Informe técnico final de Proyecto. Febrero 2005 - Enero 2006

Clave del Proyecto: 20050123

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

ANÁLISIS MOLECULARES DE Helicobacter pylori POR PCR MÚLTIPLE, GENOTIPOS METALOPROTEASAS, RESISTOTIPOS EN PATOGÉNESIS

BACTERIANA Resumen

El protocolo se cubrió en 100% de sus metas, hay una colección de cepas de Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Enterococcus spp, se desarrollo experiencia en las pruebas de PCR, tanto sencilla como multiplex, se están diseñando iniciadores para obtener una buena reproducibilidad y programas ajustados que sirven para obtener las PCR sin bandas no específicas. Los patrones fenotípicos obtenidos de sensibilidad antimicrobiana en Haemophilus influenzae y Enterococcus spp coinciden con lo obtenido por PCR, se obtienen buenos resultados, hay desarrollo tecnológico adecuado, aplicado tanto a métodos fenotípicos como genotípicos que permiten apoyar el diagnóstico y abren nuevas líneas de investigación. La amplificación del gen glmM por PCR, sirve en el diagnóstico de H. pylori ya que es un gen constitutivo, que codifica para una proteína enzimática (fosfoglucosamina mutasa) que participa en la síntesis de pared celular. Se desarrolló un análisis molecular de Helicobacter pylori por medio de PCR múltiple para genes asociados a virulencia babA2, vacA y cagA, ahora es posible separar a las cepas virulentas triple +. El análisis del genoma completo de H. pylori, demostro la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica para una metaloproteasa con un átomo de zinc. Se cuantificó la actividad de metaloproteasas de H. pylori; Los genotipos en relación con el origen geográfico, se asocian al polimorfismo en Helicobacter pylori y señalan que hay variaciones genotípicas de cepas mexicanas, que pudieran estar asociadas a la diversidad geográfica según demuestran los árboles filogenéticos obtenidos. Se estandarizo el ensayo de quimiotaxis en la cámara de Boyden con citometría de flujo para el conteo de células y la identificación del tipo de leucocitos por medio de fluorocromos, esta metodología es la primera vez que se hace y va aportar mucha información en el aspecto inmunológico, ya que no había sido descrita. En tejidos maternos infectados por estreptococo del grupo B, se observo que hay liberación de quimiocinas proinflamatorias, por células de la decidua y posiblemente, ahí, la respuesta inflamatoria de los tejidos gestacionales. U. urealyticum en semen produce alteraciones, en varones infectados; principalmente reducción en la movilidad, alteraciones morfológicas, con disminución en la cuenta espermática e incapacidad de llevar a cabo la fertilización in Vitro se observo este tipo de unión con microscopia confocal .respecto a los productos eso se observa en la ficha de productividad.

Introducción. I. Analisis moleculares de las cepas clinicas de Helicobacter pylori. Helicobacter pylori es un microorganismo Gram-negativo microaerofílico espiral, que coloniza la mucosa gástrica; asociado a gastritis crónica (GC), cáncer (CaG), úlcera péptica (UP) y linfoma tipo MALT. La infección por H. pylori inicia en la infancia y persiste durante la vida adulta. El ambiente ácido del estómago evita la colonización por otros microorganismos. H. pylori se establece por diversos factores de virulencia como: mucinasas, lipopolisacáridos, flagelos, y por la enzima ureasa, la cual hidroliza a la urea para producir amonio y CO2; el amonio producido neutraliza el ácido gástrico y favorece la colonización, aunque hay cepas ureasa negativas fenotípicamente. La amplificación del gen glmM por PCR sirve en el diagnóstico de H. pylori ya que es un gen constitutivo, que codifica para una proteína enzimática (fosfoglucosamin mutasa) que participa en la síntesis de pared celular. Las diferencias genotípicas de Helicobacter pylori, han permitido su clasificación en dos grupos de acuerdo a la presencia de los genes: vacA y cagA, relacionados con la patogenicidad de la bacteria y con la asociación de enfermedad además de clasificarse en función de marcadores de virulencia y el curso clínico de la infección: Cepas tipo I. Cepas de Helicobacter pylori que poseen el gen cagA y expresan una citotoxina funcional (vacA). Cepas tipo II. Cepas de Helicobacter pylori que perdieron el gen cagA y expresan una citotoxina (vacA) no funcional. Actualmente, se ha demostrado que la presencia genotípica de babA2, vacAs1 y cagA (cepas triples-positivas), que muestran una correlación significativamente alta con la prevalencia de úlcera y adenocarcinoma; lo cual indica la relevancia clínica del gen babA2 como un indicador útil de riesgo para desarrollar enfermedad gástrica. Por otra parte, el gen OipA, induce la producción de interleucina 8 (IL-8) in vitro e in vivo. La expresión de la proteína OipA, se altera por cierto número de dinucleótidos repetidos CT en la región 5 del gen oipA y modifica las características virulentas de la bacteria. La variabilidad en genotipos, parece tener relación con el origen geográfico de los aislamientos, dando un modelo de dispersión asociado al polimorfismo propio de esta bacteria, pero aún está incompleto en México; por eso, se planteó un estudio para conocer la distribución de diferentes genotipos. Algunos de éstos tienen alterada sus secuencias o están compuestas de multitud de pedazos cromosómicos procedentes de diferentes cepas originales. El análisis del genoma completo de H. pylori, demostro la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica para una metaloproteasa con un átomo de zinc. Las metaloproteasas son enzimas que actúan sobre diferentes sustancias de la matriz extracelular, y tienen zinc en su estructura; ésta familia de enzimas tiene más de 24 miembros, que se agrupan dependiendo de los sustratos que afecten o de sus dominios estructurales. Por ejemplo, las colagenasas degradan colágeno fibrilar, las gelatinasas muestran una actividad elevada frente al colágeno desnaturalizado, y las estromelisinas degradan componentes no colágenos de la matriz extracelular. Los fragmentos de las proteínas de la matriz resultantes de la proteólisis por metaloproteasas, median la quimiotaxis de células distales; los fragmentos de elastina degradada por la metaloelastasa de macrófago son quimiotácticos para monocitos, por retroalimentación positiva, se puede perpetuar la acumulación de macrófagos y el infiltrado bronquial, lo cual genera el ambiente inflamatorio apropiado para la destrucción progresiva como ha sido demostrado en tejido pulmonar

II. Mycoplasma spp e infección perinatal. Ureaplasma urealyticum mide 0.5 Um, con morfología esférica, o bien formas filamentosas de 2 Um de largo por 0.05- 0.3 Um de ancho; afecta al humano e hidroliza la urea, pero no metaboliza la arginina y es no fermentativo. Los micoplasmas urogenitales en infertilidad masculina son un tema controvertido; la presencia de U. urealyticum y/o Micoplasma hominis en semen de personas asintomáticas puede ser para algunos de poca importancia clínica, pero coloniza la uretra masculina hasta en un 60%. U. urealyticum en semen produce alteraciones, y otros, han reportado que apoyan la asociación de U. urealyticum y/o M. hominis con alteraciones en los parámetros espermáticos de varones infectados; principalmente reducción en la movilidad, alteraciones morfológicas, con disminución en la cuenta espermática e incapacidad de llevar a cabo la fertilización in vitro. El control del proceso normal de degradación del tejido conectivo que termina con RPM y la ruptura de las membranas fetales durante el trabajo de parto, tiene al menos dos características: 1) se encuentra compartamentalizado al entorno del corioamnios y 2) está sincronizado con otros eventos del parto hay cambios cervicales y contracciones del miometrio. Es indispensable la caracterización del microambiente que coordina la activación de estos tejidos, para entender los procesos que participan en la RPM en condiciones fisiológicas, como patológicas. A diferencia de Mycoplasma penetrans, no se ha determinado si U. urealyticum libera endonucleasas, con actividad citotóxica y muerte celular programada (apoptósis) y con pérdida de la refringencia al microscopio de contraste de fases. Es por ello, que en modelo con espermatozoides y con microscopia confocal aporta datos acerca de su papel en infertilidad y RPM. Las quimiocinas presentes en el embarazo y en trabajo de parto humano, son poco conocidas, principalmente en ausencia de infección. El estudio de los mecanismos de patogenicidad de las infecciones intrauterinas asociadas al trabajo de parto pretérmino, se sabe que las citocinas en líquido amniótico están elevadas, como: IL-1a, TNF-a, IL-6, IL-8 y MIP-1-a y se cree que éstas dos últimas, son mediadores tempranos de la respuesta inflamatoria a la infección hay atracción o activación de diferentes células inmunológicas efectoras en los sitios de inflamación. En tejidos maternos infectados por estreptococo del grupo B, se ha observado que hay liberación de quimiocinas proinflamatorias, por células de la decidua y posiblemente, ahí, comienza la respuesta inflamatoria de los tejidos gestacionales. El ácido araquidónico y otros metabolitos se liberan por macrófagos y otras células del amnios, corion y decidua con efecto uterotónicos. La producción de quimiocinas representa un eslabón bioquímico entre: la infección bacteriana, los cambios cervicales y la actividad uterina. III. Resistotipos: Los enterococos producen infecciones nosocomiales, incluyendo bacteremia, endocarditis e infecciones intra-abdominales y del tracto urinario. Enterococcus faecalis ha sido la especie enterocóccica predominante, del 80 al 90% de todos los aislamientos clínicos, y Enterococcus faecium del 5 al 15 %. Otras especies de enterococos (E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans, E. avium, y E.raffinosis) han sido aisladas con menos frecuencia, menos del 5 % de los aislamientos clínicos. causa común de infecciones urinarias. Sobrevive en el medio ambiente del hospital por su resistencia intrínseca a varios antibióticos, debido a mutaciones o por adquirir material genético.

La resistencia a aminoglucósidos, cefalosporinas y clindamicina puede ser de bajo grado. Existe resistencia a antibióticos betalactámicos, glucopéptidos, macrólidos. Se ha observado que existen dos mecanismos de resistencia a estreptomicina presentes en enterococos: I) nivel de resistencia moderada (MIC, 62 a 500 Ug/ml) debido a su baja permeabilidad y II) nivel de resistencia alta (MIC, 2,000 Ug/ml), mediada por ribosomas, con producción de enzimas que inactivan a los aminoglucósidos. Las pruebas de susceptibilidad a gentamicina son de utilidad para predecir la resistencia a otros aminoglucósidos, excepto a estreptomicina. La resistencia a estreptomicina se debe a la síntesis de estreptomicin-aciltransferasa, sin embargo, aún es susceptible a gentamicina. El sinergismo penicilina-aminoglucósidos, no se presenta en enterococos ésto dificulta la terapia en infecciones enterocócicas. La resistencia a vancomicina y aminoglucósidos debe estudiarse en cepas mexicanas ya que poco es lo que se conoce acerca del mecanismo involucrado de aislamientos clínicos. Haemophilus influenzae descrito por Pfeiffer; el serotipo b (Hib) de Pittman es el más virulento y se ha frenado por la vacuna, pero hay cepas no tipificables (HiNT). En 1990 se probó una vacuna conjugada, la cual ha disminuido la incidencia por Hib, sin embargo se han incrementado las infecciones por HiNT , ademas de existir resistencia a antibióticos beta- lactámicos. Haemophilus influenzae (Hi) es una bacteria causante de enfermedades sistémicas debidas al serotipo b (Hib) y localizadas que se relacionan con cepas no tipificables (NTHi). Diversos autores mencionan la prevalencia tanto de cepas productoras de beta- lactamasas como no productoras; por ejemplo: en E.U.A. se encontró un 40% de cepas productoras de beta- lactamasas y 13% de cepas no productoras de beta-lactamasas de baja resistencia a ampicilina (low-BLNAR), pero no BLNAR. En Grecia Dimopoulou y cols 2002 determinaron la presencia de un plásmido conjugable que está presente en distintas regiones del mundo y confiere resistencia a ampicilina. En México no se conoce del todo si el principal mecanismo descrito es la producción de beta-lactamasas, además, es posible que la frecuencia de cepas productoras de beta-lactamasas haya cambiado y/o que este presente algún otro mecanismo de resistencia por lo que se debe estudiar. A partir de la aplicación de la vacuna pentavalente ha disminuido la incidencia por el serotipo b, sin embargo ha incrementado la aparición de cepas resistentes del serotipo b y NTHi. 1.2 Objetivos se cumplieron en 100% a pesar del bajo presupuesto asignado.

• Se detectó el gen ure A y el gen constitutivo glmM (ure C) por PCR duplex de cepas de Helicobacter pylori aisladas de biopsias de pacientes pediátricos mexicanos.

• Se desarrolló un análisis molecular de Helicobacter pylori por medio de PCR múltiple para genes asociados a virulencia babA2, vacA y cagA.

• Se genotipificaron cepas de H. pylori de pacientes pediátricos mexicanos. • Se cuantificó la actividad de metaloproteasas de matriz de H. pylori; faltó medir

la cantidad de IL-8 producidas por cultivos celulares porque el equipo para hacer ELISA es muy caro y no fue suficiente.

• Se caracterizó fenotípica y genotípicamente aislados clínicos de Enterococcus faecalis con elevada resistencia a gentamicina y/o estreptomicina.

• Se determinó el patrón y factores de resistencia a antibióticos beta- lactamasas.

• Se detectó resistencia a antibióticos beta- lactámicos en cepas de Haemophilus influenzae de distintos centros hospitalarios provenientes de pacientes y portadores asintomáticos.

• Se estandanrizo el ensayo de quimiotaxis en la cámara de Boyden con citometría de flujo con la finalidad de llevar a cabo el conteo de células y la identificación del tipo de leucocitos por medio de fluorocromos.

Métodos y materiales

I. Análisis moleculares de las cepas clínicas de Helicobacter pylori.

1. Cepas de Helicobacter pylori aisladas de biopsias gástricas aisladas de pacientes pediátricos del HGCM “La Raza”.

2. Descongelación y recuperación de cepas, identificación bioquímica. 3. Extracción de DNA. Método de Tiocianato de Guanidina. 4. PCR Individual en la cepa de referencia ATCC 43504 y estandarización PCR

duplex para los genes ureA y glmM. 5. Estandarización de la PCR múltiple en la cepa de referencia ATCC 43504 y

aplicación en cepas clínicas. 6. Soutnern blot, Dot blot, secuenciación. Determinación de sensibilidad y

especificidad del método. Se analizaron 127 clonas recuperadas de 20 biopsias de 20 niños y se determinó su genotipo por PCR simple con iniciadores previamente reportados para la detección del gen ure A (ureasa). ). En la amplificación del gen glmM se diseñaron iniciadores, uno de ellos se denomino glmMR1 5’ GCATTCACAAACTTATCCCCAATC 3’. La validación del producto de 141 pb del gen glmM, y del iniciador diseñado se hizo por secuenciación del amplificado por PCR. La técnica de PCR múltiple se estandarizó con cuatro pares de iniciadores reportados previamente (cagAF1, cagAB1; VA1R, VA1F; vagF, vagR; babA2F, babA2R), los métodos de validación fueron: la técnica de Southern blot, y la secuenciación de los amplificados obtenidos por PCR múltiple. Se determinó la sensibilidad y especificidad empleando como estándar de oro la técnica de PCR individual; la técnica de hibridación de DNA: Dot blot se utilizó para comparar los resultados empleando sondas marcadas enzimaticamente. Diversidad Genética: Durante 2005 un grupo de cepas aisladas de niños mexicanos, para buscar si existe ésta heterogeneidad y polimorfismo en los genes cagA, vacA, babA y oipA. Se estudiaron 152 cepas de H. pylori aisladas de biopsia gástrica: 142 cepas aisladas de 19 niños y 9 cepas aisladas de un paciente adulto. Se usaron como referencia las cepas de H. pylori ATCC 43504 y S. aureus ATCC 29213 para validar el estudio. La susceptibilidad a CH se hizo por tira E, para los antibióticos Am, Tt y Mtz se utilizó la dilución en agar con replicador de “Steers”. Los valores de referencia para definir la resistencia a Am, CH, Mtz y Tt fueron ≥ 4, 1, 8 y 2 µg/mL respectivamente. En la diversidad genética se utilizó la técnica de RAPD-PCR con cuatro iniciadores con secuencias seleccionadas al azar (1254, 1283, 1281 y 1247). Se realizaron árboles filogenéticos con las cepas estudiadas en diferentes países empleando un programa computacional y se hizo el análisis de las secuencias reportadas en el banco de genes para poder construir árboles filogenéticos, y conocer las variaciones genotípicas de cepas mexicanas, asociada a diversidad geográfica.

Determinación de metaloproteasas: Se emplearon células Hep-2 y Caco 2, las cuales crecieron en medio MEM conteniendo 10% de SFB, 2mM de glutamina y 40µg de gentamicina/ml, en una atmósfera de 5% de CO2 a 37°C por 24 – 48 h. La infección de los cultivos celulares se realizo mediante lavados con PBS o medio MEM sin SFB, para eliminar el SFB, y se mantuvieron en el mismo medio sin antibiótico y sin suero. Se colocaron alícuotas de 100µl del cultivo celular en placas de 6 pozos a una concentración de 1X103 células/pozo, y se infectaron con 100µl de las diferentes cepas de H. pylori a una concentración de 2.5X107 bacterias/pozo incubándose overnight. La concentración de proteínas se determino empleando el método de Bradford. Con la finalidad de determinar la actividad proteolítica de las metaloproteasas, se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE 10%), impregnados con colágena desnaturalizada (gelatina), a una concentración de 0.1 %. Las muestras se obtuvieron del sobrenadante de los medios de cultivo centrifugando a 10,000 rpm durante 10 min, los cuales se ajustaron a una concentración de proteínas de 15 µg. Las muestras de los cultivos de H. pylori, así como también la de los cocultivos, se filtraron en millipore 0.22 µm, para evitar que continuara aumentando la actividad proteolítica, se congelaron a –20°C hasta su uso.

II. Mycoplasma spp e infección perinatal. Se emplearon cepas de origen clínico de Ureaplasma urealyticum: (cepa Uu26H) y Mycoplasma hominis (cepa ECV99030142), pertenecientes a la colección del Departamento de Infectología del INPer y conservadas en caldo SP-4 a –70 °C. Tambien se incluyeron cepas de M. pneumoniae y M. hyorrhin

1. Selección de donadores de semen normal 2. Obtención de proteínas espermáticas totales 3. Concentración por eliminación del solvente 4. Perfil de proteínas de espermatozoides humanos 5. Electrotransferencia 6. Marcaje de bacterias con NHS–LC–Biotina 7. Ensayo de adherencia tipo Western blot

Determinación de quimiocinas presentes en el embarazo y en trabajo de parto humano:

1. Establecer si las membranas corioamnióticas tienen efectos quimiotácticos sobre las células inmunológicas: Toma de muestra, procesamiento y cultivo de las membranas corioamnióticas cultivo de los leucocitos, Ensayo de quimiotaxis.

2. Caracterizar el tipo de células inmunológicas que son atraídas por las membranas corioamnióticas.

3. Caracterizar que quimiocinas participan en el proceso, en que cantidad se encuentras y a que concentración actúan: Identificación de la(s) quimiocina(s) presentes en los extractos, cuantificación de la(s) quimiocina(s), determinación de la concentración a la cual actúa(n) la(s) quimiocina(s).

Resistotipos: Enterococcus faecalis está involucrado en las complicaciones infecciosas de pacientes inmunosuprimidos, por factores de virulencia como resistencia a antibióticos ß-lactámicos y aminoglucósidos. Los marcadores de resistencia se encuentran codificados por plásmidos, la transferencia conjugativa depende de la respuesta a feromonas (phe) presente en bacterias donadoras y favorece la expresión de sustancias de agregación (AS) en las bacterias receptoras. Se desconoce si dicha transferencia pudiera modularse, cuando la bacteria se somete a presión selectiva de ampicilina a concentraciones subinhibitorias. Enterococcus faecalis: Se trabajo con 62 cepas de Enterococcus faecalis provenientes del Instituto Nacional de Cardiología, aisladas de hemocultivos. Todas las cepas se identificaron en género y especie por medio de pruebas bioquímicas.

1. Pruebas bioquímicas: Catalasa, telurito de potasio, bilis- esculina, tolerancia a NaCl

2. Pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos: Pruebas: HLSR, HLGR

Seleccionar de 4 a 5 colonias del mismo tipo morfológico a partir de un cultivo puro en agar. Hacer una suspensión en los tubos con caldo Mueller-Hinton, hasta ajustar la turbidez al tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland para realizar las pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos Haemophilus influenzae: Se usaron 59 cepas de portadores asintomáticos y del serotipo b aisladas de líquido cefalorraquídeo LCR. La susceptibilidad a los β−lactámicos se hizo por Kirby-Bauer, CMI, Cefinase.® Se probaron 5 antibióticos β-lactámicos (ampicilina, amoxicilina-ac.clavulánico, cefuroxime, cefotaxime y ceftriaxona) y cloranfenicol por Kirby Bauer, CMI por el método de dilución en placa con ampicilina. Las β−lactamasas+ con Cefinase® y PCR amplificaron un fragmento de 435pb correspondiente al gen blaTEM-1. RESULTADOS: I. Análisis moleculares de las cepas clínicas de Helicobacter pylori. Los genes asociados a virulencia de Helicobacter pylori con aplicación de técnicas de biología molecular como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tienen alta sensibilidad y especificidad; a pesar de ello, las PCRs simples, que hicimos, fueron costosas, utilizamos muchos reactivos, mucho tiempo y trabajo; es por ello que se planteó la necesidad de diseñar una PCR múltiple que permitiera identificar en una muestra positiva para H. pylori y los genes involucrados en la patogenia; para separar a cepas triple positivas babA2, vacAs1m1 y cagA, relacionadas con el desarrollo de úlcera y adenocarcinoma Se analizaron 127 clonas de la colección del laboratorio de Bacteriología Médica y se determino su genotipo tabla 1 y figura 1.

Tabla 1. Análisis de 127 cepas clínicas positivas y negativas para los genotipos: vacAm1s1, cagA y babA2 determinados por PCR simple.

cagA vacAm1 vacAm2 vacAs1 vacAs2 babA2 P* N** P N P N P N P N P N

84 43 91 36 36 91 91 36 36 91 48 79 *Cepas positivas **Cepas negativas

Figura 1: Análisis de 127 cepas de Helicobacter pylori clínicas positivas y negativas obtenidas de biopsias gástricas de pacientes pediátricos. Los resultados muestran que los genes: cagA, vacAm1, vacAs1, se detectan en la mayoría de las cepas, por lo que al igual que la población adulta los pacientes pediátricos están colonizados con cepas vacAm1s1, cagA+ principalmente esta relación puede observarse mejor en términos de porcentaje tabla 2y figura

Tabla 2: Porcentajes de distribución de genes individualmente en cepas de H. pylori aisladas de pacientes pediátricos

Gen /Alelo Porcentaje % 1vacAm11 68.5 vacAm2 28.34 vacAm- 3.16 vacAs1 71.63 vacAs2 28.34 2cagA2 66.14 cagA- 33.86 3babA2

3 37.79 babA2

- 62.21 1. vacA : citotoxina vacuolizante, 2. cagA: proteina altamente inmunogénica asociada a la isla de patogenicidad cagA-PAI 3. babA2: adhesina de unión a grupos Lewis b. . Porcentajes más altos. Los genotipos que se detectaron en mayor porcentaje en la población infantil mexicana fueron los siguientes: babA2

-, vacAm1s1, cagA;, babA2+; vacAm1s1,cagA+;, babA2

-, vacAm2s2, cagA- las figuras 2,3 y 4 muestran los genótipos más frecuentes obtenidos durante el estudio. A continuación se anexa a este documento algunos resúmenes que hacen constar tanto la metodología, como los objetivos obtenidos y en forma resumida se colocan los resultados de algunas de las metas planteadas para este proyecto.

Los genotipos obtenidos se muestran en la tabla 3 expresados en porcentajes y con la finalidad de apreciar su distribución en las cepas aisladas de la población infantil

Tabla 3: Porcentajes de distribución de genotipos en cepas de H. pylori aisladas

de pacientes pediátricos

Genotipo Cepas positivas Porcentaje % babA2- vacAm1s1, cagA+ 51 40.15 babA2- vacAm2s2, cagA- 28 22 babA2

+ vacAm1s1, cagA+ 29 22.83 babA2

+ vacAm1s1, cagA- 7 5.51 babA2

+ vacAs1+, cagA+ 4 3.149 babA2

+ vacAm2s2, cagA- 8 6.299 Los resultados mostraron que los marcadores de virulencia que se detectaron en mayor porcentaje fueron: vacAs1

+ (71.63%), vacAm1

+ (68.5%), cagA+ (66.14%) al igual que en

otros estudios en pacientes adultos; sin embargo, el porcentaje de cepas babA2+ se

encuentra en menor proporción (37.79%); las cepas clínicas se clasificaron en: tipo I (n=51), tipo II (n=28) y triple positivas III (n= 29), el resto de las cepas tienen el genotipo: babA2

+,vacAm1s1+,cagA- (n=7);babA2

+,vacAs1+,cagA+(n=4); babA2

+, cagA-

,vacAm2s2+ (n=8) por lo que la población infantil estudiada esta colonizada

principalmente con cepas tipo I. Los resultados no mostraron relación significativa entre entidad clínica (UP) y cepas tipo III sin embargo, estas fueron aisladas de pacientes con padecimientos crónicos (UD, GC). Los resultados mostraron que hubo 6 clonas ureasa negativas a partir de 6 niños que oscilaban entre 14 a 17 años y que presentaban en común como diagnostico clínico enfermedad por reflujo gastro-esofágico (ERGE). Los resultados se compararon a través de hibridación de DNA por Dot blot con una sonda especifica. Las 127 clonas analizadas para el gen glmM muestran que todas las cepas son positivas mostrando con ello que todas las cepas que se obtuvieron a partir de las biopsias son H. pylori además de que no se observaron productos secundarios ni otro tipo de interferencia en el empleo de este gen por lo que se concluye que estos iniciadores pueden ser empleados en futuros trabajos para la amplificación de este gen. Diversidad Genética:

La prevalencia de la infección en niños mexicanos fue de 13.3%. La edad de inicio de la colonización en niños mexicanos fue alrededor de los 2 años. El dolor abdominal severo o recurrente fue la historia prediagnóstica más relacionada con la infección por H. pylori en niños. La gastritis nodular crónica (46.1%) fue el diagnóstico endoscópico más importante en niños con H. pylori. La tasa de resistencia a Am, CH, Mtz y Tt se observó en 27.4%, 21.8%, 58.4% y 31.5% respectivamente. El 44.3% de las cepas de H. pylori fueron resistentes a dos antimicrobianos. La combinación Am-Mtz presentó mayor resistenc ia en un 16.9% de las cepas. El antimicrobiano que produjo mayor resistencia individual fue Mtz (58.9%). El 21% de las cepas fueron sensibles a los cuatro antimicrobianos. No hubo cepas de H. pylori resistentes a los cuatro antimicrobianos. La técnica de RAPD-PCR pudo distinguir entre cepas de diferentes individuos y entre cepas del mismo paciente. Los 4 iniciadores produjeron 134 marcadores y 44 perfiles RAPD reproducibles entre las 153 cepas de H. pylori estudiadas. El análisis RAPD agrupó a las cepas por su cuadro clínico. La mayoría de los niños estuvieron colonizados por una sola cepa cada uno; los perfiles RAPD de las cepas de éstos niños, fueron diferentes con sutiles diferencias en sus patrones genéticos y de susceptibilidad. Los datos sugieren que, aunque la población consistió de bacterias íntimamente

relacionadas, éstas no fueron completamente homogéneas; variantes genéticas de la misma cepa de H. pylori pueden existir entre los aislados. Dos poblaciones de H. pylori con diferentes perfiles RAPD colonizaron a 7 niños. Las cepas estuvieron más relacionadas entre ellas en un mismo paciente que con cepas de otros niños. Sin embargo, tres niños estuvieron colonizados por aislados más relacionados con cepas de otros individuos independientes que entre sí. Los resultados del estudio indicaron que existe colonización con múltiples cepas en niños mexicanos.

Metaloproteasas:

Se realizó la estandarización de las condiciones de crecimiento para la línea celular HEp-2. También se realizó la zimografía con metaloproteasas recombinantes (rMMP-2 y rMMP-9) para observar la sensibilidad del método. Se realizaron ensayos de adherencia e invasividad con cepas de E. coli y Shigella flexneri para observar si la línea celular es permisible a dichas propiedades para su extrapolación con cepas de H. pylori. Adherencia: Para la realización de esta técnica se empleó la cepa de Escherichia coli CDC 0:112 como testigo positivo. Esta cepa si se logró adherir a la línea celular. Esto nos indica que la línea celular si permite la observación del fenómeno de adherencia, por lo que si se procedió a efectuar este ensayo con una cepa de referencia de Helicobacter pylori (J99). Como testigo negativo se empleó la cepa de Escherichia coli K12, la cual no presenta el fenómeno de adherencia. Invasividad: Para esta técnica, se empleó la cepa de Shigella flexneri, la cual es invasora, y crece dentro de las células del huésped. Es por ello que se decidió emplear esta cepa para ver si la línea celular permitía o no poner de manifiesto esta característica (control positivo). Se logró poner de manifiesto el fenómeno de invasividad con la cepa empleada, Esta línea celular si permitió el fenómeno de invasividad, por lo que se procedió a realizar el ensayo con la cepa de H. pylori J99, el resultado obtenido no fue el esperado, ya que la línea celular presentó lisis: Zimografía: Se realizó la estandarización de la técnica de zimografía, para lo cual empleamos metaloproteasas recombinantes (MMP-2 y MMP-9). Las diluciones empleadas fueron las siguientes:

MMP-2 MMP-9 Carril 480 1500 1 240 750 2 230 500 3 60 250 4 30 125 5 15 62.5 6

Con

c. e

n pg

/poz

o

7.5 31.25 7 En el zimograma se pudo apreciar la diferencia de intensidad en las bandas, por lo que se observó que si tiene sensibilidad este método. También se realizaron corrimientos de otras muestras. El suero fetal bovino presentó actividad proteolítica, por lo que se procedió a la realización de lavados para eliminar la actividad del suero. El sobrenadante de la línea celular HEp-2 no presentó actividad de metaloproteasa al igual que el sobrenadante de la cepa J99. La sensibilidad de la técnica de zimografía, es alta, ya que se pudo observar diferencia en los halos proteolíticos de las metaloproteasas a diferentes

concentraciones (diluciones decimales). El SFB presentó actividad de metaloproteasa. El sobrenadante del cultivo de H. pylori no presentó actividad de metaloproteasa. La línea celular HEp-2 fue apta para la realización de los ensayos de adherencia e invasividad.

• Confirmación de ausencia de infecciones por micoplasmas y Chlamydia trachomatis en semen.

El análisis de los productos de amplificación por PCR a partir de la muestra de semen, reveló la ausencia de las bandas características de ∼715, 429, 170, y 129 pb de Mycoplasma spp./Ureaplasma spp., U. urealyticum, M. hominis y/o Chlamydia trachomatis, respectivamente; de esta manera, se consideraron los pools como libres de infección. Los controles positivos de cada una de las reacciones funcionaron adecuadamente. La Figura 5 muestra los productos de los PCR´s para Mycoplasma spp./Ureaplasma spp. y U. urealyticum. Figura 5. Resultados de la detección de Micoplasmas en semen. Productos de amplificación obtenidos con el PCR para la detección de Mycoplasma spp./Ureaplasma spp., B= Blanco de reacción; C1 y C2 = Controles positivos de Ureaplasma spp. (U. urealyticum) y Mycoplasma spp. (M.. hominis), respectivamente; M= Marcador de tamaño molecular, escalera de 100 pb. Perfil proteico espermático Se obtuvo un perfil proteico espermático con al menos 16 bandas, con pesos comprendidos entre 13 y 71 kDa,el cual fue idéntico en los tres pools de manera que se presume que el perfil es reproducible de muestra a muestra (Figura6).

pb 1500

1000

400

pb

∼715

429

1 2 3 B C1 C2 M

Confirmación del marcaje de bacterias con biotina y ensayo de adherencia en espematozoides prefijados. El marcaje de las cepas de U. urealyticum y M. hominis resulto adecuado, ya que la presencia de partículas de forma esférica reveladas con el conjugado de streptavidina-fosfatasa alcalina es compatible con la forma y tamaño reportados para éstas bacterias las cuales en ausencia del revelador no pueden visualizarse por microscopía óptica convencional. En los ensayos de adherencia, los espermatozoides que no fueron tratados con las bacterias marcadas, no presentaron tinción inespecífica en presencia del sustrato; en contraste, la presencia de bacterias adheridas al cuello y la porción proximal de la cola de los espermatozoides Ensayo de adherencia tipo Western blot. Mediante este ensayo, se identificaron 2 bandas que interaccionan específicamente con U. urealyticum, cuyos pesos moleculares aparentes son de 15.9 y 59.1 kDa; mientras que para M. hominis sólo se identificó una banda de 24.4 kDa. En contraste, M. hyorrhinis, un micoplasma que afecta al cerdo, presento interacción con 2 bandas de bajo peso molecular, pero diferentes a la identificada para M. hominis.

• Determinación de quimiocinas presentes en el embarazo y en trabajo de

parto

Se obtuvieron leucocitos totales de los tres compartimientos de mujeres con y sin trabajo de parto, con una viabilidad mayor al 97%. Se obtuvo un banco de extractos de MCA de mujeres con y sin trabajo de parto, para ser usados en los ensayos de quimiotaxis.

Los leucocitos que migraron se contaron por tres métodos ya reportados: 1) Contar en forma de barrido todo el filtro, 2) Contar 10 campos en forma vertical y después 10 en forma horizontal empezando por la parte media superior del filtro y 3) Contar 10 campos al azar; para establecer cual de los métodos era el mas reproducible. Al contar los leucocitos que migraron en los filtros de 8 µ se observó que no se distribuían en forma homogénea en todo el filtro, por esta razón, se procedió a contar el número de

células en todo el filtro, sin embargo, los leucocitos quedaban atrapados en diferentes planos y en algunas ocasiones estaban agrupados, lo que dificultó el conteo.

El número de leucocitos que se contaba en todo el filtro era muy diferente al hacerlo por duplicado, por lo que se decidió realizar el conteo por triplicado por tres observadores del mismo filtro, sin embargo, los coeficientes de variación (CV) de cada uno y entre ellos fue inaceptable.

Debido a la falta de reproducibilidad de los resultados, aunado a que se ocupaba mucho tiempo en la lectura de los filtros, se considero que ninguno de los métodos de conteo del filtro atrapador sería aceptable en ensayos posteriores. Así, se hizo la siguiente modificación en el ensayo de quimiotaxis en cámara de Boyden.

Se montaron ensayos de quimiotaxis en cámara de Boyden quitando el filtro de 8 µ y los leucocitos recuperados se contaron por citometría de flujo.

En la figura 7 se demuestra que independientemente del origen de los leucocitos probados, el conteo de los ensayos de quimiotaxis realizado por citometría de flujo fue reproducible en todos los casos.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

MATERNAS CORDON PLACENTA

# LE

UC

OC

ITO

S Q

UE

MIG

RA

RO

N

Figura7 Conteo de leucocitos; maternos ((n=2), fetales (cordón) (n=2) y de placenta (n=2), que migraron utilizando como quimiotáctico el fMLP. Los CV = 5 demuestran el conteo de los realizado por citometría de flujo fue reproducible en todos los casos

Debido a que los resultados del conteo en citometría de flujo son reproducibles, a que el conteo es rápido y que se cuenta con el material y equipo para su realización, se decidió ocupar este método para el conteo de los leucocitos migrantes en los ensayos de quimitaxis en cámara de Boyden.

Efecto de la albúmina humana en el ensayo de quimiotaxis

Al realizar el ensayo de quimiotaxis en cámara de Boyden utilizando el DMEM suplementado con 2% de Albúmina Humana (AH) y los extractos de MCA preparados con el mismo, se observó que el medio suplementado atrajo mayor número de leucocitos que el extracto de MCA. (Figura 8 )

0

500

1000

1500

DMEM 2% AH EXTRACTO DE MCA S/TP

# LE

UC

OC

ITO

S Q

UE

MIG

RA

RO

N

Figura 8: Efecto de la albúmina humana sobre la quimiotaxis. Número de leucocitos de cordón S/TP que migraron utilizando: DMEM + AH 2% (n=3) y Extracto S/TP

preparado con DMEM + AH 2% (n=3) como quimiotácticos; se observó que el medio suplementado atrajo mayor número de leucocitos que el extracto de MCA

Debido a que el control (medio suplementado) no se le podía restar al efecto quimiotáctico del extracto, se probó el DMEM preparado con una concentración más baja de AH (0.1 %) y el DMEM sin AH como quimioatrayentes. Al incrementar la concentración de AH en el medio se aumenta el paso inespecífico de los leucocitos al compartimiento inferior. Sin embargo, el medio sin AH atrajo un número mínimo de leucocitos, el cual se puede eliminar del efecto quimiotáctico de los extractos de MCA.

Haciendo todos los cruces posibles entre los extractos de MCA y los leucocitos de los tres compartimientos con y sin trabajo de parto, principalmente se observó que los extractos de MCA tienen actividad quimiotáctica sobre los leucocitos provenientes de los tres diferentes compartimientos. Además, los leucocitos maternos y de placenta con trabajo de parto respondieron más que los de sin trabajo de parto y los leucocitos fetales (cordón) fueron atraídos homogéneamente.

La naturaleza proteica del quimioatrayente fue demostrada cuando se calentó un extracto de MCA a 50°C por 15 minutos y se disminuyó significativamente su actividad quimiotáctica, en comparación con el mismo extracto de MCA sin calentar.

Al hacer el análisis densitométrico, se observó que el extracto de MCA con trabajo de parto presentó mayor concentración de IL-8, MIP-1δ, MIP-1β, I-309, Eotaxina-2 y MCP-1 que el extracto de MCA sin trabajo de parto. Sin embargo, este último presentó mayor concentración de RANTES.

III. Resistotipos:

En 59 H. influenzae hubo 11 resistentes a ampicilina por el método de Kirby Bauer y CMI. Estas amplificaron para el fragmento de 435pb de TEM-1. 3 fueron ampicilina intermedias por la prueba de Kirby Bauer, y sensibles por CMI, empleando dilución seriada en placa con medio GC enriquecido con polienriquecimiento. Estas tres podrían poseer el gen PBP3B mutado que confiere distintos grados de resistencia. En 5 cepas hubo resistencia y 8 fueron intermedias a cloranfenicol. La PCR se utilizó para identificar el tipo de β-lactamasas+ en las 11 cepas resistentes a ampicilina. En la extracción de plásmidos de bajo peso molecular, no se detectaron bandas en los geles por electroforesis. H. influenzae tiene plásmidos de alto peso molecular, que se deben de buscar, hay también algunos elementos conjugativos que se integran en el cromosoma. La resistencia a cloranfenicol también se ha reportado en megaplásmidos. La conclusión en las 11 cepas resistentes fue que el mecanismo estuvo mediado por β-lactamasas tipo TEM-1 y concuerda con los resultados de otros investigadores. En la tabla 1 se muestran los porcentajes de las cepas con respecto al serotipo al que pertenecen. En la tabla 2 muestra los porcentajes de resistencia a los antimicrobianos probados.

Tabla 1. Porcentaje de serotipos obtenidos de distintas muestras de Hi Serotipo

Muestra % b n % Cap no b n % NTHi n

Portador Asintomático - - 23.73 14 38.98 23 LCR 11.86 7 1.69 1 1.69 1 Faringeo - - 5.08 3 10.17 6 Oído - - 1.69 1 3.39 2 Hemocultivo 1.69 1 - - - -

Tabla 2. Porcentaje de cepas sensibles a antibióticos b-lactámicos y cloranfenicol de Hi Antibiótico %S n %I n %R n

Ampicilina (10mg) 76.27 45 5.085 3 18.64 11

Amoxicilina/AcidoClavulánico (20/10mg) 100 59 - - - -Cloranfenicol (30mg) 45 10.17 6 13.56 8Cefotaxime (30mg) 98.31 58 - - 1.695 1Ceftriaxona (30mg) 96.61 57 - - 3.39 2Cefuroxime (30mg) 98.31 58 - - 1.695 1

La figura 1 muestra el amplificado de las cepas resistentes a ampicilina, es un fragmento de 435bp.

En el trabajo con Enterococcus se determinó el efecto de ampicilina sobre la expresión de phe y AS de E. faecalis. Se seleccionó un aislado clínico (1390S) se estimuló con ampicilina a diferentes concentraciones. La clona resistente obtenida (1390R) dio concentración mínima Inhibitoria (CMI) de 128 µg/ml para ampicilina, tenía plásmido y se curó con ácido ascórbico 10 mM para la obtención de una clona libre de plásmido (C29); con ésta, se obtuvieron medios condicionados con feromona (MCF) sin ampicilina y con estímulos desde 0.25 a 0.75X de la CMI. Se hizo un ensayo de agregación con la donadora (1390R) y la receptora (C-29) en presencia de los MCF. La clona 1390R se estimuló también con los MCF para determinar el efecto feromona sobre la expresión de AS. La ampicilina a CMI 0.25X, favoreció la expresión de phe, se confirmo como un incremento de la agregación. A CMI mayores, la expresión de phe se redujo. Los MCF estimularon a 1390R favorecieron un incremento de AS hasta CMI 0.25X después hubo disminución en la expresión de dicha proteína. Se demostró que la ampicilina moduló la expresión de phe y AS, lo que sugiere que este antibiótico podría afectar la respuesta sexual por feromonas durante la conjugación. IMPACTO.-En la ficha de productividad se puede observar que el proyecto permitió la elaboración de 5 tesis de licenciatura y dos de doctorado. Hubo 2 publicacionews en revistas de alto impacto. Hubo varios seminarios presentados como avance y/o terminación de tesis de Maestria y/O doctorado, tenemos 3 artículos en prensa que no estoy reportando hasta que se publiquen y si hay posibilidad en el nuevo proyecto con el protocolo 2006. Se han diseñado nuevas estrategias de estudio que permitirán un mejor avance y desarrollo tecnologico aplicado a estudios de patogenicidad.. Se presentaron los resultados en varios foros nacionales y / o internacionales Se obtuvo un premio por

Figura 1. Prueba de PCR. De izquierda a derecha: Hi ATCC 33930, Hi ATCC 49247, MWP 123 bp, Hi 61, Hi 68, Hi 74, Hi 86, Hi 91, Hi 93, Hi 107, Hi 108, Hi 115, Hi116 y Hi 117

mejor cartel en Congreso Nacional de Microbiología de la alumna de posgrado Sara Ochoa Pérez y se sigue avanzando. Bibliografía

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