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i FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA QUÍMICA FARMACÉUTICA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD NOOTRÓPICA DEL EXTRACTO DE LA PULPA DEL CAFÉ ARABICA (Coffea arabica). Trabajo de Investigación presentado como requisito previo para la obtención del título de Química Farmacéutica Autor: Elda Vanessa Molina Jaramillo Tutora: Elithsine Elizabeth Espinel Armas DMQ, mayo 2018
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FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA QUÍMICA FARMACÉUTICA
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD NOOTRÓPICA DEL EXTRACTO DE LA
PULPA DEL CAFÉ ARABICA (Coffea arabica).
Trabajo de Investigación presentado como requisito previo para la obtención del título
de Química Farmacéutica
Autor: Elda Vanessa Molina Jaramillo
Tutora: Elithsine Elizabeth Espinel Armas
DMQ, mayo 2018
ii
Dedicatoria
A mis tres amores, que han sido mi soporte y mi motor para culminar mi carrera, sobre
todo por entregarme su amor, comprensión y respeto.
Mi principio y mi fin
iii
Agradecimientos
A Dios y a la virgen María Auxiliadora por permitirme culminar con esta meta.
A mis padres, hermanos y hermanas por siempre brindarme el apoyo incondicional y
confiar en mí.
A toda mi familia por el increíble soporte que me brindaron a lo largo de toda la carrera.
Al personal docente y administrativo de la Facultad de Ciencias Químicas, por ser
partícipes de este crecimiento profesional.
Al personal del laboratorio de la OSP de alimentos, por su colaboración en la
elaboración de la parte experimental del presente proyecto, de igual manera extiendo
mis agradecimientos al Centro de Biología y en especial a la Dra. Daniela Balseca y la
Señora Nancy por su apoyo en el manejo y acondicionamiento de los sujetos de
experimentación.
A los Ingenieros Jorge Grijalva, Roy Vera, Raúl Barragán, que me ayudaron en el
tratamiento estadístico de los datos experimentales.
A la Dra. Elithsine Espinel por su apoyo absoluto, su dedicación y entrega para que este
trabajo de investigación culmine con éxito.
A los Doctores Dayana Borja, Janeth Montalvo, Liliana Naranjo, Walter Remache,
Javier Santamaría por enseñarme que el ser Químico Farmacéutico es una pasión que
llena tu vida.
A mis amigos y amigas que hice a lo largo de mi vida estudiantil, que inyectaron vitalidad
y alegría en esta travesía en especial a Sofy, Yady, Mayra, Gaby y Mony por brindarme
su amistad incondicional.
iv
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El trabajo de investigación se llevó a cabo en el período julio - diciembre del 2017, en
el laboratorio del Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la
Universidad Central del Ecuador, posteriormente se evaluó la actividad nootrópica del
extracto de la pulpa de café arábica en las instalaciones del Centro de biología, que
permitió un monitoreo y acondicionamiento constante de los animales de
experimentación, el café se adquirió en la Finca San Andrés ubicada en el recinto El
Comunal, El Carmen – Manabí- Ecuador.
viii
Índice de Contenidos
Dedicatoria ................................................................................................................................ ii
Agradecimientos...................................................................................................................... iii
Constancia de aprobación del tutor ....................................... ¡Error! Marcador no definido.
Constancia de aprobación del trabajo final por tribunal ..... ¡Error! Marcador no definido.
Índice de Contenidos ............................................................................................................ viii
Índice de Anexos .................................................................................................................... xii
Índice de Gráficos ................................................................................................................. xiv
Índice de Ecuaciones ............................................................................................................. xv
Índice de Tablas..................................................................................................................... xvi
Lista de Abreviaturas .......................................................................................................... xviii
Resumen ................................................................................................................................. xix
Abstract ................................................................................................................................... xx
Introducción .............................................................................................................................. 1
Capítulo I................................................................................................................................... 3
El Problema............................................................................................................................... 3
Planteamiento del problema. .........................................................................................3
Formulación del problema ............................................................................................5
Preguntas directrices .....................................................................................................5
Objetivos .......................................................................................................................6
Objetivo general. .......................................................................................................6
Objetivos específicos. ................................................................................................6
Justificación ...................................................................................................................6
Capítulo II ................................................................................................................................. 8
Marco teórico ............................................................................................................................ 8
Antecedentes. ................................................................................................................8
Fundamento Teórico. ....................................................................................................9
Fundamento botánico. ...............................................................................................9
Origen e historia. ................................................................................................... 9
Características botánicas. .................................................................................... 10
Fruto de café ....................................................................................................... 10
Composición del fruto de café ........................................................................... 11
ix
La pulpa de café................................................................................................... 11
Procesamiento de la pulpa de café....................................................................... 11
Metabolitos Secundarios ......................................................................................... 12
Compuestos polifenólicos. .................................................................................. 12
Ácidos hidroxicinámicos. .................................................................................... 12
Ácido clorogénico. .............................................................................................. 13
Control de calidad del material vegetal. .................................................................. 14
Determinación materias extrañas ........................................................................ 14
Determinación de grasa. ...................................................................................... 14
Análisis granulométrico....................................................................................... 14
Determinación de cenizas totales. ....................................................................... 15
Determinación de porcentaje de humedad. ......................................................... 15
Control de Identidad material vegetal. .................................................................... 15
Características morfológicas. .............................................................................. 15
Ensayo de identidad. ............................................................................................ 16
Extractos Vegetales ................................................................................................. 16
Métodos de extracción. ........................................................................................ 16
Determinación de fenoles totales ............................................................................ 17
Fundamento Anatómico Farmacológico ................................................................. 18
Capacidades cognitivas ....................................................................................... 18
Enfermedades neurodegenerativas ...................................................................... 19
Actividad nootrópica. .......................................................................................... 22
Instrumentos de evaluación de procesos cognitivos animales. ........................... 22
Marco legal ................................................................................................................. 23
Hipótesis ..................................................................................................................... 24
Hi: hipótesis de trabajo ............................................................................................ 24
H0: hipótesis nula .................................................................................................... 24
Conceptualización de las variables ............................................................................. 24
Capítulo III.............................................................................................................................. 25
Metodología de la Investigación .......................................................................................... 25
Diseño de la Investigación. ......................................................................................... 25
Métodos y Materiales.................................................................................................. 26
Primera etapa.......................................................................................................... 29
x
Recolección del material vegetal ........................................................................ 29
Control calidad. ................................................................................................... 30
Control de identidad. ........................................................................................... 36
Segunda Etapa. ........................................................................................................37
Marcha fitoquímica. ............................................................................................ 38
Tercera etapa............................................................................................................38
Método 1. Laberinto Acuático de Morris. .......................................................... 38
Aparato. ............................................................................................................... 38
Método 2. Laberinto Radial de 8 brazos ............................................................. 40
Aparato. ............................................................................................................... 40
Diseño Experimental. ..............................................................................................42
Concentración fenoles totales ............................................................................. 42
Actividad Nootrópica .......................................................................................... 42
Operacionalización de variables ..............................................................................43
Técnicas e instrumentos de recolección de datos. ...................................................43
Determinación Nootrópica. ................................................................................. 44
Técnicas de procesamiento y análisis de datos. .......................................................44
Determinación cantidad de fenoles totales. ........................................................ 44
Determinación Nootrópica .................................................................................. 45
Capítulo IV ............................................................................................................................. 46
Análisis y discusión de Resultados ...................................................................................... 46
Determinación de humedad. ........................................................................................46
Determinación de fibra cruda. .....................................................................................47
Determinación de Grasa Cruda ...................................................................................48
Determinación de cenizas totales. ...............................................................................49
Control Microbiológico ...............................................................................................50
Determinación de cafeína ............................................................................................53
Estudio Fitoquímico. ...................................................................................................59
Determinación de Fenoles Totales. .............................................................................60
Determinación de Ácido Clorogénico. ........................................................................64
Marcha Fitoquímica ....................................................................................................67
Cálculo dosis de administración. .............................................................................68
Método 1. Laberinto Acuático de Morris. ...............................................................73
xi
Método 2. Laberinto Radial de 8 brazos ................................................................. 79
Disección de Animales de experimentación....................................................... 85
Capítulo V ............................................................................................................................... 88
Conclusiones y Recomendaciones ....................................................................................... 88
Conclusiones ............................................................................................................... 88
Bibliografía ............................................................................................................................. 91
xii
Índice de Anexos
Anexo A. Árbol de Problemas............................................................................................ 101
Anexo B. Certificado Botánico ......................................................................................... 102
Anexo C. Instrumento de Recolección de Datos (IRD) cantidad de fenoles totales ... 103
Anexo D. Instrumento de Recolección de Datos (IRD) actividad nootrópica ............. 104
Anexo E. Matriz de Validación de Instrumentos ............................................................. 105
Anexo F. Registro de cromatogramas de pulpa de café .................................................. 106
Anexo H Procedimiento Experimental.............................................................................. 109
Anexo I Certificados ........................................................................................................... 112
xiii
Índice de Ilustraciones
Ilustración 1.1 Composición del fruto de café..................................................... 10
Ilustración 1.2 Fórmula estructural del ácido cinámico. .................................... 12
Ilustración 1.3 Obtención del Ácido Clorogénico. .............................................. 13
Ilustración 1.4 Formación de Quinolactonas. ...................................................... 13
Ilustración 1.5 Redox entre ácido Gálico y Reactivo de Folin Ciocalteu ........... 17
Ilustración 1.6 Lesiones Macroscópicas y Microscópicas .................................. 19
Ilustración 3.1 Esquema del Laberinto Acuático de Morris ................................ 39
Ilustración 3.2 Esquema del Laberinto radial de 8 brazos.................................. 41
xiv
Índice de Gráficos
Gráfico 4.1 Cromatograma de la solución patrón 10 ppm ............................................. 53
Gráfico 4.2 Cromatograma de la solución patrón 25 ppm ............................................. 54
Gráfico 4.3 Cromatograma de la solución patrón 50 ppm ............................................. 54
Gráfico 4.4 Cromatograma de la solución patrón 75 ppm ............................................. 55
Gráfico 4.5 Cromatograma de la solución patrón 100 ppm ........................................... 55
Gráfico 4.6 Curva de calibración obtenida por HPLC. .................................................. 56
Gráfico 4.7 Cafeína obtenidas por HPLC de las diferentes muestras ............................ 59
Gráfico 4.8 Curva de calibración obtenido por el método Folin – Ciocalteu ................ 61
Gráfico 4.9 Concentración de Fenoles totales ............................................................... 63
Gráfico 4.10 Peso semanales de ratones machos ........................................................... 70
Gráfico 4.11 Peso semanales de ratones hembras ......................................................... 71
Gráfico 4.12 Tiempo de latencia en función de los tratamientos. ................................. 77
Gráfico 4.13 Tiempo de latencia en función a los días de evaluación ........................... 79
Gráfico 4.14 Comparación de Tiempo de latencia. ....................................................... 83
Gráfico 4.15 Comparación de resultados obtenidos por ANCOVA .............................. 84
xv
Índice de Ecuaciones
Ecuación Nº 1 Materia Extraña ...................................................................................... 30
Ecuación Nº2: Porcentaje de Humedad .......................................................................... 32
Ecuación Nº 3: Porcentaje de fibra cruda ...................................................................... 33
Ecuación Nº 4: Porcentaje de Grasa cruda ..................................................................... 34
Ecuación Nº5: Porcentaje de Cenizas totales ................................................................. 35
xvi
Índice de Tablas
Tabla 1.1 Composición de los principales subproductos del procesamiento del café . 11
Tabla 1.2 Sustituyentes de la fórmula estructural de ácido cinámico ............................ 12
Tabla 3.1: Codificación de Tratamientos y Bloques ...................................................... 42
Tabla 3.2. Dimensiones e indicadores de las variables .................................................. 43
Tabla 3.3 Análisis de varianza ....................................................................................... 45
Tabla 4.1 Humedad de la pulpa de café método convencional ...................................... 46
Tabla 4.2 Humedad de la pulpa de café método no convencional (Termobalanza) ...... 47
Tabla 4.3 Fibra cruda de la pulpa de café ...................................................................... 48
Tabla 4.4 Grasa cruda de la pulpa de café ..................................................................... 48
Tabla 4.5 Cenizas Totales de la pulpa de café ............................................................... 49
Tabla 4.6 RTMA en la pulpa de café previo al proceso de desinfección .................... 50
Tabla 4.7 RTMA en la pulpa de café posterior al proceso de desinfección .................. 50
Tabla 4.8 RTML en la pulpa de café previo al proceso de desinfección ...................... 51
Tabla 4.9 RTML en la pulpa de café posterior al proceso de desinfección .................. 51
Tabla 4.10 Resultados del control microbiológico de la pupa de café .......................... 52
Tabla 4.11 Soluciones patrón de cafeína, áreas y tiempos de retención ........................ 56
Tabla 4.12 Determinación de la cafeína de la pulpa de café ......................................... 57
Tabla 4.13 Concentraciones y absorbancias de las soluciones patrón de ácido gálico . 60
Tabla 4.14 Cuantificación de fenoles totales de la pulpa de café arábica ...................... 62
Tabla 4.15 Cuantificación de fenoles expresados en meq ACG/ml de muestras ......... 65
Tabla 4.16 Análisis de Varianza de Cantidad de Fenoles Totales ................................ 66
Tabla 4.17 Test de Duncan cantidad de fenoles totales ................................................. 66
Tabla 4.18 Identificación de metabolitos secundarios .................................................. 67
Tabla 4.19 Extracto Seco ............................................................................................... 68
Tabla 4.20 Análisis de varianza del laberinto acuático de Morris ................................. 74
Tabla 4.21 LSD Fisher entre tratamientos administrados al ratón ................................. 75
Tabla 4.22 LSD Fisher entre el sexo del sujeto de experimentación ............................. 75
Tabla 4.23 LSD Fisher entre los días de evaluación ...................................................... 76
Tabla 4.24 ANOVA Laberinto radial de ocho brazos en función al número de
desaciertos ...................................................................................................................... 80
Tabla 4.25 Efectos fijos, variable dependiente número de desaciertos ........................ 81
xvii
Tabla 4.26 LSD Fisher entre tratamientos administrados al ratón en función del
número de desacierto ...................................................................................................... 81
Tabla 4.27 ANOVA del laberinto radial de ocho brazos en función logaritmo natural
del tiempo de latencia ..................................................................................................... 82
Tabla 4.28 Efectos fijo, variable dependiente tiempo de latencia .................................. 83
Tabla 4.29 Resultados de la Disección de ratones machos ............................................ 85
Tabla 4.30 Resultados de la Disección de ratones hembras ........................................... 86
xviii
Lista de Abreviaturas
ACG: Ácido Clorogénico
ANOVA: Análisis de varianza
ANCOVA: Análisis de Covarianza
APoE4: Apolipoproteína e4
DCV: Deterioro Cognitivo Vascular
EA: Enfermedad de Alzheimer
EROs Especies reactivas de oxígeno
FC: Folin Ciocalteu
GA: Ácido Gálico
GB: Ginkgo Biloba
HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Definición
IRD: Instrumento de Recolección de Datos
KHz: Kilo Hertz
meq: Miliequivalentes
ml: Mililitros
nm: Nanometro
NMDA: N. Metil – D - Aspartato
OMS: Organización Mundial de la Salud
PC: Pulpa de Café
ppm: Partes Por Millón
REDOX: Reacción Óxido Reducción
RTMA: Recuento Total de Microorganismos aerobios
RTML: Recuento Total de Mohos y Levaduras
xix
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA QUÍMICA FARMACÉUTICA
Evaluación de la actividad nootrópica del extracto de la pulpa del café arabica
(Coffea arabica).
Author: Molina Jaramillo Elda Vanessa
Tutor: Espinel Armas Elithsine Elizabeth
Resumen
La actividad nootrópica tiene la finalidad de optimizar las funciones cognitivas del
cerebro, lo que conlleva, a combatir la falta de concentración, la pérdida de memoria y
la fatiga cerebral, sintomatología dependiente de la edad. El presente trabajo de
investigación evaluó la actividad nootrópica del extracto de la pulpa del café arábica
(Coffea arabica). En una primera etapa se realizó el control de calidad de la pulpa de
café arábica y la cuantificación de fenoles totales, se determinó que el extracto obtenido
por maceración dinámica y haciendo uso como solvente el etanol: agua (50:50), contiene
mayor cantidad de fenoles totales; en una segunda etapa se realizó un estudio in vivo con
ratones de la especie mus musculus como sujetos de experimentación, a los cuales se los
dividió en 4 grupos con la finalidad de administrarles agua, Ginkgo Biloba y dos
diferentes dosis de extracto de la pulpa de café. Los resultados obtenidos, empleando
pruebas de aprendizaje como el laberinto acuático de Morris y el laberinto radial de 8
brazos permitieron evaluar el aprendizaje espacial y la memoria del animal. Los datos
obtenidos se trataron con un análisis matemático de un modelo lineal mixto y se
comprobó que el extracto de la pulpa de café arábica posee actividad nootrópica, y que
la dosis 100 mg / Kilogramo del peso corporal /día de ácido clorogénico, posee mayor
efectividad en el mejoramiento de las propiedades cognitivas.
Palabras clave: PULPA DE CAFÉ, ACTIVIDAD NOOTROPICA, APRENDIZAJE,
MEMORIA.
xx
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA QUÍMICA FARMACÉUTICA
Evaluation of the nootropic activity of arabica coffee pulp extract (Coffea arabica).
Author: Molina Jaramillo Elda Vanessa
Tutor: Espinel Armas Elithsine Elizabeth
Abstract
The nootropic activity has the purpose of optimizing the cognitive functions of the brain,
which entails, to combat the lack of concentration, memory loss and brain fatigue, age-
dependent symptomatology. The present work of investigation evaluated the nootropic
activity of the extract of the pulp of the Arabica coffee (Coffea arabica). In a first stage
the quality control of the arabica coffee pulp and the quantification of total phenols was
carried out, it was determined that the extract obtained by dynamic maceration and using
as solvent the ethanol: water (50:50), contains a greater quantity of total phenols; In a
second stage an in vivo study was carried out with mice of the species mus musculus as
experimental subjects, which were divided into 4 groups with the purpose of
administering water, Ginkgo Biloba and two different doses of pulp extract coffee. The
results obtained, using learning tests such as Morris water maze and the radial 8 arms
maze allowed to evaluate the spatial learning and the animal's memory. The obtained
data were treated with a mathematical analysis of a mixed linear model and it was proved
that the extract of the Arabica coffee pulp possesses nootropic activity, and that the dose
100 mg / Kilogram of the body weight / day of chlorogenic acid, has greater effectiveness
in the improvement of cognitive properties.
Key words: PULP OF COFFE, NOOTROPIC ACTIVITY, LEARNING, MEMORY
1
Introducción
Los productos con actividad nootrópica, sean de origen natural o sintético se los
conoce actualmente como las drogas inteligentes; las cuales tienen la finalidad de optimizar
las funciones cognitivas del cerebro, lo que conlleva, a combatir la falta de concentración, la
pérdida de memoria y la fatiga cerebral; incluso están asociados con el mejoramiento de la
confusión mental, la depresión y la ansiedad. El presente estudio de investigación tiene la
finalidad de evaluar la actividad nootrópica de la pulpa de café arábica una de las plantas
comunes del Ecuador.
Un propósito paralelo del presente trabajo de investigación, es ser un referente en el
estudio de la pulpa de café arábica a fin de mitigar la contaminación ambiental, misma que
se produce al desechar inadecuadamente este residuo, debido al desconocimiento de los
productores cafeteros; se pretende optimizar su uso determinando el mejor método de
extracción de fenoles totales que brinda la actividad nootrópica, brindando un valor agregado
al realizar un estudio in vivo evaluando en pruebas de aprendizaje espacial y de memoria,
haciendo uso del laberinto radial de ocho brazos y el laberinto acuático de Morris.
El contenido del presente documento consta de cinco capítulos, los cuales son:
Capítulo I: El problema, en el cual se establece la finalidad de la investigación,
aspectos formales relacionados con los objetivos del estudio y la razón de la investigación.
Capítulo II: Marco teórico, en este capítulo se presenta los antecedentes y los
planteamientos teóricos que preceden a la presente investigación, es decir, estudios
realizados hasta el momento asociados a la pulpa de café arábica, que pueden colaborar con
el presente estudio; así también se determina la hipótesis de trabajo que dirigió al estudio
con su correspondiente sistema de variables.
Capítulo III: Marco metodológico, en este capítulo se presenta la metodología del
trabajo de investigación, referente al diseño, materiales y métodos, operacionalización de
2
las variables y las técnicas utilizadas en la recolección de datos, así como el procesamiento
estadístico seguido con el objeto de comprobar la hipótesis de trabajo.
Capítulo IV: Análisis y Discusión de resultados, en donde se presentan los datos
obtenidos en el proceso investigativo, el proceso estadístico, la interpretación y justificación
respectivas.
Capítulo V: Conclusiones y Recomendaciones, en el cual se establece las
conclusiones obtenidas en la investigación en función de los objetivos planteados. Así
también se describen recomendaciones como aportes para próximas investigaciones.
3
Capítulo I
El Problema
Planteamiento del problema.
En la actualidad, en el mundo se ha incrementado el uso de fármacos con actividad
nootrópica llamados también drogas inteligentes, de origen en su mayoría sintéticas, esto se
debe a que, la población mundial está envejeciendo con mayor rapidez. Según OMS (2016)
“Entre 2015 y 2050 la proporción de la población mundial mayor de 60 años se multiplicará
casi por dos, pasando del 12 % al 22 %, con ello incrementa la probabilidad que dichas
personas posean enfermedades crónicas que deterioran su calidad de vida. La salud mental
y el bienestar emocional tienen la misma importancia en la edad mayor que en cualquier otro
periodo de la vida. Aproximadamente un 15 % de los adultos de 60 años o mayores sufren
algún trastorno mental”.
La finalidad del tratamiento con estos fármacos es el mejoramiento de la memoria,
la capacidad de aprendizaje y la concentración, tratando de contrarrestar en cierta manera el
incremento de enfermedades neurodegenerativas crónicas como el Alzhéimer, la demencia.
Según OMS (2016). En el mundo entero hay unos 47 millones de personas que padecen
demencia, y cada año se registran 9,9 millones de nuevos casos.
Cabe recalcar que en la actualidad, las demencias primarias no son curables y
producen un daño progresivo e irreversible del cerebro. El Alzhéimer, enfermedad
responsable del 50 al 60 % del total de casos de demencia seguido por Parkinson y la
degeneración frontotemporal como lo indica Gutiérrez (2014).
Otra problemática que se genera cuando una persona padece de una enfermedad
neurodegenerativa es el costo que se relaciona con los cuidados informales y sociales que
este requiere. Como lo menciona el mismo autor, en la región de América los costos totales
estimados para las demencias son de 235 84 billones de dólares anuales, sin embargo, solo
4
el 11 % de estos costos (23 billones de dólares) corresponden a América Latina y el Caribe,
donde vive cerca del 44 % de las personas con demencia.
Debido a la relación que existe entre la presencia del estrés oxidativo y el déficit
cognitivo, se propuso el uso de antioxidantes como terapia farmacológica con el fin de
inhibir la formación de especies reactivas de oxígeno (EROs) o bien promover su captura e
inactivación (Martínez-Lazcano, 2010). Es por ello que se requiere, buscar alternativas para
la obtención de principios activos que posean actividad antioxidante y por ende actividad
nootrópica de origen natural.
En el Ecuador se registran actualmente 18 198 especies de plantas vasculares, de las
cuales es importante indicar también de estas plantas registradas, 17 748 son nativas. La
diversidad vegetal del país representa actualmente el 7,6 % de las plantas vasculares
registradas en todo el planeta (Ministerio del Ambiente para el Convenio sobre la Diversidad
Biológica, 2015). Siendo un país mega diverso, es considerable que la fuente investigación
sea la flora ecuatoriana, cuya finalidad es determinar la actividad nootrópica de las plantas
que usualmente se consumen en los hogares, generando de alguna manera una mitigación en
el deterioro mental.
El café es una de las bebidas más consumidas y populares de todo el planeta. Estudios
recientes indican que algunos constituyentes del café, como la cafeína, los ácidos fenólicos
(derivados del ácido clorogénico), los compuestos formados durante la reacción de Maillard
(melanoidinas) y ligninas, poseen propiedades antioxidantes (Pérez, Chávez, & Medina,
2013), y en el país ha ido incrementando la producción del mismo en los últimos años como
lo indica la Asociación Nacional de Exportadores de Café, (ANACAFÉ, 2002) estima que
en la región Costa se siembra 112 000 hectáreas (ha), en la Sierra 62 000 ha, en la región
Amazónica 55 000 ha, y en Galápagos 1 000 ha de cafetales.
Sin embargo, al incrementarse la producción cafetera en el país, ha ocasionado una
problemática ambiental, ya que también genera gran cantidad de subproducto (residuo) en
el procesamiento del café. La pulpa de café es el residuo que mayor porcentaje se obtiene
después del procesamiento que se realiza para conseguir la almendra del fruto, este residuo
constituye un factor para la contaminación de agua y suelos, debido al inadecuado proceso
de eliminación, porque existe desinformación sobre su utilidad, generando un deterioro en
el medio ambiente. Es por esto que resulta relevante que el presente trabajo de investigación
se utilice a la pulpa de café arábica para darle un valor agregado, ya que posee compuestos
5
bioactivos que le dan propiedades antioxidantes, dentro de los cuales destacan los
compuestos fenólicos, como lo demuestran varios estudios realizados entre ellos se
encuentra aquellos que buscan alternativas para el manejo sustentable de los residuos del
café, en los cuales se reporta las mejores extracciones sólido – líquido de dichos compuestos
bioactivos a través de extracciones convencionales con el objetivo de obtener mayor cantidad
de fenoles totales y consecuentemente determinar la actividad antioxidante (Wong, y otros,
2013) .
Por tanto, el presente estudio busca determinar un método de extracción adecuado de
compuestos bioactivos de la pulpa de café arábica, para ello se enlaza con los estudios de
fitoquímicos y etnobotánicos existentes, y aportar con la evidencia in vivo con ratones mus
musculus como sujetos de experimentación para evaluar la actividad nootrópica del extracto
que cumpla con el requerimiento de mayor cuantificación de fenoles totales, a través de
técnicas evaluación de aprendizaje espacial como son el laberinto radial de ocho brazos y el
laberinto acuático de Morris.
Formulación del problema
El presente trabajo pretende responder a la siguiente cuestión ¿Cuál es la actividad
nootrópica del extracto de la pulpa del café arábica (Coffea arabica), en estudios in vivo a
través de pruebas de aprendizaje espacial utilizando ratones de la especie mus musculus
como sujetos de experimentación?
Preguntas directrices
¿Cuáles son las pruebas específicas de control de calidad, que se debe realizar a la pulpa del
café arábica (Coffea arabica)?
¿Cuáles son los metabolitos representativos de la pulpa del café arábica (Coffea arabica)?
¿Cuál es el mejor método de extracción de los metabolitos secundarios y cómo se determina
la mayor cantidad de fenoles totales existentes en la pulpa de café arábica (Coffea arabica)?
¿Qué relación existe entre la cantidad de fenoles totales y la actividad nootrópica de la pulpa
del café arábica (Coffea arabica)?
6
Objetivos
Objetivo general.
Evaluar la actividad nootrópica del extracto de la pulpa del café arábica (Coffea
arabica), con mayor cantidad de fenoles totales, en estudios in vivo a través de pruebas de
aprendizaje espacial utilizando ratones de la especie mus musculus como sujetos de
experimentación.
Objetivos específicos.
- Realizar las pruebas específicas para el análisis de control de calidad, que se debe
realizar a la pulpa del café arábica (Coffea arabica)
- Determinar la caracterización fitoquímica de la pulpa del café arábica (Coffea
arabica).
- Determinar el contenido de fenoles totales e identificar el solvente más favorable,
para la mejor extracción con o sin ultrasonido de compuestos fenólicos en la pulpa
del café arábica (Coffea arabica).
- Establecer la actividad nootrópica in vivo, con relación a la cantidad de fenoles
totales (ácido clorogénico) a diferentes dosis de la pulpa del café arábica (Coffea
arabica), en ratones de la especie mus musculus.
Justificación
Ecuador posee una gran capacidad como productor de café, y es uno de los pocos
países en el mundo que exporta todas las variedades de café. Debido a su ubicación
geográfica, Ecuador produce uno de los mejores cafés de América del Sur y de los más
demandados en Europa. Los diferentes ecosistemas que posee el Ecuador permiten que los
cultivos de café se den a lo largo y ancho del país (Pro Ecuador, 2016). La producción del
café se ha ido acrecentando en los últimos años, por lo que el procesamiento para la
obtención de la almendra de café, (producto que posee mayor valor agregado) genera
paralelamente residuos o subproductos que al no tener un valor comercial es desechado
incorrectamente por parte de la industria cafetera ocasionando un impacto ambiental, ya que
produce una contaminación de agua y suelo.
7
El proceso que comúnmente se utiliza para dicho procesamiento es la denominada
vía húmeda que involucra el despulpado, la desmucilaginación utilizando agua, secado del
fruto y finalmente la eliminación de las envolturas internas por el trillado, de ahí, se obtiene
un 29% de la pulpa de café en base seca, y a pesar de ser un subproducto mayoritariamente,
no es aprovechado por la industria aunque existen estudios que corroboran la presencia de
compuestos bioactivos como los compuestos fenólicos: el ácido gálico, ácido clorogénico y
antocianinas, entre otros que le dan la propiedad antioxidante.
Además un elemento importante es que, el presente estudio ayuda en la búsqueda de
atenuar la contaminación ambiental, que se produce al desechar inadecuadamente la pulpa
de café, debido al desconocimiento de los productores cafeteros. En la actualidad existen
numerosos estudios que indican el manejo alternativo de residuos del café que pretende
optimizar su uso, determinando el mejor método de extracción de fenoles totales que brinda
la actividad antioxidante y que se encuentra relacionado con la actividad nootrópica es por
ello que se desea dar un valor agregado con el estudio in vivo evaluando la actividad
nootrópica por medio de pruebas de aprendizaje espacial haciendo uso de los métodos de
laberinto radial de ocho brazos y el laberinto acuático de Morris.
Al determinar la evidencia que dicho subproducto posee esta actividad nootrópica,
sería una gran ventaja para la sociedad, ya que se obtendría un producto natural con evidencia
preclínica; con la finalidad de ser un tratamiento que ayude en el mejoramiento de la
memoria, la capacidad de aprendizaje y la concentración, tratando de contrarrestar en cierta
manera el incremento de enfermedades crónicas neurodegenerativas que se ha convertido en
una problemática mundial; cabe mencionar además que se convertiría en un ingreso más
para los productores cafeteros que ven en la pulpa de café simplemente un desecho, y
generaría un interés por parte de las empresas farmacéuticas para la inversión un nuevo
fitofármaco.
8
Capítulo II
Marco teórico
Antecedentes.
El estudio de la actividad nootrópica de productos de origen natural, en la última
década se ha incrementado, debido al auge de consumo de drogas inteligentes, existe
numerosos estudios que relacionan la actividad nootrópica de una planta con las
propiedades antioxidantes; como lo reporta Tanaka, S.-Galduróz, & Gobbi (2013), en su
estudio de revisión del extracto de las hojas Ginkgo Biloba en la que atribuye que la
actividad antioxidante, convierte a dicho extracto en un agente neuroprotector frente a
enfermedades neurodegenerativas desarrolladas por un estrés oxidativo como el
Parkinson; en otro estudio realizado por Alonso (2012), corrobora lo dicho anteriormente
e indica la importancia de contar con productos naturales con actividad antioxidante
como Euterpe oleracea, entre otros, que dan muestras de su potencial para atenuar o
incluso la posibilidad de inhibir el estrés oxidativo.
Nuevos estudios in vivo realizado en el año 2016, por parte de equipo de
investigación de la Universidad Federal de Sao Paulo- Brasil, confieren que los estudios
realizados en ratas Wistar machos administrados el extracto de Ginkgo Biloba (GB)
sugieren que modula diferencialmente memoria a corto y largo plazo, así como un
comportamiento similar a la ansiedad (Cláudia R Zamberlam, 2016). Y en un estudio
clínico realizado con pacientes de 69 años aproximadamente diagnosticados con
deterioro cognitivo vascular (DCV), en las instalaciones de Sandoz Clinical, se realizó
una evaluación geriátrica, por parte del equipo de trabajo liderado por la PhD Vida
Demarin, concluyeron que de acuerdo a sus resultados, GB parecía ralentizar el deterioro
cognitivo en los pacientes con DCV, pero el efecto fue demostrado en sólo una de las
cuatro pruebas neuropsicológicas administradas, por lo que invitan a seguir realizado más
pruebas confirmatorias (Demarin, 2017).
Un vez realizada una revisión literaria en función a la relación que existe entre la
actividad antioxidante y la actividad nootrópica de bioactivos provenientes de las plantas;
en este estudio se optó por trabajar con la pulpa de café arábica que es un subproducto
del procesamiento para la obtención de la almendra del fruto, ya que existen estudios
9
como T. López (2013) y Libia Fonseca García (2014) que avalan la presencia de
compuesto fenólicos como el ácido clorogénico, incluso el último estudio confirma dicho
potencial de los residuos de café como fuentes naturales de antioxidantes.
Estudios de bioactivos presentes en la pulpa de café que le dan la propiedad de
actividad antioxidante que está ligada la presencia de compuestos fenólicos como el ácido
clorogénico y ácido cinámico realizado por el investigador Ricardo Bressani, en su
trabajo reporta que se encuentra en un 2,6 % y un 1,6 respectivamente en base seca de la
pulpa de café, como la pulpa de café conjuntamente su cáscara comprende casi el 45 %
de la cereza, son uno de los principales subproductos de café y podrían ser un material
para la extracción de cafeína y polifenoles como lo indica en sus estudios (Bressani,
Penaloza, Molina, & Gomez, 1985) y (Esquivel & Jiménez, 2012).
Técnicas de extración de compuestos fenólicos de la pulpa de café , que permite
la utilización de una alternativa tecnólogica (ultrasonido) fue el método empleado por
Norbey Tobón cuyo objetivo era determinar las mejores condiciones en la extracción
asistida por ultrasonido de los compuestos fenólicos de la pulpa de café, en las que
determinó los mejores solventes de extracción como también la eficiencia del ultrasonido
en el proceso de extracción (Tobón, 2015).
Fundamento Teórico.
Fundamento botánico.
Origen e historia.
El café arábica en el Ecuador denominado también como café arábigo al ser un
cultivo estacional requiere de 180 – 200 días de lluvia (6 meses) para un óptimo
desarrollo, aunque el cafeto presenta cierta tolerancia a la sequía su producción declina
considerablemente cuando las precipitaciones disminuyen. La especie arábiga requiere
un periodo seco de alrededor de tres meses, tiene una amplia adaptabilidad a los distintos
ecosistemas de las cuatro regiones del Ecuador (Costa, Sierra, Amazonía e Islas
Galápagos). Se cultiva desde altitudes cercanas al nivel del mar hasta los 2.000 metros.
Las principales variedades arábigas cultivadas en el Ecuador son: Típica, Caturra,
Bourbón, Pacas, Catuaí, Catimor y Sarchimor (Pro Ecuador, 2013).
La especie Arábica (Coffea arabica) es una planta de tipo arbustivo, originaria
de las regiones altas del África Central, particularmente del Sureste de Etiopía y Norte
de Kenia (Romero, Camayo, González, Cortina, & Herrera, 2010).
10
Características botánicas.
El café pertenece a la familia de las rubiáceas (Rubiaceae). Dentro del género
Coffea hay más de 100 especies, las dos especies más importantes desde el punto de vista
económico son Coffea arabica L. (café arábica) y Coffea canephora (café robusta) (Pérez
& Carril, 2014). Según el informe de “Rendimientos de Café Grano Seco en el Ecuador
2016” manifiesta la productividad de ambas especie en el Ecuador y los principales
resultados obtenidos indican que durante el periodo de análisis, la especie de café
Arábigo representó el 63% de la producción nacional de café y presentó un rendimiento
de 0,22 t/ha. El café Robusta constituyó el 37% del total producido a nivel nacional y
cuenta con una productividad de 0,48 t/ha (Monteros Guerrero, 2016).
El Coffea arabica es genéticamente diferente a otras especies de café, ya que es
tetraploide, lo que le hace tener un total de 44 cromosomas en lugar de 22. Se trata de un
arbusto grande, de aproximadamente 5 metros de altura, con hojas ovaladas y de color
verde oscuro brillante. La floración se produce después del periodo de lluvias, y sus flores
son blancas, de aroma dulce y están dispuestas en racimo. Los frutos, verdes y ovalados,
se vuelven rojos cuando maduran, al cabo de 7-9 meses. Cada fruto contiene
habitualmente dos semillas de aspecto chato y aplanado (los granos de café) (Pérez &
Carril, 2014).
Fruto de café.
El fruto de café o cereza de café, está constituido por la cáscara o endocarpio, una
capa mucilaginosa llamada mesocarpio y la pulpa o exocarpio. La semilla de café
presenta una superficie plana y se encuentran dos unidades dentro del fruto de café
(Tobón, 2015).
Ilustración 1.1 Composición del fruto de café
Fuente: (Ramos Giraldo, Sanz Uribe, & Oliveros Tascón, 2010).
11
Composición del fruto de café
Un grano de café contiene normalmente un 34 % de celulosa, un 30 % de
azúcares, un 11% de proteínas, de un 6 a un 13% de agua, y entre un 2 a 15% de materia
grasa. Otros componentes destacables son minerales, como el potasio, calcio, magnesio
y fósforo, ácidos orgánicos (cafeilquínicos o clorogénicos) y alcaloides, como la cafeína
(1-2,5%) y la trigonelina. En algunos casos también se han detectado compuestos
exógenos (contaminantes) como pueden ser restos de pesticidas, micotoxinas y
benzopireno (Pérez & Carril, 2014).
La pulpa de café
La pulpa de café es uno de los subproductos que se generan en la industria cafetera
en el proceso de obtención de la almendra del café para la comercialización, siendo uno
de los desechos con mayor porcentaje que se forja en la industrialización del café.
Tabla 1.1 Composición de los principales subproductos del procesamiento del café
Componentes Pulpa (% en base peso
seco)
Cáscara(% en base peso
seco)
Carbohidratos 44 57,8
Fibra 21 -
Grasa - 2
Cafeína 1,25 1,3
Proteínas 12 9,2
Taninos - 4,5
Polifenoles 1,0 -
Fuente: (Prado, 2011).
Procesamiento de la pulpa de café.
El procesamiento del café comúnmente utiliza la vía húmeda que involucra el
despulpado, la desmucilaginación utilizando agua, secado del fruto y finalmente la
eliminación de las envolturas internas por el trillado. Obteniendo después de este proceso
29 % de pulpa de café en base seca, 4 % de mucílago, 12 % de cascarilla y 55% de café
excelso o almendra de café.
12
Metabolitos Secundarios
Compuestos polifenólicos.
La pulpa de café es un residuo agrícola con alto contenido de polifenoles, los
llamados polifenoles son compuestos que presentan más de un grupo hidroxilo unido a
uno o más anillos bencénicos. Los cuales contiene una gran variedad de ácidos
hidroxicinámicos, como son el ácido clorogénico, ácido cafeico y ácido ferúlico, y por
acción de enzimas de tipo hidrolasas pueden ser biotransformados en aromas o
antioxidantes. Los compuestos polifenólicos constituyen una clase de metabolitos
secundarios biosintetizados por el reino vegetal (Prado, 2011).
Ácidos hidroxicinámicos.
Los alimentos y los subproductos como la pulpa de café contienen ácidos
hidroxicinámicos que son un grupo de compuestos presentes en la pared celular vegetal,
cuyos principales representantes son el ácido Ferúlico, p-Cumárico, caféico y sinápico,
de los cuales el ácido ferúlico y p-cumárico son los de mayor abundancia en la naturaleza.
Están formados básicamente por un anillo aromático, un grupo alifático y un ácido
carboxílico en el extremo. Son denominados hidroxicinámicos por la sustitución del
grupo -OH (hidroxilo) en el anillo aromático (Tobón, 2015, pág. 41).
1
6
2
5
3
4
7 9OH
O
8
Ilustración 1.2 Fórmula estructural del ácido cinámico.
Fuente: (Osorio, 2014).
Tabla 1.2 Sustituyentes de la fórmula estructural de ácido cinámico
C3 C4 C5
H OH H P - cumárico
OH OH H Cafeico
OCH3 OH H Ferúlico
OCH3 OH H sinápico
Fuente: (Osorio, 2014).
13
Ácido clorogénico.
Los ácidos hidroxicinámicos (Cafeico, Ferúlico, Cumárico y Sinápico) cuando
están esterificados con el ácido quínico forman los llamados ácidos clorogénicos.
(Tobón, 2015) Por lo tanto los ácidos clorogénicos son ésteres del ácido quínico, de los
cuales el más abundante es el 5-cafeoilquínico. Sus propiedades farmacológicas están
ligadas a su naturaleza antioxidante.
Ilustración 1.3 Obtención del Ácido Clorogénico.
Fuente: (Osorio, 2014).
El café verde es una de las principales fuentes de ácidos clorogénicos de la dieta.
Durante el proceso de tueste, los ácidos clorogénicos se transforman en lactonas y
fenilindanos (Pérez & Carril, 2014).
Durante el tostado, parte de estos compuestos es isomerizada, una parte es
transformada en quinolactonas y otra parte es degradada en compuestos de bajo peso
molecular (García, 2010).
Ilustración 1.4 Formación de Quinolactonas.
Fuente: (García, 2010).
14
Control de calidad del material vegetal.
Determinación materias extrañas.
Materias extrañas, son partes de la droga que no corresponden a las exigencias
que estipulan las monografías herbolarias como el color, tamaño, estado, grado de
pulverización, mezclas de otras partes de la planta o de otras plantas, polvo, arena, piedra
y otras sustancias minerales (Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos,
2013). En el presente estudio dentro de la mezcla de otras partes del fruto se tomó como
parámetro la determinación de fibra cruda, para asentir que se trabajó con la pulpa de
café.
A pesar de que la pulpa no se ingiere, se realizó este procedimiento para poder
determinar a partir de este parámetro si la materia vegetal con la que se trabaja es
propiamente la pulpa de café arábica, y no otra parte del fruto. El porcentaje que se estima
según Bressani, Penaloza, Molina, & Gomez (1985) es del 21 % y según el estudio de
Tobón (2015) es de 27,49 % de su composición proximal, por ende para la presente
trabajo de investigación se tomó en cuenta estos valores como límites.
Para la determinación de la fibra cruda en la pulpa de café se utilizó el método de
fibra cruda (Weende), el cual está basado en la solubilidad de la fibra no celulósica por
medio de soluciones de ácido sulfúrico e hidróxido de potasio; el fundamento del método
es asemejar este proceso al que desempeña el organismo en su función digestiva (Tobón,
2015, pág. 99).
Determinación de grasa.
El análisis de grasa o extracto etéreo de una muestra (pulpa de café), consiste en
someter la muestra exenta de agua (deshidratada) a un proceso de extracción del material
vegetal con éter etílico, separación de las fracciones volátiles, separación de las
sustancias insolubles, secado del residuo no-volátil y medición de su masa, como lo
estipula el Instituto de Normas técnicas ecuatoriana, en la norma técnica (NTE INEN-
ISO 1854, 2016)
Análisis granulométrico.
El tamaño de partículas que debe poseer la pulpa seca de café influirá en los proceso
de extracción para determinar la cantidad de fenoles totales, así lo menciona Tobón. N.
(2015, pág. 70)
15
El análisis de las propiedades físicas de la pulpa de café es de gran importancia para sus
diversas operaciones unitarias de: transporte, manejo y almacenamiento; especialmente
para aquellas actividades que están relacionadas con el manejo y análisis de sus
compuestos bioactivos en el laboratorio a causa de sus propiedades de cohesión y
segregación; es así como entre mayor sea el tamaño de partícula menor es el área de
contacto entre el solvente y la pulpa de café y la extracción podría ser subextraída; de otra
parte, si el lecho de partículas es demasiado fino, se puede realizar una sobreextracción o
presentarse en los fenómenos de formación de grumos lo que dificultaría su análisis
posterior y/o manejo.
Determinación de cenizas totales.
El método de cenizas totales está diseñado para medir la cantidad total de materia
que queda después de la ignición. Este incluye tanto cenizas fisiológicas que proceden
del tejido mismo de la planta, como las no fisiológicas, que son el residuo de las materias
extrañas (como arena y tierra) adherida a la superficie de la planta (Farmacopea
Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, 2013).
Determinación de porcentaje de humedad.
La humedad corresponde al contenido de agua presente en la muestra. Según el
Instituto de Normas Técnicas Ecuatorianas, INEN, en una de sus normas técnicas (NTE
INEN-ISO 2291, 2013); indica que el contenido de humedad es la pérdida en masa
medida bajo las condiciones operativas especificadas. El contenido de humedad y materia
volátil se expresa como un porcentaje por masa. El porcentaje que se estima según
Bressani, Penaloza, Molina, & Gomez (1985) es del 12 % y según el estudio de (Ramírez
Velasco (2016) es de 6,09 %, por ende para nuestro estudio se tomó en cuenta estos
valores como límites.
Control de Identidad material vegetal.
Características morfológicas.
Es la descripción macroscópica de la morfológica de la pulpa de café arábica,
mediante un estudio del fruto, en donde se observó sus partes, forma, dimensiones, color,
olor, marcas extrañas y peculiares.
16
Ensayo de identidad.
En este estudio se determinó el porcentaje de cafeína ya que existe estudios
previos que mencionan que la pulpa de café en base seca posee 1,3 %, de este alcaloide,
lo que nos permitió obtener un parámetro adicional en el control de calidad de la muestra
vegetal utilizada, para ello se hizo uso de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución
(HPLC)
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), es una técnica utilizada para
separar los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar
(columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe2SiCl.
La fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en la
fase móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-
covalentes de los compuestos con la columna (Miranda & Martín, 2013).
Estas interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la
muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los
compuestos a determinar, ya que ofrece la posibilidad de identificar y cuantificar sus
componentes mediante el uso de sustancias patrón (Universidad de Pamplona, 2015).
Extractos Vegetales
Métodos de extracción.
La extracción es una de las operaciones básicas del laboratorio. Se define como
la acción de separar con un líquido una fracción específica de una muestra, dejando el
resto lo más íntegro posible. Se pueden realizar desde los tres estados de la materia, y se
llaman de la siguiente manera: 1) Extracción sólido – líquido; 2) extracción líquido –
líquido y 3) extracción gas – líquido (Nuñez, 2008).
Método maceración.
Se entiende por maceración al contacto prolongado durante cierto tiempo de la
droga con el menstruo constituyendo un conjunto homogéneamente mezclado en el cual
el menstruo actúa simultáneamente sobre todas las proporciones de la droga, circulando
a través en todas las direcciones y sentidos y disolviendo sus principios activos hasta
producirse una concentración en equilibrio con la del contenido celular (Carrión &
García, 2010, pág. 28).
17
Alternativas tecnológicas.
En la actualidad el uso de tecnología para agilizar un proceso y optimizarlo ha
tomado un gran auge debido a varias ventajas entre estas se pueden considerar:
disminución del tiempo de extracción, mezclados más eficaces, permite el contacto de la
partícula con el solvente es por esta razón que se utilizará un equipo llamado ultrasonido
que imite un tipo especial de vibración de onda de sonido con frecuencia más allá de la
audición humana (45 KHz).
Determinación de fenoles totales
Los compuestos fenólicos poseen una estructura química especialmente adecuada
para ejercer una acción antioxidante actuando como captores de radicales libres
neutralizando peligrosas especies reactivas de oxígeno e iones metálicos quelantes
(Gracia, 2007).
La concentración de fenoles totales se determinó a través del método de Folin-
Ciocalteu (FC), con la finalidad de que se genere un ion fenolato que reduce al FC
mediante una reacción de tipo óxido/reducción como se observa en la ilustración 1,5 y
genera la formación de un complejo de Mo (V) que presenta una coloración azul cuya
absorbancia se mide a una longitud de onda de 765nm (Muñoz-Bernala & Gaspar A.
Torres-Aguirrea, 2017, pág. 24)
En la siguiente ilustración se presenta la reacción de oxido reducción entre el
Ácido gálico y el reactivo de Folin – Ciocalteu en medio básico.
Ilustración 1.5 Redox entre ácido Gálico y Reactivo de Folin Ciocalteu
Fuente: (Muñoz-Bernala & Gaspar A. Torres-Aguirrea, 2017).
18
Fundamento Anatómico Farmacológico
Capacidades cognitivas
Memoria
La memoria es un mecanismo o proceso que permite conservar la información
trasmitida por una señal después de que se ha suspendido la acción de dicha señal,
permite almacenar experiencias y percepciones para evocarlas posteriormente. La
memoria es uno de los procesos cognitivos más complejos y, al igual que la atención
interviene en el adecuado funcionamiento de procesos cognoscitivos (Mestre Navas &
Palmero Cantero, 2004)
Existen tres clases de memoria: la memora sensorial que se compone de varios
registro sensoriales y que tiene una gran capacidad pero un rapidísimo decaimiento o
pérdida de la misma. La información que es seleccionada por la memoria sensorial es
transmitida a la memoria de corto plazo; la memoria de trabajo, donde se retiene la
información por más de 20 segundos. La tercera estructura es la memoria a largo plazo
que mantiene la información por largos período de tiempo (Mestre Navas & Palmero
Cantero, 2004).
Atención.
Es un sistema de control de la actividad metal del organismo, en donde hace uso
de técnicas de neuroimagen que determinaron que áreas cerebrales se activan cuando los
sujetos realizan tareas de atención para el desarrollo de aprendizaje (Gómez Uribe, 2016).
Aprendizaje.
Se puede definir como la capacidad que tiene el cerebro para identificar los
estímulos que ha percibido con anterioridad (situaciones, personas, objetos, etc.). El
reconocimiento es una habilidad cognitiva que nos permite recuperar información
almacenada en la memoria y compararla con la información que se presenta ante la
persona (Cognifit, 2018).
19
Enfermedades neurodegenerativas.
Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por un deterioro progresivo
de las habilidades cognitivas y son una de las principales causas de enfermedad y
mortalidad en los países desarrollados. Estas enfermedades, además de progresivas, son
irreversibles porque hasta el momento no se han conseguido tratamientos definitivos para
ninguna de ellas (Domínguez, Álvarez, Suárez-Merino, & Goñi-de-Cerio, 2014).
Demencia y Alzheimer.
La demencia es una enfermedad neurodegenerativa que conlleva una pérdida
importante de las capacidades cognitivas. Entre los diferentes tipos de demencia, el
Alzheimer (EA) es el más común, suponiendo entre un 50% y un 70% de los casos. Sus
efectos fisiológicos están caracterizados por una pérdida de volumen cerebral y bajos
niveles de algunos neurotransmisores importantes. Sus primeros síntomas suelen estar
relacionados con pérdidas de memoria, progresando gradualmente hasta incapacitar
completamente a los afectados para poder llevar una vida autónoma. Así como también
alteraciones cognoscitivas como la afasia, apraxia y agnosia (Alianza de enfermedades
Neurodegenerativas , 2016, pág. 34)
El Alzheimer (EA) ocasiona, como se puede evidenciar en la ilustración 1.6
lesiones macroscópicas (moderada atrofia global, atrofia de los lóbulos temporales,
atrofia de la corteza cerebral y mayor dilatación de los surcos y ensanchaminetos de los
ventrículos ) y lesiones microscópicas en donde revela cambios histopatológico (
acumulación de placas amiloideas o seniles, formación de ovillos neurofibrilares y
pérdida neuronal sinaptica) (Solla, 2016, pág. 14).
Ilustración 1.6 Lesiones Macroscópicas y Microscópicas
Fuente: (Solla, 2016).
20
Existen tres proteínas cerebrales que actuan como indicadores de la
neurotoxicicidad cerebral y el desarrollo de EA, si estas presentan anomalías: la proteína
procursora de amiloide (APP) que regula las funciones cerebrales, la proteína beta
amiloide y la proteína TAU que son componentes normales de las neuronas en las que
se asocia a los microtubulos intracelurales regulando la polimeracion de estos para
posibilitar el impulso nervioso entre neuronas. La acumulación de placas amiloideas
disminuye la transmision sináptica e incrementa el estrés oxidativo y provoca la
hiperfosforilacion de la proteína TAU generando daño neuronal y otras alteraciones
(Solla, 2016, pág. 16)
Los factores de riesgo que permiten que se desarrolle la EA, son la edad ya que
es una patología edad – dependiente, factor genético en especial la presencia del alelo
apolipoproteína e4 (ApoE4) y factores de riesgo sugeridos como diabetes mellitus tipo
2, obesidad, antededentes familiares, hipertensión, depresión y traumatismo
craneoencefálico.
En la actualidad el tratamiento farmacológico para EA que se administra,tiene el
objetivo de retrasar la progresion de la enfermedad, mantener las funciones conservadas,
controlar la sintomatología clínica y mejorar la calidad de vida del paciente (Solla, 2016).
Según su funcionalidad constan:
Los inhibidores de acetilcolinisterasa para permitir compensar la
disminucion de acetilcolina que genera la EA entre estos tenemos Tacrina,
Donezepilo, Rivastigmina, Galactamicina.
Antagonista del receptor N- metil – D aspartato (NMDA), el glutamato es
un aminoácido excitador indispensable para la entrada de calcio en la
neurona cuando se encuentra en concentraciones excesiva activa una
cascada de excitotoxicidad, la Memantina se comporta como un agonista
no competitivo con baja afinidad por los receptores NMDA (Solla, 2016,
pág. 20)
Otras enfermedades del sistema nervioso central que provacan deficits
progresivos en las capacidades cognoscitivas y en la memoria son por ejemplo
enfermedades cerebrovasculares, enfermedad de Parkinson, Corea de Huntington,
Hematoma subdural, Hidrocefalia normotensa, tumor cerebral y enfermedades
sistemicas como el hipotiroidismo, deficiencia de ácido fólico, neurosífilis (Solla, 2016,
pág. 19).
21
Existen nutrientes con posibles beneficios para las funciones cognitivas, así:
Ácidos grasos poliinsaturados (omega -3 ), resisten a los radicales libres
disminuyendo el estrés oxidativo y la inflamación.
Vitamina E y C previenen el estrés oxidativo y reducen los radicales libres a nivel
celular.
Vitaminas de complejo B (B-6, B-9, B-12), actúan como cofactores de la
metilación de la hemocisteína, elevados niveles de la misma están relacionados
con el riesgo del deterioro cognitivo.
Polifenoles con acción antioxidante y neuroprotector, ya que reduce la
acumulación de placas amiloideas (Solla, pág. 20).
Existen Fitofarmacos como el Ginkgo Biloba, que poseen estudios farmacológicos
que han demostrado algunos efectos, entre estos: incremento de la metabolizacion de la
glucosa, actividad antioxidante, antagonismo del factor activador de plaquetas, efecto
vasodilatador provocado por los flavonoides como la quercetina. Además por último en
el sistema colinérgico del Sistema Nervioso Central (SNC) puede inducir aumento en la
síntesis de acetilcolina y, un aumento de los receptores colinérgicos que en el anciano se
ven reducidos en número (Morales, Bustamante, & Gallardo, 2000, pág. 95)
Los principales grupos de constituyentes del Ginkgo Biloba los conforman las
lactonas sesquiterpénicas (bilobálido) y diterpénicas (ginkgólidos A, B, C, J, M,)
proantocianidinas, bioflavonas (ginkgetina, isoginkgetina, bilobetina,) así como
agliconas flavónicas (quercetina, kaemferol,) y sus heterósidos. Contiene también
pequeñas cantidades de ácido ginkgólico (Morales, Bustamante, & Gallardo, 2000, pág.
96)
Recientes investigaciones indican que el bilobálido, otra de las lactonas terpénicas
obtenidas de las hojas del ginkgo tiene acción neuroprotectora. En estudios
experimentales realizados en animales han demostrado que el Ginkgo Biloba favorece la
recuperación del tejido neural y mejora el aprendizaje en ratas que han sido lesionadas
en la corteza frontal (Morales, Bustamante, & Gallardo, 2000)
El mecanismo de acción farmacologico Ginkgo Biloba según Morales, Bustamante,
& Gallardo (2000) es la disminución de la velocidad de desaparición de los receptores
muscarínicos y a2-adrenoceptores asociada al envejecimiento y favorece el
mantenimiento de los procesos de captación de colina en los terminales nerviosos del
hipocampo. Por su propiedad antioxidante, inactiva radicales libres de manera más
potente que la vitamina E.
22
Actividad nootrópica.
La actividad nootrópica es la capacidad de potencializar y estimular los proceso
cognitivos que adquiere los fármacos, suplementos nutracéuticos o alimentos
funcionales, por lo que se los denomina drogas inteligentes. Estos productos de origen
natural o sintético tiene la finalidad de mejorar las capacidades cognitivas del cerebro. El
término nootrópico fue acuñado por el farmacólogo Cornelius Giurgea en la década de
1970.
Un nootrópico mejora el aprendizaje y la memoria, especialmente si el
metabolismo neuronal está alterado por una carencia de oxígeno, electrochoque o
problemas relacionados con la edad, facilitación del flujo de información entre los
hemisferios cerebrales y mejora de la resistencia general del cerebro a daños físicos y
químicos (Franco Ruíz, 2005).
Instrumentos de evaluación de procesos cognitivos animales.
Laberinto Acuático de Morris.
El laberinto Acuático fue diseñado en 1981 por Richard G. Morris para estudiar
y evaluar el aprendizaje y la memoria espacial en ratas de laboratorio (Ruiz, 2007). El
laberinto evalúa la memoria espacial en ratas. Consiste en una piscina circular llena de
agua en la que se sitúa una plataforma que debe ser localizada por el animal y cuya
temperatura oscila entre 18 y 27 °C, según se utilicen ratas o ratones (Vicens, Redolat,
& Carrasco, 2003).
Laberinto radial de 8 brazos.
El laberinto radial de 8 brazos, es una técnica de evaluar el aprendizaje espacial
de animales de experimentación, en el cual consiste, según (Soriano & Guillazo Blanch,
pág. 357):
En un aparato con ocho brazos que están unidos por una plataforma central. Al final de
cada brazo se pone comida y el animal de experimentación aprende a conseguir la comida
de manera eficiente, visitando cada brazo solo una vez. El tipo de memoria utilizada para
retener la información sobre qué brazo se ha visitado previamente fue denominada por
Olton y colaboradores como memoria de trabajo. La definen como el tipo de memoria
que sirve para retener la información necesaria para guiar el comportamiento.
23
Marco legal
Existen normas nacionales vigentes que limitan el estudio de las especies
vegetativas en el Ecuador, con la finalidad de disminuir la pérdida de especies, tráfico de
especies, así como resguardar la propiedad intelectual de los investigadores.
Los cuerpos legales en nuestro país son la Constitución Política de la República
del Ecuador, LEY FORESTAL Y DE CONSERVACION DE AREAS NATURALES Y
VIDA SILVESTRE vigente desde septiembre del 2004; TEXTO UNIFICADO
LEGISLACION SECUNDARIA, MEDIO AMBIENTE, vigente desde 2013; entre otros,
que estipulan la autorización para la utilización de flora o fauna con fines científicos de
igual manera el control y movilización de productos forestales para la conservación y
aprovechamiento regulado de los recursos forestales. En ella se establecen los requisitos,
obligaciones y condiciones que el beneficiario debe cumplir para prevenir, mitigar o
corregir los efectos indeseables que pueda causar en el ambiente. Como se estipula en el
capítulo VII: DEL CONTROL Y MOVILIZACIÓN DE PRODUCTOS FORESTALES
Art 43. “El Ministerio del Ambiente supervigilará todas las etapas primarias de
producción, tenencia, aprovechamiento y comercialización de materias primas forestales.
Igual súper vigilancia realizará respecto de la flora y fauna silvestres”.
Art 44. “Para efecto de lo dispuesto en el artículo anterior, la movilización de
productos forestales y de flora y fauna silvestres, requerirá de la correspondiente guía de
circulación expedida por el Ministerio del Ambiente. Se establecerán puestos de control
forestal y de fauna silvestre de atención permanente, los cuales contarán con el apoyo y
presencia de la fuerza pública”
En este trabajo de investigación rige los principios éticos en función al Proyecto
de ley LOBA: Ley Orgánica de Bienestar Animal, para el manejo y experimentación con
los animales de experimentación como lo estipula en el Capítulo VIII: DE LOS
ANIMALES PARA EXPERIMENTACIÓN, INVESTIGACIÓN Y DOCENCIA.
Art 46. Sobre el Comité de Bioética.- “Todas las instituciones de educación
superior que cuenten con facultades e institutos de investigación y experimentación en
animales, crearán un Comité de Bioética que controlará y reglamentará estas prácticas,
cumpliendo con los protocolos internacionales de bienestar animal establecidos por la
Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE)”.
Art. 47. Prohibición de la vivisección.- “Queda prohibida la vivisección de
animales en los planteles de educación inicial, básica y bachillerato. La experimentación
didáctica con animales vivos en las universidades, laboratorios y cualquier otro espacio
de experimentación con animales, será supervisada por un Comité de Bioética y
24
únicamente se permitirá en casos en los que no puedan ser utilizadas otras alternativas
didácticas como videos o modelos anatómicos”.
Hipótesis
Hi: hipótesis de trabajo
Se evidencia actividad nootrópica similar a dosis diferentes del extracto de la
pulpa de café administradas en ratones de la especie mus musculus que contiene mayor
cantidad de fenoles totales, comparándolo con el efecto generado con el extracto de
Ginkgo Biloba.
H0: hipótesis nula
Difiere la evidencia de actividad nootrópica similar a dosis diferentes del extracto
de la pulpa de café administradas en ratones de la especie mus musculus que contiene
mayor cantidad de fenoles totales, comparándolo con el efecto generado con el extracto
de Ginkgo Biloba.
Conceptualización de las variables
El extracto de la pulpa de café arábica se obtuvo a través de los diferentes
solventes utilizando los métodos de extracción tanto el convencional como aquel que fue
asistido por alternativas tecnológicas como el ultrasonido, los cuales influyeron en el
contenido de fenoles totales obtenido por esta razón fue una variable independiente
La actividad Nootrópica tiene la finalidad de optimizar las funciones cognitivas
del cerebro, ayuda, a combatir la falta de concentración, la pérdida de memoria y la fatiga
cerebral. Esta tiende a modificarse según la dosis y la concentración del extracto de la
pulpa de café, por lo tanto fue una variable dependiente.
El aprendizaje cognitivo, memoria espacial, medido por el tiempo de latencia y
el porcentaje de aciertos y desaciertos que se genere una vez sometidos a los ratones a
pruebas de evaluación de procesos cognitivos (aprendizaje espacial y memoria),
previamente entrenados y administrados el extracto de la pulpa de café con mayor
cantidad de fenoles y de Ginkgo Biloba este último como producto de referencia.
25
Capítulo III
Metodología de la Investigación
Diseño de la Investigación.
Esta investigación se fundamenta en el enfoque o paradigma cuantitativo , a través
de la determinación de métodos de extracción con sus respectivas variables para obtener el
extracto con mayor cantidad de fenoles totales con el objeto de administrar a los sujetos de
experimentación dos dosis diferentes del extracto de la pulpa de café arábica, razón por lo
cual, se determinó el tiempo de latencia y el porcentaje de aciertos y desaciertos con que el
sujeto de experimentación mediante pruebas de procesos cognitivos que se utilizaron en el
presente trabajo de investigación, y con dichos resultados se estableció si el extracto de café
posee la actividad nootrópica.
Esta investigación alcanza al nivel explicativo, que permitió determinar los
parámetros para evaluar la actividad nootrópica y verificar como influyó la cantidad de
fenoles totales presentes en el extracto que fue administrado a los ratones. El estudio se
realizó en dos fases, la primera fase referida a la cuantificación de fenoles totales que se llevó
a cabo mediante experimentación en el laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de
Ciencias Químicas y en el laboratorio de OSP de alimentos para el control de calidad,
identificación de la pulpa de café y para obtención de los extractos de la muestra,
estableciendo parámetros de estabilidad, solubilidad y porcentaje de concentración de
principio activo. Segunda fase que se realizó en el Centro de Biología de la Universidad
Central del Ecuador, para la evaluación de la actividad nootrópica en los animales de
experimentación, ya que dichas instalaciones brindaron un acogimiento para dichos sujetos
y se cumplió de esta manera con lo que estipula el Comité de Ética en el manejo de animales
de experimentación.
Los tipos de investigación en que se apoyó la presente investigación fueron
observacional, bibliográfica y experimental. Observacional porque se permitió recopilar
datos en el laboratorio donde se desarrolló el estudio de experimentación, mediante
26
observación sistemática, cuyos instrumentos de recopilación de datos fueron; registros,
formas estadísticas y mediciones. Bibliográfico porque se realizó una revisión exhaustiva
para establecer el estado sobre el tema investigado. Por el lugar se trata de una investigación
experimental para estudiar la variable dependiente y las variables independientes.
Métodos y Materiales
La investigación se dividió en tres etapas:
Primera Etapa: Búsqueda de información etnofarmacológica y bibliográfica de la
pulpa de café arábica y del fruto de café, recolección del fruto del café, identificación
botánica, generar un Boucher taxonómico de la planta y del fruto, procesamiento del café ,
despulpado, secado, control de calidad, molienda, elaboración de los extractos totales
hidroalcohólico y metanólico.
Segunda Etapa: Cuantificación fenoles totales. Investigación fitoquímica y análisis
cromatográficos del extracto hidroalcohólico o metanólico para determinar los metabolitos
secundarios
Tercera Etapa: Evaluación de la actividad nootrópica del extracto de la pulpa de café
con mayor cantidad de fenoles totales en pruebas de aprendizaje espacial y memoria como
son el laberinto acuático de Morris y Laberinto radial de 8 brazos. Para ambas pruebas se
siguió el protocolo correspondiente.
Equipos y Materiales
- Agitador gravitatorio
- Agitador mecánico o vórtex
- Asa
- Balanza analítica (± 0,0001g). METTLER TOLEDO
- Balanza granatoria OHAUS. TRIPLE BEAM BALANCE 700 SERIES
- Balones aforados 25, 50 100 ml
- Bandejas
- Batería de tamices
- Bomba al vacío
- Brocha
- Cajas Petri
- Cámaras cromatográficos
- Cápsulas de aluminio
27
- Capuchones
- Celdas de vidrio
- Centrifugadora HETTICH ROTOFLIX
- Cocineta eléctrica
- Computadora
- Crisoles
- Cromatógrafo HITACHI L- 2420 UV – VIS
- Desecador con deshidratante adecuado (silicagel),
- Embudo
- Embudo kitasato
- Embudos de separación
- Equipo de extracción de grasa SOLVENT EXTRACTION Ser 148
- Equipo de ultrasonido ULTRASONIC CLEANER MRC
- Espátula
- Espectrofotómetro UV visible
- Estufa THELCO
- Filtro de poro 45um
- Frascos ámbar
- Gradilla
- Incubadora
- Juego de tamices 2000,1000,200, 250, 500 um, charola de fondo y tapa
- Laberinto radial de 8 brazos
- Laberinto acuático de Morris
- Lámpara Uv Vis
- Matraz Erlenmeyer 250, 500 ml
- Mechero
- Micropipetas
- Microscopio
- Molino de tornillo
- Mufla
- Papel Aluminio
- Papel empaque
- Papel filtro cualitativo
- Papel filtro cuantitativo
- Papel periódico
- Pera
- Perlas de ebullición
- Pinza para crisoles
- Piola
- Pipetas graduadas
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- Pisetas
- Placas cromatográficas
- Porta embudos
- Porta y cubre objetos
- Puntas de Micropipetas
- Refrigeradora ELTACHI
- Rotavapor BUCHI Heating Bath B- 490
- Saquillos
- Soporte universal
- Termobalanza
- Tubos con tapa rosca
- Tubos de ensayo
- Vasos de precipitación
- Viales
Reactivos
- Acetato de etilo
- Acetona
- Acetonitrilo (grado HPLC, J.T. Baker)
- Ácido acético
- Ácido gálico.
- Ácido sulfúrico 1 N
- Ácido sulfúrico 2 N
- Agua (HPLC).
- Agua Destilada
- Agua bidestilada
- Alcohol antiséptico
- Alcohol cetona
- Anhídrido acético
- Benceno
- Butanol
- Caldo Mac Conkey
- Caldo Tryptone Soy Broth (TSB)
- Cloroformo
- Cloruro férrico
- Cristal violeta
- Diclorometano
29
- Etanol 50 %
- Etanol al 96,6%
- Éter de petróleo
- Éter dietílico
- Éter dietílico
- Extracto de la pulpa de café
- Fenolftaleína
- Gelatina salada (1% de gelatina + 10 % de NaCl).
- HCl ©
- Hidróxido de sodio 10%
- Limaduras de magnesio
- Lugol
- Medio Agar Mac Conkey
- Medio Manitol Salado (MSA)
- Medio Sabouraud Dextrose Agar (SAB)
- Medio Trypticase Soy Agar (TSA)
- Metanol (grado HPLC, J.T. Baker)
- Metanol al 99,9%
- Metanol al 99,9%
- Muestra desengrasada
- Muestra Vegetal
- Reactivo de Folin – Ciocalteu
- Reactivo Dragendorff
- Reactivo Mayer
- Reactivo Wagner
- Safranina
- Solución de Ácido sulfúrico H2SO4 (1,25%)
- Solución de hidróxido de potasio KOH (1,25%)
- Solución de hipoclorito
- Solución madre de cafeína 1000 ppm
Primera etapa
Recolección del material vegetal.
El café arábica de la especie (Coffea arabica.) se adquirió en la finca San Andrés en la
provincia de Manabí cantón El Carmen en el recinto El Comunal. Se cosechó frutos de café
en estado maduro descartándose frutos verdes, secos o sobremaduros.
30
- Una vez recolectado, se procedió a realizar un lavado de desinfección de la muestra
con una solución de hipoclorito de sodio al 2%.
- Con la ayuda de un molino semiabierto se realizó la extrusión proceso que separó la
pulpa del café de la almendra del café o semilla. El siguiente paso a seguir fue el
proceso de desmucilagación, en donde el mucílago adherido a la pulpa se retiró
mediante un lavado con agua potable hasta completar aproximadamente 1 Kg de
pulpa de café.
- El proceso de secado se realizó en la primera hora a temperatura ambiente con el
objetivo de eliminar el exceso de agua sobrante, y posterior a ello se introdujo la
muestra a una estufa, a una temperatura de 50ºC por 12 horas con el fin de llevar la
materia prima a una humedad del 6 a 10 %H (base húmeda).
Control calidad.
Análisis Materia Extraña
Una vez seca la pulpa de café se pesó, se colocó aproximadamente 100 g en una caja
Petri con el objeto de eliminar materias como pulpa de café con moho, cascarilla o
almendras, las cuales se denominan como materia extraña, posterior a ello se realiza los
cálculos pertinentes para determinar la cantidad de la misma, a través de la diferencia de
pesos, según la siguiente ecuación:
𝐶 = 𝐴 − 𝐵
Ecuación Nº 1 Materia Extraña
Fuente: (Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos).
Donde,
A: Peso total de la muestra
B: Peso de materia limpia
C: Peso de materia extraña
31
Análisis granulométrico.
Un primer proceso fue el determinar el tamaño de partícula que la pulpa de café arábica
para optimizar el proceso de extracción de la muestra por lo que siguió el método MGA-
FH0010 (Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, 2013).
Según el estudio previo de Tobón (2015), se seleccionó la muestra retenida sobre la
malla N°30, que corresponde a un diámetro de partícula de 0,59 mm aproximadamente, que
corresponde a una molienda media.
- Se utilizó una batería de tamices cuyas dimensiones fueron: 2000, 1000, 500,
250,200 μm.
- Se pesó cada uno de los tamices incluyendo la charola de fondo y la tapa
- Se colocó la muestra vegetal previamente licuada en dicha batería de tamices en
el orden especificado anteriormente y durante 10 minutos se colocó en un vórtex
- Transcurrido el tiempo se pesa nuevamente los tamices y se coloca la pulpa de
café en envases de vidrio de color ámbar especificando el tamaño de partícula
que corresponde
- Se usó para la obtención de los extractos, el material vegetal que quedó retenido
en la malla cuyo diámetro de partícula fue 500 μm, y las otras muestras se usaron
para los ensayos de control de calidad e identificación de la pulpa de café.
Determinación de humedad.
Para la determinación del porcentaje de humedad se efectuó el método MGA-FH
0080, como se estipula en Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (2013)
Dicho procedimiento se realizó en las instalaciones del laboratorio de OSP de
alimentos, de la facultad de ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador
- Se pesó las cápsulas previamente taradas, se apunta los pesos
correspondientes
- Posterior a ello se pesó aproximadamente 2 – 3 g de la muestra vegetal de
menor tamaño de partícula
- Se sometió por una hora a 105 ºC en la estufa.
32
- Transcurrido ese tiempo se colocan dichas cápsulas en un desecador de
silicagel hasta que su temperatura haya disminuido a temperatura ambiente
para pesar lo obtenido.
- Este procedimiento se realiza por triplicado
- Se realizó los cálculos respectivos según la siguiente ecuación.
%ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =𝐵 − 𝐶
𝐴× 100
Ecuación Nº2: Porcentaje de Humedad
Fuente: (NTE INEN-ISO 2291, 2013)
Donde;
A: Peso cápsula + muestra húmeda
B: Peso cápsula + muestra seca
C: Peso muestra
En la presente investigación se realizó la determinación del porcentaje de humedad
con la ayuda de una termobalanza, como una prueba confirmatoria, se procedió a pesar
aproximadamente 0,5 g de la muestra esparciendo en el centro del platillo, se escogió la
temperatura y condiciones según lo que la farmacopea describe y se obtuvo dicho porcentaje
cuando se mantuvo un valor constante durante 90 segundos, se realizó el proceso por
quintuplicado.
Se debe tener en consideración que para realizar este procedimiento se tuvo que
trabajar con el material vegetal cuyo diámetro de partícula fue ≤ 200 μm, para que arroje
resultados exactos
Determinación de fibra cruda.
Se realizó la determinación de fibra cruda como lo estipula la norma venezolana
(COVENIN 430 ).
33
Este método requiere que se realice un proceso desengrasante de la muestra vegetal,
por lo que se permite el cálculo de grasa cruda de la pulpa del café.
- Una vez extraída la grasa de la muestra se procedió a pesar 0,2 g de muestra
y se le colocó en un Erlenmeyer de 250 ml y se añadió 100 ml H2SO4 1,25
% se calentó teniendo en cuenta de que no se forme espuma y se desborde.
- Se filtra y se lava con abundante agua destilada caliente hasta los 250 ml
- Una vez realizado este proceso se transfirió la muestra que quedó en papel
filtro lavándole con NaOH 1,25% un volumen de 100ml se hizo hervir y se
bajó la temperatura a una intensidad media por 30 minutos y se procede a
lavar con agua destilada caliente hasta 250 ml
- Se filtró en papel cuantitativo previamente tarado (sometido por 30 minutos
en la estufa a 130 ºC y llevado al desecador hasta que se encuentre a
temperatura ambiente) y pesado.
- Se realizó un lavado hasta 500 ml, este proceso duro casi las 24 horas, una
vez que llega a esa medida se colocó 200 ml de agua destilada caliente y se
agrega 1 – 2 gotas de fenolftaleína, se procedió a seguir lavado hasta que no
presente cambio de coloración y seguido se lavó con 50 ml de etanol al 50 %.
- Filtrado en su totalidad se colocó en una capsula para colocarlo en la estufa
por 10 minutos luego se colocó en el desecador, y una vez temporizado a
medio ambiente la muestra se pesa se lleva a la mufla a 550ºC por alrededor
de una hora o hasta que desaparezca el papel en su totalidad.
- Finalmente se volvió a pesar y posteriormente realizada la técnica se procedió
a calcular el porcentaje de fibra cruda según la siguiente ecuación.
% 𝐹𝑖𝑏𝑟𝑎 𝐶𝑟𝑢𝑑𝑎 = ⟦𝐺1⟧ × 100
Dónde:
𝐺1 = ⟦(𝑃2 − 𝑃1) − (𝐹2 − 𝐹1)
𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎⟧
Ecuación Nº 3: Porcentaje de fibra cruda
Fuente: (COVENIN 430 , 2013)
P1: Peso papel cuantitativo vacío
P2: Peso papel cuantitativo + muestra
F1: Peso capsula vacío
F2: Peso .capsula + cenizas
34
Determinación de Grasa Cruda
Para la determinación de la grasa cruda se realizó bajo los parámetros que estipula la
AOAC OFFICIAL METHODS OF ANALYSIS OF INTERNATIONAL (2012), del
método oficial AOAC 991.36 modificado
- Parte de la determinación de la fibra cruda de la muestra se realizó previamente la
obtención de la grasa cruda, por lo que se pesó aproximadamente 4 g de la muestra
directamente en el pyrex de 500 ml
- Se agregó 60 ml HCl © y 70 ml de agua destilada generando una reacción de
hidrólisis, luego se dejó hervir y posterior a ello por 30 minutos se lo mantuvo a
temperatura media para luego filtrar.
- Se lavó el filtrado con agua caliente hasta que se complete 500 ml y se dejó reposar
por 24 horas y una vez transcurrido ese tiempo y los papeles filtro seco se procedió
a extraer la grasa
- Se pesó los capuchones propios del equipo extractor, los mismos que habían sido
sometidos por 24 horas a 130 ºC en una estufa, luego se colocó los papeles filtro con
la muestra en cada uno de los capuchones de cerámica
- Se armó el equipo y por el transcurso de 25 minutos se sometió a ebullición del éter
dietílico a 80ºC. Se pesó lo obtenido una vez evaporado el solvente y se realizó los
cálculos pertinentes, según la siguiente ecuación:
% 𝐺𝑟𝑎𝑠𝑎 𝐶𝑟𝑢𝑑𝑎 =(𝐵 − 𝐶)
𝐴× 100
Ecuación Nº 4: Porcentaje de Grasa cruda
Fuente: (COVENIN 430 , 2013)
Donde:
A: Peso en gramos muestra
B: Peso en gramos del capuchón del equipo después del secado
C: Peso en gramos del capuchón del equipos antes de la extracción
Determinación de cenizas totales.
35
Se efectuó según los lineamientos del método MGA-FH 0060 como lo indica
Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (2013). Para calcular el porcentaje
de Cenizas totales se hizo uso de la siguiente ecuación.
%𝑐𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 =(𝐵 − 𝐶)
𝐴× 100
Ecuación Nº5: Porcentaje de Cenizas totales
Fuente: (Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos, 2013).
Dónde:
A: Peso muestra en gramos.
B: Peso crisol + cenizas, en gramos.
C: Peso crisol vacío, en gramos.
Control Microbiológico
Se ejecutó un control microbiológico realizando un examen para determinar el
recuento de microrganismos aerobios totales, recuento de mohos y levaduras y la
determinación de Escherichia coli,
El recuento de microorganismos aerobios totales, se pesó un gramo de la muestra de
la pulpa de café de menor tamaño de partícula y se diluyó en una relación 1/10 en caldo
Tryptone Soy Broth (TSB), posterior a ello, se sembró por el método de extensión y vertido
en cajas de estériles que contenían medio Trypticase Soy Agar (TSA) por duplicado. Se
incubó a 37°C por 48 horas, reportándose el número de ufc/g. anotando las características de
las colonias que se formaron y realizando tinción Gram para la identificación de bacterias.
Con el recuento total de mohos y levaduras, una vez diluida la muestra de igual
manera se procedió a sembrar por extensión y vertido en las cajas estériles que contenían
medio Sabouraud Dextrose Agar (SAB) por duplicado. Se incubó a temperatura ambiente
36
por 7días, reportándose el número de ufc/g. anotando las características de las colonias que
se formaron
Para la determinación del microrganismo específico E. coli se revitalizó la muestra
por 24 horas después de haber realizado una dilución 1/10 de la muestra en caldo (TSB),
posterior a ello se seleccionó la muestra al colocar 1ml de muestra revitalizada en 100 ml de
caldo Mac Conkey paralelamente se procedió a realizar un control positivo y negativo y a
cada uno de ellas se pasó agar Mac Conkey, como una forma confirmatoria de la técnica,
reportándose el número de ufc/g. anotando las características de las colonias que se formaron
y observando al microscopio
Control de identidad.
Ensayo de identidad.
Debido a estudios existentes en los cuales se ha determinado la cantidad de cafeína
que contiene la pupa de café se procedió a determinar dicho valor a través de la cromatografía
líquida de alta eficiencia con el objeto de afianzar que el estudio que se ha realizado cumple
con ciertas especificaciones
Se preparó la curva de calibración para ello se parte de una solución madre de 1000
ppm de cafeína el mismo y se prepara soluciones patrón de concentraciones conocidas (100,
75, 50 ,25 y 10 ppm), teniendo en cuenta que se aforó con metanol: agua (35: 65),
Se preparó la muestra de la pulpa de café, para ello se pesó 2,5 g y se aforó con la
solución caliente de metanol: agua, hasta 100 ml se filtró al vacío y desgasificó la muestra
con ultrasonido por 15 minutos, finalmente se trasvaso dichas soluciones a sus respectivos
viales a través de filtros de tamaño de poro 0,45 μm.
Un vez preparados las soluciones patrones como las muestras, se colocaron en la
bandeja del equipo para inyectar bajo condiciones óptimas de presión y flujo durante un
tiempo de corrida de 7 minutos a una longitud de onda 256 nm y graficar los valores de área
de pico vs concentración.
37
Segunda Etapa.
Metodología para el estudio fitoquímico.
- Extracción Maceración Dinámica
Para determinar las sustancias extraíbles con los diferentes solvente a utilizar se
procedió a realizar el método (NTE INEN ISO 2794, 2015). Con la diferencia que dicho
proceso convencional se realizó sometiendo a la muestra a una extracción sucesiva con agua:
etanol al 96,6% (50:50) y metanol al 99,9% en relación (1:10 w/v materia seca/solvente) y
con la ayuda de un agitador gravitatorio a 200 rpm durante 20 horas a temperatura ambiente,
se centrifugó y finalmente se procedió a concentrar el extracto en un rotavapor, el cual
evaporó el solvente por destilación al vacío en un evaporador rotatorio a presión reducida a
una temperatura de 40°C,hasta la mitad del volumen inicial y se almacenó a 0°C en frascos
ámbar hasta su posterior evaluación.
- Extracción Maceración asistida por ultrasonido.
Con el método de extracción asistida por ultrasonido se procedió similar al anterior
método pero que en lugar de ocupar el agitador gravitatorio, se hizo uso del equipo de
ultrasonido por 45 minutos y a 45Khz.
Fenoles totales.
Siguiendo el método Folin – Ciocalteu se procedió a preparar el reactivo de Folin-
Ciocalteu, y las soluciones con concentraciones conocidas del ácido gálico para realizar la
curva de calibración y simultáneamente se prepararon las muestras bajo las mismas
condiciones y realizó el cálculo de los fenoles totales mediante la ecuación generada por
regresión lineal de la curva de calibración (Arroyo, Bonilla, Tomàs, & Huamàn, 2011).
- Se prepararon soluciones de ácido gálico etanólico de concentraciones 500, 250, 150,
100,50 ppm.
- En tubos de ensayos envueltos en papel aluminio se colocó 0,1 ml de solución ácido
gálico, se agregó 0,5 ml del reactivo de Folin Ciocalteu y se completa 9,4 ml de
agua destilada, para el tubo control blanco se agregó el reactivo de Folin – Ciocalteu
38
y el agua, finalmente se deja reposar por 2 horas en la oscuridad para poder ser leído
en el espectrofotómetro
- Para las muestras del extracto de la pulpa de café se realizó una dilución de cada una
de ellas y se procedió con la misma técnica antes mencionada con la diferencia que
en lugar de ácido gálico se coloca 0,1 ml del extracto diluido.
- Transcurrido el tiempo se realizó la lectura en el espectrofotómetro a una longitud de
onda de 765nm y con la ayuda de Excel se determinó la regresión lineal de la curva
de calibración así como también la concentración de fenoles totales de la muestras
del extracto de la pulpa de café
Marcha fitoquímica.
En la realización de la marcha fitoquímica, para la identificación de metabolitos
secundarios que están presentes en los extractos obtenidos que posee la mayor cantidad de
fenoles totales, se hizo a través de pruebas de identificación existentes y validadas que son
usadas en el estudio fotoquímico realizado por Arroyo, Bonilla, Tomàs, & Huamán (2011).
Tercera etapa
Se adquirió del Instituto Nacional de Salud Pública e Investigación 24 ratones de la
especie en Mus musculus BALB/c con peso aproximado 30 gramos de ambos sexos, a los
cuales se les administró por vía oral durante 28 días, dosis de cada uno de los tratamientos y
luego durante el transcurso de dos semanas se realizaron los 2 test de aprendizaje el Laberinto
Acuático de Morris y el Laberinto Radial de 8 brazos.
Método 1. Laberinto Acuático de Morris.
Aparato.
El aparato que se utilizó en esta investigación consistió en un tanque circular lleno de
agua de aproximadamente 100 cm de diámetro y de 30 cm de profundidad, y se dividió d
en cuatro cuadrantes iguales. La temperatura del agua oscilaba entre 18 y 27 °C, lo que hace
que los animales quieran escapar sin sentirse tan estresados como para que se inhiba su
conducta de búsqueda de la plataforma. La plataforma de escape cuadrada, de 10 cm de
longitud y sumergida 1 cm por debajo de la superficie del agua en uno de los cuadrantes
39
(cuadrante 2), (Wenk, 2004). Además se ubicó varias señales distales alrededor del tanque
para orientar al animal mientras navegue dentro de la piscina.
Ilustración 3.1 Esquema del Laberinto Acuático de Morris
Fuente: (Navarrete, Pérez, Femenia, & Manzanares, 2008)
El test del laberinto acuático de Morris consistió en las siguientes fases:
Entrenamiento.
Los animales fueron entrenados durante cinco días para encontrar la plataforma
sumergida. En esta fase se introdujo al animal con el hocico apuntando hacia las paredes de
la piscina para que busque la plataforma durante un tiempo máximo de 60 segundos. En el
caso de no encontrarla en el tiempo máximo estableció se le colocará al ratón entre 20 o 30
segundos en la plataforma (Vicens, Redolat, & Carrasco, 2003, pág. 40).
El ensayo se detuvo después de este tiempo o después de que el animal llegó a la
plataforma. Se consideró que un animal ha encontrado la plataforma cuando permanece en
ella 5 o 10 segundos (Vicens, Redolat, & Carrasco, 2003, pág. 40).
Después se retiró al animal de la plataforma y se le dejó descansar brevemente antes
de iniciar el siguiente ensayo. Este procedimiento se repitió en los distintos ensayos y a lo
largo del entrenamiento. Esta fase de adquisición o aprendizaje, que puede durar algunos
días (Vicens, Redolat, & Carrasco, 2003).
40
Pruebas de Adquisición
- Se insertó la plataforma en el cuadrante II de la piscina.
- Después se colocó el animal en la posición de inicio deseada en el laberinto, frente a
la pared del tanque, luego se liberó en el agua. El cronómetro se inició en el momento
en que el animal fue liberado (Vorhees & Williams, 2006).
- Se detuvo el cronómetro y se registró el tiempo (en segundos) cuando el animal
alcance la plataforma. Los animales que no encontraron la plataforma dentro del
límite de tiempo (1 minuto) se les colocó en la plataforma o se les dirigió a ella
(Vorhees & Williams, 2006).
- Se permitió que el ratón permanezca en la plataforma durante 10 a 15 segundos, y
luego se quitó al ratón de la piscina y se esperó 5 minuto hasta el próximo ensayo
(Wenk, 2004).
- Se colocó el ratón en la piscina (desde el mismo lugar) con la plataforma en la misma
ubicación. Además se registró el tiempo en el que el ratón tarda en encontrar la
plataforma.se realizó cuatro ensayos durante. durante el período de evaluación que
son de 7 días (Wenk, 2004).
- Los fármacos fueron administrados antes del entrenamiento para evaluar sus efectos
en la adquisición, o después de la adquisición con el fin de evaluar sus efectos sobre
el rendimiento (Wenk, 2004).
Método 2. Laberinto Radial de 8 brazos
Aparato.
El aparato que se utilizó en esta investigación consistió en un laberinto radial elevado a 1
m desde el suelo, compuesto de ocho brazos idénticos de 35 cm de longitud x 5 cm de ancho
distribuidos radialmente, unidos a una plataforma central con un diámetro de 20 cm para
acomodar al animal y permitir que se movilice fácilmente entre los brazos. La plataforma
central estuvo rodeada de una pared de 25 cm de altura (Wenk, 2004).
Además cada brazo tenía un orificio de 5 mm de profundidad a 1 cm del extremo, que se
utilizó como recipiente para mantener la comida fuera de la vista del ratón, y las paredes a
lo largo del borde de los brazos del laberinto son cortas de aproximadamente 2 cm de altura
las cuales evitan que el animal se cayera del laberinto durante la ejecución de la tarea (Wenk,
2004)
41
Ilustración 3.2 Esquema del Laberinto radial de 8 brazos
Fuente: (Anthony G. Phillips, 2004)
El test del laberinto de brazos radiales consistió en las siguientes fases:
Habituación:
A los ratones se les ambientó de 20 minutos el primer día en el laberinto con acceso libre
a todos los brazos, uno de los cuales fue cebado con una recompensa de comida oculta.
Durante el ensayo de habituación, se colocó 2 ratones para facilitar en la aclimatación los
cuales visitaron libremente cada brazo tantas veces como quisieran. Esta habituación no se
tomó en consideración, ni registrada.
Entrenamiento de los ratones
Se pesó cada ratón cada 8 días durante el entrenamiento y la prueba para monitorear
la salud y el grado de privación de alimento y se restringió el alimento disponible al
ratón para que su peso corporal alcance el 85% antes del entrenamiento (Wenk,
2004).
El laberinto colocó en una habitación que contenía varias señales externas que fueron
visibles para el ratón y de igual manera se ubicó unas figuras de diferentes colores al
final de cada brazo y un indicativo en la pared circular del laberinto para que sea una
guía para el animal de experimentación
Se colocó un solo ratón en el laberinto; y también se puso el alimento en los pocillos
de cada brazo al final de los brazos. Los ratones recorrieron el laberinto una vez al
día todos los días incluidos los fines de semana, por siete días consecutivos.
42
Evaluación
Una vez finalizado el período de entrenamiento se procedió a evaluar a los animales
de experimentación por siete días siguiendo la misma técnica que se realizó en la etapa de
entrenamiento. Se registró el tiempo de latencia que se demoró el ratón en visitar los ocho
brazos del laberinto y el número de aciertos y desaciertos.
Diseño Experimental.
Concentración fenoles totales
El tipo de análisis estadístico experimental que se utilizó fue bloques completamente
al azar (DBCA), con su respectivo análisis de varianza (ANOVA); lo que permitió
determinar si hay efecto significativo entre los tratamientos y número de repeticiones
realizadas.
.
Tabla 3.1: Codificación de Tratamientos y Bloques
MÉTODOS CÓDIGO BLOQUES
R1 R2 R3
Maceración Dinámica Etanol: Agua T1
Metanol T2
Maceración Asistida Por
Ultrasonido
Etanol: Agua T3
Metanol T4
Elaborado por Molina Vanessa
Actividad Nootrópica
Se realizaron Modelos Lineales Mixtos para el análisis de los datos experimentales,
considerando ciertos parámetros para cada uno de los laberintos utilizados.
En el laberinto acuático se tomó en cuenta como variable dependiente el logaritmo
natural del tiempo de latencia y se evidenció las posibles interacciones que existieron entre
43
los días de tratamientos, el tratamiento que se administró en los ratones y la influencia del
sexo del animal en el resultado del aprendizaje espacial.
Para el laberinto radial de 8 brazos la variable dependiente es el número de
desaciertos que tuvo el ratón tomando las mismas consideraciones anteriores y relacionando
con el incremento del tiempo de latencia como una variable consecuencia, es decir se manejó
con un Análisis de Covarianza (ANCOVA).
Operacionalización de variables
Tabla 3.2. Dimensiones e indicadores de las variables
Variables Dimensiones Indicadores
Extr
acto
de
la
pulp
a de
café
aráb
ica
Método
extracción
Maceración dinámica Cantidad de fenoles totales
expresados en equivalentes
/ gramo del estándar ácido
gálico (g GA/ 100 g.
Maceración asistida por
Ultrasonido
Solventes de
extracción
Etanol: Agua
Metanol
Variables Dimensiones Indicadores
Act
ivid
ad
Nootr
ópic
a
Laberinto Acuático
de Morris
Índice de
aprendizaje
espacial
Tiempo promedio de latencia
(minutos)
Laberinto radial de
Ocho Brazos Índice de Memoria
Porcentaje de elecciones
correctas e incorrectas
Elaborado por: Molina Vanessa
Técnicas e instrumentos de recolección de datos.
Para la recolección de datos de la actividad nootrópica del extracto de la pulpa de
café arábica (Coffea arabica), se llevó a cabo mediante observación sistemática y aplicación
de registros, formas estadísticas y mediciones.
44
Dichos resultados se plasmaron en un cuaderno de trabajo en donde se reportó en
base a un instrumento de recolección de datos (IRD), ver anexo C, D y E, cabe recalcar que
el mencionado IRD sufrió modificaciones y ampliaciones en el transcurso del estudio y los
requerimientos que se presentaban.
La validez de los instrumentos de recolección de datos (IRD), implementados fueron
revisados con anticipación por parte de un experto para encaminar el trabajo de investigación
sujetándose a los objetivos planteados.
Determinación Nootrópica.
Recolección de datos del laberinto Acuático de Morris.
- Número de veces que el ratón encontró la plataforma.
- Tiempo de latencia, tiempo que transcurrió hasta que encuentre la plataforma.
- Recorrido realizado por el animal de experimentación hasta llegar a la
plataforma.
Recolección de datos del laberinto de 8 brazos.
Tiempo que transcurrió entre el comienzo de la sesión de prueba y el ratón
al recorrer los 8 brazos
Número de elecciones correctas e incorrectas de los brazos, la visita a un
brazo previamente elegido se considera un error de memoria de trabajo.
Técnicas de procesamiento y análisis de datos.
Determinación cantidad de fenoles totales.
El modelo estadístico seguido fue bloques completamente al azar y para su resolución
se realizó mediante el Análisis de Varianza ANOVA, que permitió determinar si hay
diferencia significativa entre la cantidad de fenoles totales obtenidos en cada extracto de la
pulpa de café arábica, haciendo uso Software estadístico SEDEX V1.0 para el análisis,
visualización de datos, modelos estadísticos y análisis predictivo y para comparar entre
tratamientos se realizó la prueba de comparación Test de Duncan.
45
Tabla 3.3 Análisis de varianza
Fuente de
Variación
Suma de
Cuadrados
Grados de
Libertad
Promedio de
los
Cuadrados
F
calculada
Valor
Crítico F
Tratamientos 𝑏 ∑(�̂�𝑖 − �̂�…)2
𝑡
𝑖=1
𝑡 − 1 𝐶𝑀𝑡 =𝑆𝐶𝑡
𝐺𝐿 𝐹𝑐 =
𝐶𝑀𝑡
𝐶𝑀𝐸
𝐹 ≥ 𝐹𝐶
Bloques 𝑡 ∑(�̂�.𝑗 − �̂�…)2
𝑏
𝑗=1
(𝑏 − 1) 𝐶𝑀𝑏 =𝑆𝐶𝑏
𝐺𝐿 𝐹𝑐 =
𝐶𝑀𝑡
𝐶𝑀𝐸
Error 𝑆𝐶𝑇 − 𝑆𝐶𝑇𝑅𝐴𝑇
− 𝑆𝐶𝐵 (𝑡 − 1)(𝑏 − 1) 𝐶𝑀𝐸 =𝑆𝐶𝐸
𝐺𝐿
Total ∑ ∑ (�̂�𝑖𝑗
𝑗𝑖
− �̂�..)2 𝑗𝑢
(𝑏𝑡 − 1)
Fuente: (Córdoba, 2017)
Determinación Nootrópica
Los datos obtenidos en el laberinto acuático de Morris fueron estadísticamente
analizados por un Análisis de varianza (ANOVA) multifactorial realizando la prueba de
comparación múltiple Test de Fisher para crear intervalos de confianza para todas las
diferencias en parejas entre las medias de los niveles de los factores, controlando al mismo
tiempo la tasa de error individual en un nivel especificado, Con ayuda del Software
estadístico INFOSTAT.
Los datos obtenidos en el laberinto radial de 8 brazos fueron estadísticamente
analizados por un Análisis de covarianza (ANCOVA), con el objeto de determinar la relación
de dependencia entre el número de desaciertos con el tiempo de latencia realizando la prueba
de comparación múltiple Test de Fisher y haciendo uso del mismo Software estadístico
INFOSTAT.
46
Capítulo IV
Análisis y discusión de Resultados
En la presente investigación se realizó un Boucher para identificación taxonómica de
la planta de café, una vez emitido un certificado por parte de Herbario Alfredo Paredes
(QAP) de la Universidad Central corroborando de que se trata de la especie Coffea arabica
se procedió a recolectar la fruta madura y se efectuó el proceso de lavado y desinfección con
una solución de hipoclorito de sodio, posterior a ello se efectuó la extrusión y la despulpación
en un molino de tornillo semiabierto para luego separar la pulpa de café de la almendra . Una
vez separada la pulpa de café se realizó la desmucilagación, cuyo proceso es lavar con
abundante agua hasta que desaparezca el mucílago de la muestra vegetal y finalmente se
efectuó el proceso de secado bajo las condiciones antes mencionadas.
Una vez seca la pulpa de café se procedió a pesar obteniendo un peso total de 1403g,
se retiró toda la materia extraña cuyo peso fue 329,04 g y se obtuvo un peso de muestra
vegetal limpia de 1073,96 g. A esta muestra se licuó y se pasó por el juego de tamices, con
el objeto de hacer uso de la muestra de la pulpa de café que quedó sobre el tamiz de tamaño
de poro 500 μm para la obtención de los extractos, y la muestra cuyo tamaño de partícula era
menor o igual 200 μm se hizo uso para la realización del control de calidad.
Determinación de humedad.
El porcentaje de humedad permite conocer la cantidad de agua ligada presente en la
pulpa de café arábica.
Tabla 4.1 Humedad de la pulpa de café método convencional
Nº Repeticiones Peso Cápsula
vacía, g
Peso
Muestra, g
Peso (Cápsula + muestra),
g
Porcentaje
de humedad
1 0,9854 2,0090 2,8685 6,26
2 0,9901 2,0081 2,8732 6,22
3 0,9866 2,0045 2,8687 6,11
PROMEDIO
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
%CV
6,20
0,012
0,19
Elaborado por: Molina Vanessa
47
El porcentaje de humedad promedio obtenido en la presente investigación como se
indica en la tabla 4,1 se encuentra dentro de los límites establecidos (6,09%- 12,0%), en base
a estudios anticipados de la pulpa de café, también se puede evidenciar que el coeficiente de
variación es bajo, lo cual indica que no existe variabilidad en las tres repeticiones que se
realizaron, ya que la variabilidad está sujeta a los parámetros del método MGA-FH 0080,
como se estipula en Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos. (2013)
Tabla 4.2 Humedad de la pulpa de café método no convencional (Termobalanza)
Peso de la muestra , g Porcentaje de Humedad
0,509 6,69
0,500 6,22
0,504 6,20
0,502 6,22
0,499 6,05
PROMEDIO 6,28
DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,23
% CV 3,74
Elaborado por: Molina Vanessa
En la tabla 4.2, el valor obtenido es similar al método convencional e ingresa dentro
del límite establecido, posiblemente porque uno de los factores que influyen notoriamente
en dicho proceso es el tamaño de partícula, es por ello que se empleó la pulpa de café de
tamaño inferior a 200 μm; el coeficiente variación es menor al 5 % lo que indica que el
técnica empleada sigue con los parámetros del método. Cabe recalcar que la importancia de
determinar la humedad es para facilitar la molienda de la pulpa de café y bloquear el
desarrollo de microorganismos.
Determinación de fibra cruda.
Para la determinación de la fibra cruda se procede con anticipación a desengrasar la
muestra, con el objeto de que la grasa cruda de la pulpa de café no intervenga en los
resultados y para establecer dicho valor los cálculos se efectuó con la ayuda de la ecuación
Nº 3.
Los resultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla:
48
Tabla 4.3 Fibra cruda de la pulpa de café
Nº
Repeticiones
Peso
muestra
inicial, g
Peso papel
cuantitativo
vacío g
Peso
(papel +
muestra),
g
Peso
Cápsula
vacía, g
Peso
(Cápsula
+Cenizas)
Porcentaje
de Fibra
Cruda
1 0,2004 0,8469 0,8955 43,7997 43,8022 23
2 0,2077 0,8585 0,9079 44,5159 44,5175 23
PROMEDIO 23
Elaborado por: Molina Vanessa
Determinación de Grasa Cruda
El proceso de desengrasar la muestra vegetal, permitió calcular la grasa cruda a través
de la ecuación Nº 4, obteniendo los siguientes datos experimentales como lo indica la tabla
subsecuente:
Tabla 4.4 Grasa cruda de la pulpa de café
Nº Repeticiones
Peso Capuchón
antes de la
extracción, g
Peso Capuchón
después de la
extracción, g
Peso de la
muestra, g
Porcentaje
de Grasa
1 73,7456 73,7968 4,0014 1,28
2 71,8385 71,8899 4,0017 1,28
3 74,3482 74,3999 4,0016 1,29
PROMEDIO
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
%CV
1,28
6, 7E-05
0,0052
Elaborado por: Molina Vanessa
El valor promedio de Fibra Cruda de 1,28 %, como lo indica la tabla 4.3 se encuentra
dentro de los límites establecidos en la investigación (21%- 27,49%),por estudios
antecesores lo que corrobora que la muestra vegetal con que se realizó el estudio es
netamente la pulpa de café; mientras que el porcentaje promedio de grasa cruda es menor a
lo estipulado en el estudio realizado por Tobón (2015), cuyo valor alcanzó el 1,355% ,
posiblemente porque los constituyentes grasos de la pulpa de café esté relacionado
directamente con el valor nutricional del cafeto del cual se obtuvo la muestra, sin embargo
se puede evidenciar que el coeficiente de variación es bajísimo debido a que se empleó un
equipo extracción que permitió reducir posibles errores ligados al investigador. No obstante
49
dicho valor no es de preocupación, ya que la muestra vegetal no es oleaginosa y solo sirve
para determinar la composición proximal que posee la pulpa de café.
Determinación de cenizas totales.
Las cenizas totales de la pulpa de café fue otro parámetro que facilitó el control de
calidad de la muestra.
Tabla 4.5 Cenizas Totales de la pulpa de café
Nº
Repeticiones
Peso Crisol
vacío, g
Peso
Muestra, g
Peso (Crisol + cenizas),
g
Cenizas
Totales
1 17,599 3,003 18,061 15,38
2 16,540 3,001 17,039 16,23
3 25,812 3,004 26,237 14,15
PROMEDIO
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
%CV
15,25
2,19
14,34
Elaborado por: Molina Vanessa
En la tabla 4.5 se observa el valor promedio de las cenizas totales obtenidas de
acuerdo a la técnica empleada según la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos
Mexicanos (2013), cuyo valor supera el 8,3 %; estipulado por Bressani, Penaloza, Molina,
& Gomez (1985), dato que está relacionado con el análisis nutricional que posee la planta
ligado al lugar de producción del mismo, es decir a la composición nutricional del suelo que
sustenta al cafeto.
En un estudio realizado por Huerta (1963) menciona que el aumento de las cenizas
totales se produce debido a la mayor absorción de los elementos proporcionados por las
fórmulas fertilizantes que se coloca en la planta de café, posiblemente este es el motivo por
el que no concuerden los valores obtenido en la presente investigación.
Ahora bien el porcentaje de coeficiente de variación (14,34 %), es alto, posiblemente
a una distribución irregular de la muestra y a ello se suma que no existen métodos
estandarizados en el país concerniente al café que sirva como referencia y se optó por trabajar
con estándares de otros países.
50
Control Microbiológico
Se realizó el control microbiológico antes y después de desinfectar la pulpa de café,
con el objeto de determinar la carga microbiana con que se recibió la muestra vegetal.
Tabla 4.6 RTMA en la pulpa de café previo al proceso de desinfección
Método Recuento
promedio en caja Factor de Dilución
Recuento Final
UFC/g muestra
Extensión Incontable 10 Incontable
Vertido Incontable 10 Incontable
Elaborado por: Molina Vanessa
Tabla 4.7 RTMA en la pulpa de café posterior al proceso de desinfección
Método Recuento
promedio en caja Factor de Dilución
Recuento Final
UFC/g muestra
Extensión 1 10 10
Vertido 0 10 0
Elaborado por: Molina Vanessa
Se evidencia en la tabla 4.6 una carga microbiana previa a la desinfección que supera
el contaje, sin embargo después de realizada la desinfección se disminuye dicha carga de
manera notoria, como se evidencia en la tabla 4.7; posterior a ello se procedió a identificar a
través de tinción Gram la naturaleza del microrganismos y dio como resultado la presencia
de un bacilo Gram (+). Este género se encuentra comúnmente en suelos y plantas donde
tienen un papel importante en ciclo del carbono y el nitrógeno, como lo menciona Cuervo
(2010), por lo que se concluye que es un microorganismo propio de la planta e incluso
muchos forman parte de la flora normal del cuerpo humano y se encuentran ampliamente
distribuidos en el ambiente y al no superar los criterios establecido por la World Health
Organization (1998) (< 105UFC/g de muestra).
51
Tabla 4.8 RTML en la pulpa de café previo al proceso de desinfección
Método Recuento
promedio en caja Factor de Dilución
Recuento Final
UFC/g muestra
Extensión 2 10 20
Vertido 3,5 10 35
Elaborado por: Molina Vanessa
Tabla 4.9 RTML en la pulpa de café posterior al proceso de desinfección
Método Recuento
promedio en caja Factor de Dilución
Recuento Final
UFC/g muestra
Extensión 1 10 10
Vertido 2 10 20
Elaborado por: Molina Vanessa
En la tabla 4.8 se puede observar que existe la presencia de hongos y levaduras; para
identificar el género y especie de dichos microorganismos presentes en la muestra vegetal,
fue necesario tomar en cuenta, las características macro y microscópicas, por lo que se
examinó los aislamientos de cada una de las cepas y contrastar con el texto Fungi and Food
Spoilage, de los autores Pitt & Hocking (1997), al examinar microscópicamente con la
técnica de tinción de coloración de estructuras fúngicas y al realizar las comparaciones
pertinentes se determinó la presencia de: Cladosporium spp; Moniliella acetoabutans;
Penicillum spp, Aspergillus, spp, entre otros. Estos dos últimos microorganismos son los
responsables de actuar en la solubilización de fósforo que se encuentra presente en la pulpa
de café, como lo indica en su estudio Blandon, Rodríguez, & Dávila (1998).
De igual manera se evidencia que el recuento final de hongos y levaduras para ambos
métodos no superan los criterios establecido por la World Health Organization (1998) (< 103
UFC/g de muestra), antes y después del proceso de desinfección
Sin embargo se evidencia, que a pesar de encontrarse dentro de los límites
establecidos según World Health Organization (1998). persiste la presencia de Aspergillus,
spp, aún después de la desinfección, y como el extracto que posteriormente se obtuvo fue
administrado a los ratones y al ser dicho hongo un patógeno oportunista que producen
aflatoxinas, consideradas como compuestos carcinógenos, según Sánchez (2002), se vio en
la necesidad de erradicar dicho microorganismo, con la solución de hipoclorito de sodio
52
(50:50), si bien es cierto se eliminó dicho hongo, al realizar la cuantificación de fenoles
totales del extracto obtenido a partir de esta muestra de pulpa de café resultó que disminuye
a la mitad la cantidad de fenoles en comparación con aquella muestra de la pulpa de café que
presentaba una colonia de Aspergillus spp.
No obstante se conoce de estudios que hacen uso de las cepas de Aspergillus
fumigatus con la finalidad de producir una enzima que degrade los taninos condensados,
dichos polímeros polifenólicos, están clasificados como taninos hidrolizables que al formar
polímeros de ácido fenólicos adquieren la propiedad de formar complejos metálicos, con las
proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos lo que disminuye el valor nutricional de la pulpa
de café, como lo menciona Contreras, Marnet, Perraud, Roussos, & Augur (2005), debido a
que genera un efecto negativo que se relaciona con la reducción de la palatabilidad
ocasionada por los efectos astringentes de estos compuestos en la saliva según Márquez &
Suárez (2008), ahora bien al mismo tiempo los polifenoles presentes en la pulpa de café
actúan como defensa contra enfermedades causadas por hongos, bacterias y virus y protegen
los tejidos contra el ataque de insectos y herbívoros, ya que tiene la capacidad para ligarse a
membranas y a la pared celular de hongos y bacterias que inhiben el crecimiento de las
bacterias y generar un efecto bloqueador de las aflatoxinas que provoca las cepas de
Aspergillus spp como lo menciona Márquez & Suárez (2008), lo cual se puede explicar como
una interacción biológica, siendo ese el motivo para proseguir con la investigación haciendo
uso de la pulpa de café arábica sometida al proceso de desinfección con solución hipoclorito
de sodio al 2% P/P, sin tener desconfianza de que los animales de experimentación puedan
tener alguna afectación en su salud una vez que se administre dichos extractos.
Tabla 4.10 Resultados del control microbiológico de la pupa de café
Control Microbiológico
Especificación Resultado Cumplimiento
Microorganismos
mesófilos aerobios
totales
<105ufc/g de
muestra*
<102ufc/g de
muestra
C
Hongos y
Levaduras
<103 ufc/g de
muestra*
<101 ufc/g de
muestra
C
Escheriachia coli <101* Ausencia
C
Simbología (*), límites establecidos. OMS (1998) C= Cumple; NC= No cumple
Elaborado por: Molina Vanessa
53
Determinación de cafeína
Para la identificación y cuantificación de la cafeína se preparó las muestras como se
indica en el capítulo anterior. Las soluciones se analizaron por cromatografía de líquidos de
alta resolución (HPLC) y por espectrofotometría UV, se evidenció la concentración de
cafeína presente en cada una de las muestras, para ello se realizó una curva de calibración
en función al área UV- VIS y la concentración de las soluciones estándar de la cafeína, con
el objeto de interpolar las áreas de cada pico que corresponde a las muestras de la pulpa de
café y de esta forma conocer la concentración de cafeína que están poseen.
Las soluciones patrón de cafeína con concentraciones: 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 75
ppm, y 100 ppm se inyectaron por separado en el sistema cromatográfico y se registraron los
siguientes cromatogramas.
Gráfico 4.1 Cromatograma de la solución patrón 10 ppm
Elaborado por: Molina Vanessa
54
Gráfico 4.2 Cromatograma de la solución patrón 25 ppm
Elaborado por: Molina Vanessa
Gráfico 4.3 Cromatograma de la solución patrón 50 ppm
Elaborado por: Molina Vanessa
55
Gráfico 4.4 Cromatograma de la solución patrón 75 ppm
Elaborado por: Molina Vanessa
Gráfico 4.5 Cromatograma de la solución patrón 100 ppm
Elaborado por: Molina Vanessa
56
De lo anterior se expresan los resultados en la siguiente tabla:
Tabla 4.11 Soluciones patrón de cafeína, áreas y tiempos de retención
Concentración, ppm Áreas Tiempo de retención
10 564193 4,917
25 1410282 4,910
50 2895303 4,900
75 4287470 4,897
100 5685182 4,890
Elaborado por: Molina Vanessa
Se realizó una representación gráfica de una señal que se midio en áreas en función
a la concentración de las soluciones patrón de la cafeína, obteniendo la siguiente curva de
calibración.
Gráfico 4.6 Curva de calibración obtenida por HPLC.
Elaborado por: Molina Vanessa
Se obtuvo por regresión lineal la siguiente ecuación:
𝑦 = 57024 𝑥 + 3254,6
y = 57024x + 3254,6R² = 0,9999
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0 20 40 60 80 100 120
Áre
as, U
V -
VIS
.
Concentración cafeína, ppm
CURVA DE CALIBRACIÓN DE LA CAFEÍNA
b m
57
Donde;
y = Área
x = La concentración de la cafeína
m = Pendiente de la recta
b = Intersección a la recta
A partir de dicha ecuación se procedió a calcular la concentración de cafeína de las
muestras de la pulpa de café; cabe recalcar que se realizó el análisis de la pulpa de café seca
y molida identificada como (t 150 u) y el extracto seco de la pulpa de café identificada como
(t 200 u), se realizó dicho proceso por triplicado de cada una de ellas
Registro de los cromatogramas de la pulpa de café seca se puede observar en los
Anexos F y G
En la siguiente tabla se representan las áreas de los picos de los cromatogramas
obtenidos de las muestras de la pulpa de café y el tiempo de retención, y con la ayuda de la
ecuación de la curva de calibración obtenida anteriormente se calcula la concentración de
cafeína presente en la muestra.
Tabla 4.12 Determinación de la cafeína de la pulpa de café
Muestra Repetición Tiempo
de
retención,
min
Área Promedio
de área
Concentración
de cafeína,
ppm
Porcentaje
de cafeína
Pulpa de
café
t-150 ua 4,880 11373146 12091815,7 211,99 0,85
t-150 ub 4,880 12448910
t-150 uc 4,880 12453391
Extracto
seco de
la pulpa
de café
t-200 ua 4,877 13305268 13335486,3 233,80 0,93
t-200 ub 4,877 13362140
t-200 uc 4,877 13339051
Elaborado por: Molina Vanessa
58
Área media de la pulpa de café (UV- VIS) = 12091815,7. Para realizar el cálculo de
concentración de cafeína se necesitó la regresión lineal de la curva de calibrado que fue:
𝑦 = 57024 𝑥 + 3254,6
Se sustituye la Y por la media de las áreas obtenidas:
12091815,7 = 57024 𝑥 + 3254,6
Y despejando X se obtiene la concentración de cafeína en ppm: •
Concentración de cafeína en HPLC = 211,99 ppm.
Posteriormente se determinó el porcentaje de la cafeína que posee la muestra. Para
ello se realizó las siguientes relaciones
%𝑝
𝑝⁄ 𝑐𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎 = [100 𝑚𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 ×
211,99𝑚𝑔1000 𝑚𝑙
×1 𝑔
1000𝑚𝑔
2,4905 𝑔] × 100 = 0,85%
Como se puede observar en la tabla 4.12 los valores obtenidos del porcentaje de
cafeína están por debajo de lo estipulado en estudios anteriores como lo indica Pandey, y
otros (2000) cuyo valor oscila en (1,25%- 1,3%), habitualmente dicho valor está relacionado
a una combinación de factores tales como la naturaleza del suelo en donde se encuentra el
cafetal, condiciones ambientales, el uso de abonos y fertilizantes e incluso la edad de la
planta. Sin embargo, dicho valor se encuentra dentro del estudio de Vega, Reyes, León, &
Franco (2014) que compara la cuantificación de cafeína entre las dos variedades de café más
predominantes como son Coffea conephora y Coffea arabica cuyo valor se encuentra entre
(0,9 %– 1,3 %) para esta última variedad.
59
Gráfico 4.7 Cafeína obtenidas por HPLC de las diferentes muestras
Elaborado por: Molina Vanessa
Como se puede evidenciar en el gráfico 4.7, existe una diferencia de 0,08% entre el
porcentaje de la muestra de la pulpa de café y del extracto seco de la pulpa de café, esto
puede ser por el comportamiento de solubilidad y las condiciones de extracción al que fue
sometido el extracto seco, lo que indica que se incrementa la cafeína cuando la muestra es
previamente sometida a un proceso de extracción con el solvente etanol: agua en una
proporción (50:50). En un estudio realizado por Flores, Peña, Bremúdez, & Nava (2016),
determinan que el extracto etanólico presenta mayor cantidad de cafeína en la pulpa de café
lo que confirma dicha diferencia de los resultados obtenidos.
Estudio Fitoquímico.
Se obtuvo los extractos de la pulpa de café a través de los dos métodos de extracción
propuestos (maceración dinámica y maceración asistida por ultrasonido) con cada uno de los
solventes (metanol y etanol: agua), y una vez concentradas las muestras se procedió a
cuantificar los fenoles totales de cada extracto, se debe mencionar que se realizó 3
repeticiones por cada tratamiento.
P U L P A D E C A F É
E X T R A C T O S E C O D E L A P U L P A D E C A F É
0,85
0,93
PORCENTAJE DE CAFEÍNA
60
Determinación de Fenoles Totales.
Para la cuantificación de fenoles totales se procedió según el método de Folin –
Ciocalteu basándose en una reacción colorimétrica de óxido – reducción, que se midió en el
espectrómetro, el reactivo de Folin – Ciocalteu actúo como agente oxidante. Se preparó las
muestras como se indicó en el capítulo anterior y se halló la concentración fenoles totales
presente en cada una de las muestras, para ello se realizó una curva de calibración en función
a la absorbancia y la concentración de las soluciones estándar del ácido gálico. Con el objeto
de interpolar las absorbancias que corresponde a las muestras de la pulpa de café y de esta
manera encontrar dicha cantidad y que fueron expresados en mg de ácido gálico por ml de
extracto (mg GA/ml extracto).
Las soluciones patrón de ácido gálico fueron preparadas con siguientes
concentraciones: 500 ppm, 250 ppm, 150 ppm, 50 ppm, y 0 ppm registrando los siguientes
datos
Tabla 4.13 Concentraciones y absorbancias de las soluciones patrón de ácido gálico
Tratamiento Concentración, ppm Concentración, mg/ ml Absorbancia
Blanco 0 0 0
St 1 100 0,1 0,45
St 2 200 0,2 0,088
St 3 300 0,3 0,142
St 4 500 0,5 0,227
St 5 600 0,6 0,281
St 6 1000 1,0 0,498
Elaborado por: Molina Vanessa
61
Gráfico 4.8 Curva de calibración obtenido por el método Folin – Ciocalteu
Elaborado por: Molina Vanessa
Se obtuvo por regresión lineal la siguiente ecuación:
𝑦 = 0,4949 𝑥 − 0,0079
Donde;
y = Absorbancia
x = La concentración de las soluciones de ácido gálico
m = Pendiente de la recta
b = Intersección a la recta
En la siguiente tabla 4.14, se representan las absorbancias obtenidos de cada extracto
de la muestra de la pulpa de café, y con la ayuda de la ecuación de la curva de calibración
obtenida anteriormente se calcula los mg ácido gálico / ml de muestra (mg GA/ml muestra)
La absorbancia del extracto etanólico por maceración dinámica de la pulpa de café
seca = 0,058. Para realizar el cálculo de concentración de ácido gálico se necesita la regresión
lineal de la curva de calibrado que fue:
𝑦 = 0,4949 𝑥 − 0,0079
b m
62
Se sustituye la Y por la absorbancia obtenidas:
0,056 = 0,4949 𝑥 − 0,0079
Y despejando X se obtiene la concentración ácido gálico expresado en mg GA/ ml
de muestra
Concentración ácido gálico = 0,129 mg GA/ ml de muestra
Posteriormente se determinó mg ácido gálico equivalente (mg GAE)/ g de muestra.
Para ello se realizó las siguientes relaciones
𝑚𝑔𝑔⁄ =
170,12 𝑚𝑔/𝑚𝑚𝑜𝑙
1𝑚𝑒𝑞/𝑚𝑚𝑜𝑙= 170,12mg/meq
meq GA/1ml muestra =0,129𝑚𝑔𝐴𝑐 𝑔á𝑙𝑖𝑐𝑜
1𝑚𝐿 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎×
1𝑚𝑒𝑞 𝐴𝑐 𝑔á𝑙𝑖𝑐𝑜
170,12𝑚𝑔𝐴𝑐𝑖𝑑𝑜 𝐺á𝑙𝑖𝑐𝑜×
100𝑚𝐿 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
1𝑚𝐿 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎× 10
= 0,758
Tabla 4.14 Cuantificación de fenoles totales de la pulpa de café arábica
Método Tratamientos Absorbancia mg GA
/ 1 ml de muestra
meq GA
/1 ml muestra
Maceración
Dinámica
Etanol: Agua 0,056 0,129 0,758
Metanol 0,033 0,082 0,482
Maceración
Asistida por
Ultrasonido
Etanol: Agua 0,036 0,089 0,523
Metanol 0,021 0,059 0,347
Elaborado por: Molina Vanessa
63
Gráfico 4.9 Concentración de Fenoles totales
Elaborado por: Molina Vanessa
De acuerdo al gráfico 4.9 se evidencia que el método de extracción que arrojó
mejores resultados es la maceración dinámica, esto se debe a que la muestra se encontraba
mayor tiempo en contacto con el solvente en comparación a la maceración asistida por
ultrasonido, sin embargo cabe recalcar que dicho método está sujeto a varios factores como
la temperatura, el tiempo de extracción, la presión, que si bien es cierto son factores que se
pueden controlar e influyen en ambos métodos existe otro factor como es la composición de
la materia vegetal que interviene directamente en los resultados, es por ello que documento
publicado por Vorobie (2010), manifiesta que se puede incrementarse la eficiencia de
método de Ultrasonido si se reduce la humedad del material vegetal y el tamaño de partícula
para mejorar el contacto solvente- sólido.
En el caso de los solventes utilizados el etanol: agua obtuvo mejores resultados,
posiblemente a causa de la presencia de agua que incrementa el volumen del material vegetal
y por efecto la superficie de contacto con el solvente y la matriz vegetal; incluso existen
algunos estudios realizados y entre ellos de Tobón (2015), en el cual concluye que la mezcla
etanol: agua (50:50), es el mejor solvente para la extracción de los compuestos fenólicos de
la pulpa de café (Coffea arabica L.) por ambos métodos de extracción.
También se puede relacionar a la naturaleza del agua ya que incrementa la constante
dieléctrica de la mezcla Etanol: Agua y con ello la polaridad del solvente, lo que mejora la
0,758
0,4820,523
0,347
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
mg GA / mL muestra
CUANTIFICACIÓN DE FENOLES TOTALES
Maceración Dinámica Etanol:Agua
Maceración Dinámica Metanol
Maceración Asistida porUltrasonido Etanol: Agua
Maceración Asistida porUltrasonido Metanol
64
capacidad extractiva por parte del solvente y probablemente de la muestra que contenga
compuestos afines a la polaridad, en el estudio realizado por Rivas, Leal, Loaiza, Morrillo,
& Colina (2017), concluye que a mayor contante dieléctrica mayor será la concentración de
polifenoles.
Debido a cada uno de estos factores, se evidencia notoriamente que se obtuvo una
mejor respuesta extractiva al realizar el método de maceración dinámico y haciendo uso
como solvente la mezcla Etanol: Agua, a más de ello el etanol le brinda una actividad
antimicrobiana al extracto que a pesar de haber sido concentrado siempre quedan trazas del
solvente utilizado.
Determinación de Ácido Clorogénico.
Al ser el ácido clorogénico (ACG) el bioactivo que le brinda la capacidad
antioxidante a la pulpa de café, se procedió a realizar una relación en función a los resultados
obtenidos en la cuantificación de fenoles totales, (expresados meq GA/ml ) y el principio del
método de Folin Ciocalteu; con el objeto que dichos valores sean expresado en meq ACG/ml
muestra, teniendo en cuenta el distinto coeficiente molar y las sustancias interferentes, el
reactivo Folin Ciocalteu (FC), contiene una mezcla de wolframato sódico y molibdato sódico
en ácido fosfórico y reacciona con los compuestos fenólicos presentes en la muestra, que
según Espinosa Manrique, Garzón Salcedo, & Medina Vargas (2016) el reactivo de FC es
una solución acuosa de color amarillo capaz de capturar uno y máximo dos electrones en
reacciones REDOX y formar especies de color azul
Al comparar las estructuras de ambos compuestos tanto el ácido gálico (3,4,5-
Trihydroxybenzoic acid) y ácido clorogénico (1S,3R,4R,5R)-3-{[(2E)-3-(3,4-
dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy}-1,4,5-trihydroxycyclohexanecarboxylic acid); se
evidencia que tienen 3 y 2 grupos hidroxilos unido al anillo aromático respectivamente que
pueden reaccionar con el reactivo FC.
Es por ello que en una primera instancia se calcula los equivalentes gramos del ácido
clorogénico, teniendo en cuenta que solo un grupo hidroxilo reaccionó con dicho reactivo,
aplicando la ecuación de equivalente gramo se obtuvo el siguiente valor:
65
𝐸𝑞 − 𝑔 =354,30872
𝑚𝑔𝑚𝑚𝑜𝑙⁄
1𝑚𝑒𝑞
𝑚𝑚𝑜𝑙⁄= 354, 3872
𝑚𝑔𝑚𝑒𝑞⁄
A partir de los cálculos realizados con anterioridad, se obtuvo el valor promedio de
0,129 mg GA/ml de muestra, cantidad de fenoles totales del extracto de la pulpa de café, y
se expresó en meq Ácido Clorogénico / 1 ml muestra.
meq ACG/1 ml muestra= =0,129 𝑚𝑔
1𝑚𝐿 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎×
1𝑚𝑒𝑞 𝐴𝐶𝐺
354,39𝑚𝑔×
100𝑚𝐿 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
1𝑚𝐿 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎× 10 = 0,364
Tabla 4.15 Cuantificación de fenoles expresados en meq ACG/ml de muestras
Método Tratamientos mg GA / 1 ml de
muestra
meq ACG/ 1 ml
de muestra
Maceración
Dinámica
Etanol: Agua 0,129 0,364
Metanol 0,082 0,231
Maceración
Asistida
por
Ultrasonido
Etanol: Agua 0,089 0,258
Metanol 0,059 0,166
Elaborado por: Molina Vanessa
Los valores obtenidos con respecto ácido clorogénico que se evidencia en la tabla
4.15 , se pueden corroborar con estudios previos de Bressani, Penaloza, Molina, & Gómez
(1985), que se realizaron en la pulpa de café y determinaron un porcentaje promedio de
taninos representado por el ácido gálico presentes en dicha muestra de 5,01 % y de ácido
clorogénico un porcentaje 2,6%, y como se observa el valor obtenido de ácido gálico es de
0,760 y de ácido clorogénico 0,364 de meq/ ml de muestra, siendo este último valor a
aproximadamente la mitad de lo que contiene de ácido gálico (GA).
66
Tabla 4.16 Análisis de Varianza de Cantidad de Fenoles Totales
Fuente de
Variación
Suma de
Cuadrados
Grados
de
Libertad
Promedio
de los
Cuadrados
F
calculada
Valor Crítico
F
5%
Valor Crítico
F
1%
Tratamientos 0,060 3 0,020 20∗∗ 4,76
9,78
Bloques 0,004 2 0,002 2 𝑛𝑠 5,14
10,92
Error 0,004 6 0,001
Total 0,068 11
Elaborado por: Molina Vanessa
En la tabla 4.16 se puede observar que existe diferencia significativa entre
tratamientos al 95% y 99% de confiabilidad, esto quiere decir que influyó en la respuesta de
cuantificación de fenoles totales, el método de extracción, así como también los solventes
empleados, no obstante entre las repeticiones que se realizaron no presentó diferencia
significativa.
Una vez realizado un análisis global de la existencia de significancia entre los
tratamiento y los bloques, se procedió a comparar entre las medias de los métodos de
extracción para ello se empleó Test de Duncan, con el objeto de comparar si la cantidad de
fenoles totales obtenidos son iguales en todos los tratamientos, con un nivel del 95,0 % de
confianza consiguiendo los siguientes resultados.
Tabla 4.17 Test de Duncan cantidad de fenoles totales
Tratamientos Medias Duncan
T1 0,36 A
T2 0,25 B
T3 0,23 BC
T4 0,17 C
Elaborado por: Molina Vanessa
Como se evidencia en la tabla 4.17 se evidencia que el T1 (maceración dinámica
Etanol: Agua) presento mayor cantidad de fenoles totales en la muestra al comparar las
medias de la concentración.
67
Marcha Fitoquímica.
El análisis fitoquímico de la pulpa de café arábica, se realizó a partir del extracto
obtenido por maceración dinámica con solvente de etanol: agua (50:50), con el objeto de
realizar la investigación del tratamiento que se administró a los animales de
experimentación, obteniendo los siguientes resultados
Donde
+++: Abundante ++: Moderado
+: Medianamente escaso +/-: Escaso -: Nada
Tabla 4.18 Identificación de metabolitos secundarios
IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES
Reacción Resultados Observaciones
Fase
Acuosa
Fase
Orgánica
Dragendorff + +++ Presencia de precipitado que se
pega en la placa de color rojizo
Mayer - + En la fase orgánica presenta una
pequeña cantidad de precipitado
Wagner ++ +++ Presencia de precipitado color
marrón en ambas fases
IDENTIFICACIÓN DE ESTEROLES
Lieberman Burchard - Se presenta una coloración verde
Zack + Coloración verdosa
IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES
Shidona +++ Presencia de espuma
Cianidina ++ Coloración rosada
Medio Alcalino + Coloración verde
IDENTIFICACION DE ANTOCIANINOS
HCl © ++ Coloración roja
IDENTIFICACIÓN DE ANTRAQUINONAS
Coloración de Bromtrager
por Krauss
+/- Coloración vagamente rosa
68
IDENTIFICACIÓN DE TANINOS
FeCl3 2% ++ Coloración ligeramente verde
Gelatina Salada ++ Precipitado blanco
Con alcaloides + Precipitado tipo gránulos en las
paredes del tubo
IDENTIFICACIÓN SAPONINAS
H2O - No se presentó espuma al agitar
con el agua
IDENTIFICACIÓN GLUCÓSIDOS CARDIOTÓNICOS
Baljet +++ Coloración rojo estable
Elaborado por: Molina Vanessa
Después de realizado el análisis fitoquímico se evidencia en la tabla 4.18 la presencia
de alcaloides, flavonoides, taninos y una escasa presencia de antraquinonas y esteroles; sin
embargo es complejo visualizar los cambios de color que se generan porque se opaca con el
color café oscuro de la muestra, así mismo, no se pudo evidenciar la presencia de saponinas.
Cálculo dosis de administración.
Para determinar la dosis que se administró a los animales de experimentación se
procedió en primera instancia a los cálculos de extracto seco.
Tabla 4.19 Extracto Seco
Vidrio reloj vacío, g Vidrio reloj+ muestra,
g
1 ml de muestra,
g
Extracto Seco,
g/ ml
13,969 13,982 1,212 0,013
14,618 14,632 1,143 0,014
14,406 14,419 1,143 0,013
Promedio 0,013
Elaborado por: Molina Vanessa
En la tabla 4.19 se concluye que 1ml de extracto obtenido posee 0,013 g de extracto
seco, por lo que posteriormente se tomó en cuenta los volumen inicial utilizado para la
maceración dinámica que fue de 450 ml , el peso inicial de la pulpa de café 45,016 g y el
volumen final, (volumen después de concentrar el extracto) que fue de 175ml; a partir de
ello se relacionó con el extracto seco (ES), donde se obtuvo 2,333g ES/175ml y relacionando
69
dicho valor con el peso se determinó que fue 2,333 g ES/ 45,016 g Pulpa de Café (PC) ó
51,83mg/1 g PC.
Con la finalidad de encontrar la cantidad de ácido clorogénico presente en extracto
seco se procedió a realizar una relación en función a revisiones bibliográficas referentes a
estudios de la pulpa de café cuyo porcentaje aproximado fue de 2,6 % ACG obteniendo
60,66 mg ACG/2,333g ES, y a partir de este valor se determinó la cantidad que se requirió
en cada dosis administrada.
Se administró a los ratones del estudió una primera dosis en función a un estudio del
CSIC y la Universidad de Granada que administran a los animales de experimentación 10mg
(ACG) / kilogramo del peso corporal / Día (equivalentes a la ingesta de ácidos clorogénicos
por consumo moderado de café), con el objeto de comparar el efecto antiglicante entre varios
extractos de café (Castillo, 2011); y una segunda dosis de 100mg (ACG) / kilogramo del
peso corporal / Día, debido que existen productos que se encuentran comercializando a nivel
mundial con dicha concentración.
Al ser una administración prolongada por vía oral, se realizó dicho proceso con la
ayuda de una micropipeta, con la finalidad de que el procedimiento sea lo menos invasivo y
por ende no genere daños en el ratón, para ello se realizó los cálculos pertinentes para
administrar 25 μL de la dosis antes mencionadas.
10 𝑚𝑔𝐴𝐶𝐺 → 70000𝑔
𝑋 𝑚𝑔𝐴𝐶𝐺 → 37,925𝑔 = 5,41𝑥10−3 𝑚𝑔 𝐴𝐶𝐺/𝑑í𝑎
Al realizar el cálculo para cada ratón y al sacar la sumatoria del mismo, se requirió
un total de 0,1158 mg ACG / día para los 24 ratones de experimentación y al relacionarlo
con 25 μL el volumen que fue administrado diariamente a cada ratón, se obtuvo un total de
600 μL aproximadamente del volumen total del extracto.
0,1158 𝑚𝑔𝐴𝐶𝐺 → 600𝜇𝐿
𝑋 𝑚𝑔𝐴𝐶𝐺 → 25000𝜇𝐿 = 4,285 𝑚𝑔 𝐴𝐶𝐺/𝑑í𝑎
70
Como fueron cantidades extremadamente pequeñas, se optó por preparar
aproximadamente un volumen de 25 ml del medicamento, el mismo que se separó en tubos
de ensayo y se mantuvo en refrigeración el que se administraba en ese momento y el resto
en congelación, para evitar de esta manera la degradación del principio activo. Una vez
comparado con la cantidad de ACG, se preparó para la dosis 1: 0,185 g ES en 25 ml de agua
y para la dosis 2: 1,856 g ES en 25ml de agua.
La dosis de Ginkgo Biloba (GB) que fue administrada fue 240 mg/ kilogramo del
peso corporal / día, por lo que se preparó 15 mg de GB en 3 ml de agua con una pureza del
95%. Cabe recalcar que los ratones fueron pesados cada 8 días y por ende la dosis se volvía
a recalcular a ese transcurso de tiempo.
Pesos de los ratones
Debido a que se requiere conocer los efectos que pudieron causar la ingesta de los extractos
administrados en los animales experimentales, se realizó una gráficas comparativas de cada
tratamiento en cada sexo del animal.
Gráfico 4.10 Peso semanales de ratones machos
Elaborado por: Molina Vanessa
35,036,037,038,039,040,041,042,043,044,045,0
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7
PES
O, g
TIEMPO, semana
PESOS SEMANALES DE RATONES MACHOS
CONTROL GINKGO BILOBA
EXTRACTO DE PULPA DE CAFÉ 10mg EXTRACTO DE PULPA DE CAFÉ 100mg
71
Gráfico 4.11 Peso semanales de ratones hembras
Elaborado por: Molina Vanessa
Se observa en los gráficos 4.10 y 4.11 diferencias entre los pesos de ambos sexos,
siendo las hembras las de menor peso.
En el gráfico 4.10, permite evidenciar que el peso de los animales que fueron
administrados el agua y Ginkgo Biloba son similares y aquellos que se administró el extracto
de pulpa de café divergen incluso al comparar entre ambas dosis, siendo los animales que se
administró la dosis del extracto de la pulpa de café 10 mg el de menor peso corporal.
Ahora bien al haber administrado el extracto de la pulpa de café en función al
contenido de ácido clorogénico, debe considerarse que también contiene bioactivos muy
importantes como son los alcaloides (cafeína), taninos entre otros, que se convierten en
coadyuvantes que influyen en el peso del animal de experimentación y en otro aspecto
fisiológico que se pudo comprobar a lo largo del proceso de experimentación fue la diuresis.
Existen estudios in vivo e in vitro que le dan las propiedades farmacológicas como
antioxidante, quelante e hipoglucemiante al ácido clorogénico, como lo menciona Rojo
(2005), en función a varios procedimientos concluyen que puede afectar en el metabolismo
lipídico, porque en ratas Zuter obesas, hiperlipémicas y resistentes a la insulina al recibir un
tratamiento crónico con ACG aumentaron la tolerancia a la glucosa y disminuyeron los
27,0
28,0
29,0
30,0
31,0
32,0
33,0
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7
PESOS SEMANALES DE RATONES HEMBRAS
CONTROL GINKGO BILOBA
EXTRACTO DE PULPA DE CAFÉ 10mg EXTRACTO DE PULPA DE CAFÉ 100mg
72
lípidos plasmáticos y tisulares ya que se evidenciaron en estudios in vitro que reduce la
absorción de glucosa e inhibe la hidrólisis de la glucosa 6- fosfato.
La cafeína aporta cambios de peso como lo demostró un estudio in vivo realizado por
López-García E (2006), en donde determinó que el aumento en la ingesta de cafeína puede
conducir a una pequeña reducción en el de peso a largo plazo, sin embargo en los hombres,
la asociación entre el consumo de cafeína y el peso fue más fuerte en los participantes más
jóvenes y en las mujeres, la asociación se incrementó en aquellos que tenían un índice de
masa corporal (en kg / m2 ) ≥25, que eran menos activos físicamente o que eran fumadores
actuales. Existe la posibilidad que la edad en los ratones machos sea el motivo por lo que el
extracto de pulpa de café afectó en el peso de estos, y la grasa corporal propia de las hembras
para el proceso de gestación influyó para que no se evidencie una pérdida significativa de
peso.
También se pudo evidenciar que, al administrar a los ratones el extracto de la pulpa
de café incrementó la diuresis de los mismos; por lo que fue imprescindible realizar el
cambio de viruta cada tres días, este efecto reflejado en mayor porcentaje en machos y
hembras que fueron administrados el extracto de café cuya dosis fue (100 mg / kilogramo
del peso corporal /día), es decir el efecto diurético estaba relacionado directamente con la
concentración de la dosis. En algunos estudios realizados se ha determinado que la cafeína
que es un alcaloide del tipo de purina metilada, tiene la propiedad de ser un diurético como
lo menciona Bressani, Penaloza, Molina, & Gomez, (1985), que al administrar pulpa de café
como ración alimenticia en rumiantes estos incrementaron la diuresis y la excreción de
nitrógeno, lo que generaba la depletación de las proteínas, por lo que fue necesario
adminístrales suplementos nutricionales que compensen dicha pérdida; es por este motivo
que se lo considera muchas veces como un bioactivo tóxico para los animales al igual que
los taninos. Esta información se pudo corroborar cuando en las camadas de los animales que
fueron administrados el extracto de la pulpa de café ingerían en su totalidad la comida que
se les proporcionaba, en cambio los sujetos experimentación que se administró el Ginkgo
Biloba y el agua dejaban parte del alimento en el recipiente.
Un elemento adicional observado es el comportamiento en los ratones machos que
fueron administrados la dosis de Ginkgo Biloba fue la agresividad, que se generó después
de 5 minutos de la ingesta, no existe un respaldo suficiente de los efectos secundarios o
adversos que involucre este comportamiento, la mayoría de estudios de este fitofármacos es
sobre los beneficios e interacciones medicamentosas que se generan; como por ejemplo
aquellos denotados en pacientes con Alzhéimer tratados con acetilsalicílico ácido, AINE o
73
anticoagulantes, cuyos pacientes presentan consecuencias en la coagulación, al consumir al
mismo tiempo suplementos que contienen ginkgo Biloba, (Centro Andaluz de Información
de Medicamentos CADIME, 2014). Es por este motivo que la presente investigación
recomienda un estudio dirigido a los posibles efectos adversos que se pueden generar si se
administra productos que posean Ginkgo Biloba.
Método 1. Laberinto Acuático de Morris.
La evaluación de los ratones en el laberinto acuático de Morris fue empleada para
medir la memoria espacial y el aprendizaje del sujeto de experimentación, que son procesos
cognitivos que suelen ser afectados con el envejecimiento del organismo asociado a una serie
de cambios neurobiológicos que producen alteraciones cognitivas con funciones
preservadas, deterioradas y facilitadas, como lo menciona en su estudio Moreno Fernández
(2013).
Los datos experimentales obtenidos en el estudio, están relacionados a la edad, sexo
y otras características que se pudieron medir como el tiempo de latencia y el recorrido óptimo
que se valoró en los sujetos de experimentación, sin embargo debido a diferencias
individuales de cada animal, el ambiente en el que se desarrolló el estudio y de igual manera
el comportamiento influyeron en los resultados obtenidos, que a simple vista divergen en
cada repetición, por lo que se generó un conflicto de aceptación de dichos valores si se los
trataba con un análisis estadístico común, es por este motivo que se optó por realizar un
análisis matemático de un modelo lineal mixto. Este tipo de método está en pleno auge en el
estudio científico del comportamiento animal y humano (Etología), ya que elimina el error
tipo 1, que rechaza la hipótesis nula cuando esta es verdad, si se lo maneja de una forma de
agregado de datos; el método lineal mixto permite acomodar las variables explicativas en
categóricas, como son los efectos fijos y aleatorias, las primeras cuando dichas variables son
informativas y tiene un número fijo de antemano como el sexo del animal y las aleatorias
cuando las variables son solo identificativas y podrían encontrarse otras si se repitiera el
estudio en diferentes circunstancias. Según Seoane (2014) el modelo mixto combina efectos
fijos y aleatorios en el análisis de datos como una estrategia lógica, como lo realiza cualquier
modelo estadístico que trata de describir una relación entre una variable respuesta
(dependiente) y una o varias variables explicativas (independientes, predictores o
covariables).
Tomando en cuenta las variables explicativas se encontró varias connotaciones, por
ejemplo la existencia de roedores que fueron evaluados, cuyo tiempo de latencia se
incrementaba, debido al miedo que les generaba ser introducidos a la piscina, y la existencia
74
de esta emoción en los animales hacían que estos solo deambulen alrededor del lugar y no
lleguen a la plataforma, lo que implica que estos procesos cognitivos antes mencionados
están ligados a un condicionamiento del miedo, es decir a la memoria emocional. Este suceso
se corrobora con el estudio realizado por Moreno Fernández (2013). En cual concluyen que
los animales al ser sometidos a condicionamiento del miedo al contexto y condicionamiento
de huella palpebral generan un bloqueo condicionado y los resultados confirman que resultan
selectivamente afectadas aquellas funciones complejas dependientes del hipocampo,
haciéndose evidente el deterioro en animales maduros antes de poder ser considerados
envejecidos. Y es por ello que los resultados obtenidos en el presente estudio de aquellos
ratones no minoraban el tiempo de latencia todo lo contrario e incluso no llegaban al
objetivo, a pesar de que los ratones no eran viejos.
Tabla 4.20 Análisis de varianza del laberinto acuático de Morris
Grados
de
Libertad
Valor F Valor P
INTERCEPTOS 1 405,52 <0,0001
Tratamientos 3 10,04 <0,0001
Sexo 1 11,97 0,0006
Días de evaluación 6 10,41 <0,0001
Tratamientos: días 18 1,27 0,2029
Sexo: días 6 2,12 0,0497
Tratamientos: sexo 3 8,77 <0,0001
Tratamientos: sexo: días 18 0,90 0,5748
Elaborado por: Grijalva Jorge & Vera Roy, 2018
Fuente: Datos obtenidos de Molina Vanessa
En la tabla 4.20, se realiza un análisis de cada uno de los efectos que influyen en las
variables respuesta que es el tiempo de latencia, en donde se determina que son diferentes
significativamente si el valor de p cumple con la siguiente condición (P<0,05), a partir de
ello se puede evidenciar que existe diferencia significativa entre los tratamientos
administrados al ratón, así como en el sexo del animal y los días de evaluación. De igual
manera se afirma que la diferencia existente entre los sexos depende de los días que fueron
evaluados y que la diferencia entre los tratamientos depende del sexo del animal de
experimentación.
75
Para determinar las diferencias verdaderas entre las comparaciones múltiples
realizadas, se empleó LSD Fisher, con el objeto de aceptar o rechazar la hipótesis de trabajo
en la cual describe que se evidencia actividad nootrópica similar a dosis diferentes del
extracto de la pulpa de café administradas en ratones de la especie mus musculus,
comparándolo con el efecto generado con el extracto de Ginkgo Biloba.
Tabla 4.21 LSD Fisher entre tratamientos administrados al ratón
Tratamientos Medias
Ln t
Medias
t , seg
Error
Estándar LSD Fisher
Control 2,40 11,02 0,12 A
Gingko Biloba 2,24 9,39 0,12 A
Extracto de la pulpa de
café 10mg 2,02 7,54 0,12 B
Extracto de la pulpa de
café 100mg 1,87 6,49 0,12 B
Elaborado por: Grijalva Jorge & Vera Roy, 2018
Fuente: Datos obtenidos de Molina Vanessa
En la tabla 4.21 se puede observar dos rangos bien definidos que indican que existe
una diferencia significativa entre los tratamientos administrados a los ratones, como se
evidencia al comparar las medias que el tiempo de latencia de aquellos sujetos de
experimentación que fueron administrados el agua (control) y Ginkgo Biloba poseen un
mayor valor representados por la letra A en comparación a aquellos que se les administró el
extracto de café en diferentes dosis cuya letra representativa es la B.
Tabla 4.22 LSD Fisher entre el sexo del sujeto de experimentación
Sexo Medias
Ln t
Medias
t, seg
Error
Estándar LSD Fisher
Hembras 2,26 9,58 0,11 A
Machos 2,01 7,46 0,11 B
Elaborado por: Grijalva Jorge & Vera Roy, 2018
Fuente: Datos obtenidos de Molina Vanessa
76
En la tabla 4.22 se evidencia dos rangos bien definidos, que permiten concluir que el
tiempo de latencia es diferente entre los dos sexos, siendo las hembras las que se demoraron
más en encontrar el objetivo, por ende la actuación es más eficiente en los ratones machos
Tabla 4.23 LSD Fisher entre los días de evaluación
Días de
Evaluación
Medias
Ln t
Medias
t, seg
Error
Estándar LSD Fisher
1 2,75 15,64 0,14 A
2 2,26 9,58 0,14 B
4 2,21 9,11 0,14 B
3 2,03 7,61 0,14 B C
5 2,03 7,61 0,14 B C
7 1,86 6,42 0,14 C
6 1,80 6,05 0,14 C
Elaborado por: Grijalva Jorge & Vera Roy, 2018
Fuente: Datos obtenidos de Molina Vanessa
En la tabla 4.23 se evidencia 3 rangos, en donde existe una diferencia significativa
notoria a partir del segundo día de evaluación y también se observa que el tiempo de latencia
va disminuyendo a medida que se les realiza la evaluación, sin embargo al séptimo día este
valor va incrementándose, posiblemente porque al ser introducidos repetidamente dichos
sujetos de experimentación se habituaron al espacio, y se tomaban más tiempo de lo que
normalmente realizaban en las primeros días de evaluación hasta el sexto día. Es por este
motivo que se recomienda que sean evaluados máximo 6 días para no tener resultados falsos
positivos. Se debe acotar la existencia de algunos animales de experimentación que a pesar
de hacer menos tiempo de latencia, estos visitaban todos los cuadrantes de la piscina hasta
llegar a la plataforma, lo que implica que no solo el tiempo de latencia debe influir en esta
evaluación sino también el recorrido óptimo que deben realizar dichos sujetos.
Se concluye con al análisis realizado de los datos experimentales obtenidos que se
rechaza la hipótesis de trabajo y se acepta la hipótesis nula ya que difiere la actividad
nootrópica a dosis diferentes del extracto de la pulpa de café administradas en ratones de la
especie mus musculus que contiene mayor cantidad de fenoles totales, comparándolo con el
efecto generado con el extracto de Ginkgo Biloba.
77
Gráfico 4.12 Tiempo de latencia en función de los tratamientos.
Elaborado por: Grijalva Jorge & Vera Roy, 2018
Fuente: Datos obtenidos de Molina Vanessa
El objetivo de este estudio fue determinar la actividad nootrópica del extracto de la
pulpa de café a diferentes dosis (10 y 100 mg/kg corporal/día), teniendo con control positivo
el Ginkgo Biloba y el agua como control negativo, que permitió comparar entre los diferentes
tratamientos para de esta manera conocer si el extractos de pulpa de café tuvo efecto.
El gráfico 4.12, permite realizar un análisis de los tratamientos administrados en los
ratones diferenciado entre hembras y machos, como se puede demostrar en los machos existe
una disminución del tiempo de latencia de aquellos sujetos cuya administración es de
extracto de la pulpa de café de concentración 10 mg seguido del Ginkgo Biloba y finalmente
del extracto de café de 100 mg de concentración, en comparación con el grupo control.
Hembras Machos
Control Ginko Coff. 10mg Coff. 100mg
0.00
7.63
15.25
22.88
30.51
Tie
mp
o (
seg
un
do
s)
Hembras Machos
78
Sin embargo en los ratones hembras se observa que dicha variable respuesta es menor
en aquellos sujetos que se administró el extracto de la pulpa de café de concentración 100
mg, seguido por el de concentración 10 mg, por lo que se concluye que el extracto de la
pulpa de café cumple con el objetivo planteado de mejorar la memoria espacial y el proceso
de aprendizaje de las ratonas, sin embargo una situación que llama la atención es que el
tiempo de latencia del grupo de Ginkgo Biloba el cual es mayor inclusive al comparar con
los resultados del grupo de control, esto se debe como se mencionó anteriormente que los
procesos cognitivos como la memoria y el aprendizaje se ven afectados por la memoria
emocional, porque precisamente en dicha camada existía una ratona que tenía miedo de
ingresar a la piscina por lo que influyó en los resultados obtenidos. Posiblemente la causa
generó un estrés oxidativo liberando mayor cantidad de radicales libre a nivel neuronal
Hay que tener en cuenta que la respuesta a un fármaco refleja la interacción de tres
parámetros dosis, vía de administración y los receptores del sitio de acción, según Homa, y
otros (2015) se cree que el hipocampo juega un papel esencial en la formación de la memoria
espacial y es altamente vulnerable al daño oxidativo, y como el extracto de la pulpa de café
posee como bioactivos polifenoles que eliminan los radicales libres se pudo evidenciar en
los resultados obtenidos que el tiempo de latencia es menor y por ende existe un incremento
de la memoria espacial y del aprendizaje.
El menor tiempo de latencia que se obtuvo en los resultados de las ratonas evaluadas
administradas el extracto de café se evidencia que a mayor dosis mayor respuesta obtenida,
pero si al comparar con los resultados de los ratones machos se puede observar que los
animales que fueron administrados el extracto de café de menor dosis (10 mg / kg corporal/
día) arrojan mejores resultados que aquellos que se les dio 10 veces más concentrada la dosis,
que está ligado al concepto de unión y las relaciones cuantitativas es decir la relación dosis
/ concentración – respuesta , en el cual sugieren que la magnitud de los efectos
farmacológicos distales inducidos por los ligandos es proporcional a la fracción de ocupación
de los receptores (Waldman, 2015), por lo que se concluye que los 100 mg de ácido
clorogénico administrados a los ratones ocuparon en su totalidad los receptores del sitio de
acción, por lo que es innecesario administrar una dosis mayor, esta diferencia entre hembras
y machos son consecuencias fisiológicas y comportamentales que acarrea el sexo de cada
individuo.
79
Gráfico 4.13 Tiempo de latencia en función a los días de evaluación
Elaborado por: Grijalva Jorge & Vera Roy, 2018
Fuente: Datos obtenidos de Molina Vanessa.
En el gráfico 4.13 se evidencia que disminuye el tiempo de latencia a medida que se
va evaluando a los sujetos de experimentación, sin embargo se puede observar que existe
una diferencia de los resultados entre sexos , esto se debe a la habituación del animal, así
como también a las condiciones que se realizaron cada día la evolución ligado a parámetros
ambientales, comportamiento de animal así como también la fisiología del mismo, es esto
último que determina que los días de evaluación depende del sexo del animal
Método 2. Laberinto Radial de 8 brazos
La tarea del laberinto radial o brazos sirve para evaluar dos tipos de memoria:
memoria espacial y memoria de trabajo. La memoria espacial se considera disminuida
cuando el roedor no visita sólo los brazos en los que cree que habrá una recompensa, mientras
que la memoria de trabajo se evalúa negativamente si el roedor entra más de una vez en cada
brazo (Instituto de neurociencias del principado de Asturias, 2013).
Hembra Macho
1 2 3 4 5 6 7
Días de evaluación
0.0
10.3
20.5
30.8
41.0
Tie
mp
o (
seg
un
do
s)
Hembra Macho
80
Es por ello que en dicha evaluación se toma en cuenta dos variables el tiempo de
latencia y el número de desaciertos, que al existir modificaciones en las mismas se evidenció
afectaciones en las propiedades cognitivas del animal, al ser las dos variables importantes,
en un modelo estadístico denominado ANCOVA (análisis de covarianza), en donde se buscó
determinar la relación existente entre el tiempo de latencia y el número de desaciertos que el
ratón pudo cometer.
En el análisis de covarianza se contemplan básicamente tres tipos variables. El primer
tipo de variable está constituido por las variables independientes (representando las
condiciones experimentales o tratamientos que se quieren probar); Un segundo tipo de
variables independientes (que representan las variables sobre las cuales no se puede ejercer
control, son variables extrañas) y estos dos tipos de variables actúan sobre la variable
dependiente o variable respuesta provocando un efecto (Análisis de Covarianza)
Es función a ello se realizó una análisis tomando en cuento al primero como variable
dependiente al número de aciertos y como covariable el tiempo de latencia y en un segundo
plano la variable dependiente el tiempo de latencia y como covariable el número de
desaciertos, para homogenizar los datos experimentales se transformó el tiempo de latencia
en logaritmo natural.
Tabla 4.24 ANOVA Laberinto radial de ocho brazos en función al número de
desaciertos
Grados de
Libertad Valor F Valor P
Interceptos 1 598,06 <0,0001
Tratamientos 3 9,09 <0,0001
Días de Evaluación 6 4,91 0,0002
Sexo 1 5,67 0,0759
t.min 1 76,37 <0,0001
Tratamientos: días 18 1,03 0,4376
Días: sexo 6 2,36 0,0354
Tratamientos: sexo 3 0,79 0,5017
Tratamientos: sexo: días 18 0,73 0,7694
Elaborado por: Grijalva Jorge & Vera Roy, 2018
Fuente: Datos obtenidos de Molina Vanessa
81
En la tabla 4. 24, se representa los resultados de cada una de las variables explicativas
que influyen en el número desaciertos, en donde se determina que son diferentes
significativamente si el valor de p cumple con la siguiente condición (P<0,05), a partir de
ello se puede evidenciar que existe diferencia significativa entre los tratamientos
administrados al ratón, los días de evaluación, tiempo de latencia. De igual manera se
establece que la diferencia existente entre los tratamientos depende de los días que fueron
evaluados y que la diferencia entre los días depende del sexo del animal de experimentación.
Como es un estudio de Covarianza se realizó la estimación de una relación causal de
dependencia o covarianza entre el número de desaciertos con el tiempo de latencia.
Tabla 4.25 Efectos fijos, variable dependiente número de desaciertos
Valor Error Estándar Valor t Valor p
t.min 0,91 0,12 7,39 <0,0001
Elaborado por: Grijalva Jorge & Vera Roy, 2018
Fuente: Datos obtenidos de Molina Vanessa
Entonces se concluye que por cada minuto adicional que demora el ratón en alcanzar
el objetivo, los desaciertos aumentan en 0,91 puntos.
Para determinar las diferencias verdaderas entre las comparaciones múltiples
realizadas, se empleó LSD Fisher, con el objeto de aceptar o rechazar la hipótesis de trabajo
en la cual describe que se evidencia actividad nootrópica similar a dosis diferentes del
extracto de la pulpa de café administradas en ratones de la especie mus musculus,
comparándolo con el efecto generado con el extracto de Ginkgo Biloba
Tabla 4.26 LSD Fisher entre tratamientos administrados al ratón en función del
número de desacierto
Tratamientos
Medias
Nº de
desaciertos
Error
Estándar LSD Fisher
Gingko Biloba 3,13 0,22 A
Control 3,10 0,22 A
Extracto de la pulpa de
café 100mg 2,68 0,24 A
Extracto de la pulpa de
café 10mg 1,85 0,22 B
Elaborado por: Grijalva Jorge & Vera Roy, 2018
Fuente: Datos obtenidos de Molina Vanessa
82
En la tabla 4.26 se evidencia dos rangos bien definidos, en donde la letra A representa
al mayor número de desaciertos que cometieron los ratones. Por lo que se concluye que los
ratones que fueron administrados el extracto de la pulpa café a una concentración de (10 mg/
kilogramo del peso corporal / día), realizaron menor número de errores, lo que indica que
poseen mejor memoria de trabajo. En comparación al grupo del Ginkgo Biloba, sin embargo
si existe diferencia significativa entre los dos tratamientos a base del extracto de la pulpa de
café arábica.
Como se mencionó también se realizó al análisis en función al tiempo de latencia.
Tabla 4.27 ANOVA del laberinto radial de ocho brazos en función logaritmo natural
del tiempo de latencia
Grados de
Libertad Valor F Valor P
Interceptos 1 172,87 <0,0001
Tratamientos 3 12,42 <0,0001
Días de Evaluación 6 2,01 0,0710
Sexo 1 2,04 0,2264
Nº desaciertos 1 58,35 <0,0001
Tratamientos: días 18 1,26 0,2281
Días: sexo 3 3,73 0,0135
Tratamientos: sexo 6 2,56 0,0235
Tratamientos: sexo; días 18 1,37 0,1643
Elaborado por: Grijalva Jorge & Vera Roy, 2018
Fuente: Datos obtenidos de Molina Vanessa
En la tabla 4. 27, se realiza un análisis de cada una de las variables explicativas que
influyen en el número desaciertos, que determina que son diferentes significativamente si el
valor de p cumple con la siguiente condición (P<0,05), a partir de ello se puede evidenciar
que existe diferencia significativa entre los tratamientos administrados al ratón, el número
de desaciertos. De igual manera se afirma que la diferencia existente entre los tratamientos
y lo días de evaluación depende del sexo del animal de experimentación.
Como es un estudio estadístico de Covarianza, se realizó la estimación de una
relación causal de dependencia o covarianza entre el tiempo de latencia con el número de
desaciertos
83
Tabla 4.28 Efectos fijo, variable dependiente tiempo de latencia
Valor Error
Estándar Valor t Valor P
Nº desaciertos 0,12 0,02 7,64 <0,0001
Elaborado por: Grijalva Jorge & Vera Roy, 2018
Fuente: Datos obtenidos de Molina Vanessa
Entonces se concluye que por cada desacierto del sujeto de experimentación
adicional, el tiempo de latencia se incrementa en 0,12 puntos.
Gráfico 4.14 Comparación de Tiempo de latencia.
Elaborado por: Molina Vanessa
El gráfico 4.14 permite observar que tanto los machos como las hembras que fueron
administrados el extracto de la pulpa de café de concentración ( 10 mg / kilogramo del peso
corporal / día) requirieron mayor tiempo para alcanzar el objetivo, sin embargo en el caso de
los animales de experimentación que fueron administrados el extracto de la pulpa de café de
concentración ( 100 mg / kilogramo del peso corporal / día) obtuvieron el mismo tiempo de
latencia promedio tanto para hembras como para machos, además aquellos que fueron
administrados el Ginkgo Biloba realizaron el menor promedio en general.
2,97 3,10
2,56
2,01
2,75
3,67
2,56 2,48
CONTROL EXTRACTO DE PC 10mg
EXTRACTO DE PC100 mg
GINKGO BILOBA
TIEMPO DE LATENCIA,MINUTOS
Male Female
84
Con el objeto de verificar que ambas respuestas tienen la misma importancia, y por
ende la respuesta final sean similares aunque en sentido opuesto se presenta las siguientes
ilustraciones.
Elaborado por: Molina Vanessa
Gráfico 4.15 Comparación de resultados obtenidos por ANCOVA
Al observar ambas gráficas se puede denotar que los ratones que fueron
administrados la dosis de (10 mg / kilogramo del peso corporal / día) del extracto de la pulpa
café presentan menos desaciertos en comparación al resto de tratamientos, sin embargo,
requieren mayor tiempo de latencia , esto significa que el extracto de la pulpa de café a esta
dosis incrementa la memoria de trabajo pero no ayuda en la memoria espacial; ahora bien al
observar los resultados de la dosis de (100 mg / kilogramo del peso corporal / día) del
extracto es el segundo tratamiento que posee un valor menor de número de desaciertos y
menor tiempo de latencia requirió para cumplir el objetivo, por lo que se concluye que el
extracto de la pulpa de café a esta concentración favorece a ambas propiedades cognitivas;
si se realiza una comparación con el Ginkgo Biloba que el control positivo en el estudio, este
no mejora la memoria de trabajo pero si en un cierto rango la memoria espacial; lo que
permite inferir que el extracto de la pulpa de café mejora la actividad nootrópica de los
sujetos de experimentación.
El menor tiempo de latencia que se obtuvo en los resultados de los animales de
experimentación de ambos sexos evaluados y administrados el extracto de café se evidencia
que a la dosis 100mg / kilogramo del peso corporal / día, que está ligado al concepto de
unión y las relaciones cuantitativas es decir la relación dosis / concentración – respuesta , el
cual sugiere que la magnitud de los efectos farmacológicos distales inducidos por los
ligandos es proporcional a la fracción de ocupación de los receptores (Waldman, 2015), por
lo que se concluye que los 100 mg de ácido clorogénico administrados a los ratones ocuparon
en su totalidad los receptores del sitio de acción, y los resultados obtenidos al administrar la
3,13 3,1 2,681,85
GINKGO BILOBA
CONTROL EXTRACTO DE PC 100 MG
EXTRACTO DE PC 10 MG
NÚMERO DE DESACIERTOS
2,66 2,723,39
2,27
CONTROL GINKGO BILOBA
EXTRACTO DE PC 10 MG
EXTRACTO DE PC 100 MG
TIEMPO DE LATENCIA, minutos
85
dosis de 10mg / kg corporal/ día , se visualiza una diferencia entre hembras y machos que
son consecuencias fisiológicas y comportamentales que acarrea el sexo de cada individuo.
Disección de Animales de experimentación.
Finalmente se realizó la disección de ocho ratones en total, un ratón de cada grupo
de administración con el objetivo de evidenciar la existencia de anormalidades que llamen
la atención en el presente trabajo de investigación. Según Fuentes Yanez (2013), la disección
de sujetos de experimentación permite observar posibles lesiones, cambios morfológicos que
pueda evidenciar algún tipo de patología.
Tabla 4.29 Resultados de la Disección de ratones machos
Elaborado por: Molina Vanessa
Tratamientos Control Ginkgo
Biloba
Extracto de PC
10mg ACG
Extracto de PC
100mg ACG
Peso
ratón, g
41,85 44,64 42,12 37,92
Hígado Peso, mg 2042,7 1830,7 1629,4 2072,6
Peso,% 4,9 4,1 3,9 5,5
Forma Semiovoide Semiovoide Semiovoide Semiovoide
Coloración Rojizo
oscuro
Rojizo
oscuro
Rojizo oscuro Rojizo oscuro
Bazo Peso, mg 85 77,2 71,3 186,3
Peso,% 0,2 0,17 0,17 0,49
Dimensiones, cm 1,5 x 0,6 1,6 x 0,4 1,9 x 0,4 2,0 x 0,7
Coloración Rojizo
oscuro
Rojizo
oscuro
Rojizo oscuro Rojizo oscuro
Riñón
izquierdo
Peso, mg 361,2 270,9 276,7 315,5
Peso,% 0,86 0,61 0,66 0,83
Dimensiones, cm 1,3 x 0,6 1,2 x 0,7 1,2 x 0,7 1,2 x 0,7
Coloración Rojizo
oscuro
Rojizo
oscuro
Rojizo oscuro Rojizo oscuro
Riñón
derecho
Peso, mg 392,7 287,7 265,7 280,5
Peso,% 0,94 0,64 0,63 0,74
Dimensiones, cm 1,4 x 0,8 1,2 x 0,8 1,1 x 0,7 1,2 x 0,6
Coloración Rojizo
oscuro
Rojizo
oscuro
Rojizo oscuro Rojizo oscuro
Corazón Peso, mg 268,6 255,7 195,6 209,2
Peso,% 0,64 0,57 0,46 0,55
Dimensiones, cm 1,1 x 0,7 1,0 x 0,6 0,9 x 0,6 0,9 x 0,7
Coloración Rojizo
oscuro
Rojizo
oscuro
Rojizo oscuro Rojizo oscuro
86
Tabla 4.30 Resultados de la Disección de ratones hembras
Tratamientos Control Ginkgo
Biloba
Extracto de PC
10mg ACG
Extracto de PC
100mg ACG
Peso ratón,
g 31,8 30,12 30,01 34,02
Hígado
Peso, mg 1417,6 1199,6 1596,3 1778,7
Peso,% 4,5 4,0 5,3 5,2
Forma Semiovoide Semiovoide Semiovoide Semiovoide
Coloración Rojizo
oscuro
Rojizo
oscuro Rojizo oscuro Rojizo oscuro
Bazo
Peso, mg 124,4 52,1 111,1 83,2
Peso,% 0,39 0,17 0,37 0,24
Dimensiones, cm 1,5 x 0,6 1,6 x 0,4 1,9 x 0,4 2,0 x 0,7
Coloración Rojizo
oscuro
Rojizo
oscuro Rojizo oscuro Rojizo oscuro
Riñón
izquierdo
Peso, mg 199,9 183,5 206,9 186,3
Peso,% 0,63 0,61 0,69 0,55
Dimensiones, cm 1,0 x 0,6 1,1 x 0,7 1,1 x 0,6 1,1 x 0,6
Coloración Rojizo
oscuro
Rojizo
oscuro Rojizo oscuro Rojizo oscuro
Riñón
derecho
Peso, mg 200,1 197,7 202,8 179,4
Peso,% 0,63 0,66 0,68 0,53
Dimensiones, cm 1,0 x 0,6 1,1 x 0,6 1,4 x 0,7 1,2 x 0,7
Coloración Rojizo
oscuro
Rojizo
oscuro Rojizo oscuro Rojizo oscuro
Corazón
Peso, mg 153,4 132 110 175,9
Peso,% 0,48 0,44 0,4 0,52
Dimensiones, cm 0,9 x 0,5 0,9 x 0,5 0,9 x 0,5 1,2 x 0,7
Coloración Rojizo
oscuro
Rojizo
oscuro Rojizo oscuro Rojizo oscuro
Elaborado por: Molina Vanessa
Comparar el peso de los órganos entre los animales tratados con el grupo de control
es complejo, debido a la diferencia de los pesos corporales de cada ratón, motivo por el cual
se comparó con el peso expresado en porcentaje, cuyo valor se obtuvo al relacionar el peso
del órgano con el peso corporal del animal.
En la tabla 4.29 se puede observar que el sujeto de experimentación que fue
administrado la dosis de 100 mg ACG/ kilogramo del peso corporal / día del extracto de
pulpa de café arábica presento un hígado y un bazo más grandes, cuyo porcentaje fue (5,5 %
y 0,49 %) respectivamente en comparación al grupo de control, el agrandamiento del estos
órganos es posible que se deba al depósito excesivo de glucógeno o grasa como lo menciona
87
Gutiérrez & Pavón (2017), lo que puede ocasionar a su vez esplenomegalia, que está
relacionada con la hepatomegalia; esto se puede deber a que estos ratones al tener un efecto
diurético alto requerían la ingesta de mayor cantidad de alimento en comparación al grupo
de control para suplir posibles deficiencias de nutrientes, lo que acarrearía un incremento de
grasa en su organismo.
La edad y el sexo, así como la constitución genética, factores nutricionales,
exposición al ambiente y manejo sanitario, producen cambios en el estado fisiológico de los
animales de laboratorio, que conducen a un incremento o pérdida de peso de ciertas
estructuras anatómicas (Fuentes Yanez, 2013), como se puede evidenciar en las tablas 4.29
y 4.30, el porcentaje de corporal de cada uno de los órganos analizados no presentan valores
que estén fuera de lo normal, sin embargo se puede evidenciar que el porcentaje del peso del
hígado en función al peso corporal del animal tanto de hembras como machos es superior al
comparar con del grupo control de cada sexo, esto podría deber a lo mencionado con
anticipación con respecto al efecto diurético que generaba la cafeína presente en el extracto.
88
Capítulo V
Conclusiones y Recomendaciones
Conclusiones
Se realizó la identificación taxonómica de la planta de café proveniente de la
provincia de Manabí, cantón El Carmen; la misma que pertenece a la especie Coffea arabica,
los parámetros de control de calidad analizados de la pulpa de café son 6,20 % de humedad,
23 % de fibra cruda, 1,28% de grasa cruda, 0,85 % cenizas totales y cumpliendo con los
criterios de control microbiológico establecido por la OMS para microorganismos aerobios,
enterobacterias, mohos y levaduras.
Mediante el análisis fitoquímico del extracto de la pulpa de café arábica obtenido se
determinó la presencia de alcaloides, flavonoides, taninos y escasa presencia de
antraquinonas y esteroles, de igual manera se determinó el porcentaje de cafeína de la pulpa
de café arábica y del extracto seco de la pulpa de café a partir de la regresión lineal cuya
ecuación fue 𝑦 = 57024 𝑥 + 3254,6 con r2 = 0,9999, obteniendo los siguientes porcentajes
0,85% y 0,93%, respectivamente.
Se determinó el contenido de fenoles totales de la pulpa de café arábica, a través de
método de extracción de maceración dinámica y maceración asistido por ultrasonido con dos
solventes, el primero una mezcla etanol: agua (50:50) y el segundo metanol 99%, y se
identificó que el solvente etanol: agua (50:50) y el método de extracción de maceración
dinámica, son las condiciones óptimas que permiten obtener extractos con una mayor
cuantificación de fenoles totales de la pulpa de café arábica (Coffea arabica) cuyo valor es
0,758 meq ACG / ml de muestra
Se evaluó a los animales de experimentación en dos pruebas de aprendizaje y se
evidenció la existencia de diferencias significativas entre hembras y machos los mismos que
están ligadas a consecuencias fisiológicas y comportamentales del individuo.Se comprobó
que el extracto de la pulpa de café arábica (Coffea arabica) tienen actividad nootrópica, y
que la dosis 100 mg / kilogramo del peso corporal /día de ácido clorogénico, poseen mayor
efectividad en el mejoramiento de las propiedades cognitivas, de aprendizaje y memoria.
89
Recomendaciones
Se debe implementar Buenas Prácticas de Manufactura y Buenas Prácticas de
Agricultura para el procesamiento de la pulpa de café arábica, ya que es considerada un
residuo en las industrias cafeteras, con el objeto de evitar la contaminación cruzada el
momento de obtener la almendra del café en las industrias cafeteras.
Se recomienda estandarizar métodos para determinar una composición proximal de
la pulpa de café a nivel nacional, para que sirva como referencia para futuras investigaciones.
Para evaluar a animales de experimentación se recomienda que estos sean criados
bajo la supervisión del investigador en la posibilidad de la situación, o que en su efecto se
adquiera sujetos que posean la misma edad, sexo y un peso aproximado.
Si en futuras investigaciones se realiza la evaluación de propiedades cognitivas con
los aparatos usados en este trabajo de investigación, se recomienda que se entrene durante 3
días un solo laberinto y se evalué los siguientes 3 posteriores días, esto con la finalidad que
el sujeto de experimentación no genere habituación y no influya en los resultados en el
momento de realizar el procedimiento.
En la realización de las pruebas de aprendizaje se debe tener en cuenta los siguientes
factores: el ambiente libre de ruido y distracciones, horario nocturno para que el animal de
experimentación este activo y la adquisición de un software que determine el recorrido
realizado por el ratón en el laberinto acuático de Morris.
Se recomienda realizar un estudio histopatológico del cerebro como un proceso
confirmatorio para evaluar el extracto de la pulpa de café arábica en función de la actividad
nootrópica.
Otro método confirmatorio que se recomienda realizar es un estudio a partir de
cultivos celulares que midan los indicadores neurotóxicos que desarrollan la enfermedad de
Alzheimer relacionados con los niveles bajos de SIRT1 que indican la existencia de
90
anomalías en la proteína TAU por HPLC de igual manera para que se determine la actividad
antioxidante de la pulpa de café arábica.
Debido al comportamiento observado en los ratones machos que fueron
administrados el Ginkgo Biloba, se recomienda realizar un estudios de los efectos adversos
y secundarios de este fitofármaco.
Se recomienda realizar estudios preclínicos con la pulpa de café arábica relacionado
con afectación en el metabolismo lipídico del animal de experimentación.
91
Bibliografía
Alianza de enfermedades Neurodegenerativas . (2016). Prevalencia y Costes de las
Enfermedades Neurodegenerativas. Universidad Complutense. Madrid:
NeuroAlianza. Recuperado el 24 de abril de 2018, de http://neuroalianza.org/wp-
content/uploads/Informe-NeuroAlianza-Completo-v-5-optimizado.pdf
Alonso, R. J. (2012). El fruto del asaí Euterpe oleracea como antioxidante. Revista de
Fitoterapia, 12(2), 149-157. Obtenido de
www.fitoterapia.net/php/descargar_documento.php?id=4385&doc_r=sn
Análisis de Covarianza. (s.f.). Recuperado el 25 de marzo de 2018, de
http://www.uru.edu/fondoeditorial/libros/pdf/manualdestatistix/cap6.pdf
Anthony G. Phillips, S. A. (2004). Magnitude of Dopamine Release in Medial Prefrontal
Cortex Predicts Accuracy of Memory on a Delayed Response Task. Revista de
neurociencia, 24(2), 547-557. doi: https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.4653-
03.2004
AOAC OFFICIAL METHODS OF ANALYSIS OF INTERNATIONAL. (2012). AOAC
OFFICIAL METHOD, 923.03 (19th Edition ed.).
Arroyo, J., Bonilla, P., Tomàs, G., & Huamàn, J. (2011). Estudio Fitoquìmico del extracto
etanòlico y de las fracciones de las hojas del matico. Revista Peruana Quimica, 14(1
y 2), 62-67. Obtenido de
https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=3&cad=rja
&uact=8&ved=0ahUKEwic5ODE1LfVAhVBTSYKHZaHCAgQFgg6MAI&url=ht
tp%3A%2F%2Frevistasinvestigacion.unmsm.edu.pe%2Findex.php%2Fquim%2Far
ticle%2Fdownload%2F4599%2F3679&usg=AFQjCNGIxqZEu6EpwEmMo
Blandon, G., Rodríguez, N., & Dávila, M. T. (1998). Caracterización microbiologica y físico
- química de los subproductos de beneficio del café en proceso de compostaje.
Cenicafé, 49(3), 169-185. Recuperado el 12 de enero de 2018, de
http://biblioteca.cenicafe.org/bitstream/10778/753/3/arc049%2803%29169-185.pdf
Bressani, R., Penaloza, W., Molina, M., & Gomez, R. (noviembre de 1985). Solid-State
Fermentation: an Alternative to Improve the NutritiveValue of Coffee Pulp.
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,, 49(2), 388-393. Obtenido
de http://aem.asm.org/content/49/2/388.full.pdf
Carrión, A., & García, C. (2010). Preparación de extractos vegetales. Cuenca. Recuperado
el 31 de enero de 2018, de
http://dspace.ucuenca.edu.ec/bitstream/123456789/2483/1/tq1005.pdf
92
Castillo, M. D. (2011). Estudio in vivo del efecto antiglicante de los compuestos del café.
Madrid. Recuperado el 25 de octubre de 2017, de
http://digital.csic.es/handle/10261/151691
Centro Andaluz de Información de Medicamentos CADIME. (2014). Enfermedad de
Alzahimer: Tratamiento Farmacológico. El Boletín Terapéutico Andaluz, 29(1).
Recuperado el 16 de marzo de 2018, de
http://temas.sld.cu/medicamentosterapeutica/files/2014/12/CADIME_BTA2014-
29_01.pdf
Cláudia R Zamberlam, V. N. (julio de 2016). Efectos del extracto de Ginkgo biloba
estandarizado a la adquisición, recuperación y extinción de supresión condicionada:
Evidencia de que la memoria a corto plazo y la memoria a largo plazo son
diferencialmente modulada. Elseivier - Physiology & Behavior(165), 55-68.
Obtenido de
https://www.researchgate.net/publication/304746742_Effects_of_standardized_Gin
kgo_biloba_extract_on_the_acquisition_retrieval_and_extinction_of_conditioned_s
uppression_Evidence_that_short-term_memory_and_long-
term_memory_are_differentially_modulated
Cognifit. (2018). Obtenido de ReconocimientoHabilidad Cognitiva. Neuropsicología:
https://www.cognifit.com/es/habilidad-cognitiva/reconocimiento
Contreras, M., Marnet, N., Perraud, I., Roussos, S., & Augur, S. G. (2005). Degradación de
Taninos Condensados por Aspergillus fumigatus MC8. Recuperado el 12 de enero
de 2018, de
https://smbb.mx/congresos%20smbb/merida05/TRABAJOS/AREA_III/OIII-26.pdf
Córdoba, U. n. (2017). Aula Virtual. Recuperado el 15 de diciembre de 2017, de FAcualtad
de Ciencias Agropecuarias:
http://www.fca.proed.unc.edu.ar/mod/book/view.php?id=6305&chapterid=1
COVENIN 430 . (2013). COVENIN. Obtenido de Café elaborado determinación de fibra
Cruda: http://www.sencamer.gob.ve/sencamer/normas/430-82.pdf
Cuervo, J. (2010). AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE Bacillus spp VOMO
FIJADORES BIOLÓGICOS DEL NITRÓGENO Y SOLUBILIZADORES DE
FOSFATOS EN DOS MUESTRAS DE BIOFERTILIZANTE COMERCIAL. Tesis,
Pontificia Universidad Javeriana , Carrera de Microbiología Agrícola y Veterinaria,
Bogota D. C. Recuperado el 06 de marzo de 2018, de
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis404.pdf
Demarin, V. a. (febrero de 2017). Efficacy and safety of Ginkgo biloba standardized extract
in the treatment of vascular cognitive impairment: A randomized, double-blind,
93
placebo-controlled clinical trial. Neuropsychiatric Disease and Treatment , 13, 483
- 490. doi:10.2147/NDT.S120790
Domínguez, A., Álvarez, A., Suárez-Merino, B., & Goñi-de-Cerio, F. (2014). Afecciones
neurológicas y barrera hematoencefálica.Limitaciones y estrategias para la liberación
de fármacos al cerebro. Rev Neurol, 58(5), 213-224. Obtenido de
https://www.researchgate.net/profile/Felipe_Cerio/publication/260381812_Neurolo
gical_disorders_and_the_blood-
brain_barrier_Strategies_and_limitations_for_drug_delivery_to_the_brain/links/57
03639208aea09bb1a310fe/Neurological-disorders-and-the-blood-brain-
Espinosa Manrique, W. E., Garzón Salcedo, L., & Medina Vargas, O. (2016). Validación de
una metodología analítica para la cuantificación de polifenoles totales, en procesos
de extracción asistida por microondas sobre frutos de la especie colombiana. Ciencia
Química Farmacia, 45(1), 109-126. Recuperado el 12 de marzo de 2018 , de
http://www.scielo.org.co/pdf/rccqf/v45n1/v45n1a07.pdf
Esquivel, P., & Jiménez, V. M. (mayo de 2012). Propiedades funcionales de café y los
subproductos del café. ResearchGate, 46(488-495).
Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (Segunda edición ed.). (2013).
México.
Flores, F., Peña, J., Bremúdez, C., & Nava, C. (2016). Alianzas estratégicas para el
aprovechamiento. Agronomía Colombiana, 34(1), 54-57. Recuperado el 10 de
febrero de 2018, de
http://www.agronomia.unal.edu.co/sites/default/files/IMGS/IICTA2016/Revista%2
0Agronomia%20Colombiana%20%28suplemento%29%20Congreso%20IICTA%2
02016%20Parte%201%20pg23-226.pdf
Franco Ruíz, J. C. (2005). Drogas Inteligentes. En J. C. Franco Ruíz, Drogas Inteligentes
(pág. 12). Paidotribo.
Fuentes Yanez, M. (2013). PESO DE LOS ÓRGANOS EN RELACIÓN AL PESO
CORPORAL EN RATONES INFLUENCIA DE LAS VARIABLES EDAD, SEXO
Y SU COMBINACIÓN. Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado, 17.
Recuperado el 15 de abril de 2018, de
http://www.ucla.edu.ve/dveterin/departamentos/CienciasBasicas/gcv/2530int2530er
2530no/articulos/documasp/~3kubrugi.pdf
García, L. Á. (2010). CUANTIFICACIÓN DE ANTIOXIDANTES CONTENIDOS EN EL
CAFÉ (Coffea arabica) verde tostado rocedente de Veracruz. Tesis, Universidad
Autónoma de México, facultad de Ciencias Químicas, Toluca. Recuperado el 09 de
marzo de 2018, de
94
http://ri.uaemex.mx/bitstream/handle/20.500.11799/67543/Luis%20Angel%20Rug
erio%20Garc%EDa-split-
merge.pdf;jsessionid=72F1A0C169485B42438CEE9C4C01F586?sequence=5
Gómez Uribe, P. A. (2016). Análisis de las habilidades cognitivas básicas ( atención y
memoria) el nivel de inteligencia emocional y el rendiineto academico, asi como su
posible relación en los estudiantes de los grados 9,10,y 11 del Institución educativa
Santa Gema. Universidad de Antioquía, Santa Fe de Antioquía. Recuperado el 24 de
abril de 2018, de
http://200.24.17.74:8080/jspui/bitstream/fcsh/475/3/GomezPaola_Analisishabilidad
escognitivasbasicasatencion.pdf
Gracia Navas, M. (2007). CUANTIFICACIÓN DE FENOLES Y FLAVONOIDES
TOTALES EN EXTRACTOS NATURALES. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE
QUERÉTARO. Recuperado el 24 de abril de 2018, de
http://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias-
2007/56_1UAQGarciaNava.pdf
Gutiérrez, C., & Pavón, P. (2017). Hepatosplenomegalia. Protocolo diagnósticos y
terapeúticos en pediatría, 5, 229 -239. Recuperado el 01 de abril de 2018, de
https://www.aeped.es/sites/default/files/documentos/5-hepatoesplenomegalia.pdf
Gutiérrez, J. L. (2014). Demencias y enfermedad de Alzheimer en América Latina y el
Caribe. Revista Cubana Pública, 40(3). Obtenido de
http://bvs.sld.cu/revistas/spu/vol40_3_14/spu08314.htm
Homa, R., Mehdi, M., Mansoureh, S., farnaz, N., Mohsen, E. F., & Shima, A. (09 de marzo
de 2015). The effect of rosemary extract on spatial memory, learning and antioxidant
enzymes activities in the hippocampus of middle rats. Medical Journal of the Islamic
Republic of Iran, 29(187.9). Recuperado el 17 de febrero de 2018, de
http://www.manualmoderno.com/descargas_gratuitas/01_waldman.pdf
Huerta, A. (1963). Efectos de la fertilización del suelo en la composición mineral, foliar del
cafeto. Café Servicios Técnicos de Café y Cacao, 49-59. Recuperado el 12 de enero
de 2018, de https://books.google.com.ec/books?id=ON4OAQAAIAAJ&pg=RA4-
PA59&lpg=RA4-
PA59&dq=cenizas+totales+de+pulpa+de+caf%C3%A9&source=bl&ots=8DybReu
Lls&sig=TgH-
O_IXovkeL9HEYYh_GlUdINs&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwilr9zuhMbZAhWrsl
kKHbK0CsIQ6AEIQDAC#v=onepage&q=cenizas%20tot
Instituto de neurociencias del principado de Asturias. (2013). Recuperado el 11 de enero de
2018, de Aparatos de evaluación en roedores:
95
https://ineuropa.uniovi.es/servicios/roedores;jsessionid=468879B8E3AA40EF62B0
701F86F18550
Libia Fonseca García, L. S. (octubre de 2014). CAPACIDAD ANTIOXIDANTE Y
CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN CAFÉ Y SUBPRODUCTOS DEL
CAFÉ PRODUCIDO Y COMERCIALIZADO EN NORTE DE SANTANDER
(COLOMBIA). VITAE, REVISTA DE LA FACULTAD DE QUÍMICA
FARMACÉUTICA, 21(3), 228-236. Obtenido de
https://www.researchgate.net/profile/Maria_Rivera29/publication/302925756_ANT
IOXIDANT_CAPACITY_AND_TOTAL_PHENOL_CONTENT_IN_COFFEE_A
ND_COFFEE_BY-
PRODUCTS_PRODUCED_AND_MARKETED_IN_NORTE_DE_SANTANDER
_COLOMBIA/links/57335dda08ae9ace84073952/ANTIOXIDANT-CAPACI
Lopez-Garcia E, v. D. (marzo de 2006). Changes in caffeine intake and long-term weight
change in men and women. The American Journal of Clinical Nutrition, 83(3), 674
- 680. Recuperado el 13 de marzo de 2018, de
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16522916/
Márquez, D., & Suárez, A. (2008). El Uso de taninos condensados como alternativa
nutricional y sanitaria en rumiantes. Revista de medicina Veterianaria(16).
Recuperado el 15 de enero de 2018, de
https://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:8xM2fOFFOZ8J:https://d
ialnet.unirioja.es/descarga/articulo/4943803.pdf+&cd=2&hl=es&ct=clnk&gl=ec&c
lient=firefox-b-ab
Martínez-Lazcano, J. C. (2010). RADICALES LIBRES Y ESTRÉS OXIDATIVO EN LAS
ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS. Mensaje Bioquímico(XXXIV),
43-59. Obtenido de
https://www.researchgate.net/publication/265886313_Radicales_libres_y_estres_ox
idativo_en_las_enfermedades_neurodegenerativas
Mestre Navas, J. M., & Palmero Cantero, F. (2004). Una guia academica para los estudios
en Psicopedagogia Psicologia y Pedagogia. Madrid, España: Mc Graw hill.
Recuperado el 24 de abril de 2018
Ministerio del Ambiente para el Convenio sobre la Diversidad Biológica. (2015). Quinto
Informe Nacional. Quito.
Miranda, A., & Martín, O. (2013). Cromatografía Líquida de Alta Resolución. Recuperado
el 31 de enero de 2018, de http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-
gases%20l%C3%ADquidos.pdf
96
Monteros Guerrero, A. (2016). RENDIMIENTOS DE CAFÉ GRANO SECO EN EL
ECUADOR . Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca.
Recuperado el 2018 de marzo de 24 , de
http://sipa.agricultura.gob.ec/pdf/estudios_agroeconomicos/rendimiento_cafe_gran
o_seco2016.pdf
Morales, M., Bustamante, S., & Gallardo, R. (2000). Aplicaciones clínicas del extracto de
las hojas de Ginkgo Biloba. Revista Fitoterapia, 2(1). Recuperado el 26 de abril de
2018, de
https://www.researchgate.net/profile/Miguel_Morales7/publication/281442874_Apl
icaciones_clinicas_del_extracto_de_la_hoja_de_Ginkgo_biloba/links/55e7421008a
eb6516262de14/Aplicaciones-clinicas-del-extracto-de-la-hoja-de-Ginkgo-
biloba.pdf
Moreno Fernández, R. D. (2013). Neurogénesis hipocampal adulta y envejecimiento
cognitivo. 6(3), 14-24. Recuperado el 16 de marzo de 2018, de
http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1989-
38092013000300003
Muñoz-Bernala, O. A., & Gaspar A. Torres-Aguirrea, J. A.-G.-G.-Z.-P. (diciembre de 2017).
NUEVO ACERCAMIENTO A LA INTERACCIÓN DEL REACTIVO DE FOLIN-
CIOCALTEU CON AZÚCARES DURANTE LA CUANTIFICACIÓN DE
POLIFENOLES TOTALES. Revista especializada en Ciencias Químicas
biológicas, 20(2), 23-28. Recuperado el 12 de marzo de 2018, de
http://www.elsevier.es/es-revista-tip-revista-especializada-ciencias-quimico-
biologicas-93-articulo-nuevo-acercamiento-a-la-interaccin-S1405888X17300037
Navarrete, F., Pérez, J., Femenia, T., & Manzanares, J. (2008). Methods to evaluate cognitive
disorders in animal models. Revista Neurología, 47(3), 137-145. Recuperado el 15
de enero de 2018, de
https://www.researchgate.net/publication/51428231_Methods_to_evaluate_cognitiv
e_disorders_in_animal_models
NTE INEN ISO 2794. (2015). Insttuto Nacional de Normas Ecuatorianas INEN. Obtenido
de PRODUCTOS DE APICULTURA. PROPÓLEO:
http://www.normalizacion.gob.ec/wp-
content/uploads/downloads/2015/07/nte_inen_2794.pdf
NTE INEN-ISO 1854. (2016). Instituto de Normas técnicas ecuatoriana, INEN. Obtenido
de QUESO DE SUERO – DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE GRASA –
MÉTODO GRAVIMÉTRICO (MÉTODO DE REFERENCIA) (ISO 1854:2008|IDF
59:2008, IDT):
http://apps.normalizacion.gob.ec/fileserver/2016/nte_inen_iso_1854_idf59.pdf
97
NTE INEN-ISO 2291. (2013). Instituto de Normas Técnicas Ecuatorianas, INEN. Obtenido
de GRANOS DE CACAO. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE
HUMEDAD (MÉTODO DE RUTINA) (IDT):
http://apps.normalizacion.gob.ec/fileserver/2016/nte_inen_iso_2291.pdf
Nuñez, C. (2008). EXTRACCIONES CON EQUIPO SOXHLET. Obtenido de
cenunez.com.ar: www.cenunez.com.ar
OMS. (2016). Demencia Una Prioridad de salud Pública. Washintong D.C: World Health
Organization. Obtenido de http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs362/es/
Osorio, E. (2014). FArmacognosia. Antioquia, Colombia: Universidad de Antioquia.
Pandey, A., Soccol, C. R., Nigam, P., Brand, D., Mohan, R., & Roussos, S. (Junio de 2000).
Biotechnological potential of coffee pulpand coffee husk for bioprocesses.
Biochemical Engineering Journal, 6, 153- 162. Recuperado el 17 de enero de 2017
Pérez, E., & Carril, U. (2014). Café I (G. Coffea). Reduca (Biología). Serie Botánica, 7(2),
113-132. Obtenido de http://eprints.ucm.es/27835/1/1757-2066-1-PB.pdf
Pérez, L., Chávez, K., & Medina, L. &. (2013). COMPUESTOS FENÓLICOS,
MELANOIDINAS Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE CAFE VERDE Y
PROCESADO DE LAS ESPECIES Coffea arabica Y Coffea canephora. (Ciotecnia,
Ed.) REvista de Ciencias Biológicas y de la salud, XV(1), 51-56. Obtenido de
http://www.biotecnia.uson.mx/revistas/articulos/22-
8%20COMPUESTOS%20FENOLICOS.pdf
Pitt, J. I., & Hocking, A. (1997). Fungi and Food Spoilage (2 th ed.). AD HOCKING.
Prado, L. (enero - marzo de 2011). La pulpa de café, un residuo fuente de antioxidantes
polifenólicos. CIENCIACIERTA: Universidad Autónoma Metropolitana(25).
Obtenido de
http://www.posgradoeinvestigacion.uadec.mx/CienciaCierta/CC25/1pulpa.html
Pro Ecuador. (MAYO de 2013). Análisis sectorial del café. Obtenido de Exportaciones,
Especialista sectorial de café y elaborados – Dirección de Promoción y exportación:
http://www.proecuador.gob.ec/wp-
content/uploads/2013/05/PROEC_AS2013_CAFE.pdf
Pro Ecuador. (06 de diciembre de 2016). Analisis Sectorial del Café verde. Obtenido de
Instituo de Promoción de exportación e inversiones:
http://www.proecuador.gob.ec/compradores/oferta-exportable/cafe/
Ramírez Velasco, L. &. (2016). LIBERACION DE ÁCIDO CAFEICO DE LA PULPA DE
CAFÉ EMPLEANDO UN EXTRACTO CON ACTIVIDAD CLROGENATO
ESTEREASA DE Aspergillus ochraceusPRODUCIDA POR FERMENTACION
98
SÓLIDA. Revista Mexicana de ingeniería Química, 15(2), 503-512. Recuperado el
13 de julio de 2018, de http://www.redalyc.org/pdf/620/62046829017.pdf
Ramos Giraldo, P., Sanz Uribe, J., & Oliveros Tascón, C. (2010). Identificación y
clasificación de frutos de café en tiempo real a través de la medición de color.
Cenicafé, 61(4), 315-326. Obtenido de
http://www.cenicafe.org/es/publications/arc061(04)315-326.pdf
Rivas, B., Leal, I., Loaiza, L., Morrillo, E., & Colina, C. (diciembre de 2017). Phenolic
Compounds and antioxidant activity in extract of four oregano species. Revista
Técnica de la Facultad de Ingeniería de la Universidad del Zulia, 40(3), 134-142.
Recuperado el 06 de marzo de 2018, de
https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=8&cad=rja
&uact=8&ved=0ahUKEwj9icH779fZAhUOhuAKHQiQAhkQFghlMAc&url=http
%3A%2F%2Fwww.produccioncientifica.luz.edu.ve%2Findex.php%2Ftecnica%2F
article%2Fdownload%2F23040%2F23041&usg=AOvVaw3FXn-AOKR
Rojo, G. (2005). Consumo de Café y diabetes mellitus. Endocrinología nutrición, 52(10),
556-563. Recuperado el 13 de marzo de 2018, de http://www.elsevier.es/es-revista-
endocrinologia-nutricion-12-articulo-consumo-cafe-diabetes-mellitus-
S1575092205710640
Romero, J., Camayo, V., González, M., Cortina, G., & Herrera, P. (2010). Caracterizacion
citogenetica y morfologica de hibridos interespecificos entre Café arábica y las
especies diploides C. liberica y C. eugenioides. CENICAFÉ, 61(3), 206-221.
Obtenido de
https://www.researchgate.net/publication/277048508_Caracterizacion_citogenetica
_y_morfologica_de_hibridos_interespecificos_entre_C_arabica_y_las_especies_di
ploides_C_liberica_y_C_eugenioides
Ruiz, J. (2007). FAcilitación del aprendizaje y la memoria de una tarea referencial espacial
en el laberinto acuatico de Morris por autoestimulación electrica intracraneal ,
ratas Wistar. tesis Doctoral, Barcelona.
Sánchez, E. (2002). Inhibición del crecimiento y la producucón de toxinas de Aspergillus
flavus y A. parasiticus por extractos de plantas del genero Agave. Universidad
Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas, San Nicolás de los
GArza. Recuperado el 15 de enero de 2018, de
http://eprints.uanl.mx/1193/1/1080124371.PDF
Seoane, J. (2014). ¿Modelos mixtos (lineales)? Una introducción para el usuario temeroso.
ETOLOGUÍA, 24. Recuperado el 22 de marzo de 2018, de
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jspinill/CFCUAM2014/Etologuia_2014_
24_15_37_modelos_mixtos_una_guia_para_el_usuario_temeroso.pdf
99
Solla, I. A. (2016). Influencia de la alimentación en la prevención del deterioro cognitivo en
la enfermedad de Alzheimer. Universidad de la Rioja. Recuperado el 24 de abril de
2018, de https://biblioteca.unirioja.es/tfe_e/TFE002052.pdf
Soriano, C., & Guillazo Blanch, G. (s.f.). Neurociencia Cognitiva. En Fundamentos de
neurociencia (pág. 357). Editorial UOC.
T. López, A. P.-B.-M. (mayo de 2013). Mejora de la capacidad antioxidante de los extractos
de la pulpa de café por la fermentación láctica de estado sólido. CyTA- Journal of
Food, 11, 359-365. Recuperado el 15 de abril de 2017, de
http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/19476337.2013.773563
Tanaka, K., S.-Galduróz, R. F., & Gobbi, L. T. (Julio de 2013). Extracto de Ginkgo Biloba
en un modelo animal de enfermedad de Parkinson: una revisión sistemática.
ResearchGAte, 11, 430-435. Obtenido de
https://www.researchgate.net/publication/259530578_Ginkgo_Biloba_Extract_in_a
n_Animal_Model_of_Parkinson's_Disease_A_Systematic_Review
Tobón, N. (2015). Extracción asistida por ultrasonido de compuestos fenólicos de la pulpa
de café (Coffea arabica L.) variedad Castillo. Corporación Universitaria Lasallista,
180. Recuperado el 16 de febrero de 2016
Universidad de Pamplona. (2015). Cromatografía líquida de Alta Resolución. Recuperado
el 31 de enero de 2018, de
http://www.unipamplona.edu.co/unipamplona/portalIG/home_154/recursos/general
/29042015/elecromatografia.pdf
Vega, A., Reyes, S., León, J. D., & Franco, A. B. (2014). Cuantificación de cafeína de cafés
comerciales de Panamá. Ciencia y Tecnología, 30(2), 57-64. Recuperado el 20 de
febrero de 2018, de
https://revistas.ucr.ac.cr/index.php/cienciaytecnologia/article/view/20346
Vicens, P., Redolat, R., & Carrasco, M. d. (2003). Aprendizaje espacial y laberinto de agua:
metodología y aplicaciones. Psicothema, 15(4), 539-544.
Vorhees, C. V., & Williams, M. T. (27 de 07 de 2006). Nature Publishing Group. Morris
water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and
memory. USA. Obtenido de http://www.nature.com.ololo.sci-
hub.bz/nprot/journal/v1/n2/abs/nprot.2006.116.html
Vorobie, E. (2010). Principles of physically assited extractions and applications in the food,
beverage and neutraceutical industries. (S. S. Rizvi, Ed.) Separation, extraction and
concenrations processes in the food, beverage and nutraceutical industries, 694.
Recuperado el 17 de febrero de 2018, de
100
https://books.google.com.ec/books?id=13ZwAgAAQBAJ&printsec=frontcover&hl
=es&source=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=false
Waldman, S. (2015). Interacciones Fármaco - Receptoras. En S. Waldman,
princnipiosFarmacología Molecular. manual moderno. Recuperado el 24 de marzo
de 2018, de http://www.manualmoderno.com/descargas_gratuitas/01_waldman.pdf
Wenk, G. L. (2004). Current Protocols in Neuroscience. Assessment of Spatial Memory
Using the Radial Arm Maze and Morris Water Maze. Obtenido de
http://onlinelibrary.wiley.com.sci-
hub.bz/doi/10.1002/0471142301.ns0805as26/abstract;jsessionid=8471311C93EE8
AED5717F23D19B1851F.f03t01?userIsAuthenticated=false&deniedAccessCusto
misedMessage=
Wong, J. E., Guyot, S., Rodríguez, R., Gutiérrez, G., Contreras, J., & Saucedo, G. &. (2013).
Alternativas Actuales para el Manejo Sustentable de los Residuos de la Industria del
Café en México. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila, 5(10).
World Health Organization. (1998). Materials, Quality Control Methods for Medicinal Plant
(ilustrada ed.). (1. World Health Organization, Ed.) Ginebra. Recuperado el 15 de
marzo de 2018, de
http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/41986/9241545100.pdf;jsessionid=
EF6560AE1E62C9413308B4FF4AE72BF8?sequence=1
101
Anexo A. Árbol de Problemas
102
Anexo B. Certificado Botánico
103
Anexo C. Instrumento de Recolección de Datos (IRD) cantidad de fenoles totales
104
Anexo D. Instrumento de Recolección de Datos (IRD) actividad nootrópica
105
Anexo E. Matriz de Validación de Instrumentos
106
Anexo F. Registro de cromatogramas de pulpa de café
Gráfico 1 Cromatograma pulpa de café (t 150u a)
Gráfico 2 Cromatograma pulpa de café (t 150u b)
107
Gráfico 3 Cromatograma pulpa de café (t 150u c)
Anexo G. Registro de cromatogramas de extracto seco de la pulpa de café
Gráfico 4 Cromatograma extracto seco de la pulpa de café (t 200u a)
108
Gráfico 5 Cromatograma extracto seco de la pulpa de café (t 200u b)
Gráfico 6 Cromatograma extracto seco de la pulpa de café (t 200u c)
109
Anexo H Procedimiento Experimental
Recolección Extrusión Lavado
Secado Control microbiológico Tamizaje
110
Determinación de Humedad Maceración Dinámica
Centrifugación Concentración Determinación de Fibra
Cruda
Determinación de Grasa Cruda
111
Acondicionamiento de los ratones Administración de la Dosis
Laberinto Acuático de Morris
Laberinto Radial de 8 Brazos
Disección de los Ratones
112
Anexo I Certificados
