, JorgeMuschietti, Horacio Martinetto, Alvaro Estevez, Dan Kaplan, SoniaLafon y Silvia Cabral, por los momentosgratos que compartimos ypor todo el apoyo recibido.

A Betina Orman por su amistad y por su apoyo moral.

A mi esposo, Víctor, que compartió conmigo los momentosdifícilesy todo lo bueno de estos años.

"Non, mille fois non, il n' existepas une catégorie de sciences auxquelles on puisse donner le nom desciences appliquées.Il y a la science et les applica­tions de la science, liées entreelles commele fruit á l'arbre quil'apporte."

(Pasteur, 1871)

No, mil veces no, no existe una ca­tegoria de ciencia que pueda lla­marse ciencia aplicada.Están la ciencia y las aplicacionesde la ciencia, relacionadas entreellas comola fruta al árbol que laporta.

(Pasteur, 1871)

I N D I C E

PáginaRESUMEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..1

ABREVIATURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..5

INTRODUCCION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..7

Biometalurgia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..8

Química de las transformaciones biometalúrgicas . . . . . . . . . ..11Lixiviación directa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..llLixiviación indirecta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..13

Microorganismosinvolucrados en procesos biometalúrgicos..15Campo tecnológico y áreas de aplicación . . . . . . . . . . . . . . . . . ..17

Lixiviación de metales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..17

Desulfurización de carbón . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..19

Purificación de metales preciosos . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..24Consideraciones sobre la optimización de los procesosbiohidrometalúrgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..25

Fisiología y metabolismo de T. ferrooxidans . . . . . . . . . . . . . ..27Fuente de carbono . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..27

Metabolismo energético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . \ . . . . . . . . . ..29Interacción bacteria-sustratos insolubles . . . . . . . . . . ..34Fijación de nitróáeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..34

Desarrollo de sistemas genéticos en T. ferrooxidans . . . . . ..36Marcadores de selección . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..37

Plásmidos de T. ferrooxidans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..38

Clonado y expresión de orígenes de replicaciónde plásmidos de T. ferrooxidans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..39Transferencia de vectores a T. ferrooxidans . . . . . . . . ..42

OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..46

MATERIALES Y METODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..47

METODOS MICROBIOLOGICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..48

Cepas utilizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..48

Aislamiento de cepas con capacidad biolixiviante . . . . . . . . ..49Medios de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..50

Preparación y uso de sulfuros metálicos sintéticos . . . . . . ..57Empleode especímenes naturales, concentrados yminerales como sustratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..58

Fotografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..59

Microscopía de scanning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..59

METODOS PARA LA PREPARACION DE PLASHIDOS Y TRANSFORMACION

DE BACTERIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..60

Identificación de ADNplasmidico medianteminipreparaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..60

Crecimiento bacteriano y cosecha . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..60Lisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..60

Métodos de purificación del ADNplasmidico . . . . . . . . . ..61Electroforesis en geles de agarosa horizontales . . . . ..62

Preparación de ADNplasmidico en gran escala . . . . . . . . . . . . ..62Crecimiento bacteriano y cosecha . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..62Lisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..63

Purificación del ADNcircular cerrado . . . . . . . . . . . . . . ..65Transformación en E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..65

Preparación de células competentes . . . . . . . . . . . . . . . . . ..65Transformación con plásmidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..65

METODOS ANALITICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..67

Determinación de cobre soluble . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..67

Determinación de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..67CAPITULO I

BUSQUEDA DE VECTORES POTENCIALES PARA LA TRANSFORMACION DE

T. ferrooxidans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..71

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..72

Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..77

Selección de cepas de thiobacilos con resistenciamúltiple a iones metálicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..77Análisis de plásmidos en las cepas con resistenciamúltiple . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..80

Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..85

CAPITULO II

ANALISIS DEL CRECIMIENTODE T. ferrooxidans EN MEDIOS

SOLIDOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..86

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..87

Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..87

Análisis del crecimiento en medio sólidoagarizado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..87

Desarrollo de métodos para la obtención decolonias de T. ferrooxidans en 24 horas . . . . . . . . . . . . ..94Obtención de colonias en medio ferroso sinagarizar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..101

Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..101

CAPITULOIII

CALCULO DE TIEMPOS DE GENERACION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..105

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..106

Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..106

Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..109

CAPITULO IV

ANALISIS DE LA RELACION BACTERIA-PRODUCTO CRISTALINO . . . . . . . . ..110

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..111

Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..111

Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..117

CAPITULO V

BIO-OXIDACION DE SULFUROS METALICOS. DESARROLLO HICROBIANO

EN RELACION A LA FUENTE DE NITROGENO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..118

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..119

Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..120

Crecimiento en SCusintético con y sin agregadode nitrógeno amoniacal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..120Análisis del desarrollo bacteriano en función dela composición de un medio ferroso . . . . . . . . . . . . . . . . . 121Bio-oxidación de sulfuros metálicos sintéticos,especimenesnaturales, concentrados y minerales.....122

Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..128

CAPITULO VI

CRECIMIENTO, BIO-OXIDACION Y RESISTENCIA DE T. ferrooxidansEN FUNCION DEL CONTENIDO DE AGUA DEL HEDIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..133

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..134

Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..134

Cinética del crecimiento bacteriano y su correla­ción con el SCu bio-oxidado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..135

Sensibilidad de cepas de T. ferrooxidans a ionesinhibidores en medios deshidratados . . . . . . . . . . . . . . . ..137

Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..137

CAPITULO VII

EENOHENOS DE TRANSLOCACION BACTERIANA EN SUPERFICIES . . . . . . . . ..140

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..141

Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..142

Evidencias del deslizamiento en T. ferrooxidans.....142Evidencias del lanzamiento en T. férrooxidans . . . . . ..146

Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..148

CONCLUSIONES GENERALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..150

BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..154

RESUMEN

Considerando que existe mayor probabilidad en la expresión de ge­nes entre bacterias relacionadas, se obtuvo una colección de ce­pas del género Thiobacillus seleccionadas según los fenotiposasociados a resistencias de tipo enzimático a distintos metalesinhibidores. Entre estas cepas se seleccionaron aquéllas que pre­sentaron resistencias múltiples a los iones metálicos que son in­hibidores de T, ferrooxidans con la expectativa de que, al igualque sucede en otras especies, estas resistencias pudieran estarcodificadas en un plásmido único.

Se determinaron los patrones plasmídicos y se purificaron losplásmidos de las cepas con resistencias múltiples. Unode estosplásmidos fue transferido a una cepa de E. coli, obteniéndose unnotable incremento en las resistencias a los iones metálicos in­hibidores de T. ferrooxidans (ng+, Ag+, Cd2+, Te203=, Ast-, yHAsO4=),en asociación con los fenotipos característicos. Estoindicó que el plásmido codifica resistencias múltiples a dichosiones, cuyos genes provienen de una especie de Thiobacillus.

Por enriquecimiento y aislamientos a partir de muestras de mine­rales nacionales se constituyó un banco de cepas bacterianas queresponden a las caracteristicas de T. ferrooxidans.

Se analizó el crecimiento de las cepas asi obtenidas, comparando­lo con una cepa de colección de T. ferrooxidans en medio ferrosoagarizado, a fin de obtener un método adecuado de plaqueo. Sedescubrió que el principal problema en la obtención de coloniasen corto tiempo, reside en el contenido de agua del medio. Se de­sarrolló también un método de obtención de colonias en un medioferroso sin agarizar. constituido por una fina capa de sales de­positadas sobre el vidrio de una placa.

El requerimiento de un alto grado de deshidratación del medio,para el crecimiento rápido de estas bacterias, permite caracteri­zarlas comomicroorganismos Xerofilicos (del griego: amantes delo seco).

En vista del corto tiempo requerido para la obtención de coloniasen estas condiciones (24 hs), se determinaron los tiempos de ge­neración de las cepas en medio liquido y adheridas al sustratosólido (altamente deshidratado). Se encontró que en medio líquidoel tiempo de generación de distintas cepas oscila entre 7 y 11hs, en tanto que adheridas a un medio sólido deshidratado, oscilaentre 20 y 30 minutos. Estos resultados se analizaron en funciónde la principal barrera técnico-económica de los actuales proce­sos biohidrometalúrgicos, caracterizados por una baja velocidadde multiplicación bacteriana.

Por microscopía de scanning se analizaron las relaciones microor­ganismo-productocristalino, que se establecen durante la coloni­zación bacteriana del sustrato. Se encontró que el producto de laactividad bacteriana en medios deshidratados se encuentra en es­tado cristalino, y que las bacterias van quedando, al menos tem­poralmente, ocluídas en el cristal que forman.

Por aplicación de las condiciones anteriores, se estudió el cre­cimiento bacteriano y la bio-oxidación de distintos sulfuros me­tálicos sintéticos, concentrados y minerales.

Se arribó a conclusiones respecto de las condiciones que indepen­dizan el crecimiento bacteriano del nitrógeno amoniacal, sugi­riendo una elevada eficiencia en la fijación de nitrógeno, en me­dios deshidratados. Se propone que el cristal en el que las bac­terias van quedandoocluídas, protege al sistema nitrogenasa deloxigeno.

Se analizó la cinética del crecimiento de T. ferrooxidans en fun­ción del aumento de la masa proteica y del contenido de agua enel medio, y su correlación con la cinética de bio-oxidación desulfuro cúprico.

Se determinó que las cepas de T. ferrooxidans son resistentes alos iones metálicos que resultan inhibidores en medio líquido,cuando el grado de deshidratación de un medio sólido es el reque­rido para el desarrollo óptimo de la bacteria.

La obtención de plásmidos con múltiples resistencias, provenien­tes de especies de Ihiobacillus y el conocimiento del contenidode agua en un medio sólido, en el cual el T. ferrooxidans es sen­sible a los iones metálicos, crean un marco más adecuado paratrabajar en el desarrollo de una metodología de transformaciónpara T. ferrooxidans.

Tanto en medios ferrosos comoen sulfuros metálicos, se descu­brieron fenómenosde translocación bacteriana en superficies, queno habían sido descriptos en estas bacterias y que podrían apli­carse con fines tecnológicos.

ABREVIATURAS

ADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Acido desoxiribonucleico

Amp . r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Ampicilina

°C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Grados oentígrado

Cél . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Células

E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Escherichia

EDTA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Acido etilendiamino tetraacético

g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ‘ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Gramo

kb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Kilobases

l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Litro

mg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Miligramo

min . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .¿....Minutos

m1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..mililitro

M0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Oxido metálico

M804 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Sulfato metálico

MS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Sulfuro metálico

NaAcO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Acetato de sodio

nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Nanómetros

pzv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Peso en volumen

Pág . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Página

Ref . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Referencia

rpm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Revoluciones por minuto

SDS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Dodecil sulfato de sodio

T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Thiobacillus

TCA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Acido tricloro-acético

Tc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Tetraciclina

Tris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..2 amino-2-hidroximetil-1,3 propano diolUV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Ultravioleta

vzv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Volumen en volumen

ug . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..Microgramo

GlosarioBuffer: Solución de sustancias químicas que mantienen el pH.Concentrado: Un espécimen casi puro de un compuesto metálico, ex­

traido de minerales por procedimientos de metalurgiaextractiva.

Pellet: Material que queda adherido al fondo de un tubo lue­go de una centrifugación.

_ 6 _

INTRODUCCION

Biometalurgia

La metalurgia extractiva puede definirse comoel conjunto de tec­nologias requeridas para extraer metales a partir de sus respec­tivos minerales (1).

Los metales, salvo raras excepciones comolos metales nobles, seencuentran en sus respectivos yacimientos en forma de compuestosquimicos, en general insolubles, que deben ser descompuestos paraextraer de ellos la forma libre del metal.

Segúnlos procesos tradicionales de metalurgia extractiva, estose logra a través de varias etapas que se esquematizan en la Fi­gura 1. Por análisis de la misma surge el elevado consumo deenergía, la demandade reactivos químicos, la contaminación am­biental dada por polvos y gases, y los elevados costos de inver­sión implicados.

La Biometalurgia es la tecnología referida a la oxidación bioló­gica de sulfuros metálicos insolubles por microorganismos acidó­filos, que los convierten en sulfatos metálicos solubles fácil­mente separables (2-6).

Aunquelos términos Bionetalurgia, Bionineria o Biolixiviaciónson relativamente nuevos, se cree que la recuperación de cobre apartir de drenajes de minas por biolixiviación ha sido explotadadesde 1000 años antes de Cristo. Aunquetales operaciones minerasson difíciles de documentar, se sabe que la biolixiviación de co­bre en gran escala se practicó en las minas de Río Tinto en Espa­ña durante el siglo XVIII. Estos antiguos mineros recuperaban co­bre de sitios de lixiviación natural sin saber que el rol activodel proceso era ejercido por bacterias. Recién en la década delsesenta de este siglo fue reconocido el papel que juegan en esteproceso los organismos. Actualmente, el 10%de la producción decobre de Estados Unidos se obtiene por biolixiviación.

Energía.———..-_—-—_——>l TRITURACION l

I:1 iEnergía-u-"u-"n, MOLIENDA....... --_I

Energía -__-__.._1"--* FLOTACION

Reactivos——-—-——-—--,(concentración)(Xantatos, espuman­

Polvo SO:tes, cianuros,etc.)

Energía ........... —->I TOSTACIONI__- _- _- ÏsÏmLumso:

Diaolvente _ _. . _ __ ___, LIXIVIACIONSO4H2 QUIMICA M0+SO4H2——+MSO4+H20

OBTENCION DE METAL NATIVO(Electrólisis o Precipitación Química)

Figura 1: Diagramade flujo tipo de laa operaciones involucradasen metalurgia extractiva.

En los últimos años, varios países han puesto en práctica la re­cuperación de uranio a escala industrial por procesos biometalúr­gicos.

Se ha demostrado que por procesos biometalúrgicos es posible oxi­dar los siguientes sulfuros metálicos: pirita y marcasita (FeSz),pirrotita (FeS), calcopirita (CuFeSz),bofnita (CusFeS4), coveli­ta (CuS), calcosina (Cqu), tetrahedrita (CuaszS7), enargita(3Cu38.Aszss), molibdenita (M082),esfalerita (ZnS), arsenopirita(FeAsS), rejalgar (AsS), orpiment (Asst), cobaltita (CoAsS),pentlandita (Fe,NisSs), violarita (NizFeS4), bravoita (Ni-,Fe)Sz,millerita (NiS), polidymita (Ni384), antimonita (Sb253), marmati­ta (ZnS), galena (PbS), geocronita Pbs(Ss,Asz)Ss,Ga283 y CuSe.

El creciente interés de biotecnológos en el desarrollo de lasnuevas técnicas de "biomineria" es consecuencia de la necesidaden la industria minera de encontrar alternativas a la metalurgiaextractiva convencional. Esta necesidad surge de la realidad mi­nero-industrial actual:

El agotamiento de minerales de leyes altas y la conse­cuente necesidad de explotar yacimientos que, si bientienen importantes reservas, las leyes son cada vez me­nores con lo cual, las tecnologías convencionales im­plican costos cada vez más elevados al punto que, yaci­mientos de importantes reservas metalíferas no son ex­plotables por metalurgia extractiva convencional.

Los crecientes problemas de contaminación ambientalasociados a la tostación de sulfuros minerales y a lacombustión de carbones ricos en compuestos azufrados.

El costo creciente del elevado consumode energía enlos métodos convencionales.

De ahí que se prevee que el desarrollo y optimización de las téc­nicas biometalúrgicas permitirán que compitan ventajosamente enel desarrollo de la mineria.

Quimicade las transformaciones biometalúrgicas

Según las condiciones de lixiviación, el tipo de mineral tratadoy la bacteria presente, se han planteado dos mecanismosde oxida­ción microbiana de sulfuros metálicos: ataque directo y ataqueindirecto, según se ilustra en la Figura 2.

I. l . Í. 1. l

En el caso de la lixiviación directa. el Thiobacillus ferrooxi­dans u otra bacteria obtienen energia por oxidación de sulfurosmetálicos insolubles convirtiéndolos en sulfatos metálicos, solu­bles (5,6,9). Aunque el mecanismode lixiviación directa se hainferido de observaciones de microorganismos adheridos a sulfurosmetálicos en minerales sometidos a biolixiviación (7), la mejorevidencia provino de estudios que usaron sulfuros metálicos purospreparados sintéticamente (8). La incubación de células lavadascon sustratos sintéticos sumergidosen soluciones de lixiviación,resultó en consumode oxigeno y solubilización de metal. Esteproceso se describe simplificadamente por la reacción:

BacteriaMS + 202 44;>MSO4 1.

donde Mrepresenta un metal.

_ 11 _

CuFaS2leMadón hdileda CMSO4

L!xivíaci6n

ñ Chapi-asma

“nrnhlsn:celula!

Poriplasma

—.._._ Envoluracelula:¡42504/

Flagalo pola!

Figura 2: Esquema de lixiviación directa e indirecta de cal­copirita (CuFeSz)con 7%jobacillus férrooxidans.

- 12 ­

A modode ejemplo se presentan las reacciones de oxidación bioló­gica por vía directa de algunos sulfuros metálicos.

BacteriaFeSa(pirita) + 3502 + H20-———-—————————>Fe804+ H2804 2.

BacteriaCuS(covelita)+202—>CuSO4 3.

BacteriaZnS(esfalerita) + 202-————-——-—;4>ZnSO4 4.

4CuFeSz(calcopirita)+1702+2H2804—a>4CuSO4+2Fe2(SO4)3+2H20 5.

Lixiliaciánindimta

La bacteria Tbiobacillus ferrooxidans es capaz de obtener energiapor oxidación de hierro ferroso según la reacción:

Bacteria2Fe804 + 302 + H2804-———---————e>Fez(SO4)3 + H20 6.

El sulfato férrico resultante es un fuerte oxidante capaz de oxi­dar y disolver una amplia variedad de sulfuros metálicos. Estemecanismoes el denominado indirecto, porque si bien se produce apartir del sulfato férrico producido por la bacteria, procede aúnen ausencia de oxígeno o células viables (5,6,9).

- 13 _

Las siguientes reacciones ilustran sobre este mecanismo:

CuFeSz(calcop1rita) + 2Fez(SO4)a———>CuSO4+ 5FeSO4 + 28° 7.

Cqu (calcosita + 2Fs2(SO4)3-—+ZCuSO4+ 4FeSO4 + S° 8.

CuS (colvellita) + Fez(SO4)3-———»CuSO4+ 2FeSO4 + S° 9.

U02 + Fez(SO4)a-——-—->UOzSO4 + 2FsSO4 10.

CusFeS4(bornita) + Fez(SO4)3-——»SCuSO4+ 13FeSO4 + 48° 11.

Finalmente, el mecanismods lixiviación indirecta depende de laregeneración biológica de sulfato férrico, según la reacción 6.

El azufre elemental (8°) producido según las reacciones 7-10, esoxidado a ácido sulfúrico por la bacteria Thiobacillus ferrooxi­dans, según la reacción:

Bacteria28° + 302 + 2H20-———-———————-—>2H2804 11.

De esta forma se regenera el ácido sulfúrico consumido según lasreacciones 5 y 6, y se mantiene el pH bajo, alrededor de 2, favo­reciendo el desarrollo de estas bacterias que, en general, sonacidofilicas.

La asociación de estos dos mecanismos permite, por ejemplo en unmedio ácido, la conversión de CuFeSz(calcopirita) en los sulfa­tos cúprico y ferroso, según las reacciones 5, 7 y 11, siendo lareacción global resultante:

_ 14 _

5CuFeSz + 2002——->5SO4Cu + 5804Fe 12­

Por mecanismos análogos a éstos, un elevado número de compuestosmetálicos son factibles de biooxidación (15) con la consecuentesolubilización.

Hicroorganisnos involucrados en procesos biometalúrgicos

Por muchos años se pensó que el único microorganismo involucradoen la lixiviación de metales a partir de minerales era Thiobaci­llus ferrooxidans. En años relativamente recientes, se han descu­bierto y caracterizado otros microorganismos (10,11).

La Tabla 1 presenta los principales microorganismos que puedenparticipar en procesos biometalúrgicos. De ellos, el T. férrooxi­dans es el más ampliamente estudiado y se lo considera como el demayor importancia económicaa los fines de aplicación industrialpor varias razones:

Posee capacidad de lixiviación directa e indirecta porser un oxidador tanto de sulfuros metálicos como dehierro ferroso.

Es el microorganismo más ampliamente difundido en am­bientes minerales.

Posee capacidad de oxidación de un amplio espectro desulfuros metálicos.

Tabla I: Microorganismos involucrados en procesos biometalúrgicos.

de levadura,glucosa,eaca­roea,xyloea,1actosa,etc.

Nutrientes Tenperatura pHBacterias Fuentes de Fuentes de ('C)

energía carbón Rango Optina Rango Optino

Infobacillue ferrooxidane Fe2*.S',S¡-, 002 2.0-40 28 l,0-4,3 2.0SzOs¡-,533­anplio espec­tro de sulfa­ron ¡etílicoe

Tilobaclllue tbiooxldene S',50:1',5525e 00: 2.0-40 28 1.5-5 3.0

Leptoepiríllun terrooxidane ¡93* CO: 2.0-40 30 1.5-5 3.0

Iilonacillue orzanaparue S' 00:,glucoea, 2.0-40 20 1.5-6 3.0(7. acidotillue) gelactoea,

fructoea,xy­lona,riboea,arablnoaa,citrato

7llobeclllue tnloparne 5',s:031-, CO: 2.0-40 20 6-7,! 7 0eulturoe

75105007110:771.2,3 !e¡’,3°,8203¡-, COa.extracto 7-60 50 l.l-3.5 2.7pirita, de levadura.calcoplrita cieteina,

cletlaa

‘Sultbbaclllae therno !e¡*,5’.eulfu- 00:.glucoee, 30-58 50-55 l.7-4.5 2.1-2.5vaultldooxídane roe nlneralee eacaroea,

’ ¡lntanina

Sultolobun acídocaldaríoe 5°,extracto 00:,extracto 55-85 70-75 0.0-5.9 2.0-3.0de levadura de levadura,

trintona,peptona,ribo­ea,etc.

‘Sultblobue brierleyl lei*,5‘,eulfn- 002,extracto 45-75 70 2.0-7.0 1.5-2.0roe aineralee de levadura,

eacaroea,lac­toea,dcido¡lutarlco

‘Sulfblobue ¡altitaticas S’ 00:.extracto 50-90 75-87 1.0-5.5 3.0-4.5

Campotecnológico y áreas de aplicación

La Biogeotecnologia es la ciencia que tiene por objeto extraermetales a partir de minerales, concentrados, rocas y solucionespor la acción de microorganismos o sus metabolitos a presión nor­mal y temperatura de 5 a 90°C (4,5). Una de sus áreas de desarro­llo tecnológico es la Biohidrometalurgia y se refiere a la oxida­ción de sulfuros metálicos, azufre elemental y hierro ferroso pormicroorganismosacidófilos, según se describió anteriormente. Lasprincipales áreas de aplicación actual y en via de desarrollo deprocesos Biohidrometalúrgicos son: Lixiviación de metales, Desul­furización de carbón y Purificación de metales preciosos. A con­tinuación se discuten brevemente y se presentan los principalessistemas hasta ahora desarrollados a los fines de explotación in­dustrial.

La lixiviación bacteriana de metales tiene por objeto obtenercompuestosmetálicos solubles fácilmente separables, por biooxi­dación de los compuestos metalicos insolubles contenidos en losminerales, de modode reemplazar las costosas operaciones reque­ridas por la metalurgia extractiva convencional.

La lixiviación bacteriana de metalles se lleva a cabo actualmentesegún distintos sistemas que dependen de la escala y caracteris­ticas del mineral en cuestión.

La lixiviación microbiana in situ puede ser considerada como unsistema de extracción bajo tierra que mejora por via microbioló­gica la disolución de valores metálicos a partir de minerales debaja graduación o leyes marginales. Las soluciones de lixiviación

_ 17 _

son inyectadas y percolan a través de la masa de rocas. Cuando sealcanza la disolución de los valores metálicos deseados, las so­luciones son colectadas por bombaspara la recuperación de losmetales (12,16).

La lixiviación microbiana en botaderos es un método de solubili­zación de metales empleado para recuperar metales a partir de me­nas pobres, generalmente de grados submarginales, asociados aoperaciones a cielo abierto (open pit). Por ejemplo, las masasminerales que contienen rocas con leyes bajas y que deben ser ex­traídos para mejorar y/o permitir el acceso a las partes de mine­ralización más ricas. Estas rocas son acumuladas en depósitos lo­calizados en la vecindad de la zona de explotación y la parte su­perior de los mismoses irrigada con soluciones conteniendo mi­croorganismos. Estas soluciones percolan a través de la masa deroca. Cuandola operación finaliza, la solución es bombeadadesdela base del depósito para la recuperación de metales (2,12,15).

La lixiviación microbiana en pilas, es un método en el que el mi­neral triturado se apila en capas regulares sobre áreas apropia­damente preparadas. La pila es una pirámide truncada. La dimen­sión controlante de tamaño es la altura de la pila que a su vezse relaciona con la granulometría del mineral. La parte superiorde la pila es irrigada con las soluciones de lixiviación que con­tienen microorganismos que continuamente percolan a través delmineral (6,12).

La lixiviación microbiana en tanque es un proceso donde los meta­les son lixiviados a partir de minerales y concentrados en tan­ques Pachuca, reactores o tanques acondicionados en los que lapulpa constituida por el mineral y la solución lixiviante, unavez inoculada, es agitada y aireada en un sistema termostatizado.En la práctica biotecnológica. la dilución de la pulpa expresada

_ 13 ­

como la relación de masa liquida y masa sólida contenidas en unamasa de pulpa dada, varía entre 4 y 10 (13,14).

Cabedestacar que, si bien los distintos procesos de lixiviaciónhasta ahora desarrollados y puestos en práctica tienen caracte­rísticas particulares, todos tienen un factor común:el mineralse encuentra suspendido, inundado y/o sometido a percolación consoluciones ácidas, de nodo que los microorganismos son confinadosa un medio acuoso.

Desulïurizagiándecanbán

El carbón, Junto con el gas natural y el petróleo constituyen lostres combustibles de mayor importancia para la provisión de ener­gía. En el mundoexiste actualmente una demanda constantementecreciente por 1a explotación del carbón (19). Sus principalesaplicaciones son:

Producción de energía eléctrica por combustión de car­bón. Por esta vía se obtiene en prmedio el 30%de laenergia eléctrica mundial (Estados Unidos: 35%,U.R.S.S.: 42%, China: 80%).

Producción de coque para la industria siderúrgica.

Industria del cemento.

Materia prima de la carboquímica para la producción decombustibles líquidos.

Por sus aplicaciones y por la creciente demanda,el carbón repre­senta la explotación minera de mayor significado económico en elmundo. Actualmente se consumen 3.200 millons de toneladas poraño. Los estudios de mercado de las necesidades actuales y laproyección antes de la actual crisis del petróleo arrojaban parael año 2.000 una demanda de 6.800 millones de toneladas.

El carbón fue el eje de la política económica mundial durante elsiglo XIX. En el siglo XXese rol le correspondió al petróleo. Noobstante, las cifras anteriores dan cuenta del protagonismo delcarbón en este siglo.

Sin embargo, a pesar de ser una de las fuentes energéticas másabundantes, la explotación de nuevos yacimientos se encuentra li­mitada por el contenido de azufre en el carbón (17,19,20).

El contenido total de azufre de diferentes tipos de carbón variaentre 0,5 y 7%y está presente como compuestos orgánicos o inor­gánicos. El azufre elemental se presenta raras veces. El conteni­do de azufre orgánico es en general bajo, menor de 0,8%. La mayorparte del azufre inorgánico se presenta en forma de pirita (FeSz)comoparticulas finamente diseminadas. Dependiendo del tipo decarbón, el contenido de azufre piritico varia entre 0,5 y 6%. LaFigura 3 muestra la estructura quimica de un carbón bituminosocon pirita (FeS) asociada.

La combustión del carbón con alto contenido de azufre resulta enemisiones a la atmósfera de concentraciones de 802 que excedenconsiderablemente los niveles admisibles: < 80 pg/m3. En la at­mósfera el SOz se oxida a 8032- y posteriormente a 8042-. Con lasprecipitaciones, el ácido sulfuroso y sulfúrico llega a la tierraen forma de lluvias ácidas con los consecuentes perjuicios a lavegetación, animales y a la salud humana. La Figura 4 muestra unesquema de este fenómeno.

Figura 3: La estructura quimica de carbón bituminoso con pirita(FeSz) asociada.

...> H¡,SO4 \\\}\\‘SU.F.."F¡SCACD‘;., \\ \\ \\ \\\\\‘ ‘35; \

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F_‘e82+ 32 O2 + HZO _____)FeSO4 + I-IZSO4

T. ferroxídansrut." h 1' q ' .2. _ ..79‘n-.v'CO¡.-¡--,..:::j . j_z. - "

kk. :-.----—---w n 5,, v - . ­

Figura 4: Esquemarepresentativo de la oxidación de azufre víacombustión y vía metabolismo microbiano.

Una estación de combustión de carbón que genera el 75%de laelectricidad del Reino Unido, quema carbones que van de 0,9 a 4%en pirita, con lo cual libera a la atmósfera 1,4 millones de to­neladas de azufre por año.

Se ha calculado que en el mundose liberan 100 millones de tone­ladas de azufre por año.

De ahí que las disposiciones que regulan la calidad del aire enla mayoria de los países altamente industrializados, han estable­cido niveles de 802 en la atmósfera que establecen un limite su­perior de 0.03 ppmcomoconcentración media aritmética anual. De­pendiendo de las escalas de explotación en cada país, esto res­tringe la posibilidad de combustión solamente a aquellos carbonescuyo contenido en azufre total sea menor de 1.0-1.5%.

En años recientes se ha intensificado la búsqueda de métodosefectivos para desulfurización de carbón. Ante la actual crisisdel petróleo, Estados Unidos está instrumentando y apoyando fir­mementeel desarrollo tecnológico para la desulfurización de car­bón (17).

Los métodos fisicos y químicos tradicionales, tales como flota­ción, separación magnética, hidrogenación, etc., no son efecti­vos, operan a altas temperaturas y presiones, e implican costosenergéticos que los hacen inaplicables en la industria del carbón(19,20).

Desdeque se aislaron cepas de Tbiobacillus ferrooxidans de dre­najes ácidos de minas de carbón (18), se generó interés en la po­tencial explotación de este microorganismos para oxidar los mine­rales piríticos y azufrados presentes.

El T. ferrooxidans obtiene energia por oxidación en aerobiosis de

-23­

Pirita (FeSz) y azufre nativo, según las reacciones que se indi­can en la Figura 4, produciendo compuestos solubles de fácil se­paración, sobre todo si se considera que el carbón antes de en­trar a las usinas, pasa por un proceso de preacondicionamientoque comprendeel pasaje por torres lavadoras (19).

La oxidación y solubilización biológica de pirita y S° en el car­bón se produce por microorganismos y mecanismos equivalentes alos de la lixiviación bacteriana de metales. La diferencia resideen que en la lixiviación de metales, el producto de interés quedasolubilizado en la solución y el sólido constituye el residuo, entanto que en la desulfurización de carbón, la solución es el re­siduo y el sólido constituye el producto de interés.

Varios trabajos han demostrado la potencialidad de la vía micro­biológica para la desulfurización de carbón (21-24), pero laaplicación industrial tropieza aún con la lentitud del proceso.Noobstante, los progresos en este área sugieren que la desulfu­rización de carbón via microbiológica está en el horizonte.

Burlficafiándemfialasnmigmmlihemfimdesnlïnms mi­mulas

Se ha demostrado que, cuando concentrados que contienen pirita(FeSz), arsenopirita y oro finamente disperso y asociado a losanteriores, se sometena biolixiviación, se produce la solubili­zación de la mayor parte de los sulfuros minerales. Esto haceque, en la etapa de cianuración posterior para la recuperación deoro, los rendimientos de recuperación se incrementen notoriamente(5,25).

Los minerales a partir de los cuales la recuperación de oro era

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menor al 50%con el tratamiento por cianuración solamente, la re­cuperación aumentó a más de 90%cuando se pretrataron con T. fe­rrooxidans antes de la cianuración.

Consideraciones sobre la optimización de los procesos biohidrome­talúrgicos

Esta tecnologia ha desperado interés mundial por las ventajas po­tenciales que tiene respecto de los procedimientos convencionalesde metalurgia extractiva:

BAJO CONSUMO DE ENERGIA

BAJO CONSUMO DE REACTIVOS QUiMICOS

REDUCIDOS COSTOS DE INVERSION

ES UN PROCESO LIMPIDO QUE N0 PRODUCE CONTAMINACION AM­

BIENTAL

AL MOMENTO PERMITE LA EXPLOTACION ECONOMICA DE YACI­

MIENTOS DE BAJA LEY

Sin embargo, en el estado actual de desarrollo, la aplicación deesta tecnología requiere de largos periodos de procesamiento,desde varios meses a años para obtener recuperaciones aceptables.La velocidad de lixiviación es baja y esto es atribuible a la ba­ja velocidad de multiplicación de las bacterias intervinientes.

El tiempo de procesamiento constituye de por si una significativabarrera técnico-económicaa los fines de aplicación industrial.Además, la baja velocidad de lixiviación impone la necesidad de

_ 25 _

operar con grandes masas de minerales que, en general, quedan so­metidas a variaciones climáticas, lo cual impide el control finode los sistemas que se tornan fluctuantes, erráticos y en conse­cuencia con resultados no constantes ni previsibles en el tiempo.

El incremento en la velocidad de lixiviación o biooxidación, y enla velocidad de multiplicación bacteriana, es ciertamente el me­joramiento más esperado (2). De alli que el estudio de las carac­teristicas fisiológicas, condiciones de desarrollo y crecimientode microorganismos con respecto a la oxidación de compuestos me­tálicos, aplicado a la solución de los problemas tecnológicos an­tes enunciados, es una importante área de investigación actual.

Existen expectativas empresarias en el mejoramiento de la capaci­dad biolixiviante de los microorganismos por técnicas de Ingenie­ria Genética (26,27). Una de las propiedades que es factible me­Jorar, comose verá más adelante, es la tolerancia a metales tó­xicos, que normalmente están presentes en muchos minerales. Latecnologia de modificación genética del Thiobacillus ferrooxidansno ha avanzado tanto como la de otras especies, fundamentalmentepor las condiciones inusuales requeridas para su crecimiento ypor las dificultades encontradas en laboratorio para la obtenciónde colonias en medio sólido agarizado.

La falta de conocimientos acerca de los mecanismos exactos queposibilitan la biodegradación de minerales y de las interaccionesbaCteria-sustrato insoluble. se considera un serio problema queinteresa resolver (2), entre otras razones porque ello hace in­ciertas cuáles son las caracteristicas bacterianas que podrianser genéticamente alteradas para mejorar las capacidades de lixi­viación microbiana.

En el marco de lo antes descripto se encuadran los objetivos deesta tesis.

_ 26 _

Fisiología y metabolismo de T. tbrroaxidans

El T. férrooxidans es una bacteria acidofilica, mesofilica qui­mioautotrófica, y constituye el microorganismo más importante enlos procesos biohidrometalúrgicos. Siendo un miembrodel géneroThiobacillus pertenece al grupo de bacterias que es capaz de ob­tener la energía para el crecimiento y mantenimiento celular apartir de la oxidación de compuestos reducidos de azufre o de laoxidación de Fe2+ a Fe3+ usando 02 como aceptor electrónico (28).

Al microscopio electrónico, el T. ferrooxidans muestra un altogrado de polimorfismo: células grandes en forma de varilla conlos extremos redondeados (1,6-1,7 p de largo por 0,3-0,7 ul deancho), o bien células esféricas, ovoides o alargadas (0,6-0,7 ude largo por 0,3-D,4 p de ancho). Las microfotografias muestran,además, la pared caracteristica de los organismos Gran-negativos(29-32). Diferentes cepas pueden poseer flagelo y/o pili (33).

Las vias metabólicas en T. ferrooxidans corresponden a las usua­les en microorganismosquimiolitotróficos.

Eusniedecarbgng

El T. ferrooxidans fija C02 a través de un ciclo de Calvin (28,34,35). La reacción global del ciclo de Calvin se puede represen­tar de la siguiente forma:

3003+9ATP+5H20+6NADH—————>HCOCHOHCH20H2P03+9ADP+6NAD+8H3904

La operación del ciclo requiere ATPy del complejo reductor CO:­NADHque son sintetizados a través de las reacciones de oxidación

_ 27 ­

y constituyen las moléculas de acoplamiento con las reaccionesanabólicas.

La oxidación del hierro ferroso y de los compuestos reducidos deazufre proveen la energia requerida para la fijación de dióxidode carbono y otras funciones metabólicas.

Debido a su potencial de oxidoreducción, el Fe2+ es incapaz dereducir el NADrequerido para la fijación autotrófica de dióxidode carbono. El Thjobacillus férrooxidans posee una cadena respon­sable del flujo de alrededor del 10% de la cantidad total deelectrones (11). Considerando los potenciales de quinona, cito­cromos (C1 y b) y ferredoxina, se ha sugerido que ellos están in­volucrados en este proceso. Unavía posible de esta transferenciainvertida de electrones es el ciclo-Q (37,38) que se representaen la Figura 5.

pH2 ' DH? +>_2H. Narco)Q ü

Hifi" '480

QH* e- ?._—_H,QtfiÜ GH

w Í“ 12502+/3+__ 2 QH_.. 4

F9 ’5800. 1 HQHZ ———-QH2

Figura 5: Representación esquemática del flujo reverso de elec­trones en Tbiobacillus férrooxidans.

_ 28 _

Solamente la ubiquinona puede servir comoun carrier de electro­nes y protones, debido a la elevada diferencia de potencial entrelas formas oxidada y reducida. Debido a su elevado potencial, laubiquinona reducida puede aceptar electrones probablemente trans­feridos desde el citocromo c. Los sitios de oxidación y reducciónde la ubiquinona son las superficies interna y externa de la mem­brana citoplasmática, respectivamente. Los electrones de 1a ubi­quinona oxidada son transferidos al NADpor un carrier como laferredoxina. El ciclo Q se sustenta por el potencial quimico, ge­nerado por la diferencia de concentración de ión hidrógeno a am­bos lados de la membrana.

Metabolismoenszsflim

Los procesos bioenergéticos ocurren en la membranacitoplasmáticaque contiene los citocromos, los cuales constituyen los componen­tes más importantes de la cadena de transferencia de electrones.

Esta cadena de transporte de electrones actúa comomediadora en­tre los dos componentes de la reacción global de oxidación dehierro ferroso, de la siguiente forma:

2Fe2+-—————————>2Fe3+ + 2e­

2e- + 502 + 2H+-——————>H20

2Fe2+ + E02 + 2H*-—-———>2Fe3+ + HzO

-29­

La Figura 6 muestra el esquemade la transferencia de electronesy síntesis de ATPdurante la oxidación de Fe2+. Esta transferen­cia conduce a la generación de un potencial electroquimico que dalugar a la síntesis del ATP requerido para la fijación de COz yotras funciones del metabolismo intermediario.

Membrana

citoplasmática Matriz

pH 2.0 pH 5.0-6.0

2Fe2+\\ 29- /’H20

2Fe3+A/ K302 + 2H+

2H+ KY» ATPI a 2H+

\\—/Á\NADP + Pi

A Hzo t

‘47 02 7

Figura 6: Representación esquemática de la fosforilación oxidati—va en Thiobacillus ferrooxidans a partir de hierro fe­rroso .

_ 30 _

De acuerdo con los cálculos de Tuovenin y Kelly (39), la oxida­ción de dos iones Fe2+ resulta en la sintesis de una molécula deATP.

La cadena de transporte de electrones involucra a la rusticianinay a los citocromos c, c1 y a1, según se ilustra en el esquema dela Figura 7.

Los estudios espectrofotométricos del estado de oxidoreducción deestos citocromos han revelado la siguiente secuencia en la cadenade transferencia de electrones (40):

rusticianina___,cyt. c___+cyt. cl___>cgt. a1—;—>02

La rusticianina, una proteína compuesta de una cadena polipeptí­dica simple con un átomo de cobre, es el aceptor inicial de elec­trones (41,42).

Envoltura Membrana

celular v citoplasmática

2Fe2+) (Rusticyanina) (cyt .2Fe3+

Figura 7: Representación esquemática de la transferencia de elec­trones durante la oxidación de hierro ferroso en Thia­

I

l

I

I

l

I

l

l

I

I

l

l

l

l

l

bacillus ferrooxídans.

-31­

Por definición, para que una especie bacteriana sea miembro delgénero Thiobacillus, debe ser capaz de utilizar 1a oxidación decompuestos de azufre inorgánicos para cubrir sus requerimientosenergéticos.

Los mecanismos de oxidación de compuestos de azufre en Ihiobaci­llus ferrooxidans son similares a los de otras especies del géne­ro Thiobacillus (43,44,11,45).

Los sulfuros metálicos, el azufre elemental, el tetrationato y eltiosulfato, permiten el crecimiento de T. ferrooxidans. En la ma­yoría de las especies de Thiobacillus estudiadas, el sulfito esla molécula intermediaria clave. La energía se produce por oxida­ción de sulfito a sulfato a través de las enzimas sulfito oxidas,ADPsulfurilasa, APSreductasa y adenilato quinasa.

En algunas especies de Thiobacillus, la oxidación de sulfurosconstituye un proceso de dos etapas (46). En la primera etapa,caracterizada por una baja velocidad, una proteina que contienecobre parece ser el aceptor primario de electrones. La segundaetapa de la oxidación de sulfuro está asociada con la fracción demembranadonde los electrones son transferidos a lo largo de lacadena respiratoria, que comprende los citocromos b, c y a. Lareacción de oxidación de sulfuros se puede representar de la si­guiente forma:

S—->Cu—proteina——+flavinas?->cyt. b-—*cyt. c->cyt. d-—+02

Primera etapa Segunda etapa

_ 32 _

La Figura 8 muestra un esquema de la oxidación de compuestos re­ducidos de azufre por especies del género ïhiobacillus.

82032'//////25032T————>

8042­

2H+

Membrana

citoplasmática

cadena de

transferencia

de electrones

E02 + 2H+

H20

ATP

/Ï2H+

KADP + Pi

Figura 8: Representación esquemática de la oxidación de' compues­tos reducidos de azufre en Thiobacilos.

_ 33 ­

WWWLa oxidación y consecuente solubilización de sulfuros metálicospor Thiobacillus ferrooxidans ha sido probada ensayando sulfurosmetálicos sintéticos comoúnica fuente de energia (47-49). Noobstante, lo que no está claro son los mecanismos fundamentalesque ocurren cuando las células bacterianas y los sulfuros minera­les interactúan, ni el mecanismode la destrucción de la estruc­tura del sulfuro mineral (50).

La primera etapa de la interacción bacteriana con sustratos inso­lubles parece ser el contacto o adsorción de las células sobre lasuperficie mineral (51-54).

A partir de este contacto, el sustrato podria ser atacado bioquí­micamente. Se presume que en primera instancia la célula produci­ria enzimasextracelulares capaces de destruir o distorsionar laestructura cristalina a fin de permitir la subsecuente oxidaciónbiológica. Noobstante, nada se sabe acerca de la naturaleza deeste contacto, de los componentescelulares involucrados en él. ode las condiciones fisico-químicas que lo gobiernan.

Por todo lo expuesto, la investigación en este área aún oscura,de la interacción bacteria-sustrato, puedeaportar datos signifi­cativos a los fines de optimización de los procesos biohidrometa­lúrgicos.

EiJacióndenitLóseno.

AunqueThiobacillus ferrooxidans es muyeficiente en la utiliza­ción de nitrógeno amoniacal, la escasez de esta forma de nitróge­no en los minerales puede limitar seriamente la eficiencia de losprocesos biohidrometalúrgicos (55). Por otra parte, el agregado

_ 34 _

de nitrógeno amoniacal a las soluciones de lixiviación implica unsignificativo costo adicional.

La capacidad de fijar nitrógeno atmosférico es importante paracualquier organismo que haya evolucionado en ambientes carentesde otras fuentes de nitrógeno. Hackintosh (36) demostró por in­corporación de 15N2en el material celular que el T. ferrooxidanses capaz de fijar nitrógeno atmosférico.

Aunquelas condiciones fisiológicas para la fijación de nitrógenoson relativamente variables, la enzima nitrogenasa que está ex­clusivamente conservada es por ello muysensible al oxigeno. ComoT. ferrooxidans es un aerobic obligado, capaz de vivir en condi­ciones extremas, Pretorius y colaboradores (57) investigaron lapresencia y organización de los genes estructurales del sistemanitrogenasa en cinco cepas diferentes de T. ferrooxidans. Estosautores clonaron los genes nifHDK de la cepa ATCC33020 de T. fe­rrooxidans en Escherichia coli y determinaron que dichos genesestán en la misma secuencia que se ha encontrado en los operonesnif de otras bacterias.

La presencia de secuencias de DNAhomólogas a los genes nifHDK deK. pneumoniae en las cinco cepas de T. ferrooxidans, sugiere quela capacidad de fijar nitrógeno puede ser bastante general en ce­pas de esta especie.

Uncarácter muydistintivo en la fisiología de T. ferrooxidans esque posee un sistema nitrogenasa siendo un aerobic obligado devida libre. Las proteinas nif son lábiles al oxigeno y el sistemaresponsable de la fijación de nitrógeno funciona solamente encondiciones de anaerobiosis extrema (56). MacKintosh (36) demos­tró que el T. ferrooxidans es capaz de fijar nitrógeno atmosféri­co usando hierro ferroso comofuente de energia pero en concen­traciones de oxígeno limitadas, de modotal que en condiciones de

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microaerobiosis el oxigeno es suficiente para la oxidación dehierro requerido para una fijación de 15N2medible. Estas condi­ciones de microaerobiosis serian suficientes para permitir la ex­presión y funcionamiento del sistema nitrogenasa. Sin embargo,los estudios in situ con el T. ferrooxidans no han permitido de­mostrar una actividad de fijación de nitrógeno en las condicionesde operación de los procesos biohidrometalúrgicos.

El entendimiento detallado de cómo el T. ferrooxidans resuelveesta aparente contradicción fisiológica y el conocimientode lascondiciones en que esta bacteria fija nitrógeno eficientemente,representarán un significativo aporte a la tecnologia biominera.

Desarrollo de sistemas genéticos en T. tbrroaxidans

El desarrollo de procedimientos para el mejoramiento genético delT. ferrooxidans y la meJor comprensión de los procesos que con­trolan la expresión génica en organismosautótrofos acidofilicos,constituyen importantes áreas de investigación. En este sentido,son importantes los beneficios potenciales que puede generar eluso de la tecnología del DNA recombinante y de la manipulacióngenética de cepas de T. férrooxidans.

Hayvarios pasos importantes para el desarrollo de sistemas gené­ticos en una bacteria comoésta:

Se deben identificar caracteristicas útiles que puedan ser­vir como marcadores para la identificación y selección decepas recipientes transformadas.

Se deben identificar y caracterizar moléculas de DNAvecto­res que puedan replicar en T. ferrooxidans y que puedan lle­var insertos de DNA.

Se debe aislar y purificar las secuencias de DNAque codifi­quen para las caracteristicas fenotípicas deseadas. H

Realizar la construcción de las moléculas de DNAvector.

Desarrollar un métodopara transferir vectores a las cepasreceptoras de DNA.

No se conocen los mecanismos de control de la expresión génica enbacterias autotróficas. ComoT. ferrooxidans tiene una fisiologíamuydiferente a la de E. c011 o a la de cualquier otro heterótro­fo que haya sido genéticamente estudiado, es importante estable­cer si algunas regiones genéticas de control se expresan o sonequivalentes a las de bacterias heterotróficas.

El conjunto de genes hasta ahora caracterizados y disponibles pa­ra la manipulación genética de T. férrooxidans, proviene en sutotalidad de bacterias heterotróficas cuyas relaciones genéticascon T. ferrooxjdans son inciertas.

MamadgneadaaalemLÓn

Se ha investigado la identificación de marcadores potenciales deselección para estudios genéticos, que puedan ser utilizados enun medio inorgánico con sulfato ferroso comofuente de energía apH 1,8.

Si bien T. ferrooxidans es altamente resistente a elevadas con­centraciones de varios iones metálicos como el Cu2+, C02+, Mn2+.Ni2+ Y Zn2+, es sensible a aniones de el As y el Te, y extremada­

_ 37 _

mente sensible a H82+, H8+ y Ag+ (9.58-60).

La resistencia a iones metálicos es un marcador particularmenteatractivo para estudios genéticos en T. férrooxidans porque, ade­másde ser una herramienta útil de laboratorio para seleccionarposibles transformantes, conferirian a la bacteria característi­cas industrialmente útiles (2). En efecto, muchosminerales quepor su composiciónseria susceptibles de bio-oxidación contienen,además, estos inhibidores metálicos que, aunque en bajas concen­traciones, resultan inhibidores del crecimiento bacteriano.

Dadoque los genes de resistencia a estos metales se han identi­ficado en otras bacterias (59), dichos genes podrian servir comomarcadores genéticos para T. ferrooxidans.

La resistencia a antibióticos se ha usado ampliamente comomarca­dores de selección en bacterias heterotróficas. Dealli que se haensayado la sensibilidad de cepas de T. ferrooxidans a un amplioespectro de antibióticos (60). Todas las cepas resultaron sensi­bles a rifampicina, cloranfenicol, cefaloridina y ampicilina.

Elásmidgs de T. fbrrooxidhns

Se han aislado y caracterizado plásmidos de varias cepas de T.ferrooxidans (60-62). En uno de estos estudios, tres de seis ce­pas aisladas de distintas fuentes contenían plásmidos que varia­ban entre 4,5 y 27,5 Kb (60). Por mapeode restricción se identi­ficaron sitios de restricción únicos para clonado.

En otro trabajo, se aislaron nueve cepas de una mina de uranio enCanadá. Cada una contenía entre uno y cuatro plásmidos, y el ta­mañode los plásmidos variaba entre 12,2 a 43x10a Da (62). Trata­ron de correlacionar la presencia de plásmidos de un tamaño par­

_ 38 _

ticular con un incremento en la resistencia a uranio se detecta­ron plásmidos de aproximadamente 1310,5x106 Da en cuatro cepasque tenian las mayores resistencias a U022+. No obstante, losplásmidos no se caracterizaron por análisis de restricción y nose estableció la relación entre ellos. En una de las cepas, ladesaparición de estos plásmidos se correlacionó con la desapari­ción de la resistencia a uranio, pero tal evidencia circunstan­cial no es conclusiva para establecer una relación causal. Hastael momento, no ha podido asignarse un determinado fenotipo a unplásmido particular, y por ello, estos plásmidos son consideradoscomo“crípticos”. Por otro lado, la cura de plásmidos de T. re­rrooxidans por varias técnicas, no ha dado resultado.

Clonado y expresión de origenes de replicación de plásmidos de T.ferrooxidans

Varios plásmidos provenientes de cepas de T. ferrooxidans han si­do transferidos a E. coli (63-65), sin que ningún fenotipo parti­cular haya podido ser asignado a los productos de transformaciónen la bacteria.

Además, se ha analizado la capacidad de cuatro plásmidos de T.ferrooxidans para replicar en E. coli y PBeudomonasaeruginosa apartir de un origen de replicación de T. ferrooxidans (Tabla II).Los plásmidos se clonaron en pBRazs en el que el sitio del origende replicación se conoce. Se utilizaron varias estrategias parala construcción de los plásmidos recombinantes y para la delecióndel origen de replicación de pBRszs. Unode estos plásmidos re­combinantes, el pDER412,el cual deriva del pDER401(Figura 9) ycontiene el gen de resistencia a cloranfenicol, fue capaz de re­plicar tanto en E. 0011 comoen P. aeruginosa a partir de un ori­gen de replicación de T, ferrooxidans (64). Los otros plásmidos

_ 39 _

recombinantes no dieron este resultado. Noobstante, esto escoincidente con observaciones similares.en plásmidos de otras es­pecies. La replicación de la mayoria de los plásmidos está res­tringida a la especie de la que provienen o a otras estrechamenterelacionadas, mientras que muypocos son capaces de replicar enuna variedad de especies bacterianas.

Comoel pDER412contiene un origen de replicación de amplio rangode huésped, sitios de restricción únicos y la resistencia a clo­ranfenicol comomarcador, potencialmente es un vector Shuttle pa­ra experimentos de manipulación genética que involucren T. farra­oxidansy bacterias heterotróficas.

Tabla II: Plásmidos recombinantes de T. ferrooxidans clonados enpBRazs

DesignaciónPlásmidos de TamañoSitio de Marcador de del plásmidoT.ferroox1dans Referencia (kb) clonado selección recombinantea

pTRss (60) 19,6 HindIII Apr,Cmr pDER330,pDER331pTF-FCz (65) 12,4 PstI Tcl',Cmr pDER4os,pDER4oaPTF33020-l (63) 6,7 HindIII Apr,Cmt pDER501pTFssozo-z (63) 11,5 HindIII Apt,Cmr pDER601

Tcr,Apr,Cmr pDEReoz

a Las diferentes designaciones son las dos orientaciones delplásmido de T. ferrooxidans en pBRazs.

_ 40 _

EcoRlPst I FPvuI

\ SUPPRIMEDANSDORLH\

‘Lamkb' \

\\p8R325

pDR 1.01118kb Pstl

Xhol ‘——U—"

PVul\' Pvu l\

0mé¿É\.\ Apal

Figura 9: Construcción y mapa de restricción de pDR412,un plás­mido recombinante de T. férrooxidáns y pBRazs, con unorigen de replicación de amplio rango de huésped.

-41­

Transferencia de vectores a T, férrooxidans

Unpaso critico en el desarrollo de un sistema genético para T.ferrooxidans es la transferencia de vectores a cepas receptoras.Los esfuerzos para transferir plásmidos de T. ferrooxidans portransformación con células tratadas y no tratadas con calcio, hansido infructuosos.

Para otras bacterias-se han utilizado procedimientos de transfor­mación y fusión de protoplastos para la transferencia de plásmi­dos (66). Asimismose ha investigado la producción y regeneraciónde esferoplastos en dos cepas de T. férrooxidans (67). Despuésdel tratamiento con lisozima, las cepas FD1y TFss produjeron 90y 40%de esferoplastos estables, respectivamente. Con la cepa FD1se obtuvo, además, una regeneración del 70 al 93%en agar blando.Esta cepa es mixotrófica, pero no se sabe si la capacidad pararegenerar en agar blando está relacionada con la mixotrofía. Lascepas autotróficas absolutas son muydificiles de crecer en medioagarizado. Se intentó transformar esferoplastos de la cepa FD1con el plásmido pDERsoz usando polyetilenglicol 4000 (40%, pzv)de acuerdo con el método de fusión de esferoplastos de Coetzee ycolaboradores (68), no pudiendo aislarse transformantss Cn! yTcr. Esto puede haber sido debido a una falla en la transforma­ción o a la carencia de expresión de genes heterólogos en un au­tótrofo como T. ferrooxidans.

Aunquela transformación es el sistema más directo para transfe­rir plásmidos, tiene la desventaja de que no es un fenómenogene­ral y a menudoestá confinado a determinadas cepas dentro de unaespecie particular.

La conjugación es un procedimiento menos directo, pero tiene laventaja de ser más ampliamenteaplicable para transferir plásmi­dos entre bacterias. Los plásmidos de amplio espectro de huéspe­

_ 42 _

des (69) que son capaces de transferirse a sí mismosy movilizarotros plásmidos, ha facilitado significativamente la transferen­cia por conjugación.

Comoun paso inicial en el desarrollo de un sistema de conjuga­ción para T. férrooxidans, se investigó la movilización de losplásmidos recombinantes de T. ferrooxidans (Tabla II) entre cepasde E. coli (70). Ninguno de los plásmidos fue capaz de transfe­rirse por si mismode una cepa de E. coli sensible al ácido nali­díxico a otra resistente.

El plásmido RP4-IncP de amplio rango de huésped no movilizó elpBRszs, pero fue capaz de movilizar al pDER401, pDER412, pDER4zs,y pDERsoza frecuencias altas, como se muestra en la Tabla III.

Tabla III: Movilización de plásmidos recombinantes de T. farra­xidans entre cepas de E. 0011.

Plásmido conjugativo Plásmido movilizado Frecuencia deconjugación

RP4 y pRKzola (IncP) pBRazs <1.6 x 10-9pDERsal (1,8 x 10-9pDER4o1 2,5 x 10-1pDER412 2,5 x 10-1pDER425 2,4 x 10-1pDERsoz 1,0 x 10-2pDERsoz 2,5 x 10-5

-43­

La movilización del pDER401, pDER412, pDER425, pDERsoz y pDERsozpero no del pBRazs, indica que los componentes de T. terroaxidansde estos plásnidos recombinantes tienen funciones de movilizaciónque han sido activadas por RP4 o pRK201a.

Para la transferencia de ADNentre diferentes especies bacteria­nas, un requerimiento importante es contar con un medio apropiadopara llevar a cabo la conjugación. Comoel T. ferrooxidans es unautótrofo acidofilico que tiene requerimientos muydiferentes alos de E. coli, que es una bacteria heterotrófica que crece a pHneutro, no ha sido posible la conjugación en forma directa entreambas especies. Para resolver este problema se ha propuestotransferir ADNde E. coli a T. ferrooxidans en dos etapas, usandocomo intermediarios especies de thiobacilos que pueden crecertanto a pH neutro o ácido, comoen presencia de sustratos orgáni­cos o autotróficamente. Estas especies son el T. novellus, T. 1n­termedius o T. neopolitanus.

En la primera etapa, la conjugación se llevaria a cabo entre E.coli y una de las especies anteriores de thiobacilos, a pHneutroy en presencia de sustratos orgánicos, mientras que en la segundaetapa se podria producir la conjugación entre la cepa receptorade la etapa anterior y T. férrooxidans a bajo pH y en ausencia desustratos orgánicos.

La primera de estas dos etapas ha sido posible. Los plásmidos RP4o RP1 se transfirieron conJugativamente de E. coli, tanto a T.novellus comoa T. neopolitanus (71,72).

Noobstante, la segunda etapa de transferencia de ADNa T. ferro­oxidans no ha sido posible aún.

_ 44 _

Todos los trabajos que al momentose han realizado en un esfuerzopor transformar T. férrooxidans por una variedad de técnicas,concluyen en que las falencias que impiden la transferencia y ex­presión de ADNa T. ferrooxjdans pueden deberse a algunos de lossiguientes elementos:

1) La carencia de expresión de genes de resistencia provenientesde bacterias heterotróficas en un autótrofo acidofílico yaque nada se sabe de la equivalencia o no de expresión en am­bos.

2) La falta de un medio de plaqueo adecuado para T. ferrooxidansque permita con seguridad seleccionar posibles transforman­tes. Los métodos hasta ahora diseñados son lentos, inciertosy de resultados no repetitivos.

3) Fallas en los métodos de transferencia de ADNa T. férrooxi­dans.

En este marco se inscriben algunos de los objetivos de esta te­sis.

-45­

OBJETIVOS

Los objetivos generales de esta tesis apuntan al desarrollo deprocedimientos tendientes a la transformación de T, ferrooxidansy el estudio de distintos aspectos de la fisiología de esta bac­teria, relacionados con el mejoramiento y 1a optimización de latecnologia biohidrometalúrgica.

En tal sentido, se plantearon los siguientes objetivos particula­1‘83:

Analizar el crecimiento de T. ferrooxidans en medios sólidos,en busca de un método eficiente para la obtención de colo­nias.

Conformaruna colección de cepas de T. férrooxjdans aisladasde minerales nacionales y caracterizarlas por sus sustratosespecíficos y condiciones de desarrollo.

Seleccionar cepas de especies del género Ihiobacillus con re­sistencias a iones metálicos.

Determinar la presencia de plásmidos en las cepas resistentesy purificarlos.

Analizar la posibilidad de acceder a una metodología detransformación en T. ferrooxjdans.

MATERIALES Y METODOS

METODOS MICROBIOLOGICOS

Cepasutilizadas

La Tabla IV indica las cepas con capacidad lixiviante utilizadas,así comosu origen y condiciones de cultivo.

Tabla IV: Cepas con capacidad lixiviante utilizadas

Cepas de Origen Sustratos conoci- Rango deT. ferrooxidans dos y/o eneayados tempera­

tura

ATCC19.859 Trusell P. Fe2+, SO, 52032-, 28-37°C(73) 84032­

Sulfuros metálicos

BA1 Aislada de mineral de Fe2+,SzOs=, CuS, 28-37’Ccobre del yacimiento Cqu, ZnS, CoS"Bajo de Alumbrera".Esta tesis.

BAz Aislada de mineral de Fe2+, 82032, CuS, 28-37°Ccobre del yacimiento Cqu. szSa“Bajo de Alumbrera".Esta tesis.

Bas Igual a1 anterior Fe2+, 8203=, CuS, 30-50°CFeSz, ZnS

CMI Aislada de mineral de Fe2+, 8203=, Cqu, 28-37°Ccobre del yacimiento Fez, ZnS, CoS“Campana Mahuida".Esta tesis.

CMz Igual al anterior Fe2+, 8203=, Cqu, 28-45°CPbS

_ 43 _

Se utilizó 1a cepa XL1 de E. coli (sup E44 hsd R17 rec A1 end A1Eyr A43 thi rel A1 Lac-), sensible a Ampicilina. Se determinó susensibilidad a Te203= en medio LB siendo 10-5 Mla concentracióninhibitoria, por lo cual los transformantes resistentes se selec­cionaron en Te203= 10-‘l My después se analizó el crecimiento enconcentraciones mayores.

Aislamiento de cepas con capacidad biolixiviante

Las cepas indicadas en la Tabla IV se aislaron a partir de tresmuestras de mineral del yacimiento "Bajo de la Alumbrera" (Cata­marca) y de dos muestras de mineral del yacimiento “Campana Ma­huida" (Neuquén).

La primera etapa del enriquecimiento se efectuó sembrando 10 g decada muestra en un medio que contenía tiosulfato como fuente deenergia, de modode descartar las especies bacterianas que oxidansolamente hierro ferroso pero no compuestos reducidos de azufrecomo Laptospirillun férrooxidans. Para ello se incubaron lasmuestras en erlenmeyers conteniendo 100 ml de medio con agitacióna 30°C. Se controló el desarrollo de microorganismos por observa­ción en microscopio bajo contraste de fase.

Posteriormente se inocularon con 1 ml de cada uno de los cultivosanteriores, Erlenmeyers conteniendo 100 m1 de medio 9K que conte­nía hierro ferroso comofuente de energia. Se los incubó con agi­tación a 30°C y se controló de la misma forma el desarrollo demicroorganismos. Se obtuvo desarrollo de bacterias baciliformes yel medio cambió de color verdoso a pardo rojizo por la formaciónde hierro férrico.

_ 49 _

La obtención de cultivos puros se realizó por aislamiento de co­lonias individuales durante varios ciclos de subcultivo en medioferroso ISP gelificado con agarosa según los lineamientos que sedescriben en el Capítulo II.

Inicialmente, las cepas se mantuvieron por repique cada dos mesesen medio liquido 9K. Por los resultados obtenidos durante el de­sarrollo de esta tesis, actualmente se mantienen en heladera enmedios sólidos, tanto en medio ferroso agarizado comoen sulfurosmetálicos deshidratados.

Los sulfuros metálicos ensayados para cada cepa e indicados en laTabla IV se utilizaron comosustratos, según los criterios que sedescriben en el Capítulo V.

Medios de cultivommmSe mezclaron en el momentode utilizar las siguientes solucionesesterilizadas separadamente.

Solución A:

(NH4)2SO4 6.00 sKCl 0,20 g

MgSO4 1,00 g

CaNOa 0,02 gH20 800 ml

Ajustada a pH:3,5 con una solución de SO4H2IN y esterilizada enautoclave a 121°C durante 20 minutos.

_ 50 _

Solución B:

NazSzOs.5H20 10,00 gHzo 200 m1

AJustada a pH=3,5 con una solución de SO4H21N y esterilizada porfiltración.

Medio 2K (74)

Se mezclaron en el momentode usar las siguientes soluciones es­terilizadas separadamente.

Solución A:

(NH4)2SO4 3.00 8KCl 0.10 8

'KzHPo4 0,50 gMgSO4.7H20 0,50 gCa(NOa)2 0,01 8Hzo 700 ml

SO4H2 10N 1 ml

Solución B:

FeSO4.7H20 300 ml de una solución14,74% (P/V)

Media ISR fiálldg (75)

Para la obtención de colonias en medio ferroso agarizado, se uti­lizó esencialmente el medio de Manningcon algunas modificacio­nes .

El medio se preparó por combinaciónde tres soluciones esterili­zadas separadamente y se mezclan en caliente en el momento depreparar las placas.

Solución A:

(NH4)2SO4 6,00 8KCl 0.20 sMgSO4.7H20 1.00 8Ca(N03)2 0.02 ESO4H2 0,06M 400 ml

Solución B:

FeSO4.7H20 20,00 8H20 200 ml

Ajustada a pH=1,8 con una solución de SO4H26M.

Solución C:

Agarosa ultra pura B.R.L. o agar Difco-Bacto encantidad calculada para obtener la concentraciónfinal (pzv) que se indicó en los ensayos del Capí­tulo II en un volumen de 400 ml de agua.

Una vez mezcladas las soluciones en caliente, se colocaron en ca­da placa los volúmenes correspondientes. Las placas incompletasse prepararon distribuyendo un volumen determinado de medio enaproximadamentela mitad de la superficie de la placa.

Cuandose usaron medios adicionados de prolina, betaína o sarco­syl (10-2 M), la adición se hizo después de mezclar las solucio­nes A, B y C, a partir de soluciones madres 1 M.

El cloruro de potasio se adicionó a la Solución A en las cantida­des correspondientes a la concentración molar indicada en cadacaso .

_ 52 ­

Cuandose usó polietilenglicol 8000, el medio se preparó de lasiguiente forma: Las Soluciones A y B igual que las indicadas an­teriormente; en tanto que en la Solución C la agarosa se disolvióen 300 ml de agua en lugar de 400 ml. Se preparó una solución D,constituida por la cantidad de polietilenglicol 8000 necesariapara alcanzar la concentración final requerida en 100 m1de agua.

Las cuatro soluciones se mezclaron en el momentode usar el mediode cultivo.

MedinSElignidQ

Se preparó por combinación de dos soluciones estériles, en el mo­mento de usar.

Solución A:

(NH4)2SO4 6.00 gKCl 0.20 8MgSO4.7H20 1.00 8Ca(N03)2 0,02 gH20 800 ml

Solución B:

FeSO4.7H20 20,00 gH20 200 ml

El pH en las soluciones A y B se ajustó a 1,8 con SO4H26 M.

“1215239.102!

Se empleó para la obtención de colonias sobre una capa de salesdepositadas sobre el vidrio de la placa. Se preparó por la mezclaen el momentode usar, de dos soluciones estériles. La composi­ción de las mismas corresponde a la de las Soluciones A y B del

_ 53 _

medio ISP liquido, multiplicando la concentración de cada salcomponente por cinco o por diez, según se trate del medio ISP 5Xo 10X, respectivamente.

Una vez mezcladas las Soluciones A y B, se distribuyeron homogé­neamente mediante movimientos de rotación 3 ml por placa. La eli­minación de agua por evaporación fue más rápida que cuando se de­bió eliminar el exceso de agua contenida en un gel.

Medio MS (10)

El medio MS líquido se preparó en el momento de usar mezclandolas siguientes soluciones esterilizadas separadamente.

Solución A:

(NH4)2SO4 2.00 gKCl 0.10 sK2HP04 0,25 gMgSO4.7H20 800 ml

El pH se ajustó a 2 con SO4H2 IN.

Solución B:

FeSOq.7H30 20.00 8HZO 200 ml

El pH se ajustó a 2 con SOqHz 1 N.

Medio Baalsrud (76)

Este medio se usó para la selección de las cepas portadoras deresistencias a iones metálicos pertenecientes a especies del gé­nero Thiobacillus.

_ 54 _

El medio se preparó mezclando en el momentode usar, las dos so­luciones siguientes esterilizadas por separado.

Solución A:

NazSzOs.5HzO 5,00 gKNOs 2,00 g

MgSO4.7H20 0,60 gNH4Cl 0,50 gH20 900 ml

Solución B:

K2HP04 2,00 g

NaHCOs 1,00 g

FeSO4.7H20 0.01 8ClH 0,1N 100 ml

Las especies de Thiobacillus autotróficas facultativas se carac­terizaron por el crecimiento mediante la oxidación de glucosa.Para ello se usó el medio anterior, reemplazandoel tiosulfatopor glucosa, de modode obtener una concentración final de 0,1%.

Media LB (Luria-Bertani)

Composiciónpor litro:

Triptona Bacto 10 gExtracto de levadura Bacto 5 gNaCl 10 g

El pH se ajustó a 7,5 con hidróxido de sodio.

-55­

Madig M3

Este medio se usó para determinar las resistencias a iones metá­licos de los transformantes de la cepa XL: de E, coli selecciona­dos por resistencia a Te203= y Ampicilina en medio LB.

Se preparó mezclando en el momentode usar las siguientes solu­ciones esterilizadas separadamente:

Agar 3% (2X) 100 m1

Sales M9 (10X) 20 ml

M8504 1M 400 ul

CaClz 1M 20 ulVitamina B1 (tiamina)1% 80 ulGlucosa 20% 2 m1

H20estéril c.s.p. 200 m1

La vitamina se preparó en H20estéril en un recipiente estéril.Para evitar 1a precipitación de sales el CaClzse adicionó en úl­timo término. La formulación de sales M9(10X) fue la siguiente:

NazHPO4 6,00 g

HK2P04 3,00 gNaCl 0,50 gNH401 1,00 gH20 c.s.p. 1 l

El pH se ajustó a 7,4 con NaOH.

Han de Ampicilina

Se utilizó una solución madre de sal sódica de ampicilina en aguacon una concentración de 10 mg/ml. Se esterilizó por filtración.

-56­

Para preparar las placas, los medios autoclavados se dejaron en­friar a 55°Cantes de adicionar la Ampicilina necesaria para al­canzar la concentración final requerida.mmmnhmnmmaammmSe utilizaron soluciones madres 1 M o 10-3 M de: HgClz, AgNOa,CdClz, NaAst. Naz(AsO4H)y K2(Te203). Las soluciones madres seesterilizaron por filtración y se agregaron a los mediosde cul­tivo agarizados mantenidos a 55°C en el momentode preparar lasplacas.

Preparación y uso de sulfuros metálicos sintéticos

El sulfuro cúprico (CuS) y el sulfuro de cobalto (CoS) sintéticosse prepararon por precipitación a partir de soluciones de sulfatode cobre y sulfato de cobalto, respectivamente. Manteniendo lassoluciones en caliente pero sin llegar a ebullición, se agregóuna solución de sulfuro de sodio (NazS), hasta que finalizó laformación de precipitado negro de los sulfuros correspondientes.Se separó el precipitado del sobrenadante por decantación. Elprecipitado se lavó el númerode veces necesario, hasta que elsobrenadante quedó limpido y dio reacción neutra. En el últimolavado la separación del precipitado se hizo por centrifugación a3000 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos. Decantando elsobrenadante, quedó una masa húmedafactible de transferir a pla­cas en volúmenes medidos de 2 a 3 ml por placa, mediante una pi­peta automática cuyo "tip" tenia la punta cortada.

Por movimientos de rotación de la placa, se obtuvo una capa homo­génea de sulfuro metálico distribuida en toda 1a superficie. Lasplacas se secaron en la campanade flujo laminar hasta que la ca­pa de sulfuro metálico se observó seca y que las placas mantuvie­ran peso constante. Luegode ello se esterilizaron a vapor fluen­te durante 20 minutos en tres dias consecutivos.

En el momentode inocular las placas se acidificaron con las co­rrespondientes soluciones estériles de ácido sulfúrico, cuyo vo­lumeny concentración se determinó en cada caso, según los crite­rios expuestos en el Capitulo V.

Empleode especimenes naturales, concentrados y minerales comosustratos

Se utilizaron los siguientes especimenesnaturales de alta purezaproporcionados por el Servicio Geológico de la Secretaría de Mi­neria de la Nación: Muestras de pirita (FeSz) y antimonita(szsa) molidos a -100 mesh y una muestra de galena (PbS) molidaa -40 mesh.

Se utilizó además, un concentrado de esfalerita (ZnS) que contie­ne el 59%de zinc y fue proporcionado por la empresa Cerro Casti­llo S.A. Este concentrado de sulfuro metálico de alta graduaciónse obtuvo a partir del mineral respectivo, por procedimientos demetalurgia extractiva.

Se utilizó también, mineral de cobre del yacimiento “Campana Ma­huida“ proporcionado por el Servicio Minero de la provincia deNeuquén. La especie de cobre predominante fue de calcosina (CuSz)y el mineral se ensayó molido a -100 mesh o triturado a 1/4".

Cualquiera de los sustratos anteriores se utilizó distribuyendouniformemente en placas cantidades pesadas de los mismos. Lasplacas se esterilizaron a vapor fluente 20 minutos durante tresdias consecutivos.

Cuandose trabajó con placas descartables, las cantidades pesadasde cualquier sustrato se esterilizaron envueltas en papel de alu­minio y luego se volcaron asépticamente a las placas. En el mo­

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mentode inocular, los sustratos se acidifioaron con solucionesestériles de SO4H2,siguiendo el criterio de volumeny concentra­ción de ácido más conveniente definidos en el Capitulo V.

Fotografia

Las fotografias de los cultivos microbianos se tomaron en formadirecta, usando una lente smc PENTAX-A MACRO1:2.8,50 mmy conuna pelicula KODAKEktachrome (100 ASA).

Microscopía de Scanning

El material a analizar en cada caso se fijó sobre una grilla conglutaraldehido al 3%. Se lavó en buÍTbr de Millinning. Se deshi­drató con acetona a1 25%, 50%, 75%, 80% y 95% sucesivamente, me­diante tres lavados de 5 minutos cada vez. El punto critico desecado se determinó por Critical Pbint. Se metalizó con un evapo­rador de alto vacio marca Icol, modelo JEE-4C, con una aleaciónde oro-paladio (60%de oro-40% de paladio). Para las observacio­nes se utilizó un microscopio Icol, modelo JSM-ZSS.

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METODOS PARA LA PREPARACION DE PLASHIDOS Y TRANSFORMACION DE

BACTERIAS

Identificación de ADNplasnidico mediante ninipreparacionesWWXWCuando la identificación de ADNplasmídico se hizo en especies dethiobacilos, se inoculó 10 ml de medio Baalsrud con una colonia.El medio contenía 100 ug/ml de Ampicilina para las especies autó­trofas facultativas y NaAsO4H10-4 Mpara las especies autótrofasabsolutas. Se cultivó a 30°Ccon agitación. Cuandola identifica­ción de plásmidos se hizo en la cepa XLI de E. coli transformadacon el plásmido de la cepa T.12, se inoculó con una colonia, 5 mlde medio LBconteniendo 100 pg/ml de Ampicilina. Se cultivó a37°C con agitación. Luegode ello, las células se colectaron porcentrifugación a 5000xg por 10 min.

Liais

Según la cepa empleada se utilizaron distintos procedimientos delisis.

Lisis alcalina (77):

Se usó este procedimiento con la cepa XLI de E. c011.

El precipitado celular se resuspendió en 1 ml de TGE(Tris.ClH 25mM,pH 8.0, glucosa 50 mMy EDTA10 mn), y se transfirió a un tu­bo Eppendorf, que se centrifugó durante 2 min a 12000xg. El pre­cipitado bacteriana se resuspendió en 100 pl de TGEy se agrega­ron 200 pl de NaOH0,2 N y SDS 1% (pzv). Se mezcló suavemente porinversión y se dejó 5 min a temperatura ambiente. Luego de ellose agregó 150 ul de NaAcO5 M, pH 5,2 y se mezcló suavemente por

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inversión, dejando 10 min en hielo y centrifugando 10 min a12000xg. Se recuperó el sobrenadante con cuidado de no remover elsedimento constituido por restos celulares y ADNcromosómico.

Lisis por alta concentración de SDS(78):

En minipreparaciones de la mayoria de las cepas de thiobacilospudo detectarse la existencia de plásmidos. Conestas cepas seutilizaron los lineamientos generales de un procedimiento de li­sis desarrollado para detectar plásmidos en Clostridium acetobu­tylicum. El procedimiento involucra la generación de protoplastoscon lisozima, la inhibición de nucleasas por incremento en laconcentración de EDTA,y la lisis con alta concentración de SDS.

El procedimiento debió adaptarse en cuanto a las concentracionesde los reactivos y condiciones de lisis para cada cepa. Las eta­pas generales del procedimiento son las siguientes:

Las células se suspendieron en 50 ul de una mezcla que contenía:lysozima 5 mg/ml, sacarosa 20%, NaCl 50 mM, EDTA1 mM, y Tris.ClH100 mMpH 8, y se deJó por 25 min a temperatura ambiente. Luegode ello se agregó 200 pl de EDTAcuya concentración varió entre50 y 150 mMy 200 pl de SDS cuya concentración fue de 2 o 3%. Sedejó 30 min a temperatura ambiente antes de iniciar la purifica­ción.WMWMMWLos métodos indicados a continuación se utilizaron para despro­teinizar y/o para concentrar el ADNplasmidico. Las extraccionesse realizaron en el orden en que se describen.

Extracción fenólica: Se utilizó fenol recién destilado, previa­mente equilibrado con Tris-ClH 1 M, pH 8,0 hasta alcanzar un pH:7,6, y luego con una solución conteniendo Tris-ClH 0,1 M. pH 8; 2

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mMEDTAy 10 mMB-mercaptoetanol. La extracción se realizó con unvolumen de fenol por cada volumen de solución de ADN.Después decentrifugado se recogió la fase acuosa, sin tomar la interfase.

Extracción con fenol-clorofbrmo: Se realizó de la misma forma queel anterior, utilizando una solución de fenolzcloroformozalcoholisoamílico (25:2421).

Extracción con clorofbrmo: Se utilizó cloroformo:alcohol isoami­lico (24:1), y se procedió comoen los casos anteriores.

Precipitación etanólica: Se realizó ajustando la solución de ADNa 0,3 Mde acetato de sodio o 0,25 Mde acetato de amonio, yagregando 2,5 volúmenes de etanol absoluto. Se mantuvo 15 min a-70°C y se centrifugó de 15 a 30 min a 4°C en centrífuga Eppen­dorf.ManualesthSe aplicó la técnica descripta por Maniatis (79) utilizando comobuffbr de corrida TBE 0,5X (TBE 5X: 0,45 M HaBOs Tris y EDTA 10mM).Los geles se prepararon con concentraciones de agarosa entre0,4 y 0,6% y se adicionaron con 1 HE/ml de bromuro de etidio. Sesometieron a un voltaje de 1-5 V/cm, durante el tiempo necesariopara alcanzar la separación adecuada, La posición de las bandasse visualizó con un transiluminador UV.

Preparación de ADNplasnídico en gran escala

Qmaimienighacteniangxmmhn

Conuna colonia perteneciente a alguno de los clones de thiobaci­los con resistencias múltiples, se inoculó 5 ml de medio Baalsrudconteniendo 100 ug/ml de Ampicilina cuando la bacteria correspon­día a un autótrofo facultativo, y 10-4 Mde Naz(AsO4H)cuando labacteria era un autótrofo absoluto. Se dejó crecer a 30°C con

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agitación hasta saturación del cultivo. Coneste cultivo se ino­cularon 500 ml del mismo medio y se dejó a 30°C con agitaciónhasta saturación (48-72 hs). Luego de ello, se centrifugó 15 mina 5000xg y se descartó el sobrenadante.

Para algunos clones de thiobacilos (T11, T12) resultó convenientelavar el pellet en una solución 10-2 Mde sarcosyl, somentiendo avortex durante 1-2 min. Se centrifugó 15 min a 10000xg, y se des­cartó el sobrenadante.

El precipitado celular se lavó dos veces en 10 m1 de TES (Tris.ClH 10 mM, pH 7,8, EDTA 1 mM, y NaCl 0,1 M).

Lisis

Se usaron dos procedimientos de lisis: por ebullición y por SDS.

Lisis por ebullición (80):

El precipitado proveniente de 500 ml de cultivo se resuspendió en10 ml de TES (Tris.ClH 10 mM, pH 8,0. EDTA 0,1 mM, y NaCl 0,1 M)

y se transfirió a un Erlenmeyer de 50 ml. Se adicionó 1 ml de unasolución de lisozima (20 mg/ml en Tris.ClH 10 mM,pH 8,0) pre­parada en el momentode usar, y se mantuvo el Erlenmeyer sobre lallama de un mechero Bunsen, agitándolo constantemente, hasta elmomentoen que comenzó la ebullición.

Inmediatamente se sumergió el Erlenmeyer en un recipiente conagua hirviendo y se lo mantuvo por 40 segundos. Se enfrió elErlenmeyer sumergiéndolo en agua con hielo durante 5 min y setransfirió el contenido viscoso del frasco a un tubo de ultracen­trífuga que se centrifugó a 25000 rpm durante 30 min a 4°C.

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Lisis por SDS(81):

El sedimento bacteriano proveniente de 500 m1de cultivo se re­suspendió en 10 m1 de una solución fria de sacarosa al 10% enTris.C1H 50 mM,pH 8,0. Se adicionaron 2 ml de una solución delisozima (10 mg/ml en Tris.ClH 0,25 M, pH 8,0) preparado en elmomento de usar, y 8 ml de EDTA0,25 M, mezclando por inversiónvarias veces. Se dejó en hielo 10 min. Luego de ello se adiciona­ron 4 ml de SDS 10%mezclando rápidamente con una varilla de vi­drio. Entonces, se adicionaron 6 m1 de NaCl 5 M, mezclando cuida­dosamente y dejando en hielo por 1 hora. Se centrifugó durante 30min a 30000 rpm a 4°C, para remover el ADNde alto peso moleculary residuos bacterianos.

El sobrenadante se sometió a extracción con fenol/cloroformo dosveces y una con cloroformo. Después de cada extracción se trans­firió la fase acuosa a un tubo limpio.

A la fase acuosa se le adicionaron 2 volúmenes de etanol, se mez­cló bien y se mantuvo a -20°C durante 1 hora. Al cabo de ello, secentrifugó a 1500xg durante 15 min a 4°C, El sedimento se secóbrevemente en un desecador delvacio y se resuspendió en 8 ml deTE (pH 8,0).mmmmmPor cada mililitro de solución de ADN,se adicionó 1 g de clorurode cesio. Se mezcló cuidadosamente hasta la disolución de la saly se adicionaron 0,8 ml de solución de bromuro de etidio (10 mg/ml en agua) por cada 10 ml de solución de cloruro de cesio. Secentrifugó a 40000 rpm durante 36 hs a 20°C. Se aspiró la bandade ADNplasmidico con una pipeta Pasteur, utilizando una lámparade UVpara identificar con seguridad la banda.

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El bromurode etidio se eliminó mediante repetidas extraccionescon n-butanol (saturado en H20).

La muestra se diluyó con agua hasta un volumen final de 8 ml y seprecipitó agregando 0,8 ml de NaAcO3 M (pH 5,2) y dos volúmenesde etanol absoluto. Luego se dejó 20 min a -70°C, y se centrifugóa 10000xg por 10 min.

El sedimento se lavó con etanol 80%(v:v), se dejó secar y se re­suspendió en 500 pl de Hzo.

Transformación en E. call

Se inocularon 5 m1 de medio de cultivo LB con una colonia de lacepa XLI y se incubó toda la noche a 37°C. Se tomó 1 ml del cul­tivo anterior y se inoculó en 100 ml de medio LB contenidos en unErlenmeyer de 250 m1 que se incubó a 37°C, con gran agitación du­rante 2 hs. El cultivo se centrifugó 10 min a 3000xg y el sedi­mento se resuspendió en 40 ml de beI frío (KAcO30 mM,KCl 100mM, CaClz 10 mM, MnClz 50 mM, Glicerol 15% (v/v)), dejando enhielo 20 min.

Se centrifugó 10 min a 1100xg y el precipitado se resuspendió en4 ml de beII frio (PIPES 10 mM, KCL 10 mM, CaClz 75 mM, Glicerol15% (v/v), se dejó en hielo 5 min y luego se transfirió a tubosEppendorf, en alicuotas de 200 pl.

Se congeló por inmersión en nitrógeno líquido y se guardó a-70°C.

ILansIsziánmnnlasmidgs

Una alícuota de bacterias competentes se descongeló sumergiendoel tubo 1 min en agua y se dejó 10 min en hielo. Cuando las célu­las competentes se prepararon en el momento. este paso no fue re­

querido. Se agregaron 60 pl de la suspensión bacteriana a un tuboEppendorf conteniendo 10 pl de la suspensión de ADN,dejando 30min en hielo. Luego de ello se incubó 1 min a 42°C y se colocónuevamente en hielo.

Se agregaron 0,5 m1 de medio LB precalentado a 37°C, y se incubóa la mismatemperatura, durante 45 min para permitir la expresióndel plásmido.

Una alícuota de 200 pl de este incubado se sembró, mediante ras­trillado, en placas de Petri con LBconteniendo Ampicilina (100pg/ml) para la selección de transformantes por resistencia a esteantibiótico, o telurito de potasio (10-4 M)para la selección detransformantes con resistencia a este ión metálico. Las placas seincubaron a 37°C en estufa por 16 hs.

METODOS ANALITICOS

Determinación de cobre soluble

Las valoraciones de cobre se realizaron utilizando la técnica deespectrofotometria de absorción atómica con llama de aire/aceti­leno en la longitud de onda de 324,7 nm (para las soluciones másdiluídas) y de 327,4 nm (para las de mayor concentración).

El métodoutilizado para realizar la valoración fue el de agrega­do patrón, siendo todas las muestras medidas por este método,comparándolas con la señal de blanco de reactivo (H2504 0,06 N).En todos los casos se utilizó comofuente de excitación una lám­para de cátodo hueco de cobre operada a 3 miliamperes.

Determinación de proteínas

Se utilizó el método de Peterson (82), modificado para adaptarloa la determinación de proteínas de T. ferrooxidans a partir deminerales en proceso de biolíxiviación (83).

La medición de proteínas se efectuó a partir de placas que conte­nían CuS comosustrato, con,distinto grado de deshidratación.Este último se determinó por pérdida de peso de cada placa y seexpresó como humedad remanente respecto del volumen de líquidoagregadopara la acidificación.

A fin de obtener una suspensión homogéneaa partir de 1a cual de­terminar proteínas, el contenido de cada placa se diluyó en SO4H20,06 N agregando en cada caso, el volumen necesario para alcanzarun volumen total de 10 m1, considerando la humedad remanente encada placa.

Se indican a continuación los pasos seguidos a fin de determinarproteínas por mililitro de pulpa obtenida.

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Despuésde agitar la placa suficientemente comopara solubilizarlos cristales de sulfato de cobre y suspender homogéneamentetodoel sólido presente, se tomó 1 ml de esta suspensión y se latransfirió a un tubo de ensayo. A la mezcla se le adicionó 5 mlde Na(0H) 0,5 M y se mantuvo durante 15 min en un baño de aguahirviendo. De esta forma se hidrolizaron tanto las proteinas delas células que están en la solución comode las que están adhe­ridas al sustrato. El hidrolizado se separó de la fase sólida porcentrifugación a 5000 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.Después de la centrifugación, 1 m1del sobrenadante que resultóclaro y transparente, se transfirió a otro tubo y se agregó 0,3m1 de una solución de deoxicolato de sodio 0,15%. Se mantuvo por10 min a temperatura ambiente. La proteina se precipitó por agre­gado de 0,3 ml de TCA72%. Se centrifugó a 10000 rpm durante 15min a temperatura ambiente. Luego de volcar cuidadosamente laparte superior del sobrenadante muylentamente, dado que el pre­cipitado resultó flojo, el resto se centrifugó nuevamentea 10000rpm durante 10 min a temperatura ambiente. El sobrenadante seeliminó por aspiración con una pipeta Pasteur y el precipitado sesecó colocando los tubos boca abajo sobre un papel de filtro.

El precipitado de proteina se sometió a una reacción colorimétri­ca que es una modificación del método de Lowry (84).

Se adicionó 1 ml de agua y 1 ml de solución A* al precipitado deproteína. Se mezcló por Vortex y se mantuvo 10 min a temperaturaambiente.

Se adicionó 0,5 ml del reactivo de Folin & Ciocalteu diluido 6veces, agitando inmediatamente.

Se mantuvo 30 min a temperatura ambiente, y la densidad óptica semidió a 750 nm. El instrumento se colocó en posición cero median­te un control constituido por SO4H20,06 N con adición de todoslos componentes del método.

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La curva de referencia se obtuvo mediante una solución estándarde albúmina bovina. Se adicionaron 5 ml de Na(0H) a 1 m1 de lasmuestras conteniendo distintas concentraciones de proteina. Lue­go, las muestras se trataron según los pasos antes indicados. Poreste métodose obtienen relaciones proporcionales directas entrela concentración de proteínas y la densidad óptica de la soluciónfinal, cuando el rango de concentración de proteínas en la pulpaoriginal está entre 0,3 y 2 mg/ml.

CAPI TULO I

BUSQUEDA DE VECTORES POTENCIALES

PARA LA TRANSFORMACIONDE T. ferrooxidána

Introducción

Conla perspectiva de desarrollar procedimientos que posibilitenla transformación del T. ferrooxidans, se encaró la identifica­ción de marcadores potenciales de selección.

El T. férrooxidans posee una elevada resistencia a aquellos ionesmetálicos que están asociados a sus sustratos: Cu2+, Coz+, Fe2+,Niz+ y Zn2+. Esta bacteria posee una resistencia al cobre 200 ve­ces superior a los limites de otras bacterias Gramnegativas. Noobstante ello, la toxicidad de ciertos iones metálicos sobre elT. ferrooxidans es comparable a la observada en otras bacterias.Es muy sensible a ng+, Ag+. Cd2+, A6043-, AsOa3-, Te2032-, entreotros (9,59,85,87). La Tabla V muestra la concentración inhibito­ria de distintos iones en medio líquido conteniendo hierro ferro­so como fuente de energía.

Cuandoen lugar de hierro ferroso se usan sulfuros metálicos comofuente de energía, la sensibilidad a los iones inhibidores es aúnmayor (58). Esto constituye una limitante en los procesos de bio­hidrometalurgia. Conformea la composición de cada mineral; a me­dida que avanza el proceso de bio-oxidación, los iones se solubiJlizan y su concentración aumenta, pudiendo llegar a ser incompa­tible con el crecimiento del bacilo (87).

El incremento en la resistencia a inhibidores metálicos es parti­cularmente atractiva porque, además de constituir un marcador deselección, puedeconferir a la bacteria características de impor­tancia industrial.

Diversas especies bacterianas heterotróficas contienen determi­nantes genéticos responsables de la resistencia a iones metálicoscomo el ng+ y órgano mercuriales, Ag+, Cd2+, A3043-, A6033-.Te2032-, entre otros (69,88-92). Estos determinantes de resisten­cia, a menudose encuentran en plásmidos y transposones en fre­

_ 72 ­

cuencias relativamente altas,

nocidos que portan estos determinantes genéticos, asi como

lo cual facilita suLa Tabla VI resume los mecanismos de resistencia y plásmidos

tos fenotipos asociados a estas resistencias.

manipulación.co­

cier­

Tabla V: Tolerancia de T. férrooxidans a iones inorgánicos.

Concentración InhibitoriaIon 8/1 o mg/l

Cu3+ 28 8/1Co2+ 30 g/lFe2+ 160 8/1Ni2+ 72 8/1zn2+ 119 g/l

Hg2+ 2 IDE/l

Ag+ 0,1 mg/lCd2+ 1,0 g/lA3043- 0,5 8/1A5033- 10 1118/1

TeanZ- 17,0 mg/lsz+ 200,0 mg/l

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Tabla VI: Resistencia bacteriana a iones metálicos.

¡ISISTBICIA CODI- FBIOTIPO ASOCIADOA

IOI lICAlISIO 0! IIBIBICIOI IICAIISIO DE IISISTBICIA IICLDA POR: LA ¡ISISTIICIA

lercurioreductasa

Bgïi Bloqueode grupos-SBy ¡(1' -—--1> Bq’ Plaseidos y trane- Colonias gris oscuroS-S. luy tóxico a con- y secanielo especial posonas (pRIee,Tnse1.centraciones de l-SIg/l de transporte etc.)

Ag' B concentraciones Iuy Producción de conpues- ll plll de Paeudoao- Colonias oscuras. Porbajas afecta la respi- tos que tornan conple- nas es típico. ln cé- exposición a ia lun elración y otras funciones ios inertes con la! lulas resistentes a sedio de cultivo se oscu­asociadas a la superii- plata. ésta constitu- rece por foreación de A320cie celular. Tóxico a ye el 30! de la bio- y queda un halo claro ai­concentracioaes de 0.1- naaa. rededor de cada colonia1 eq/l

CdH Bloqueo de grupos-SB. li transporte hacia el li plrse de 5.aureus llnguno descriptoTóxico a concentracio- exterior de la célula y el pHOLuede A. eu­nes de 40-100 ¡3/1 es el nás couún. Se han tropbus son pláslidos

propuesto adelds varios generaisente asocia­otroe necanisnos dos a penicilinae

As043- lcunulación via siste- Sistena de transporte Casi sienpre ligado Iinguno descriptola de transporte de activo al exterior de a resistencia aP043-. Conpetidor de la célula. Específico Sb3*,is033- y anti­P043-. Bloqueo de qul- para As041-, no bióticos.Plasnidos denonas,netabolisno de reconoce P041- Stapbilocoecus aureusasúcares,síntesie de ’(P1150,p1514.p11141)ATPy ácidos nucleicos y I. coll (pl1re)

Sb3i Bloqueo de grupos-SB. Sistena de transporte Igual al anterior linguno descriptoy luy tóxicos aunque el activo al exterior deisOai- rango de concentra- la célula

ción tóxica es variable

TezOJI- lo claro

Reducciónenzinática

"¡033 ——-> Te.Se discute si es elnecanisno o está ano­ciado a la resistencia

Iegaplasnido de Alca­lísenes (pllBele),de InterobacteriaceaeTn 521

Colonias negras porel Te.

Considerando que hasta el momentose desconoce si es posible laexpresión de genes de bacterias heterotróficas en un autotrofoacidofilico como T. ferrooxidans, y frente al hecho de que muchosinvestigadores han tratado de transformar T, ferrooxidans a tra­vés de marcadores de selección provenientes de E. coli con resul­tados negativos, se estableció comoestrategia de trabajo la se­lección de clones de resistencia a los inhibidores metálicos men­cionados a partir de cepas salvajes del género Thiobacillus, enla expectativa de que, tratándose de bacterias relacionadas delmismogénero, existe mayor probabilidad en la expresión génica,replicación de plásmidos y compatibilidad.

Por definición, para que una especie bacteriana sea miembro delgénero Thiobacillus, debe ser capaz de utilizar la oxidación decompuestos inorgánicos de azufre para cubrir sus requerimientosenergéticos.

La Tabla VII resume los criterios de clasificación y especies delgénero Thiobacillus (93). A excepción de los acidófilos extremosT. ferrooxidans y T. thiooxidans, las demás especies crecen en unrango de pH entre 4 y 8. Además, tanto los autótrofos absolutoscomolos autótrofos facultativos pueden utilizar tiosulfato comofuente de energia y al C02 como fuente de carbono, de modoque laselección se hizo en un medio general para thiobacilos comoes elmedio Baalsrud indicado en Materiales y Métodos.

Existen en la literatura varios trabajos en bacterias heterotró­ficas acerca de cepas con resistencias múltiples a metales pesa­dos codificadas en un único plásmido, que es generalmente de losconsiderados plásmidos "grandes". Se ha sugerido que tal hecho esel resultado de la adquisición secuencial de transposones indivi­duales que se estructuraron durante la evolución como unidadestransponibles compuestas (88,89). Por esta razón se trató de bus­car fenómenosequivalentes en especies de thiobacilos.

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Tabla VII: Clasificación y especies del género Thiobacillus.

Thicbaciilus tiíparusa) pl: 6-8

Tbicbaciilus neapolitanus

l. ierobios absolutosb) pl: 1-3,5 Tbiobacilius tbíooxidans

-- A: Oxidansolanente

coapuestos deazufre

2. Anaerobiofacultativo: Iiiobacillus dcnitriticansUtiliza ¡03- en ausencia de 02

[isttictaaente ‘Jautotrófico(I)

-- B: Oxidancoap. ¡e!t o de azufre: fijabaciilus {circozidaus

THIOBACILLUS¿(género)

h z Oxidaciónde tiosulfato repriaida por sustratos orgánicos: Tiobacillus noreiiusAutotróficos

facultativos %_ m) W : Oxidaciónsiuultánea de tiosulfato y sustancias orgánicas: iiiobacilias intersedius

En varios trabajos se ha demostrado una fuerte correlación evolu­tiva entre resistencias a iones metálicos y resistencias a anti­bióticos (88,90,94). Por cura con acriflavina se ha determinadoque, en general, las resistencias a metales y antibióticos se en­cuentran asociadas en plásmidos únicos de aproximadamente 23 Kpb.Por ello, y considerando que la resistencia a la Ampicilina esuno de los posibles marcadores de selección para T. ferrooxidans,se analizó esta resistencia en las cepas de thiobacilos seleccio­nadas por resistencia a iones metálicos.

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Resultados

Seleccióndecspasdeihighmilescnnmsimciamúliinlea19mmLos thiobacilos pueden aislarse fácilmente por enriquecimiento encultivos a partir de minerales que contienen compuestos de azufrereducido. En este trabajo, la selección de cepas salvajes se hizoa partir de muestras minerales, aguas surgentes portadoras deazufre y tierras azufradas, tomadas en condiciones adecuadas parapreservar la flora bacteriana. Esta labor se realizó en coordina­ción con la Secretaria de Mineria.

Previo enriquecimiento en el medio de Baalsrud, selectivo parathiobacilos, se transfirió a placas con el mismomedio agarizadoy posteriormente se seleccionaron a partir de cada muestra enri­quecida, las cepas con mayor resistencia a cada uno de los ionesmetálicos ensayados.

En el caso de las aguas surgentes portadoras de azufre, no hizofalta el enriquecimiento puesto que contenían una densa poblaciónde thiobacilos.

Considerandoque en general las resistencias a iones metálicosson inducibles, en cada caso se seleccionó por réplica sucesivacon terciopelo en un rango de concentración del ión entre 10-7 y10-2 M.

Se obtuvo asi un conjunto de cepas con resistencia para cada unode los iones inhibidores ensayados. Se aislaron y consideraroncomocepas con resistencia a aquéllas que, además de presentarresistencia a una concentración especifica de un ión, mostrabanlos fenotipos característicos que han sido asociados a los meca­nismos de resistencia en bacterias heterotróficas (ver Tabla VI),y otros que, si bien no han sido descriptos antes, evidenciaban

-77­

ser fenotipos asociados a este tipo de mecanismo.Por ejemplo, lacepa 103 indicada en la Tabla VIII, crecida en ausencia de inhi­bidores desarrolla colonias de color blanco calcáreo, en tantoque en medios adicionados con Cd2+, las colonias son amarillofuerte y el color se intensifica a medidaque se incrementa laconcentración de Cd2+en el medio. La cepa 216 presenta coloniaspequeñas, transparentes, de aspecto gelatinoso en ausencia de in­hibidores, en tanto que en medio adicionado con AsO4S-, las colo­nias son rojas y el color se intensifica con la concentración deA5043-.

En cada cepa seleccionada se analizaron las resistencias a otrosiones. De esta manera, se conformó una colección de trece cepaspertenecientes a especies de thiobacilos, con resistencias múlti­ples a iones metálicos, caracterizadas según se indica en la Ta­bla VIII y que adquieren los fenotipos característicos asociadosa cada resistencia. Se diferenciaron las cepas autotróficas abso­lutas de las autotróficas facultativas, pues estas últimas puedentambién utilizar glucosa comofuente de energía.

Se analizó también, la resistencia a la ampicilina en las cepasde resistencia múltiple a iones metálicos. Comose aprecia en laTabla VIII, solamente las autotróficas facultativas presentan re­sistencia a la ampicilina, y no las cepas autotróficas absolutas.

_ 73 _

Tabla VIII: Caracterización de cepas de thiobaciloe con resisten­cia múltiple a iones metálicos

Resistencia a iones utilices (l) lesistelcia aanpiclllna

Clones cazo ¡1* ¡310 PBI. Te2031- ¡3053- ¡5043- Sbh ¡g/¡l

1.210 10-! 10-1 10-3 10-l 10-3 10-1 10-1 10-1

1.213 10-1 10-3 10-3 10-1 10-3 10-3 10-3 10-5

1.216 10-4 10-3 10-3 10-! 10-! 10-3 10-3 10-3

1.211 10-4 10-1 10-4 10-3 10-3 10-3 10-1 10-3 --- AUTOTROFOS

1.300 10-‘ 10-1 10-3 10-1 10-, 10-1 10-1 10-z

LJM 1m: 1m: 1%! INI 1m: 1m: 1m: INI

1.501 10-! 10-1 10-3 10-1 10-3 10-1 10-1 10-1

1.1 10-, 10-1 10-4 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3 150

1.6 10-3 10-z 10-! 10-1 10-3 10-3 10-: 10-, 150

1.11 10-! 10-1 10-3 10-1 10-1 10-! 10-1 10-! 150 AUTOTIOFOS

1.12 10-3 10-1 10-4 10-1 '10-3 10-¡ 10-1 10-a 150 FACULTATIVOS

1.103 10-3 10-1 10-3 10-1 10-3 10-1 10-1 10-1 150

1.104 10-3 10-1 10-3 10-1 10-3 10-! 10-’ 10-! 150

- 79 _

Análisisdelgsnlásmidgaenlascemsmnmsimmmïlnnle

La Figura 10 muestra los resultados del análisis de los plásmidosextraídos de las cepas autótrofas absolutas. Las cepas T.210,T.213, T.216 y T.217 muestran plásmidos con tamaños en generalmenores a 10 Kpb. Solamente uno de ellos es relativamente grande.Las minipreparaciones de las cepas T.300, T.316 y T.501 parecíanno tener plásmidos. Sin embargo, trabajando con dos técnicas di­ferentes y luego de purificar el ADNplasmídico por gradientes decloruro de cesio, pudo observarse la presencia de plásmidos queen minipreparaciones son enmascarados por el ADNcromosómico.

En cuanto a los autótrofos facultativos, la cepa T.12 tratada pordistintas técnicas y condiciones, muestra un único megaplásmido.En la Figura 11 se ve que corre por encima de los fragmentos deADNcromosómico.

La cepa T.11, también según una variedad de técnicas y condicio­nes, muestra en una de ellas tres plásmidos, uno de ellos relati­vamente grande (ver Figura 12).

Las cepas T.1, T.6, T.104 y T.103 en minipreparaciones no eviden­ciaban plásmidos, pero preparados por dos técnicas distintas ypurificando el ADN plasmídico en cloruro de cesio, muestra cadacepa un megaplásmido único que corre un poco por encima de losfragmentos de ADNcromosómico (Figura 13). En minipreparaciones,estos plásmidos también eran enmascarados por los fragmentos deADNcromosómico.

Unode estos plásmidos, el de la cepa T.12, fue transferido portransformación a una cepa de E. c011 recA- (XLI), sensible a am­picilina. Se seleccionó por resistencia a ampicilina y por resis­tencia a Te203=. Dos de los transformantes aislados adquirieronel plásmido de la cepa T.12, según se muestra en la Figura 14.

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Crom

210 216213 217 300

316501 Figura 10: Análisis de

plásmidos. Los plásmidosde las cepas 210,213, 216y 217 se obtuvieron apartir de minipreparacio­nes según el procedimien­to de lisis por alta con­centración de SDS usandoEDTA 150 mM y SDS 3%. Lasbandas plasmídicas de lascepas 300,316 y 501 seobtuvieron según la puri­ficación de ADNplasmídi­co en gran escala utili­zando para cada cepa tan­to el métodode lisis porebullición (izquierda)como el método de lisispor SDS (derecha).

Figura 11: Análisis deplásmidos de la cepaT.12, a partir de mini­preparaciones obtenidassegún el procedimiento dealta concentración de SDSvariando las concentra­ciones de EDTAy SDS. Elmejor resultado (linea B)corresponde a 100 mM deEDTA y 2% de SDS.

-81_

T1 T6 T103 T104

.Figura 12: Análisis delos plásmidos de la cepaT.11 obtenidos según mi­‘nipreparaciones mediantelisis por alta concentra­ción de SDScon distintasconcentraciones de EDTAySDS. A: marcadores, D(mejor resultado): EDTA150 mM y SDS 2%.

Figura 13: Análisis delos plásmidos de las ce­pas T.l, T.6, T.103 yT.104 a partir de la pu­rificación de ADNplasmí­dico en gran escala, uti­lizando la técnica de li­sis por ebullición (iz­quierda) y la de lisispor SDS (derecha).

-82­

Figura 14: Análisis deplásmidos de dos trans­formantes de la cepa XLIde E. coli transformadacon el plásmido de la ce­pa T.12 y seleccionadospor resistencia a ampici­lina y por resistencia atelurito y de la cepaT.12.

Figura 15: Crecimiento de la cepa XLl de E. coli transformada conel plásmido dede K2Te203.

T.12, en medio M9 conteniendo 10-3 M

La Figura 15 muestra una de las cepas transformadas de E. colique es capaz de reducir el T6203=y sus colonias son negras debi­do a la conversión de telurito a telurio.

Cuandose analizaron el resto de las resistencias en la cepa deE. coli transformada, se determinó que éstas se incrementaron enuno a tres órdenes de magnitud respecto de la cepa sin transfor­mar, indicando que el plásmido de la cepa T.12 posee los determi­nantes genéticos de tales resistencias.

Tabla IX: Resistencias comparativas a ampicilina (ug/ml) y io­nes metálicos (Molar) entre la cepa de E. coli sintransformar y transformada y la cepa T.12.

E. coli E. coli transf. T.12

Ampicilina -- 150 ug/ml 150 ug/mlTe2032- 10-5 M 10-3 M 10-3 MCd2+ 10r5 M 10-3 M 10-3 M

Ag+ 10-s M 10-4 M 10-2 MAsOa3- 10-5 M 10-3 M 10-2 M

As043- 10-5 M 10-2 M 10-2 M

Sb3+ 10-5 M 10-3 M 10-3 M

Pb2+ 10-5 M 10-3 M 10-2 M

ng+ 10-3 M 10-5 M 10-4 M

_ 34 _

Discusión

Se aislaron trece cepas de especies de thiobacilos caracterizadaspor poseer múltiples resistencias a iones metálicos. Los plásmi­dos de estas cepas se purificaron y analizaron. Al menos en uncaso, se probó que las resistencias múltiples a iones metálicos yla resistencia a ampicilina están codificadas en un mismop1ásmi­do.

Estos plásmidos constituyen vectores potenciales para trabajar en1a metodología de transformación de T. ferrooxidans, con máschance que otros en 1a expresión o en 1a compatibilidad por pro­venir de bacterias relacionadas, con la ventaja de tener variosnarcadores de selección y estas características estarian entrelas que se piensa serian de interés industrial.

_ 35 _

CAPITULO II

ANALISIS DEL CRECIMIENTO DE

Mobacillus fmidans ENMEDIOSSOLIDOS

Introducción

El Thiobacillus ferrooxidans es una bacteria de lento crecimien­to, tanto en medio liquido comoen medio sólido. Una de las razo­nes que se atribuyen a la dificultad de obtener colonias en mediosólido, es la existencia de impurezas orgánicas o de productos dehidrólisis del agar-agar que inhiben el crecimiento de esta bac­teria.

Se han propuesto distintas alternativas comomedios sólidos quepermitan el crecimiento: silica gel (95), bajas concentracionesde agar purificado (96). agarosa (9) o diferentes tipos de fil­tros de membrana (97). No obstante. en todas las circunstanciasel crecimiento es lento, del orden de varias semanas. Las colo­nias, cuando se obtienen, se deben observar bajo una lupa este­reoscópica y los resultados por lo general no son reproducibles.

Para cualquier estudio genético que se proponga, asi comopara laselección de cepas, es indispensable contar con un método de pla­queo eficiente. En principio. por estas razones se analizó elcrecimiento de esta bacteria en medios sólidos y se desarrollarontécnicas tendientes a la obtención de colonias en corto tiempo.

Resultados

Análisisdelcmimientoenmediosálidgagarizadg

Algunas observaciones condujeron a plantear los experimentos in­dicados abajo. En primer lugar, figuran las realizadas a travésdel seguimiento del desarrollo de colonias en función del tiempo,en el medio ISP indicado en Materiales y Métodos, solidificadocon agarosa al 0,5%. Unavez inoculadas, las placas fueron obser­vadas cada 6 a 8 horas con un estereomicroscopio. Durante aproxi­madamente40 dias no se visualizó ninguna evidencia de crecimien­to. Al cabo de tal tiempo, se hizo evidente bajo el estereomi­

- 37 _

croscopio. la aparición de microcolonias que tomaban rápidamenteun tamaño de aproximadamente 0,1 a 0,5 mmy eran observables di­rectamente. De tal forma, el lapso entre la ausencia de coloniasy la presencia de colonias observables a simple vista oscilabaentre 6 y 8 horas.

Conel fin de analizar la posibilidad de que el crecimiento fuerainhibido por la agarosa o alguna sustancia soluble contaminante,se prepararon placas incompletas (ver Materiales y Métodos), einmediatamente después de que el medio solidificó se colocaron enposición vertical comomuestra la Figura 16, durante 24 horas, demodode producir un drenaje de agua hacia abajo. En tales condi­ciones, el supuesto inhibidor de ser soluble disminuiria su con­centración en la parte superior de la placa.

Al cabo de 16 a 17 dias aparecieron colonias de 4 a 7 mm, comopuede apreciarse en la Figura 16. No obstante, algunas placastambién mostraban al cabo de 5-6 dias, un desarrollo bacterianoen el lugar donde el inhibidor proveniente de la agarosa teórica­mente debia haberse concentrado Junto con algunas sales del me­dio.

Las dos observaciones anteriores sugirieron que existe una condi­ción del medio que se alcanza a través del tiempo y que hace po­sible el crecimiento rápido y la formación de colonias.

La Figura 17 muestra una placa de medio sólido que fue preparaday se solidificó en un plano levemente inclinado, de modoque unode sus bordes es muy fino. La placa se inoculó, tocando con unansa cargada, el borde opuesto, es decir el de mayor espesor in­dicado por la flecha. En tales condiciones, las colonias se for­maron al cabo del séptimo dia sobre el borde más fino. Esto indi­ca que necesariamente debió ocurrir un desplazamiento de las bac­terias inoculadas respecto del lugar de siembra. Debe tenerse encuenta que la adhesión al medio agarizado es una condición nece­saria para la formación de colonias.

-33­

Figura 16: Colonias de la cepa BAI, obtenidas en una placa incom­pleta que se mantuvo24 horas en posición vertical,antes de ser inoculada.

Figura 17: Colonias de la cepa ATCC19.859 que se formaron en elborde con menor espesor de medio de cultivo en unaplaca que se inoculó en el borde que indica la flecha.

Por estas razones y evidencias, se planificaron los experimentosque se describen a continuación. A excepción del Experimento 1,en los demas se inocularon las placas tocando con el ansa cargadaun lugar determinado de la placa a fin de visualizar la adhesióny formación de colonias respecto del lugar de siembra. Los expe­rimentos se hicieron con las cepas ATCC19.859, BA1y BA2 indica­das en Materiales y Métodos.

Ekperimento 1

Se prepararon placas con 20 ml de medio ISP con una concentraciónde agarosa de 0,5%. Se inocularon y rastrillaron. Se cortaron es­térilmente con un bisturí pequeñas porciones del medio inoculado,y se trasladaron a otra placa estéril. Se incubaron todas lasplacas a 30°C. En la placa que contenía pedacitos de medio inocu­lado hubo un fuerte crecimiento comomuestra la Figura 18, entreel quinto y sexto dia, mientras que las placas originales crecie­ron colonias muypequeñas entre los 35 y 40 dias.

El medio de cultivo, el inóculo y las condiciones de incubaciónson las mismas. La única diferencia reside en la velocidad dedeshidratación, considerando la posibilidad de drenaje de laspiezas pequeñas.

EXperimento 2

Conel fin de analizar la influencia del grado de deshidratacióndel medio en el tiempo de formación de colonias se prepararonplacas incompletas (ver Materiales y Métodos) con 10 ml de medio,o completas con 20 ml de medio.

Las placas se secaron en campana de flujo laminar durante 15 o180 minutos. Los resultados de la Tabla X muestran que un mayortiempo de secado y la posibilidad de drenaje en las placas incom­pletas, acortan notablemente el tiempo de formación de colonias.

- 90 _

Ekperimento 3

Considerando que el tiempo requerido para alcanzar un determinadogrado de deshidratación depende del volumen de medio de cultivoque se coloca en cada placa, se analizó la influencia de este pa­rámetro en el tiempo necesario para la formación de colonias.

En la Tabla X se observa una correlación inversa entre el tiempode aparición de las colonias y el volumen de medio. Comose ob­serva en la Figura 19, el tamaño de las colonias también está encorrelación inversa con el volumendel medio de cultivo por pla­ca.

ENperimento 4

Se analizó, además, el efecto de la concentración de agarosa yagar en el tiempo de formación de colonias y, particularmente, enla adhesión de la bacteria al lugar de siembra.

Cuandose usa agar Difco-Bacto comoagente gelificante. en gener­al se necesitan concentraciones superiores al 1%para obtener unbuen gel. No obstante. comoen este experimento el inóculo no fuerastrillado, se ensayaron menoresconcentraciones.

En cuanto al tiempo de secado en la campana de flujo laminar, elmismoensayo se hizo secando 15 minutos antes de inocular o du­rante 3 dias consecutivos, por periodos de 180, 120 y 60 minutos.

Del análisis de los resultados indicados en la Tabla X surge queel crecimiento en agar y agarosa es equivalente a concentracionessimilares de estos geles. y que dicho crecimiento se retarda conel incremento en la concentración de los geles. En estos experi­mentos. el tiempo de secado es critico en cuanto a la observacióndel crecimiento.

-91­

Figura 18: Colonias que desarrollaron entre el quinto y sexto diasobre pequeñas porciones de medio inoculado que se

. trasladaron a una placa estéril.

contie­nen 7 ml (izquierda) y 3 ml (derecha) de medio ISP.

Figura 19: Colonias de la cepa ATCC19.859 en placas que

Tabla X: Efecto de la concentración, volumen de medio y tiempode secado en el tiempo requerido para la formación decolonias de Imiobacillus ferrooxidans.

Dias requeridospara la aparición

Concentra- Tiempo de de coloniasción del Vol/placa secado an- ATCC BAl BA2

Exp. Gel gel (%) (ml) tes de 18859inocular

2 Agarosa 0,35 10 180 min 11 12 11Agarosa 0,35 20 180 min 20 21 20Agarosa 0,35 10 15 min 22 23 21Agarosa 0,35 20 15 min 35 35 34

3 Agarosa 0,35 3 15 min 3 3 4Agarosa 0,35 7 15 min 15 15 15Agarosa 0,35 15 15 min 26 27 27Agarosa 0,35 20 15 min 35 35 36

4 Agarosa 0,35 10 15 min 20 19 20Agarosa 0,50 10 15 min 27 26 26Agarosa 0,70 10 15 min 33 32 34Agarosa 0,80 10 15 min 42 43 42Agar 0,50 10 15 min 27 27 27Agar 1,00 10 15 min 42 43 42Agar 1,50 10 15 min 59 N.0. N.0.Agar 2.00 10 15 min N.O. N.0 N.O.Agar 3,00 10 15 min N.0, N.0 N.0.Agarosa 0,35 10 3 dias* 4 3 4Agarosa 0,50 10 3 dias* 7 7 7Agarosa 0,70 10 3 dias* 10 11 10Agarosa 0,80 10 3 dias* 14 14 14Agar 0,50 10 3 dias* 8 B 8Agar 1,00 10 3 dias* 13 12 13Agar 1,50 10 3 dias* 15 15 15Agar 2,00 10 3 dias* 18 17 18Agar 3,00 10 3 dias* 28 27 28

N.0.: No se observan colonias después de 50 dias de cultivo.*: Se secó durante 3 dias consecutivos. exponiendo en la cam­

pana de flujo laminar durante 180, 120 y 60 minutos cadadia, respectivamente.

En todos los casos indicados en la Tabla X. las colonias se for­maron en toda la placa, a pesar de que se inoculó en un lugar de­terminado de la misma. Esto indica que el T. ferroaxidans, en de­terminadas circunstancias, no se adhiere a la agarosa o al agar,comosucede con otras bacterias.

Es evidente que en estos experimentos, los parámetros que espon­táneamente varian en el medio de cultivo a través del tiempo, sonuna pérdida de agua por evaporación y consiguientemente, un in­cremento en la concentración de las sales componentes.

En relación a ello también se analizó el efecto de la concentra­ción de las sales componentestanto en 1a adhesión de la bacteriaal lugar de siembra comoen el tiempo requerido para la formaciónde colonias. Esto se hizo variando la concentración de cada unade las sales y la composición global respecto del medio ISP indi­cado en Materiales y Métodos según el gradiente: 1X, 1.2K, 1.4K,1.6K, 1.8K, 2.0K y 2,5x‘

Los incrementos en las concentraciones salinas no impidieron, enningún caso. el desplazamiento de la bacteria en el medio agari­zado y no afectaron significativamente el tiempo de aparición decolonias.

Desarrollademémdosnanalagbienmándsmlgniasdsn ferroc­xidansenZAths

Las relaciones entre el crecimiento bacteriano y el agua se handiscutido tradicionalmente en términos de presión osmótica (98).

La mayoria de los microorganismos poseen mecanismos que les per­miten sobrevivir con algún grado de "stress" a ciertos cambios enla presión osmótica, pero relativamente pocos han evolucionadocon adaptaciones para sobrevivir y crecer óptimamente en ambien­tes con baJa actividad de agua (98-101). Para ello, diferentes

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microorganismosempleanestrategias distintas, pero todos ellosposeen algo en común: acumulan solutos intracelulares para balan­cear la presión interna celular contra la externa, previniendoasi el movimientode agua hacia el exterior de la célula. Estossolutos intracelulares deben ser compatibles con las funcionesmetabólicas, de ahi que se los denomine solutos compatibles, ylas células pueden acumularlos por sintesis de novo o por trans­porte desde el ambiente exterior.

Los solutos compatibles de muchos microorganismos son aminoácidoso compuestosrelacionados, particularmente betaina, prolina y/oglutamato, solos o a veces en combinación con K+ (98,99).

Por otra parte, las bacterias halofilicas extremas. son proca­riontes que requieren para su crecimiento óptimo. una actividadde agua muybaja, dada especificamente por una elevada concentra­ción de cloruro de sodio, y se han adaptado a estas condicionesesencialmente por acumulación intracelular de potasio (102-104).

A fin de lograr algún grado de comprensión respecto de la fisio­logía de T. férrooxidans y tratando de reducir el tiempo de for­mación de colonias, se analizó tanto la adhesión al lugar desiembra, como el tiempo de formación de colonias en medio ISP,gelificado con agarosa 0,35%y adicionando diferentes compuestos,que en el marco de lo conocido, podrian tener algún efecto en elcrecimiento.

Ademásde prolina y betaina, se ensayó sarcosyl. Este último seconsideró en función del notable incremento de la movilidad de T.ferrooxidans, que se observa al microscopio, cuando una coloniase suspende en una solución de este detergente. La estructura delsarcosyl (sal sódica del ácido N-Lauroil sarcosina) semeJa la dederivados metilados de aminoácidos involucrados en efectos osmo­regulatorios. Es probable además, que el sarcosyl actúe disocian­do algún componentede la envoltura celular.

En el Experimento 1, se prepararon placas con 10 m1 de medio ISPadicionando en cada caso los distintos componentes, según se in­dica en la Tabla XI y se secaron en la campana de flujo laminardurante 15 o 180 minutos. Las placas se inocularon con tres ce­pas: ATCC19.859, BAl o BA2, pero el inóculo en lugar de provenirde medio liquido, se obtuvo por suspensión de una colonia en 1 mlde la Solución A del medio ISP indicada en Materiales y Métodos.La preparación del inóculo se hizo en el momentode inocular lasplacas, de modode someter la bacteria el menor tiempo posible aun medio liquido. Se inoculó tocando con el ansa cargada un lugarmarcado en el borde de la placa.

La Tabla XI indica el número de dias necesarios para la formaciónde colonias y se promediaron los resultados con las tres cepas.Las diferencias de tiempo de formación de colonias entre una yotra cepa varian escasamente en términos de horas.

La concentración de ClK indicada corresponde a la adicionada almedio ISP, el cual tiene 0,2 g/l.

En todos los casos las colonias aparecieron dispersas por toda lasuperficie de la placa, indicando que ninguna de estas condicio­nes es suficiente para una adnesión directa al lugar de siembra.Esto es consistente con el hecho de que la primera evidencia decrecimiento por observación de las placas en un estereomicrosco­pio, se obtiene solamente unas horas antes de que se formen colo­nias visibles por observación directa.

El menor tiempo requerido para la formación de colonias, según elExperimento 1 fue de 5 o 6 dias. Las observaciones anteriorespermiten sospechar que este tiempo se requiere para una mayorevaporación de agua, que fluye lentamente desde la base a la su­perficie del mediode cultivo.

-96­

Tabla XI: Efecto del tiempo de secado y concentración de ClK enmedio ISP conteniendo o no prolina, betaina o sarcosylen el tiempo requerido para la formación de coloniascon las cepas de T.ferroox1dans ATCC19.859, BA1 y BA2.

Tiempo de ClK Sin adición Prolina Betaina SarcosylExp. secado (min) (M) (Control) (lO-ZM)‘(10-2M) (lO-ZM)

1 15 0 20 15 15 13180 0 15 10 10 8

15 0.06 13 8 8 7180 0,06 10 6 6 5

15 0,12 13 8 8 7180 0,12 10 6 6 5

15 0,25 13 8 8 7180 0,25 10 6 6 5

2 15* 0 15 12 12 10180* 0 12 7 7 6

15* 0,06 10 5 4 3180* 0,06 7 2 2 1**

15* 0,12 10 4 4 3180* 0,12 7 2 2 1**

15* 0,25 10 4 4 3180* 0,25 7 2 2 1**

(*) Las placas después de secadas se mantuvieron en estufa a30°C durante 6 días y se secaron 5 minutos cada día.

(**) Desarrollan por incubación durante una noche.

El Experimento 2 de la Tabla XI se realizó de la misma forma queel Experimento 1, excepto que las placas, después de preparadas ysacadas durante 15 y 180 minutos en la campana de flujo laminar.se mantuvieron en estuva a 30°C durante 6 dias. Cada dia se seca­

_ 97 _

ron en la campana durante 5 minutos, de modode evaporar el aguaque asciende a la superficie. Después de 6 dias, se inocularon dela misma forma que antes.

Las placas preparadas con prolina y betaina según las condicionesdel Experimento 2 formaron colonias a los 2 dias. Estas placas semantuvieron en estufa a 30°C durante 9 dias antes de inocularlas.En estas condiciones fue posible obtener el desarrollo de colo­nias al cabo de una noche.

Los medios conteniendo sarcosyl 10-2 My cloruro de potasio 0,06Mdieron los mejores resultados, obteniéndose colonias de 5 a 10mmcomo se muestra en la Figura 20.

Es importante destacar que, a pesar del alto grado de deshidrata­ción logrado en algunos medios, en ningún caso se logró una adhe­sión directa al lugar de siembra‘ El agua del inóculo podria sersuficiente para permitir el deslizamiento o para impedir la adhe­sión. Por otra parte, se debe considerar que la molécula respon­sable de la adhesión podria estar sujeta a sintesis de novo o amodificación de su estructura cuando la bacteria se transfiere deun medio liquido a un medio sólido altamente deshidratado‘

Conel fin de estudiar en másdetalle la relación de esta bacte­ria con el agua, se analizó el crecimiento en medio sólido conte­niendo Polyetilenglycol 8000 y diferentes concentraciones de clo­ruro de potasio. Las placas se prepararon con 10 m1 de medio ISPcon una concentración de agarosa de 0,35%. Las placas se secaronen la campana de flujo laminar durante 15 y 180 minutos, y seinocularon de la mismaforma que en los casos anteriores. Los re­sultados se muestran en la Tabla XII.

Puede apreciarse que, a medida que aumenta la concentración dePEGcon la consiguiente disminución en la actividad de agua, dis­minuye el tiempo requerido para la formación de colonias.

-98­

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Figura 20

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Coloni

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cepa BAz obteni

B

das

recta (sector del recuadro en A)

M Y ClK 0,06 M A

en medio ISP

Fotografía tomada

99

Fotografiacon­

COX]

Tabla XII: Efecto del tiempo de secado de las placas, concentra­ción del cloruro de potasio y de polyetilenglycol 8000en el tiempo de formacion de colonias de las cepasATCC 19.859, BA1 Y BA2.

PEG 8000 % (Pïv)Tiempo de ClKsecado (min) (M) 0 2 3 4

15 0 21 15 13 9

180 0 15 14 10 6

15 0,06 13 11 9 6

180 0,06 10 8 6 3*

15 0,12 13 10 8 6

180 0,12 10 8 6 4*

En un experimento similar, manteniendo las placas a 30°C durante4 días y secándolas en la campana durante 5 minutos cada dia, an­tes de inocularlas, las placas preparadas según las condicionesque se indican con un asterisco en la Tabla XI, formaron coloniasdispersas por toda la placa al cabo de una noche. No obstante,las colonias fueron mas pequeñas (1 a 2 mm). Solamente en un ca­so, que se muestra en la Figura 21, hubo un menor grado de desli­zamiento respecto del lugar de siembra. No obstante este menorgrado de dispersión, no se pudo volver a repetir aún trabajandoen las mismas condiciones,

- 100 ­

Qbiancjámdemloniasenmsdiofezmsnsinasariaar

De lo anteriormente expuesto surge que el principal problema téc­nico involucrado en 1a obtención de colonias en medios agariza­dos, reside en el tiempo requerido para la deshidratación delgel. Debido a esto, surgió la idea de no agarizar el medio decultivo que se coloca en las placas, de modode facilitar la pér­dida de agua por evaporación y analizar la factibilidad de creci­miento en 1a capa de sales que se deposita sobre la superficie dela placa.

Las mejores condiciones se obtuvieron distribuyendo 3 m1 de medioliquido 5X o 10x, respecto de 1a concentración de sales del medioISP, en placas de fondo perfectamente plano.

La siembra se efectuó en el centro de la placa con 20 ul de uninóculo en medio liquido y la incubación se realizó a 30°C.

Con tal procedimiento se obtuvo un depósito de una fina capa desales homogéneamentedistribuida sobre la superficie de la placa.El desarrollo bacteriano comenzóa observarse luego de que lasplacas perdieron el brillo propio de la humedady a las poóas ho­ras se observaron las colonias adheridas al vidrio de la placa.La Figura 22 muestra este fenómeno en una placa conteniendo medio5X. Es importante aclarar que para obtener una disposición homo­génea de las sales sobre la superficie de las placas, éstas nodeben secarse en la campana de flujo laminar, puesto que el as­pecto de las colonias no es claro ni uniforme.

Discusión

Se han utilizado varios términos para describir microorganismosque han evolucionado con adaptaciones fisiológicas que les permi­ten crecer en ambientes con baja actividad de agua: halofilicos,osmofilicos, osmotolerantes, xerofilicos, etc.

Figura 21: Colonias de la cepa BAzobtenidas inoculando en el lu­gar que indica la marca, una placa que contiene medioISP con 4% de PEG 8000.

Figura 22: Colonias de la cepa BAzque crecieron a partir de unafina capa de sales del medio 5X, depositadas sobre elvidrio de la placa. Fotografia tomada contransiluminación.

— 102 ­

El término halofilicos se aplica correctamente a un grupo espe­cializado de bacterias que crecen óptimamente en ambientes de ba­Ja actividad de agua, pero esta última debe estar determinada es­pecificamente por una elevada concentración de ClNa (20-30%pzv).

El término osmofilico implica solamente el requerimiento de unaelevada presión osmótica para el desarrollo óptimo, en tanto queosmotolerante se aplica a microorganismos que no requieren de unaelevada presión osmótica pero que poseen mecanismos que les per­miten adaptarse, en cierto grado, al stress osmótico.

El término Xerofilico (del griego: amante de lo seco), parece elmásapropiadopara describir las caracteristicas fisiológicas delT. ferrooxidans, ya que el incremento de la presión osmótica poraumento de la concentración de las sales componentes en los me­dios, no mejora ni anticipa el desarrollo. Por otra parte, se sa­be que el crecimiento y la oxidación de hierro por el T. ferroc­xidans en medio liquido, se inhiben cuando se incrementa la con­centración de ClNa (105,106).

El desarrollo de colonias en pocas horas en las sales depositadassobre el vidrio de una placa, constituye una evidencia muyfuertesobre la existencia de un requerimiento especifico de un altogrado de deshidratación para el desarrollo óptimo de esta bacte­ria. Noobstante, esto no debe interpretarse comoque la bacteriano requiere agua. puesto que ésta puede ser provista por la hume­dad.

Es dificil explicar hasta este momento los efectos del ClK, laprolina. la betaina y el Sarcosyl sobre el crecimiento del T. fe­rrooxidans. Unaexplicación razonable podria ser que algunos deestos compuestos interactúan con algún componente de la membrana,incrementandola solubilidad de ciertas proteinas poco solubles.En este sentido, es conocido que la prolina y el Sarkosyl puedeninteraccionar con proteinas aumentandosu solubilidad (107).

- 103 ­

La adhesión bacteriana a un medio gelificado. es una condiciónnecesaria para la formación de una colonia. Para la mayor partede las bacterias, un gel de agar es suficiente para su adhesión.Los experimentos descriptos demuestran que esto no es asi con elT. férrooxidhns, aún en las mayores concentraciones de agar oagarosa ensayadas‘

Cuando la placa posee un gradiente de humedad, las colonias seforman en el lugar más deshidratado, indicando que la adhesión alsustrato, al menos establemente, no se produce en presencia de unexceso de agua.

Debeconsiderarse que para el crecimiento a partir de la oxida­ción de sulfuros metálicos o azufre (lixiviación directa), el T.ferrooxidans requiere de un mecanismode contacto o adhesión alos sustratos sólidos insolubles (7,108). Sin embargo, esta adhe­sión no es frecuente y no siempre ocurre en las masas mineralessometidas a lixiviación. Hasta el momentose desconoce la rela­ción de este fenómeno con la actividad del agua, asi como lascondiciones que permiten una adhesión eficiente y estable a estossustratos.

Los resultados descripto evidencian que el T. ferrooxidans encuanto a su crecimiento posee un carácter altamente hidrofóbico.Esto está en concordancia con la caracterización en este microor­ganismo de un liposacárido, purificado a partir de su membranaexterna que muestra un alto contenido lipidico (109). Tal liposa­cárido podria ser el responsable del carácter hidrofóbico del T,ferrooxidans. No obstante, la relación de este LPScon el meca­nismo de adhesión no ha sido determinada.

- 104 ­

CAPITULOIII

CALCULO DE TIEMPOS DE GENERACION

Introducción

Comose diJo antes, la principal hggzglg_jfign1gg:gggnfinign de losprocesos biohidrometalúrgicos reside en los lazggs_pgzigdgs__deWWW, yestoseatribuyealahumanadLnultinlinaciónMeziana.

Se ha determinado que el tiempo de generación de T. férrooxidansen medios líquidos oscila entre 6 y 37 horas, dependiendo de ce­pas y condiciones (110-112).

La posibilidad de obtener colonias en pocas horas sugiere que elT. ferrooxidans puede dividirse a velocidades muchomayores quelas anteriormente observadas. Por esta razón y con fines compara­tivos, se estimaron los tiempos de generación de las cepas ATCC19.859, BA1y BA2en medio ISP líquido,y en el mismo medio sólidocuando el grado de deshidratación permite un crecimiento rápido.

Resultados

Para la estimación de los tiempos de generación en medio líquido,las células se cultivaron en Erlenmeyers conteniendo 100 m1 demedio ISP, agitados a 30°C. El volumen se ajustó periódicamentecon una solución de SO4H2de pH 1.8.

El número de células se determinó por diluciones y recuento enplaca.

Los tiempos de generación minimos correspondientes a la fase ex­ponencial, se estimaron a partir de los resultados que se mues­tran en la Figura 23, por la ecuación:

AT x Logzts

Long-LogCo

- 106 ­

Los tiempos de generación promedio de las células multiplicandoadheridas al medio sólido deshidratado se estimaron por 1a ecua­ción anterior de la siguiente forma:

Se inocularon con las tres cepas, placas con medio ISP sinadiciones pero altamente deshidratado.

El inicio del desarrollo se determinó por observación de lasplacas cada 2 horas en un estereomicroscopio, y se consideróque el desarrollo se inició una hora antes a que fuera obser­vado.

Se consideró que cada colonia proviene de una célula (00:1).

El número final de células (C1) se determinó transfiriendocuantitativamente cada colonia, mediante un escarbadientesestéril, a 1 ml de la Sol. A del medio ISP. Luego de agitarcon Vortex de modode lograr la suspensión total de la misma.se contó el número de células por diluciones y recuento enplaca. El número final de células por colonia, se determinócomopromedio de tres colonias para cada cepa.

Se consideró un AT que resulta del tiempo transcurrido entreel momentode inicio del crecimiento hasta el momentoen quehubo colonias visibles directamente y se aislaron para hacerel recuento de células.

En la Tabla XIII se indica el tiempo de generación minimo,correspondiente a la fase exponencial durante el crecimiento enmedio liquido, y el tiempo de generación promedio cuando lascélulas crecen adheridas a un sustrato sólido altamentedeshidratado, para las tres cepas.

- 108 ­

Tabla XIII: Tiempos de generación en medio liquido y en medio só­lido deshidratado.

tg minimo. Crecimiento tg promedio. CrecimientoCEPAS libre. Medio liquido adherido a sól.deshidratado

ATCC19.859 10,3 horas 25 minutos

BAl 8,5 horas 20 minutos

BA2 11,6 horas 28 minutos

Discusión

Los resultados anteriores muestran que si bien T. férrooxjdans esun microorganismo tolerante al exceso de agua, su desarrollo 6p­timo corresponde a condiciones de baja actividad de agua. Debeconsiderarse que esta bacteria evolucionó en rocas y minerales,que en los ambientes mineros no se encuentran sumergidos en agua.

La identificación de condiciones que permiten una elevada veloci­dad de multiplicación bacteriana es de importancia tecnológica en1a optimización de los procesos hasta ahora denominados Biohidro­metalúrgicoa.

— 109 ­

CAPITULO IV

ANALISIS DE LA RELACION

BACTERIA-PRODUCTO CRISTALINO

Introducción

Se ha descripto anteriormente la capacidad del T. ferrooxidans deformar en placas microcolonias observables en estereomicroscopio(10,75). Habia llamado la atención las formas angulares de lasmismas, particularmente de las que Harrison caracterizó como“co­lonias en forma de estrella".

La particularidad de las colonias presentadas en el Capítulo II,reside en el tamaño y en el tiempo de formación de las mismas. Sibien la forma y el tamaño alcanzado depende de la cepa utilizada,de la composición del medioy de la estrategia utilizada para re­ducir la actividad de agua, todas tienen algo en común: formasangulares o geométricas que semeJan cristales.

Por otra parte, es de esperar que los productos metabólicos, re­sultantes de la biooxidación, en medios con alto grado de deshi­dratación se encuentren en estado cristalino.

Cabepreguntarse cómoes la distribución y relación bacteria-pro­ducto cristalino en estas colonias.

Para responder a estas cuestiones se procedió a la observación delos preparados bajo microscopía de scanning.

Resultados

Se describen las observaciones obtenidas a partir de coloniasbacterianas, de aproximadamente un centrímetro de diámetro, enforma de estrella, comola que con una flecha se indica en la Fi­gura 24.

La Figura 25 es un esquema de una colonia tipo, en el que se in­dican zonas de características diferenciables a simple vista: a)centro de la colonia de aspecto pulverulento; b) borde de colora­

- 111 ­

ción más oscura que el resto de la colonia; y c) zona intermediaentre centro y borde.

Los centros de las colonias comoel indicado con (a), por obser­vación directa, tienen apariencia de granulado menor. Las foto­grafias correspondientes de scanning, muestran unidades cristali­nas menores en forma cúbica, disgregadas como se muestra en lasFiguras 26, 27 y 28.

Cuandola superficie de la zona que va desde el centro al borde,comola representada por (c) en la Figura 25, se analiza porscanning, sólo se observan cristales ordenados paralelos al planode la colonia, comomuestra la Figura 29. Pero si estos cristalesse lavan levemente con una solución ácida antes de hacer el fija­do para el análisis por scanning, se observan las bacterias dis­tribuidas desordenadamente como se muestra en la Figura 30. Encambio, si cristales de esta zona se rompen mecánicamente con unescarbadientes estéril, previamente al análisis por scanning, encristales semidestruidos por acción mecánica, se observan lasbacterias distribuidas según planos y direcciones ordenadas comose observa en la Figura 31. Las imágenes sugieren que las bacte­rias quedan temporalmente ocluidas en el cristal que forman.

Cuandoel borde de la colonia indicado por (b) en la Figura 25 seanaliza por scanning. sin introducir ninguna alteración previa,se observan cristales alargados, que a diferencia de los de lazona (c), se han levantado del plano de la colonia y grupos deellos toman formas de ramilletes, comose muestra en las Figuras32 y 33.

Aunquetodos los cristales del borde, tienen forma semejante y seencuentran levantados respecto del plano de la colonia, se apre­cian diferencias entre ellos, fundamentalmenteen el extremo su­perior que queda más expuesto al aire y alejado de la base. Algu­

- 112 ­

nos tienen su extremo superior cerrado, y otros lo tienen abiertocomose observa en las Figuras 34 y 35. Algunos presentan fractu­ras en el extremo superior comose muestra en la Figura 36.

Las observaciones realizadas en el borde de las colonias asocia­das al hecho de que 24 a 48 horas después de que se obtienen lascolonias analizadas comienzan a formarse colonias menores en losalrededores de las originales (ver Figura 24), permiten asociarel fenómenoa un mecanismode translocación bacteriana en super­ficie, conocido en microbiologia como "expulsión" o "eyección", yque se discute en el Capitulo VII.

Figura 24: Fotografia de colonias de la cepa BAzobtenidas enmedio ISP con saroosyl 10-2 M y 01K 0,05 M.

- 113 ­

_.\ÍSae(_nl(c) zona

Representaciónuna colonia.

25:

(b) borde,

1guraquemática'decentro,termedia.

F

ámica del(a) Fig.

ta panoria.centro de la colon

25.

isVFigura 26

amplifi­centro

: Fotografíacada de cristales en elde la colonia.Figura 28amplifi­

centroFotografía

istales en elcada de o;de la colonia.Figura 27

Figura 29} Fotografía de la su­perficie de la colonia. (c)Fig.25.

Figura 31: Cristal correspon­diente a la zona (c) F1g.25,roto mecánicamente.

Figura 30: Cristal correspon­diente a la zona (c) Fig.25,lavado levemente con sol. áci­da. ‘

Figura 32: Vista panorámica delborde de la colonia, (b) Fig.25.

vJl .5 " WFigura 33} Vista panorámica delborde de la colonia (b) Fig.25.

g

.v='ïsï-ÍFigura 35: Cristal abierto delborde de la colonia, (b) Fig.25.

¡0p

Figura 34: Cristal abierto delggrde de la colonia. (b) Fig.

'Figura 36: Cristal cerrado delborde de la colonia, (b) Fig.25.

Discusión

Las fotografias indican que la bacteria queda, al menos temporal­mente, ocluida en los cristales que resultan de su actividad me­tabólica.

Las perforaciones presentes en las caras de los cristales sugie­ren que la bacteria posee mecanismoscapaces de lisar los crista­les que formó.

La interrelación entre la orientación bacteriana y su distribu­ción espacial, con la estructura del cristal formado, deberá serobjeto de estudios en el futuro.

CAPITULO V

BIO-OXIDACION DE SULFUROS METALICOS

DESARROLLO MICROBIANO EN RELACION A

LA FUENTE DE NITROGENO

Introducción

La bio-oxidación de sulfuros metalicos y la capacidad de T, 1%»rrooxidans de utilizarlos comosustratos energéticos, según losmecanismosde lixiviación directa. se ha probado ensayando sulfu­ros metálicos sintéticos o especimenes naturales de alto grado depureza, comoúnica fuente de energía (47.48.49).

En estos casos se ha cultivado la bacteria en medios que contie­nen 52 p:v de un sulfuro metálico finamente molido y suspendidoen un medio líquido agitado que contiene amonio como fuente denitrógeno y trazas de otras sales.

Aúnen cultivos con una elevada concentración celular inicial(107 cél/ml), la velocidad de bio-oxidación de sulfuros metáli­cos, determinada por medición de metal solubilizado es muy baja,del orden de miligramos por litro y por hora, durante la fase ex­ponencial.

La velocidad de bio-oxidación por via directa de los sulfuros me­tálicos contenidos en minerales, es dificil de cuantificar, por­que la mayoria de los minerales contienen hierro ferroso y férri­co, lo cual impide la diferenciación entre los mecanismosdirectoe indirecto de solubilización de metal. Noobstante, el requeri­miento de varios meses a años para obtener recuperaciones acepta­bles de metal solubilizado, indica que en los minerales la velo­cidad de bio-oxidación de sulfuros metálicos por via directa,también es muy baja.

Se denominapulpa a la suspensión liquida de minerales trituradoso molidos, que se somete a procesos biohidronetalúrgicos. En lapráctica biotecnológica, la dilución de la pulpa (R), expresadacomola relación de masa de líquido y masa de sólidos (L/S), os­cila entre 4 y 10, o sea, entre 9 y 20%de sólidos en suspensión(13).

- 119 ­

Por los resultados obtenidos en los capitulos anteriores, se en­sayó el crecimiento microbiano y la bio-oxidación de sulfuros me­tálicos sintéticos, concentrados y minerales, en condiciones debaja actividad de agua. Se analizó también el desarrollo micro­biano en relación a la fuente de nitrógeno.

Resultados

Qmimientgsnflusintátimcgnxsinammgdsnitmmam­niacal

Se prepararon placas de vidrio de 9 cm de diámetro, que contienenuna delgada pelicula de sulfuro cúprico (SCu) sintético seca yestéril, preparados según se indica en Materiales y Métodos. Seacidificaron, agregando de a gotas 1,5 ml por placa de alguna delas siguientes soluciones estériles: a) Acido sulfúrico 0,1 N; ob) Solución A del medio MSindicado en Materiales y Métodos connitrógeno amoniacal y sales que aportan trazas de fósforo, pota­sio y magnesio; o c) Solución A del medio MSsin nitrógeno ano­niacal.

Las placas se inocularon descargando en el centro 10 ul de uninóculo de la cepa BAz, preparado por suspensión y disolución deun cristal de sulfato de cobre proveniente de un cultivo ante­rior. en ácido sulfúrico 0,06 N. Las placas inoculadas y los res­pectivos controles estériles se incubaron a 30°C.

Cuandose perdió el brillo propio de la humedad, se observaronlas primeras evidencias de desarrollo, y pocas horas después seobtuvieron en las placas inoculadas, cristales azules de sulfatode cobre de aproximadamente 0,5 cm de ancho por 2,5 cm de largo.como muestra la Figura 37.

Estos cristales son, a su vez. colonias bacterianas. Cabría deno­minarlos "cristales biológicos".

- 120 ­

En cuanto a la composición del medio, en los tres casos indicadosanteriormente por a, b y c, el desarrollo es equivalente. En ge­neral, se obtiene un mejor desarrollo cuando el sulfuro metálicose acidifica con una solución de ácido sulfúrico solamente.

Considerando que el sulfuro de cobre sintético fue preparado apartir de drogas que no son de grado analítico, puede proponerseque las impurezas presentes en el mismoson suficientes para pro­veer los elementos requeridos en cantidades mínimas para el desa­rrollo bacteriano. tales comofósforo, potasio, magnesio, etc.Este último punto se analizará más adelante. Noobstante, consi­derando que en medios liquidos se requiere de la adición de 2 a 6g/l de sulfato de amoniopara que el desarrollo bacteriano seaposible, los resultados obtenidos sugieren una elevada eficienciade fijación de nitrógeno atmosférico, cuando el desarrollo bacte­riano se produce en medios con baja actividad de agua.

Analisisdeldssarmllgbacjeriang enmnniándela composicióndannmedigígrmsg

A fin de lograr mayorclaridad en los resultados anteriormenteexpuestos, y frente a la imposibilidad de contar con sulfuros me­tálicos de grado analítico, se analizó el desarrollo bacterianoen relación a la composicióndel medio, utilizando sulfato ferro­so de grado analítico comosustrato energético.

Para introducir en el sistema de análisis la menorcantidad decomponentesposibles que pudieran aportar impurezas, se evitó elagregado de agentes gelificantes utilizando el métodode obten­ción de colonias sobre la capa de sales depositadas sobre el vi­drio de una placa.

Las placas se prepararon distribuyendo uniformemente alguno delos siguientes medios: a) 3 ml por placa de una solución al 10%de SO4Fe.7H20grado analítico, ajustada a pH 1,8; o b) 1,5 ml por

- 121 ­

placa de una solución al 20%de SO4Fe.7H20grado analítico ajus­tada a pH 1,8, más 1,5 ml por placa de la solución A del medio MSsin el agregado de nitrógeno amoniacal. Las placas preparadas conambos medios se inocularon con las cepas ATCC19.859. BA1 o BAa yse incubaron a 30°C, analizándose la formación de colonias cuandoel medio se deshidrató.

En las placas que contenían solamente sulfato ferroso grado ana­lítico, no hubo formación de colonias. En algunas de ellas queda­ron grabadas las huellas típicas de un fenómenode deslizamientobacteriano, que se discute en el Capítulo VII. La Figura 38 mues­tra una fotografía amplificada. Se sabe que en medios deshidrata­dos. esta forma de translocación bacteriana es incentivada porfalta de nutrientes.

En las placas que contenían además de sulfato ferroso, pequeñascantidades de sales que aportan elementos comofósforo, potasio ymagnesio, aunque sin agregado de una fuente de nitrógeno, se for­maron colonias de aproximadamente 5 mmde diámetro, como muestrala Figura 39.

Los resultados indican que en medios deshidratados, el desarrollobacteriano se independiza del agregado de nitrógeno amoniacal.Era de esperar que, si T. ferrooxidans ha evolucionado con unsistema nitrogenasa, deben existir condiciones en las que estesistema funcione eficientemente.

Bimxidacióndesulfurosneïálicgssintátim.esmímemm­nales.meLos principios anteriormente descriptos, respecto de la fisiolo­gía bacteriana en relación al agua, se aplicaron a la bio-oxida­ción de sulfuros metálicos sintéticos o naturales de alto gradode pureza (especímenes) o concentrados provenientes de minerales.

- 122 ­

Figura 37: Cristalde cobre obtenidos

es de sulfatoinoculando

"con la cepa BAzsulfuro cúpricoacidificado‘

Figura 38: Fotografia ampliadade huellas de deslizamientobacteriano de la cepa BAI gra­badas en una placa que contienesolamente sulfato ferroso. Labarra indica 1 cm‘

Figura 39: Colonias de la cepaBA1obtenidas a partir de sul­fato ferroso y las sales de laSol. A del medio MS.

- 123 ­

Cantidades pesadas y estériles de cada sustrato en cuestión secolocan en placas de Petri distribuyendolos en toda la superficiede la placa y posteriormente se humedecieron con soluciones deácido sulfúrico de volúmenes y concentraciones apropiadas segúnlos siguientes criterios:

a) El volumen más conveniente por unidad de peso del sustrato enCUOBtiÓnes el menor volunenque asegura la acidificación to­tal y uniforme del sustrato. Este volumen depende de las ca­racteristicas fisico-químicas de cada sulfuro, en particularcuando se trata de minerales porosos debe asegurar la acidifi­cación a través de los poros. No obstante, el volumen debe serel menor posible que cumpla con las condiciones anteriores, afin de evitar pérdidas de tiempo inherentes a la deshidrata­ción.

b) La concentración de ácido más conveniente está dada por lacantidad de ácido que en el volumen más conveniente asegure laacidificación del mineral, impida la compactación, provea lacantidad de ácido para que las bacterias desarrollen eficien­temente, y contemple eventuales pérdidas por evaporación. Enlos procesos biohidrometalúrgicos la cantidad de ácido a agre­gar a\la solución de lixiviación, también debe contemplar elconsumosegún los parámetros antes enunciados.

En las condiciones aquí propuestas, el volumende acidificaciónresultó ser muyinferior al volumende solución ácida de sistemaslíquidos.

A continuación se describen algunos ensayos y formas de cultivoen distintos sustratos metálicos, según los criterios expuestos.

1- Se prepararon, según se indica en Materiales y Métodos, placasde Petri de 9 cm de diámetro conteniendo una capa delgada desulfuro cúprico (SCu), seca y estéril, acidificando con 0,5 ml

— 124 ­

acidifi­inocularon

de una solución de ácido sulfúrico 0,3 N tratando decar homogéneamentetodo el sustrato. Las placas seen el centro con 10 pl de un cultivo de la cepa BA1preparadapor suspensión y disolución de un cristal de sulfato de cobreproveniente de un cultivo anterior, en ácido sulfúrico 0,06 N,inmediatamente antes de la inoculación, de modode mantener elmenor tiempo posible a las bacterias en medio liquido y se in­cubaron a 30°C. A las 24 horas se obtuvo el desarrollo que semuestra en la Figura 40 con cristales de sulfato de cobre in­coloros (el estado anhidro es incoloro),de 0,5 cm de ancho por2 a 3 cm de largo, que a su vez son colonias y por observaciónal microscopio mostraron una densa población bacteriana.

Se utilizó comosustrato un espécimen natural de pirita (FeSz)de alto grado de pureza, triturando a -100 mesh. Este sustratocuando se deshidrata después de la acidificación, muestra unaelevada tendencia a la compactaciónque dificulta el desarro­

deel

La concentración

llo bacteriano. Se determinó como volumen más convenienteacidificación el que corresponde a una relación 1:1 entrepeso de pirita y el volumende acidificación.

condi­de ácido más conveniente para este sistema y para lasciones de desarrollo bacteriano que a continuación se descri­ben, fue de 0,45 N. Asi, colocando 0,5 g de pirita estéril enplacas de plástico de 5,5 cmde diámetro, se adicionaron 0,5ml de la solución estéril de ácido 0,45 N y por movimientos de

logró una delgada y homogénea capa de sustratoSe inoculó el centro de cada placa con un inóculo

de la cepa CM1 adaptada al desarrollo en pirita por cultivosanteriores. Se incubaron las placas cerradas a 30°C. A las 24horas comenzarona evidenciarse los primeros indicios de desa­

rotación seacidificado.

rrollo. Diez horas después se obtuvo un desarrollo comoel quemuestra la Figura 41.

- 125 —

3­ Se utilizó comosustrato un espécimen natural de elevada pure­za de galena (PbS) triturado a -40 mesh. Se colocó 1 g de ga­lena estéril por placa de plástico de 5,5 cmde diámetro. Seacidificó con 1 m1de una solución de 0,24 N de ácido sulfúri­

inoculó con la cepa CMz proveniente de unincubándose a 37°C. Entre 18 y 22

Seis ho­blanco

co estéril y secristal de sulfato de cobre,horas después, comenzóa evidenciarse el desarrollo.ras después se obtuvieron pequeños cristales de colorvidrioso y de tamaño equivalente al de un grano de galena, pe­

Estosro contrastando con el color plomizo de ésta. cristalesresultan ser solubles y por observación al microscopio, mos­traron una densa población bacteriana.

Se utilizó comosustrato un concentrado proporcionado por Ce­rro Castillo S.A. de esfalerita (ZnS) conteniendo 592 de zinc.

plástico de 9 cm deácido

rotacionales

Se colocaron 2 g estériles en placas dese agregaron 1,5 m1 de solución estéril de

sulfúrico, 0,24 N distribuyendo por movimientosel sustrato acidificado en toda la placa. Se inoculó el centrode las placas con un inóculo de la cepa ATCC19.859 previamen­te adaptada al crecimiento en ZnS y suspendido en SO4H20,06 Nen ,Se incubó a 30°C. Alrededor de 48horas después comenzóa evidenciarse el crecimiento, y 12 ho­

diámetro y

el momentode inocular.

ras después se obtuvo el desarrollo que se muestra en la Figu­ra 42, asociado al tipico color blanco del sulfato de zinc.

Las placas, de 9 cm de diámetro, se prepararon según se indicaen Materiales capa delgada de sulfuro decobalto (SCo), seca y estéril y se acidificaron agregando 0,5ml de una solución de ácido sulfúrico 0,3 N de modode acidi­ficar homogéneamente todo el Se elcentro con inóculos de las cepas ATCC19.859, BA1 y CM1prove­nientes de un cultivo anterior en sulfuro de cobalto y se in­

y Métodos, con una

sustrato. inocularon en

- 126 ­

cubó a 30°C. A las 24 horas se obtuvieron desarrollos como losque se muestran en las Figuras 43, 44 y 45, con el color rojoesperado de los cristales de sulfato de cobalto.

Se utilizó comosustrato un espécimen natural de antimonita(szSs) de alta pureza molido a -100 mallas.ensayados,

De los sustratoséste es el másdifícil de acidificar por su hidro­

fobicidad. La obtención de una masa homogéneamenteacidificaday distribuida en la superficie de las placas requiere de mayo­res volúmenesde solución ácida que en los casos anteriores.Además,espátula estéril. Este sistema tiene, además,

para conseguir esta masa homogénea, se mezcló con unauna elevada ten­

dencia a la compactación, que dificulta el desarrollo bacte­riano por lo cual deben utilizarse concentraciones de ácidomayores que en los casos anteriores. Los mejores resultados seobtuvieron distribuyendo homogéneamenteen placas de poliesti­

0,5 g de szSa estéril. y 1,5 mlsolución de ácido 0,6 N estéril. Unavez inoculadas,

reno de 5,5 cm de diámetro,de unalas placas se incubaron semiabiertas para facilitar la pérdidade agua por evaporación. Entre los 3 y 4 días posteriores seprodujo el desarrollo, formandouna fina capa en la superficiede color blanco delicuescente, típico del sulfato de antimo­nio. La Figura 46 muestra el desarrollo de la cepa BAzen estesustrato.

Se utilizó comosustrato un mineral de cobre molido a -100mesh, conteniendo 2,1% de calcosina (Cqu). Se colocaron 5 gde mineral estéril en placas de poliestireno de 8,5 cmde diá­

ácidola

masa homogéneamenteen toda la placa y se distribuyó de a go­

metro, acidificando con 5 m1de una solución estéril desulfúrico 0,4 N. Por movimientos de rotación se distribuyó

tas 100 pl de inóculo de la cepa CMzproveniente de un cultivoen CuS. Incubando a 37°C, el

la humedad, comenzó a observarse el creci­a las 48 horas, cuando se pierde

brillo propio de

- 127 ­

miento y doce horas después se obtuvo un desarrollo como elque muestra la Figura 47, caracterizado por levantamientos dela capa de mineral asociados a pequeños cristales azules.

8- Se ensayó una muestra de mineral del yacimiento CampanaMahui­da, triturado a 1/4 de pulgada. Según el Informe Calcográficoproporcionado por la Dirección General de Minería de Neuquén,el sulfuro metálico predominante en este mineral es calcosina(Cqu).

Se colocaron 30 g de mineral por placa y se determinó como vo­lumen y concentración de ácido más conveniente, 20 ml de unasolución de ácido sulfúrico 0,45 N. Se inoculó con la cepa CM1proveniente de un cultivo en sulfuro cúprico sintético, incu­bando a 37°C con la placa abierta, a fin de permitir una rápi­da evaporación. A las 16 horas se obtuvo un desarrollo bacte­riano sobre las piedras, comoel que muestran las Figuras 48 y49. Por lavado de las piedras se obtuvo una solución celesteconteniendo el cobre soluble.

Discusión

Los resultados obtenidos indican que en medios de baja actividadde agua, el sistema nitrogenasa de T. ferrooxidans es eficienteen la fijación de nitrógeno atmosférico. Cabe proponer que elcristal en el que las bacterias van quedandoocluídas, al menostemporalmente durante su desarrollo, provee la protección de oxí­geno al sistema nitrogenasa.

Por todo lo expuesto, deben profundizarse los estudios sobre lacaracterización del T. ferrooxidans comomicroorganismo de vidalibre. En este sentido, se sabe que la primera etapa de la oxida­ción biológica de un sustrato sólido insoluble implica una inter­acción célula-sustrato a través de un mecanismode contacto o ad­

- 128 ­

Ou

.fl

g

Figura 40: Cristales de sulfatode cobre obtenidos con la cepaBA1inoculada en sulfuro cúpri­CO.

Figura 42: Desarrollo de la ce­pa ATCC19.859 en un concentra­do de esfalerita (ZnS).

Figura 44: Cristales de sulfatode cobalto obtenidos con la ce­pa BA1inoculada en sulfurocobalto.

de

Figura 41: Desarrollo de la ce­pa CMIen un espécimen naturalde pirita (FeSz).

Figura 43: Cristales de sulfatode cobalto obtenidos con la ce­pa ATCC 19.859 inoculada ensulfuro de cobalto.

Figura 45: Cristales de sulfatode cobalto obtenidos con la ce­pa CM1inoculada en sulfuro decobalto.

-—_­

Figura 47: Desarrollo de la ce­pa BA2 en un mineral de cobremolido a -100 mesh que contiene2,1%de calcosina (Cqu).

Figura 46: Desarrollo de la ce­pa BA2inoculada en un especi­men natural de(szSa).

antimonita

Figura 48: Mineral de cobre delyacimiento CampanaMahuida tri­turado a 1/4" sometido a bio­

Figura 49: Fotografía amplifi­cada del mineral indicado en laFig.48, colonizado con la cepa

oxidación con la cepa CM1 CMI.(derecha) y no tratado (iz­quierda).

- 131 ­

hesión. Los resultados obtenidos indican que el agua dificulta oimposibilita una adhesión estable de las células a dicho sustra­to.

Ademásse ha desarrollado la hipótesis de que 1a segunda etapa enla oxidación biológica reside en la destrucción de la estructuracristalina del sulfuro metálico, mediante sistemas enzimáticos de1a bacteria, a fin de permitir la oxidación posterior (50). Deser asi, estas enzimas no deben ser diluidas ni eluídas de la zo­na de ataque.

Si bien 1a actividad de oxidación de distintos sulfuros metálicospor distintas cepas es variable. y está determinada por la histo­ria de su existencia, los mecanismosprevios que deben cumplirsepara que la oxidación biológica sea eficiente, están gobernadospor condiciones semejantes.

- 132 ­

CAPI TULO VI

CRECIMIENTO, BIO-OXIDACION Y RESISTENCIA

DE T. femidana EN FUNCIONDEL

CONTENIDO DE AGUA DEL MEDIO

Introducción

El perfil fisiológico y las características de crecimiento del T.ferrooxidans, hasta ahora se habian analizado en medios y siste­mas con elevada actividad de agua. De los resultados expuestos enesta Tesis, se deduce que el comportamiento de la bacteria es muydiferente en medios con baJo contenido de agua.

A fin de analizar el comportamiento de la bacteria en función delcontenido de agua en el medio, se determinó la cinética del cre­cimiento bacteriano en función del aumento de la masa proteica ydel contenido de agua en el medio y su correlación con la cinéti­ca de bio-oxidación de sulfuro cúprico. Se determinó también lasensibilidad del T. ferrooxidans a los iones inhibidores en medioagarizado y deshidratado y en un sulfuro metálico variando elcontenido de agua.

Resultadosmmm hacieniangxsucgnmlaciánmnelSflumudadoSe determinó el contenido proteico y el cobre solubilizado enfunción del tiempo de cultivo. El ensayo se hizo con placas quecontenían 1 g de sulfuro cúprico previamente esterilizado y 1 mlde ácido sulfúrico 0,15 N estéril, mezclándolos homogéneamentepor movimientos de rotación. De esta forma, y considerando 1adensidad de la solución de acidificación igual a uno. puede supo­nerse que se partió de una relación masa de liquido a masa de só­lido (L:S) igual a uno. Se inoculó cada placa con 20 ul de uninóculo de la cepa BAzobtenido por disolución de cristales desulfato de cobre provenientes de un cultivo anterior. El inóculocontenía 0,885 mg/mlde proteína. Placas no inoculadas se utili­zaron comocontroles estériles. Todas las placas se incubaron a30°C. Teniendo en cuenta que a través del tiempo se produce es­pontáneamente la pérdida de agua por evaporación y que en reali­dad, es este fenómenoel que determina el desarrollo bacteriano,

se calculó la variación de L:S a través del tiempo por la pérdidade peso de cada placa al momento de ser analizada respecto delpeso al iniciar la incubación. Cada placa perdió alrededor de 0,4g de agua cada 24 horas.

Para la determinación de proteinas y cobre solubilizado, en elmomentode analizar cada placa se adicionó el volumen necesariode una solución de ácido sulfúrico 0,06 N para alcanzar un volu­mentotal de 10 ml de líquido, considerando el liquido remanenteen cada caso. La solubilización de los cristales de sulfato decobre se obtuvo por agitación manual de la placa hasta obteneruna masa homogénea de sólido y líquido. Se separó 1 m1 de estamasapara determinar proteinas y el resto se filtró en papel defiltro Whatmande velocidad media. En el filtrado se midió el co­bre soluble según se indicó en Materiales y Métodos. El contenidoproteico se expresó en miligramos de proteina por mililitro demasa. El cobre solubilizado se expresó en miligramos de cobre pormililitro de solución. En la Figura 50 se muestran los resulta­dos.

Sensibilidad de cenas de T. ferrooxidans a inner-1inhibidores enmedida deshidratadds.

Contando con plásmidos que podrian ser usados como vectores detransformación genética en T. ferrooxidans y con métodos apropia­dos de obtención de colonias para la selección, se procedió a de­terminar cuáles son las concentraciones inhibitorias de Hg2+,Ag+, Ca2+, As043-, AsOa3- y TezOsz- para las cepas ATCC 19.859,BA1Y BAz en medios deshidratados.

En medio ferroso agarizado ISP, adicionado con betaína o con sar­cosyl y deshidratado según se indicó en el Capítulo II, de modode obtener colonias en 24 horas, las tres cepas dieron crecimien­to positivo, aún en la mayor concentración (10-2 M) de cualquierade los iones que son inhibidores en medio líquido.

- 135 ­

41.0

—3o

É É”I3, —2o -‘:3É un\í¡U .í

‘C

3-3

8 —100.

o

Tiempo (hs)

1L de 0:5 o}. dz 0,05L/S

Figura 50: Incremento en la concentración de proteinas (A.) y deSO4Cubiolixiviado (o ) en función del tiempo de cul­tivo asociado a la relación L:S en cultivos de T. fe­rrooxidans realizados en placas conteniendo SCuacidi­ficado. Las condiciones se indican en el texto. ( o )Cobresoluble en placas estériles.

— 136 ­

Cabe pensar que la betaina o el sarcosyl podrian estar enmasca­rando los iones inhibidores, impidiendo su efecto comotales. obien, que la inhibición o la resistencia están asociadas al con­tenido de agua en el medio.

Comoen un medio ferroeo agarizado no resulta precisa la cuanti­ficación del contenido de agua, se analizó la resistencia en fun­ción de la relación masa de líquido a masa de sólido (L:S), uti­lizando comosustrato un concentrado de esfalerita (ZnS) que con­tiene el 59%de zinc. Para ello, se prepararon placas conteniendo2 g de esfalerita estéril, 2 ml de una solución de SO4H3 0,24 Ny cualquiera de los inhibidores en una concentración 10-3 M. Par­tiendo de una relación masa de líquido a masa de sólido igual auno, se estableció un gradiente de relaciones L:S (0,75; 0,50;0,25; 0,15 y 0.10) secando las placas en la campanade flujo la­minar hasta que por pérdida de peso se determinó que el liquidoremanente era el necesario para dar la relación L:S requerida.

Se analizó el crecimiento de las tres cepas antes indicadas pro­venientes de cultivos anteriores en ZnS. Los inóculos se obtuvie­ron por disolución de cristales de SO4Znen SO4H20,06. La TablaXIVmuestra los resultados.

Discusión

Tanto la multiplicación bacteriana comola bio-oxidación del sul­furo de cobre se incrementan rápidamente cuando la relación L:Ses menor de 0,2 y ambas velocidades son máximas cuando la rela­ción L:S es aproximadamente 0,05. Este último valor es un tantoincierto puesto que la pérdida de peso en las placas no reflejacon exactitud la pérdida de agua por evaporación, ya que se in­troduce un error por el aumento en la masa microbiana y en laoxidación del sulfuro a sulfato. Es de hacer notar que en lapráctica biotecnológica se trabaja con relaciones L:S de entre 4y 10.

- 137 —

Tabla XIV: Crecimiento en esfelerita (ZnS) de las cepas ATCC19.859, BA1 y BA: en presencia de H32+, Ag+, Cd2+,A6043-, A3033- y Teanz- a una concentración 10-2 M,en función de la relación masa de líquido a masa desólido (L:S)

Inhibidores (10-3 M)

Cepa L:S ng* Ag+ Cd2+ A5043- A5033- Te032­

ATC019.859 1

0,750,50 — - ­0,25 - - - ­0,15 - - + + + +

0,10 + + + + + +

BA1 1 - - - - ­

0,75 - ­0,50 - - - - ­0,25 - - - - ­0,15 — +1 + + + +

0,10 + + + + + +

BAz 1 — - - - - ­

0,75 - ­0,50 - - ­0,25 - - - ’0,15 — - + + + +

0,10 + + + + + +

- 138 ­

De la Tabla XIVse desprende que cuando la relación L:S es en ge­neral menor de 0,15, el T. férrooxidans no es sensible a los in­hibidores metálicos. La razón de ello puede residir en que la in­hibición no existe por carencia del agua requerida para solubili­zar los iones inhibidores, o porque la bacteria cuando desarrollaen medios con baja actividad de agua produce cambios en su super­ficie celular que le permiten una resistencia generalizada. Serequerirán mayores estudios para confirmar esto. Noobstante, losresultados sugieren que esta bacteria no ha incorporado mecanis­mosenzimáticos de resistencia a iones que normalmente están pre­sentes en la mayoría de los minerales, porque en las condicionesen que evolucionó no los requería.

Por otro lado, para una futura selección de transformantes del T.ferrooxidans es evidente que las mismasdeberán ser efectuadas enmedios que posean una relación L:S superior a 0,15.

- 139 ­

CAPITULO VII

FENOHENOS DE TRANSLOCACION BACTERIANA

EN SUPERFICIES

Introducción

Se conocen varios fenómenosde translocación bacteriana en super­ficies que responden por lo menos a seis tipos de mecanismos di­ferentes por los cuales las bacterias pueden movilizarse sobresuperficies sólidas (113). Dos de ellos son el "deslizamiento"(gliding) y el "lanzamiento" (darting).

Deslizaniento se define comoel movimiento bacteriano continuo,no asociado a flagelo, que se produce sobre superficies sólidassiguiendo regularmente el eje longitudinal celular. Los mecanis­mos que hacen posible esta forma de movimiento en las bacteriasdenominadasdeslizantes, están siendo estudiados y se han pro­puesto varios modelos (114-120).

El deslizamiento bacteriano puede ser individual o social. Eldeslizamiento social se produce en grupos de células bacterianasdenominados clusters. balsas o enjambres. Estos grupos en gene­ral asumen la forma fusiforme con una célula, denominada lider,en el frente de avance. Se cree que, evolutivamente, han desarro­llado esta propiedad comouna forma de penetrar más eficientemen­te en un nuevo ambiente.

Unade las características más notables del fenómenodel desliza­miento reside en el grabado superficial de surcos que se puedenobservar por estereomicroscopía con iluminación oblicua, en elcaso de deslizamiento individual, o a simple vista en el caso deldeslizamiento social (121-123).

Las condiciones ambientales que favorecen el deslizamiento son:

- La concentración de nutrientes: tienden a deslizarse cuando laconcentración de nutrientes es baja o nula.

- 141 ­

Humedad:en un medio agarizado, el deslizamiento es directa­mente dependiente del contenido de humedad del mismo. Una cla­ve para impedir el deslizamiento y poder obtener colonias estrabajar con agar desecado (124). En superficies sólidas comovidrio, poliestireno o acero, el deslizamiento es muy depen­diente de la humedadambiental.

A pesar de que las bacterias deslizantes son taxonómicamente he­terogéneas, todas tienen en comúnuna superficie celular de ca­rácter netamente hidrofóbico. Las mutantes no hidrofóbicas pier­den la capacidad de deslizamiento (114). Por ello se cree que lasinteracciones a nivel de los puntos de contacto entre las célulasy la superficie sólida son del tipo hidrofóbico.

Lanzamientoes una clase de translocación bacteriana en superfi­cie, característica de bacterias que crecen en agregados celula­res dentro de cápsulas, y que resulta en la proyección de algunascélulas desde el agregado hacia la periferia (113). La caracte­ristica tipica de este fenómenoes la formación de nuevas colo­nias en un medio agarizado sin que exista ninguna huella de cone­xión con las colonias originales a través del agar. En ciertoscasos, mediante preparados microscópicos especiales, el lanza­miento se ha observado en el microscopio (125). Se especula quelas fuerzas que rompenel quiste celular provocando el lanzamien­to, están asociadas a la multiplicación celular.

Resultados

Mancha da deslizamiento en T. ferrooxidans

El T. ferrooxidans es una bacteria que posee un flagelo para sumovimiento bacteriano en medios liquidos. La imposibilidad de ad­herir la bacteria al lugar de siembra y el desplazamiento por to­

— 142 ­

da la placa aún en medios altamente deshidratados, según se des­cribió en el Capitulo II. indican la existencia de un mecanismoadicional para su desplazamiento en superficie.

Cabe pensar que el agua proveniente del inóculo produce la humec­tación suficiente para impedir la adhesión directa al lugar desiembra, promoviendoel asi deslizamiento. Las siguientes expe­riencias tienden a demostrar la existencia de este tipo de fenó­meno:

a- Se colocaron en placas de 9 cm de diámetro, 2 g de un concen­trado de esfalerita (SZn) conteniendo 59% de zinc y una vezesterilizadas, se acidificaron con 1,5 cm3de solución estérilde ácido sulfúrico 0,24 N. Por movimientos rotacionales sedistribuyó el sustrato acidificado por toda la placa. Las pla­cas se secaron en la campanade flujo laminar hasta que el pe­so de cada placa disminuyó hasta la pérdida de un 90%o más dela solución de acidificación agregada. Las placas se inocula­ron con una suspensión liquida de bacterias, tocando con unansa un borde marcado de la placa, como el indicado con unaflecha en la Figura 51. Pocas horas después comenzó a obser­varse el desarrollo típicamente blanco asociado a la formaciónde SO4Znpor bio-oxidación en la periferia de la zona de siem­bra. La zona de inoculación no presentó la formación del depó­sito blanquecino debido a su mayor tenor de humedad.

b- Una placa que contiene una capa de SCu sintético, seco y es­téril, se acidificó homogéneamente con 1,5 ml de SO4H20,1 N.Se inoculó en el centro con 20 pl de un inóculo denso de lacepa BAsy se incubó destapada a 37°C, para favorecer la eva­poración. A las 12 horas se observó un desarrollo comoel queilustra la Figura 52, lo cual muestra la capacidad de despla­zamiento bacteriano mientras hubo humedad.

— 143 ­

c­ Se utilizó comosustrato un mineral de cobre molido a -100mesh, que contiene 2,1% de calcosina (Cqu), colocando 5 g demineral estéril por placa de poliestireno de 8.5 cm de diáme­tro. acidificando con 5 ml de una solución estéril de ácidosulfúrico 0,4 N, e incubando las placas sobre un plano leve­mente inclinado de modoque uno de los bordes tuviera un mayorespesor. Luego de inocular con 20 ul de un inóculo de 1aCMz, en el borde de mayor espesor,la Figura 53 e incubar a 37°C,más fino se deshidrata primero.

cepaindicado con una flecha en

el bordeSe observó que a las 26 horascomo es de esperar,

comenzóa evidenciarse el desarrollo microbiano en el bordemás fino (Figura 53).

Aúnvarios dias después, cuando la placa ya se encontraba to­talmente deshidratada. no hubo ninguna evidencia de desarrolloen el resto de la placa. Esto indica que, mientras hay excesode humedad, las bacterias se deslizan, curiosamente en direc­

asociados a un gradiente de humedad negativa,más deshidratada una adhesión estable

que les permite multiplicar y oxidar el sustrato.

ción y sentidoproduciendo en la zona

Considerando que el agua proveniente de un inóculo liquido im­pide la adhesión bacteriana/al lugar de siembra, aún en mediosmuydeshidratados, se analizó el desarrollo bacteriano en me­dio de baja actividad de agua,

obtuvo triturando con un escarbadientes estéril unaa partir de un inóculo sólido.

Este secolonia proveniente de un medio ferroso hasta obtener un polvomuy fino. Una placa incompleta preparada con medio ISP adicio­nado con PEG8000 y deshidratada,

tocando con un ansa un lugar marcado de la placase inoculó con el polvo an­

terior, comoel que muestra la Figura 54. Se esperaba un desarrollo inme­diato en el lugar de siembra por lo que las placas se mantu­vieron sobre la mesada para observación. A la hora comenzó aevidenciarse un oscurecimiento y a las 4 horas se obtuvo un

- 144 ­

Figura 51: Crecimiento bacte­riano y bio-oxidación de SZn.La flecha indica el lugar desiembra con un inóculo líquido.

Figura 53: Desarrollo bacteria­no y bio-oxidación de mineralde cobre en el borde más deshi­dratado de la placa. La flechaindica el lugar de siembra.

Figura 52: Crecimiento bacte­riano y bio-oxidación de SCu.Se inoculó en el centro de laplaca.

Figura 54: Crecimiento y desli­zamiento bacteriano en medioferroso agarizado y deshidrata­do. La flecha indica el lugarge siembra con un inóculo sóli­o‘

- 145 ­

fuerte desarrollo solamente en el lugar de siembra, indicandouna adhesión directa. Luegocomenzarona abrirse surcos a par­tir del lugar de siembra y desarrollo bacteriano. Estos surcoscrecieron según un frente de avance, y en 4 horas cubrieron lasuperficie agarizada de la placa. A1día siguiente se obtuvie­ron colonias dispersas por toda la placa, aunque particular­mente más concentradas en el borde más delgado. Los surcos,visibles por observación directa, constituyen la huella tipicadel deslizamiento social.

e- Frecuentemente, en medios ferrosos agarizados muy deshidrata­dos, después de la formación de las colonias, se produjo laapertura de surcos visibles por observación directa, comomuestra la Figura 55. Los surcos avanzan a partir de las colo­nias, dejando la micromorfologia tipica del deslizamiento so­cial.

En otras bacterias. se ha probado que el deslizamiento socialse produce aún en medios muy deshidratados dependiendo de lahumedadambiental. A veces las colonias llegan a desintegrarsetotalmente, comomuestra la Figura 56.

Exidennias dal lanzamienm en T. ferrooxidans

Las observaciones realizadas pOr microscopía de scanning en elborde de una colonia obtenida en medio ferroso y expuestas en elCapítulo IV (Figuras 32 a 36), asociadas a1 hecho de que 24 a 48horas después de que se obtienen colonias comolas analizadas.comienzan a formarse colonias menores en los alrededores de lasoriginales comolas que muestra la Figura 24, podrian indicar 1aexistencia de un fenómenode lanzamiento bacteriano a partir delos cristales formados en el borde de la colonia.

- 146 ­

Figura 55: Colonias obtenidasen medio ferroso agarizado ydeshidratado. Las flechas indi­can las huellas del desliza­miento bacteriano que se produ­ce a partir de las colonias.

Figura 56: Huellas del desliza­miento bacteriano producidas apartir de colonias que se des­integraron totalmente.

Figura 57: Crecimiento microbiano y evidencias de lanzamiento enSCu. A: Colonias constituidas por cristales de sulfato de cobre.B: Levantamiento de los cristales desde el plano del sustrato. C:Formaciónde colonias satélites indicadas por las flechas.

Para probar 1a existencia de este fenómenose acidificó con 0,5ml de solución de ácido sulfúrico 0,3 N, una placa que contieneuna capa de CuSsintético estéril y se inoculó con la cepa BA1.La Figura 57 muestra seouencialmente los siguientes fenómenos ob­servados en la misma placa.

Cuandose perdió el brillo propio de la humedaden el sustrato, alas pocas horas se formaron colonias bacterianas constituidas porcristales azules de sulfato de cobre, Estos cristales estaban enel plano del sustrato, comose muestra en A. Entre las 24 y 48horas siguientes, las colonias comenzarona levantarse del -planodel sustrato mediante hilos que parecen rígidos, comose muestraen B. Casi paralelamente, comenzóa observarse el desarrollo decolonias satélites, comose muestra en B y C, sin que exista nin­guna huella de conexión a través del sustrato, entre las coloniasoriginales y las desarrolladas posteriormente.

Fenómenosequivalentes se observaron con distintas cepas crecien­do en una variedad de sulfuros metálicos.

Discusión

Las bacterias deslizantes son ,un grupo de bacterias taxonómica­mente heterogéneas y filogenéticamente provienen de raíces dife­rentes. Noobstante, hay algunas características que la mayoríade ellas tienen en común. Tienen una pared celular Gram-negativa.En varios casos se ha aislado y caracterizado un lipopolisacári­do. El deslizamiento parece estar siempre conectado con la excre­ción de un material mucilaginoso y en medio líquido las célulastienden a pegarse entre si formando nódulos o a las paredes delos recipientes de vidrio, aún en cultivos agitadoe. Estas carac­terísticas son semejantes a las de T. ferrooxidans.

Se ha argumentado que las bacterias deslizantes han evolucionadocon este tipo de movilidad comoconsecuencia de sus requerimien­tos metabólicos y de las características de los ambientes en que

- 148 —

evolucionaron (106). Por ejemplo. bacterias fototróficas se des­lizan a través de matas densas de algas en busca de luz. Los mi­croorganismos quimiolitotróficos que obtienen energia por oxida­ción de SHz, deben moverse a sitios que posean un equilibrio sa­tisfactorio entre ácido sulfidrico y oxigeno. Los microorganismosdegradativos, cuyos sustratos son macromoléculas, como celulosa,pectinas o proteinas que no difunden deben deslizarse. en ambien­tes muy secos comosuelo o madera, para alcanzar sus sustratosespecificos.

Debe tenerse en cuenta que T. ferrooxidans ha evolucionado en mi­nerales. donde sus sustratos insolubles se encuentran en bajaconcentración y en particulas dispersas en el mineral. Estas bac­terias no podrian haber evolucionado en sus hábitats naturales,si no hubieran desarrollado mecanismosde translocación en super­ficies, equivalentes a los antes descriptos.

Estos mecanismosse podrian explotar tecnológicamente. Conside­rando que los sulfuros metálicos se encuentran en forma de partí­culas dispersas en los minerales, lograr un elevado rendimientode extracción del metal implica que a1 momentode conseguir elgrado de deshidratación que permita una adhesión estable, cadapartícula deberá tomar contactó con al menosuna célula. Para es­to, se requeriría una concentración del inóculo muyelevada. Pue­den proponerse etapas alternadas de deshidratación para favorecerla adhesión estable y de humectación para disolver parcialmentelos cristales formados, y facilitar el deslizamiento bacterianohacia nuevas particulas.

Los resultados esquematizados en la Figura 54 indican que existeun rango de humedadambiental, en que son posibles tanto la adhe­sión y oxidación de sustrato comoel deslizamiento social.

- 149 ­

CONCLUSIONES GENERALES

El Thiobacillus ferrooxidans y otras bacterias biolixiviantesde

que no se encuentran sumergidos en unhu­

han evolucionado en ambientes minerales de bajo contenidoagua, o por lo menos,sistema liquido. El agua contenida en los minerales y lamedadambiental, es suficiente para su desarrollo.

desarrolloXerofi­

El requerimiento de medios deshidratados para suóptimo, permite caracterizarlas comomicroorganismoslicos.

La oxidación biológica de un sustrato sólido insoluble impli­ca una interacción célula-sustrato a través de un mecanismode adhesión. El exceso de agua dificulta o imposibilitaadhesión. Sidel sustrato hay sistemas enzimáticos involucrados, estas en­

estaen la destrucción de la estructura cristalina

zimas no deben ser diluídas ni eluidas de la zona de ataque.

En medios de baja actividad de agua, el metabolismo bacteria­no se activa disminuyendo notablemente los tiempos de genera­ción con el consecuente incremento en la velocidad de oxida­ción de sustrato. Este principio resuelve la principal barre­

procesos biohidrometalúrgicosla baja velocidad de multiplica­

ra técnico-económica que losencuentran en su aplicación:ción bacteriana.

En estas condiciones, los microorganismos que se multiplicanquedan, al menos temporalmente, ocluidos en los cristales queresultan de su actividad metabólica.

indepen­el

nitrógeno

El desarrollo microbiano en medios deshidratados sediza delsistema nitrogenasa es eficiente en la fijación de

agregado de nitrógeno amoniacal, indicando que

atmosférico. Se puede proponer que el cristal en el que lascélulas bacterianas van quedandoocluidas durante su desarro­llo, ni­provee la protección contra el oxigeno del sistema

- 151 ­

trogenasa. Esto resulta de interés tecnológico, puesto queevitaría los costos relacionados con el agregado de nitrógenoamoniacal, hasta ahora requerido en los procesos biohidrome­talúrgicos.

Cuando la relación masa de liquido a masa de sólido (L:S) esmenor de 0,15, es decir en medios cuya actividad de agua es

los iones metálicosliquidos,

La razón de ello puede residir en

óptima para la multiplicación bacteriana,que son inhibidores de T. férrooxidans en mediosdejan de actuar comotales.que 1a inhibición en condiciones de baJa actividad de agua noexiste por carencia del agua requerida para solubilizar losiones inhibidores.

La obtención de cepas de T. ferrooxidans transformadas porIngenieria Genética resistentes a los iones inhibidores, enlas nuevas condiciones de desarrollo aqui propuestas puedeperder su interés tecnológico. Noobstante, por el hecho decontar con plásmidos provenientes de especies de Thiobacillus

a inhibidorescon métodos eficientes de cultivo de T. ferrooxidans en labo­que portan resistencias múltiples metálicos,

ratorio y por la posibilidad de seleccionar transformantes enmedios que posean una relación L:S superior a 0,15, se handesarrollado condiciones más adecuadas para trabajar en unametodologia de transformación genética de T. ferrooxidans.

Se puso en evidencia la existencia en T. ferrooxidans de me­canismos de translocación en superficies, comoel desliza­

los sulfuros metá­Pe­se

miento y el lanzamiento. En los minerales,licos se encuentran finamente diseminados en particulasqueñas. Para lograr un elevado rendimiento de extracción,requiere que al menos una célula tome contacto con cada par­

- 152 ­

ticula. Para esto, es factible aprovechar la existencia deestos mecanismos para el mejoramiento de 1a tecnologia debiolixiviación.

delagua, entre los procesos tradicionales incluidos en Biohidro­En base a la relación esencialmente opuesta respecto

metalurgia y las condiciones de bio-oxidación microbiana quese han descripto, cabría proponer para el futuro el términoBiodeshidronetalurgia.

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