Fijación biológica de Nitrógeno. (Última Act. 08­02­2008) 

José Olivares Pascual (olivares@eez.csic.es) Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada 

Supuestas  las  necesidades de agua cubiertas,  el  nitrógeno es el  factor  limitante más  importante  para  el  desarrollo  de  las  plantas  que  lo  necesitan  para  formar proteínas,  ácidos  nucléicos,  etc.  Dentro  de  los  ciclos  biogeoquímicos  de  los elementos minerales, el del nitrógeno (Fig. 1) es especialmente complicado por encontrarse, en condiciones naturales, en distintos estados de valencia (de +5 a ­ 3) formando compuestos estables. 

U n o 

d e 

e s t o s 

c o mpuestos,  el  nitrato,  la  forma más  usual  tomada  por  la  planta,  es  clave  en  su nutrición y puede hallarse en el suelo derivado del contenido mineral del mismo, de aquel que se pueda  incorporar de  la atmósfera o de la biotransformación de las moleculas orgánicas que lo contienen formando parte de los restos vegetales y animales que allí  llegan o de los propios microorganismos que lo habitan. La desnitrificación, o reducción del nitrato hasta nitrógeno molecular o dinitrógeno, N2, es una actividad microbiana importante, cuantitativamente considerada y por su efecto contaminante del ambiente. Las pérdidas de nitrógeno asimilable que esta  actividad  conlleva  son  compensadas  por  la  llamada  fijación  de  nitrógeno, que se entiende como la oxidación o reducción de este elemento para dar óxidos o  amonio.  Todos  los  procesos  del  ciclo  actúan  de  forma  que  en  condiciones normales las diferentes actividades microbianas estan equilibradas y las pérdidas son  compensadas  por  las  ganancias.  La  masiva  utilización  de  fertilizantes nitrogenados está actuando sobre el ciclo con claros resultados negativos, entre ellos contribuyendo al cambio climático (Nitrógeno y cambio climático). 

La  fijación  de  nitrógeno  puede  ser  puramente  abiótica  o  biológica.  Por  la primera se  forman óxidos como consecuencia de  la combustión de compuestos

orgánicos, descargas eléctricas, etc., que son arrastrados al suelo por la lluvia, o amonio  por  el  proceso  industrial  Haber  Bosch.  Por  la  segunda,  la  fijación biológica  de  nitrógeno  (FBN),  proceso  llevado  a  cabo  por  organismos procarióticos, el N2 es reducido a amonio e incorporado a la biosfera. 

A pesar de  la abundancia de N2 en  la atmósfera (más del 70 por ciento), no es aprovechable  por  las  plantas  que  se  ven  obligadas  a  utilizar  las  formas combinadas que se encuentran en el suelo en cantidad insuficiente para soportar los cultivos intensivos. Por lo que supone en el aporte de nitrógeno a las plantas, la FBN presenta un gran interés que ha determinado que sea considerada objeto de  intensa  investigación  desde  que  en  1888  fue  descubierta,  aunque empíricamente era aprovechada ya por los romanos cuando observaron el efecto beneficioso  de  la  rotación  de  los  cultivos  (Bosquejo  histórico). No  en  vano  la fijación biológica contribuye globalmente de forma importante al suministro del nitrógeno  requerido  por  las  plantas.  El  resto  necesario  procede  casi  en  su totalidad del amonio sintertizado vía Haber Bosch con un gasto, para conseguir el H2 y la alta temperatura y presión requeridas, del 1 % de la energía consumida a nivel mundial. Hoy día la FBN cobra más valor, si cabe, dentro del contexto de la  agricultura  sostenible,  ya  que  puede  evitar  el  uso  abusivo  de  fertilizantes nitrogenados  con  el  consiguiente  ahorro  en  el  consumo  de  energía  y  la disminución de  la degradación del medio. Desde este punto de vista ecológico, también  es  interesante  señalar  la  importancia  de  la  FBN  en  el  mar  por  la necesidad  de  nitrógeno  asimilable  disponible  que  requieren  los  océanos  para actuar como sumideros del CO2 de la atmósfera. 

Este proceso microbiano es llevado a cabo por organismos procarióticos en vida libre  o  en  simbiosis,  esto  último  si  ocurre  en  asociación  mutualista  con  las plantas. Hay una gran representación de especies microbianas portadoras de esta característica pertenecientes a muy diferentes grupos de bacterias como se puede ver en la Tabla 1. 

Se trata de un proceso altamente consumidor de energía. El triple enlace que une los dos átomos de nitrógeno es duro de romper. El trabajo es llevado a cabo por la enzima nitrogenasa con el consumo de 16 moléculas de ATP por N2 reducido, según la ecuación: 

N2 + 16ATP + 8e­ + 8H+ = 2NH3 + 8H2 + 16ADP + 16Pi 

Algunos  fijadores  libres,  como  Azotobacter,  requieren  hasta  100  unidades  de equivalentes de glucosa por unidad de nitrógeno fijado. Por ello su significación agrícola es baja, que se  incrementa considerablemente en el caso de  la  fijación simbiótica,  como  la  establecida  entre  Rhizobium  y  las  leguminosa,  donde  la relación  disminuye  de  6  a  12  unidades  de  glucosa  consumidas  por  unidad  de nitrógeno  reduido.  En  este  caso,  además,  la  fuente  de  energía  son  los compuestos carbonados suministrados directamente por la planta derivados de la fotosíntesis, mientras que los fijadores libres han de tomarlos del suelo donde no existen  en  la  cantidad  y  forma  necesarias.  Así  de  hecho,  Azotobacter proporciona al suelo unos cientos de gramos de nitrógeno por hectárea/año y, en cambio,  este  valor  sube  en  la  asociación  de  Rhizobium  con  alfalfa,  trébol, guisante o soja, a unos cientos de kilos. A pesar de estas diferencias, la fijación

libre por sí sola representa a nivel global algo menos de la mitad del total de N2 fijado por año (Fig. 2), ya que la simbiótica, aunque sea más alta, está limitada a unas pocas especies vegetales, entre ellas,  las  leguminosas de gran  importancia económica y social. 

Fig.2 

Tal  limitación  es un  handicap  a  la hora  del aprovechamiento integral  de  este proceso biológico, del que quedan  fuera cultivos  tan importantes como arroz,  maíz  o trigo.  Esta  es también  la  causa de  que  se  busque la  forma  de  que estas  especies vegetales, fundamentales  en alimentación humana, puedan llegar a utilizar el N2 y hacerse independientes de su aplicación como fertilizante. 

Junto al interés que esta posibilidad tiene y que ha determinado la dedicación de numerosos  grupos  a  su  estudio,  dos  hechos  han  determinado  el  avance  de  los conocimientos sobre la FBN desde los años 70. Por un lado, la introducción para su  detección  y  medida  de  la  técnica  de  la  reducción  de  acetileno  a  etileno (ARA), basada en la capacidad de la nitrogenasa de reducir compuestos de triple enlace (algo sobre evolución) y, por otro,  la aplicación a las  investigaciones en curso de las herramientas propias de la biología molecular. 

La  determinación  de  ARA  permitió  hacer  medidas  de  la  actividad  enzimática fidedignas  con  un  simple  cromatógrafo  de  gases,  eliminando  la  nunca  precisa observación del crecimiento bacteriano en medios de cultivo libres de nitrógeno o la poco asequible espectrometría de masas para determinar la incorporación de 15N2. Esta última técnica es muy usada en los experimentos que se realizan para conocer  el  nitrógeno de  la  planta  que procede de  la  atmósfera  o  del  suelo  y/o fertilizante aplicado, especialmente en ensayos de campo. 

Los estudios genéticos, por otra parte, demostraron  la  implicación directa en  la fijación de unos veinte genes, nif, en el caso de  los fijadores  libres (Figura 3  y regulación)  y de  bastantes más en  los  simbióticos, como Rhizobium, ya que  el establecimiento  de  la  simbiosis  mutualista  con  la  planta  conlleva  una complicación  adicional.  En  la  Fig.  3  se  muestran  los  genes  nif  de  Klebsiella

pneumoniae, enterobacteria capaz de fijar N2 en anaerobiosis. Las asequibilidad de  esta  bacteria  y  la  especial  distribución  de  esos  genes  en  su  genoma  ha facilitado considerablemente el estudio molecular del proceso y la transferencia de los conocimientos a otros sistemas fijadores. 

Fig.3

Aunque  todos  los  organismos  y  sistemas  fijadores  son  susceptibles  de  ser aprovechados  en  agricultura,  y  de  hecho  se  puede  encontrar  en  la  bibliografía referencias  al  respecto,  hay  algunos  más  útiles  que  otros,  no  sólo  por  la eficiencia  del  proceso  y  por  los  niveles  de  nitrógeno  que  incorporan,  sino también, por el interés de los cultivos susceptibles de ser tratados. Los sistemas potencialmente más útiles, como se ha dicho arriba, implican, de una forma más o menos  íntima,  un  hospedador  con  el  que  la  bacteria  establece  la  asociación beneficiosa. 

Entre ellos, un primer  sistema recoge  lo que se  llaman  rizocenosis asociativas, por no  formarse en  la asociación microbio­planta estructuras especializadas en las  raíces. Entre estas asociaciones  se encuentra  la  formada por plantas C4 del tipo  maíz  o  caña  de  azucar  y Gluconacetobacter, Azoarcus, Herbaspirillum  o Azospirillum. Aquí la bacteria fija nitrógeno a expensas del exudado radical que aprovecha muy bien al colonizar los espacios intercelulares del cortex de la raíz. Aunque  estas  asociaciones  han  dado  mucho  que  hablar,  pues  se  ha  asociado siempre  la mayor  producción  vegetal  a  la  fijación  de N2,  por  lo menos,  en  el caso de Azospirillum, está demostrado que el efecto beneficioso de la asociación es  debido  mayoritariamente  a  la  capacidad  que  posee  la  bacteria  de  producir fitohormonas  que  determinan  un  mayor  desarrollo  del  sistema  radical  y,  por tanto,  la  posibilidad  de  explorar  un  volumen  más  amplio  de  suelo.  Así  como Rhizobium  está  evolutivamente  especializado  en  proporcionar  nitrógeno  a  la

planta  cuando  se  encuentra  asociado  a  ella  (las  formas  bacterianas  que  fijan nitrógeno en los nódulos, los llamados bacteroides, no se multiplican por lo que todo el nitrógeno fijado es traspasado al hospedador), el N2 que fijan estas otras bacterias  no  es  exportado  y  solamente  puede  ser  aprovechado  después  de  su muerte y lisis y una vez que haya sido mineralizado. Pero, aunque estas bacterias no se puedan usar en la práctica como fijadoras, hay estudios que demuestran su utilidad  en  inoculaciones  conjuntas,  con  Rhizobium  o  solas  como  PGPRs (rizobacterias que promueven el crecimiento vegetal). 

En un segundo sistema intervienen cianobacterias y algunas plantas entre las que ciertos helechos, como Azolla (Figura 4a), pueden jugar un papel importante en la  fertilización  de  los  cultivos  de  arroz.  Aunque  las  cianobacterias  estan provistas  de  fotosíntesis  oxigénica  han  desarrollado  estrategias  especiales dirigidas a  la convivencia de  la  fijación, proceso anaerobio, con la  fotosíntesis. En  unos  casos,  algunas  células  vegetativas  se  diferencian  en  ausencia  de nitrógeno combinado en los llamados heteroquistes donde no hay fotosíntesis y sí  fijación de nitrógeno (Figura 4b y 4c). Los niveles de nitrógeno aportados a estos  cultivos  pueden  hacer  al  arroz  bastante  independiente  de  la  fertilización nitrogenada.  La  práctica  de  la  utilización  de  este  sistema  es  frecuente especialmente  en  el  Sudeste  asiático.  En  otros  casos,  como  en  Gleothece  o Synechococcus,  la  fijación  y  la  fotosíntesis  estan  separadas  temporalmente, realizandose la fotosíntesis de día y la fijación en la noche. Fig.  4a Fig.4b  Fig.  4c 

Dentro  de  un  tercer  sistema,  que  encuadra  las  endorrizobiosis  mutualistas,  se encuentran  la  conocida  como  actinorriza,  que  se  establece  entre  Frankia,  un actinomiceto,  y  algunas  plantas  leñosas,  como  el  aliso  o  la  casuarina,  y  la asociación Rhizobium­leguminosa  que,  como  se  ha  indicado más  arriba,  es  la que tiene más  importancia desde el punto de vista agronómico. Ha sido y es  la más  estudiada  y  se  toma  como  modelo  para  una  posible  extensión  de  la capacidad  fijadora  a  otros  cultivos.  Adicionalmente,  el  papel  del  uso  de leguminosas arbustivas en la recuperación o regeneración de suelos degradados es de reseñar y donde las micorrizas tienen también una gran importancia. 

Si  bien  estas  bacterias,  de  la  subclase  a  de  las  proteobacterias,  se  engloban colectivamente bajo el término genérico de Rhizobium, pertenecen a los géneros

Rhizobium,  Sinorhizobium,  Allorhizobium,  Bradyrhizobium,  Mesorhizobium  y Azorhizobium (Tabla 2). 

La mayoría de las especies de la familia Leguminosae forman esta asociación, y es especialmente  frecuente en  las subfamilias Papilionoideae y Mimosoideae  y escasa  en Cesalpinoideae.  En  las  raíces  de  estas  plantas  aparecen  cuando  son infectadas  por  Rhizobium  unas  tumoraciones  de  distinta  forma  y  tamaño, nódulos (Figura 5), donde se lleva a cabo la fijación de N2. Fig.5 

En unos pocos ejemplos (en las leguminosas Sesbania y Aechynomene) también se  forman  nódulos  en  los  tallos.  Algunas  de  las  bacterias  son  bastantes específicas con posibilidad de infectar y nodular un reducido número de especies vegetales. Otras son más promiscuas. En cualquier caso, la capacidad de infectar las células del cortex de  la raíz se deriva de un  intercambio de señales entre el microsimbionte y el hospedador. Flavonoides exudados por las plantas inducen la expresión en Rhizobium de los genes nod (Figura 6) implicados en la síntesis de los conocidos como factores de nodulación o, simplemente, factores nod. 

En  lineas  generales,  cada  leguminosa  libera  al  medio  unos  determinados inductores (p. e. la alfalfa, luteolina y la soja genisteina) que la bacteria reconoce y la lleva a sintetizar el factor nod correspondiente, que está constituido por un esqueleto  de  4  a  5  N­acetil  glucosaminas  con  bastantes  sustituciones  que determinan  la  especificidad.  Estos  factores,  que  se  conocen  también  por  su composición  como  lipoquitooligosacáridos  (LCOs), determinan modificaciones en  los  pelos  radicales,  la  formación  del  canal  de  infección  y  la  división  de células  del  cortex,  que  conducen  a  la  formación  del  nódulo  en  cuyo  interior, perfectamente estructurado, se va a llevar a cabo la fijación (Fig. 7).

Al  nódulo  llega  el  fotosintetizado,  en  forma  de  sacarosa,  para  soportar  el proceso. Servirá de fuente de energía, poder reductor y esqueleto carbonado para la  incorporación del amonio resultante de  la  fijación, que será transportado por el  xilema  al  resto  de  la  planta  en  forma  de  amidas  o  ureidos,  según  el hospedador  sea  de  origen  templado  o  tropical  (Fig.  8).  Aunque  por  mucho tiempo  se  ha  creido  que  el  amonio  producido  era  transferido  a  la  célula

hospedadora por simple difusión pasiva, y así muestra esta figura, se ha descrito que tan pronto como el amonio aparece se convierte en alanina y de esta forma es  transportado  fuera  de  la  bacteria.  ¿Por  qué  alanina?  Se  especula  que  esto impide  la  utilización  del  amonio  por  la  propia  bacteria.  Una  vez  fuera  este aminoácido  es  convertido  rápidamente  en  glutamato  para  su  transporte  como amidas  y/o  ureidos  al  resto  de  la  planta.  Sin  embargo,  la  implicación  de  la alanina,  aunque  llamativa,  es  una  hipótesis  actualmente  muy  controvertida (metabolismo del carbono y nitrógeno en el nódulo). 

Esta fijación simbótica puede considerarse bastante eficiente, sin embargo, parte de la energía consumida en el proceso se gasta en reducir protones a hidrógeno, (como  se  puede  ver  en  la  ecuación  mostrada  al  comienzo),  reducción concomitante  con  el  paso  de  N2  a  amonio,  que  hace  que  la  fijación  sea  un teórico  25  por  ciento  menos  eficiente.  Hay  cepas  microbianas  provistas  de hidrogenasa capaces de reciclar el hidrógeno y recuperar la energía perdida, y a otras se les podría transferir los genes responsables de este caracter. 

Entre  los  numerosos  genes  de  la  planta  que  de  una  u  otra  manera  están relacionados  con  la  simbiosis,  y  descritos  especialmente  en Lotus  japonicus  y Medicago  truncatula,  leguminosas  que  se  han  tomado  como  modelo  dado  su simplicidad  genómica,  hay  algunos  de  función  conocida,  como LjSYMRK/MtNORK/DMI2,  que  codifican  una  quinasa  que  inicialmente  se pensó podría ser el receptor de la señal bacteriana, o PsSYM8/DMI1 implicados en  los pulsos de calcio. Algunos de estos genes tienen que ver en  la  formación de  las  micorrizas.  También  se  han  descrito  otros  genes,  como  HAR1  (en  L. japonicus),  Sym29  (Pisum  sativum)  o  NARK  (soja)  que  codifican  proteínas homólogas  a CLAVATA1 de Arabidopsis. Estos  genes  estan  implicados  en  la regulación  de  la  nodulación,  en  lo  que  se  conoce  como  autorregulación,  que limita el número de nódulos que se pueden formar en las raíces. Es curioso que mientras  la  expresión  de  CLV1  tiene  un  efecto  a  corta  distancia,  sobre  el 

Fig. 8. Esquema de funcionamiento de un nódulo

crecimiento apical del  tallo,  la expresión de  los otros,  si  bien ocurre en  tallo  y hojas, se manifiesta a larga distancia sobre la formación de primordios de raíces laterales y nódulos. Mutantes en estos genes son hipernodulantes,  lo que no es útil para la planta teniendo en cuenta la limitación energética a que está sometida la  fijación. Un paso  importante  supuso  la  obtención  del  primer mutante  de M. truncatula  que  no  responde  al  factor  nod  con  la  deformación  de  los  pelos radicales  ni  flujo  de  calcio.  Este  mutante  (npf)  es  capaz,  sin  embargo,  de establecer simbiosis con hongos de la micorriza, por  lo que el  locus NPF (Nod Factor  Perception)  está  implicado  de  forma  específica  en  la  percepción  del Factor  nod,  al  contrario  que  otros  descritos  previamente  comunes  a  ambas simbiosis  (DMI1,  DMI2,  DMI3)  responsables  de  la  transducción  de  la  señal. Estos genes necesarios para la percepción de los factores nod se conocen como NFR1, NFR5, en L.  japonicus  y LYK3 y LYK4  en M.  truncatula,  y codifican quinasas  transmembranas  del  tipo  LysM  serina/treonina  cuyos  dominios extracelulares  podían  ligar  dichos  factores.  La  Fig.  9  representa esquemáticamente algunos de los genes implicados en el proceso de nodulación descritos  hasta  ahora.  Esta  representación  (para  más  detalles  ver  Fig.  14  de Futuro  de  la  FBN)  no  es  una  foto  fija  pues  de  vez  en  cuando  se  incorporan nuevos genes a la cadena. 

La  secuenciación  a  punto  de  concluir  de  los  genomas  de  L.  japonicus  y M. truncatula facilitará considerablemente las cosas, de tal forma que se podrá tener idea de los genes que están ausentes o no se regulan adecuadamente en plantas no leguminosas de interés agronómico, para que sean capaces de establecer una simbiosis efectiva con Rhizobium y así hacerse independientes de la fertilización nitrogenada. Hay  otras  luces  en  el  túnel:  la  observación  de  que  los  factores  nod  pueden activar  el  gen  MtENOD12,  que  codifica  una  nodulina  temprana  de  M. truncatula, en plantas transgénicas de arroz (Oryza sativa) sugiere también que al menos parte de los mecanismos de percepción/transducción pueden operar en plantas  no  leguminosas.  De  hecho,  Rhizobium  es  capaz  de  nodular  la  no leguminosa Parasponia andersonii, perteneciente a  las ulmaceas. Hay  también muchas  similitudes  entre  el  proceso  de  floración  y  nodulación,  incluso  en  el desarrollo del canal de  infección en su marcha hacia el primordio nodular  y el tubo polínico en su avance hacia el óvulo. Se puede afirmar que la nodulación ha utilizado  mecanismos  preexistentes  en  las  plantas  que  han  derivado  a  la simbiosis Rhizobium­leguminosa a lo largo de la evolución. Recientemente se ha descrito, incluso, que no todas las bacterias que fijan nitrógeno en simbiosis con las leguminosas requieren la producción de factores nod. La activación de genes de  la  planta  implicados  en  el  reconocimiento  de  las  citoquininas  lleva igualmente a la formación de nódulos.

Fig. 9 

Esta  simbiosis  mutualista,  que  se  puede  tomar  como  paradigma  de  la aplicabilidad de  la  fijación de  nitrógeno, es  la que presenta mayor  interés a  la hora de hablar de biofertilización, t érmino que se define como la utilización de microorganismos  vivos  para  mejorar  el  crecimiento  de  las  plantas,  bien incidiendo  sobre  su  nutrición  a  través  de  la  puesta  a  su  disposición  de  los nutrientes  requeridos,  bien  actuando  sobre  su  desarrollo  por  la  producción  de fitohormonas. En paralelo se utiliza biocontrol y biorremediación cuando con la inoculación  de microorganismos  se  quiere  eliminar  los  patógenos  del medio  o incrementar  la  respuesta  defensiva  de  la  planta  hacia  ellos  o  eliminar compuestos  xenobióticos  del  ambiente,  respectivamente.  La  utilización  de inoculantes para las leguminosas es fundamental si la especie vegetal no ha sido cultivada en ese suelo y, por tanto, no hay presencia de la especie de Rhizobium correspondiente. Este es el caso de la soja en Europa que ha de ser inoculada con B. japonicum o S. fredii. Sin embargo, aún cuando existen en nuestro suelos las bacterias  apropiadas  para  vicias,  alfalfa,  tréboles,  guisante,  lenteja,  garbanzo, etc., no siempre son lo suficientemente efectivas, esto es fijadoras de nitrógeno, y  hay  casos  en  los  que  se  hace  necesaria  la  inoculación  si  se  quieren  obtener rendimientos  satisfactorios.  Lo  mismo  ocurre  cuando  las  características  del suelo, como la acidez, sequía, etc. influyen en la persistencia de Rhizobium. En las Fig. 9 y 10 se exponen ejemplos de inoculación a distintas escalas.

Fig.10 

Fig.11 

Las  leguminosas  que nodulan  nunca  se  encuentra  en  condiciones  naturales  sin formar  la simbiosis con sus bacterias presentes en el medio. En un suelo donde no  sea  posible  la  infección  de  la  planta  por  ser  una  especie  vegetal  nueva implantada en el lugar, el rendimiento del cultivo no es superior al 40 por ciento potencial. Con  la  inoculación  se puede  llegar  hasta el 80 por ciento, el 20 por ciento  restante  sólo  se  conseguirá  con  manipulación  genética  y  el  manejo adecuado de  la  simbiosis. Los  intentos de utilizar  fertilizante nitrogenado para incrementar  el  rendimiento,  aparte  del  costo  económico  que  supone,  inhibe  el establecimiento de una  simbiosis efectiva  y, por  tanto, el  aprovechamiento del N2.  No  hay  que  desconocer  que  la  FBN  está  sometida,  por  diferentes mecanismos, a una estricta regulación por nitrógeno combinado en el medio. La nutrición nitrogenada de las leguminosas es, por otra parte, más complicada que en  otras  plantas.  La  aplicación  de  nitrógeno  en  forma  de  nitrato  o  amonio  no mejora el rendimiento frente a  la  fijación. Determina un alargamiento del ciclo vegetativo que puede  redundar en una drástica disminución de  la cosecha. Las leguminosas no han sido mejoradas en este sentido, al contrario que los cereales. La  capacidad del  trigo  silvestre  para  usar  nitrógeno  es muy  reducida,  sólo  los cultivares  modernos  dan  una  respuesta  proporcional,  entre  ciertos  límites,  al nitrógeno  aplicado.  El  suministro  continuado  de  nitrógeno  derivado  de  la fijación  va  cubriendo  las  necesidades  del  hospedador,  por  lo  menos  hasta  la fructificación,  cuando  el  fotosintetizado  en  lugar  de  ir  hacia  la  raíz  deriva  al llenado del fruto. Una práctica útil con buenos resultados es aplicar en floración nitrógeno  combinado  de  rápida  absorción.  En  este  momento  el  nitrogeno aplicado no tiene efecto negativo sobre la fijación porque ésta ya se ha detenido por falta de fuente energética y los nódulos han entrado en senescencia. 

En  el  caso  concreto  de Rhizobium,  los  inoculantes  deben  de  estar  constituidos por  cepas  seleccionadas  por  su  infectividad,  competitividad  (posibilidad  para

nodular  en  presencia  de  las  cepas  nativas  normalmente menos  funcionales),  y capacidad  para  fijar  nitrógeno  en  simbiosis  con  la  especie  vegetal correspondiente.  En  todos  los  inóculos,  sean  del  tipo  que  sean,  sería  además deseable,  que  las  cepas  que  los  constituyen  estuvieran  provistas  de  alguna estrategia por la que desaparecieran del ambiente una vez cumplida su mision o se  impidiera  la  transferencia  genética  horizontal  para  salvaguardar  la biodiversidad  de  la  microbiota  del  medio.  La  eliminación  del  inóculo  o  el control  de  la  transferencia  genética  deben  ser  tenidas  en  cuenta fundamentalmente  cuando  se  trate  de  inoculantes  preparados  con  organismos modificados genéticamente (OMG), obtenidos con vistas a incrementar algunas de sus propiedades. En el caso de Rhizobium, por ejemplo, la capacidad de fijar nitrógeno  de  una manera  más  eficiente  (por  la  presencia  de  hidrogenasa)  o  la resistencia  a  condiciones  adversas:  salinidad,  sequía,  pH  bajo,  presencia  de pesticidas, etc. (ver Futuro de la FBN) 

En  esta  simbiosis  mutualista  tampoco  hay  que  olvidar  la  planta. Aunque más difícil  de  estudiar  que  la  bacteria,  ya  se  conocen  genes  del  hospedador directamente  implicados  en  el  establecimiento  de  una  simbiosis  efectiva  con Rhizobium, así como algunas de  las proteínas,  llamadas  nodulinas, codificadas por  ellos.  Mutaciones  en  muchos  de  estos  genes,  conocidos  como  Sym, bloquean  la  nodulación  en  diferentes  etapas  de  su  desarrollo,  y  unos  cuantos parecen ser comunes con la micorrización. Todos estos conocimientos se aplican a conseguir la extensión de la capacidad fijadora a otras plantas no leguminosas de  interés.  Junto a  la alternativa de  lograr que el maíz, el  trigo o el arroz sean infectados  de  forma  eficiente  por  Rhizobium,  se  presenta  la  posibilidad  de transferir  la capacidad fijadora a estas plantas de tal forma que sean capaces de aprovechar  el  N2  por  sí  mismas.  Todavía  hay  que  salvar  muchos  obstáculos, tanto  en  una  como  en  otra  variante,  pero  no  es  aventurado  afirmar  que  es cuestión  de  tiempo. Hay que decir,  sin  embargo,  que no  todo  es óptimo  en  la obtención de plantas autosuficientes para el nitrógeno, pues aunque los cultivos no  tendrían  que  ser  fertilizados  serían  menos  productivos.  El  costo  energético que supone la fijación llega a ser hasta tres veces más alto que la utilización del nitrato por lo que  las plantas crecerían menos, el rendimiento sería más bajo  y puede que  incluso se  redujera el área de cultivo, pero esa  independencia de  la fertilización  nitrogenada  haría  el  cultivo  posiblemente más  rentable,  adecuado para  zonas  economicamente  débiles  y  ambientalmente  más  limpio (Perspectivas). 

Mientras  tanto  y  como  resumen práctico,  la  selección  de  cepas  y  su  adecuada manipulación genética para preparar los inoculantes más idoneos y la mejora de la  planta  para  que  no  sea  factor  limitante  en  el  establecimiento  de  la correspondiente simbiosis, son objetivos a corto plazo. 

Recientemente se ha descrito que especies de Methylobacterium, Burkholderia y Ralstonia  (hoy  día  Wautersia)  entre  otras β  proteobacterias,  pueden  nodular leguminosas tropicales y establecer con ellas simbiosis efectivas. Este hallazgo, todavía  por  explotar,  parece  interesante  por  lo  que  puede  suponer  para  la ampliación  natural  de  las  simbiosis  fijadoras  a  otros microorgansmos  distintos de Rhizobium, y quién sabe, si con eso facilitar la extensión de esta característica a otras especies vegetales fuera de la leguminosas.

Bibliografía para consultar: 

­ González­López, J. Lluch, C. Interacción planta­ microorganismo: metabolismo del nitrógeno. Ed. Rueda SL. Madrid. 1992. ­ Leigh, G.J. Nitrogen fixation at the millennium. Elsevier Science. London, RU (2002) ­ Morot­Gaudry, J.F. Nitrogen assimilation by plants. Physiological,biochemical and molecular aspects. Science Publisher Inc. Plymouth, RU, 2001. ­ Postgate, J. Nitrogen Fixation, Cambridge University Press, Cambridge, RU, 1998. ­ Spaink, H.P., Kondorosi, A., Hooykaas, P.J.J. The Rhizobiaceae, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Holanda. 1998. ­ Sprent, J.I. Nodulation in legumes. Royal Botanic Gardens, Kew, RU. 2002. ­ Triplett, E.W. Prokaryotic Nitrogen Fixation, Horizon Scientific Press, Wymondham, Norfolk, RU, 2000. ­ Leigh, G.J. The world's greatest fix: a history of nitrogen in agriculture. Oxford University Press. 2004 . ­ Palacios, R. , Newton, W.E. Genomes and genomic of nitrogen fixing organisms. Springer, Dordrecht, Holanda. 2005. ­ Bedmar, E.J., González, J., Lluch, C., Rodelas, B. Fijación de nitrógeno: Fundamentos y aplicaciones. Sociedad Española de FijacióndeNitrógeno (SEFIN), Granada 2006. ­ Jones. K.M., Kobayashi, H., Davies, B.W., Taga, E., Walker, G.C. How rhizobial symbionts invade plants: the Sinorhizobium­Medicago model. Nature Rev. 5, 619­633 (2007) ­ Sprent, J.I. Evolving ideas of legume evolution and diversity: a taxonomic perspective on the occurrence of nodulation. New. Phytol. 174, 11­25 (2007) 

En España  este  proceso  biológico  es  estudiado  bajo  diferentes  puntos  de  vista por varios grupos: en el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Centro de  Ciencias  Medioambientales,  Estación  Experimental  Aula  Dei,  Estación Experimental  del  Zaidín,  Instituto  de  Bioquímica  Vegetal  y  Fotosíntesis, Instituto  de  Recursos  Naturales  y  Agrobiología  de  Salamanca),  en  las Universidades:  Autónoma  de  Madrid  (Dpto.  de  Biología),  Córdoba  (Dpto  de Bioquímica  y  Biología  Molecular),  Granada  (Dptos.  de  Biología  Vegetal  y Microbiología), La  Laguna  (Dpto. Microbiología  y Biología Celular), Navarra (Dpto. de Fisiología Vegetal), Politécnica de Madrid  (Dpto. de Biotecnología), Pública de Navarra (Dpto. de Ciencias del Medio Natural), Salamanca (Dpto. de Microbiología),  San  Pablo  (CEU),  Sevilla  (Dptos.  de  Microbiología  y Parasitología y de Microbiología), CIFA (Las Torres y Tomejil).

Enlaces de interés: 

www.toulouse.inra.fr/6enfc www.ugr.es/~eianez/ www.chasque.net/microlab/ www.cifn.unam.mx www.fund­culturadepaz.org www.ugr.es/local/sefin 

Agradecimientos:  se  agradece  la  colaboración  de  los  miembros  del  Grupo  de Investigación, de Francisco Gutiérrez, de la asistencia de Francisca González y, especialmente la de Javier de la Fuente, webmaster de esta página. 

Fuente: 

http://www.eez.csic.es/~olivares/ciencia/fijacion/index.html