Facultad de Ciencias de la Vida MAGISTER EN BIOTECNOLOGÍA ...
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1 Facultad de Ciencias de la Vida MAGISTER EN BIOTECNOLOGÍA Y CIENCIAS DE LA VIDA TESIS ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE ERYM3 Y SU EFECTO SOBRE LA BIOMASA MITOCONDRIAL Juan Pablo Soffia Director de Tesis Dr. Álvaro A. Elorza Santiago, Chile. Junio 11, 2021
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Facultad de Ciencias de la Vida MAGISTER EN BIOTECNOLOGÍA Y CIENCIAS DE LA VIDA
TESIS
ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE ERYM3 Y SU EFECTO SOBRE LA BIOMASA MITOCONDRIAL
Juan Pablo Soffia
Director de Tesis Dr. Álvaro A. Elorza
Santiago, Chile. Junio 11, 2021
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FINANCIAMIENTO
Esta tesis se realizó en el Laboratorio de Medicina Mitocondrial del Instituto de Ciencias Biomédicas de
la Facultad de Medicina y de la Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Andrés Bello; y fue
financiada por el proyecto FONDECYT N°1180983: “Targeting anemia through enhancing mitochondrial
dynamics and mitophagy: Investigation of two novel mitochondrial proteins”.
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AGRADECIMIENTOS
Quiero siempre agradecer a todos los que hicieron posible este trabajo, y en primer lugar a mi padre, mi
madre, mis hermanas, hermano y familiares que siempre me apoyan y me dan ánimos, porque siempre
tienen la certeza y la confianza de que yo lograré todo lo que me proponga, aunque yo sufro de mis dudas,
angustias, incertidumbre y tristezas. Son ellos y ellas, de verdad, los pilares más grandes e importantes de
mi vida. Me han enseñado a construir mi propia montaña sobre la que erguirme y mirar al futuro, honesto,
lleno de confianza, paz y tranquilidad por el avenir, y en especial con mucho amor, me enseñaron a recibir
lo que venga con todo el amor posible, los amo: mamá, papá, Vero, Andrea, Francisco, Sofía, Trini y Fabiola.
Quiero agradecer en segundo lugar a mi tutor: Dr. Álvaro A. Elorza, quien me recibe en su laboratorio,
que pone su confianza y su paciencia en mí, que me guía a mejorar, a aprender, me ayuda a entender y a
visualizar aspectos no evidentes, ya sea en el ámbito científico o, a veces también, personal. Me ayuda y
me guía para que juntos logremos contribuir a retrasar y por qué no, a revertir el envejecimiento celular.
Álvaro es mi primer tutor, uno muy querido. Siempre soñé con tener uno y estoy orgulloso de tenerlo a él.
Mis queridas compañeras y compañeros de laboratorio son para mí una luz brillante prendida, para que
yo saque mi mayor sonrisa y disfrute de cada día, lleno de ánimo, conversación, colaboración, supervisión,
ayuda y risas. Las/os compañeras/os que tengo son muy especiales, siempre están dispuestas/os a ayudar
y casi siempre tienen una respuesta o una solución a mis dudas. Me encanta hacerles preguntas porque
me ayudan mucho y por todo lo anterior estoy muy agradecido de tenerlas/los como equipo de
laboratorio, a Gaby en especial, a Andrea, Amori, Matías, Macarena, Jocelyn y pronto a Emilio y Fernanda.
Por último, quiero agradecer a mis amigos. Ellos siempre están orgullosos de mis proyectos y desafíos,
me han apoyado siempre desde que me conocen, en todas mis decisiones, sin juicios, ni prejuicios.
Siempre me acompañan en los mejores y peores momentos, ellos saben sacarme una risa cuando estoy
triste y saben cómo alegrarme cuando celebramos. Mis amigos siempre están para festejar y disfrutar del
día a día que nos regala la vida y con ellos quiero seguir siempre reuniendo más y mejores nuevos
momentos de alegría. Estoy muy feliz de tenerlos como amigos, en especial a Diego, Gabriel, Néstor y Fdo.
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ÍNDICE
PORTADA ............................................................................................................................................ 1
FINANCIAMIENTO ............................................................................................................................... 2
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................................. 3
ÍNDICE ................................................................................................................................................ 4
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS .............................................................................................................. 6
ABREVIATURAS ................................................................................................................................... 7
RESUMEN ......................................................................................................................................... 10
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 11
1.1 Mitocondrias ........................................................................................................................................ 11
1.1.1 Ciclo de vida mitocondrial ............................................................................................................. 14
1.2. Mitofagia ............................................................................................................................................. 14
1.2.1 Clasificación de las proteínas según vías de mitofagia ................................................................. 20
1.3. Expresión de genes mitofágicos ......................................................................................................... 21
1.4. ERYM3 ................................................................................................................................................. 24
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ..................................................................................................................... 28
DISEÑO EXPERIMENTAL ..................................................................................................................... 29
Objetivo específico 1 ................................................................................................................................. 29
Objetivo específico 2 ................................................................................................................................. 37
2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................... 39
2.1 Amplificación y Purificación del ADN plasmidial ................................................................................. 39
2.2 Modelo celular y condiciones de cultivo celular ................................................................................. 39
2.3 Método de transfección ...................................................................................................................... 40
2.4 Inhibición de la Biogénesis Mitocondrial ............................................................................................. 40
2.5 Aislación de ADN total ......................................................................................................................... 40
2.6 Aislación de ARN total ......................................................................................................................... 41
5
2.7 Geles de Agarosa para ADN ................................................................................................................. 41
2.8 Cuantificación ARN y ADN ................................................................................................................... 41
2.9 Síntesis de ADNc .................................................................................................................................. 42
2.10 Cuantificación de ADNmt y de la expresión de erym3, pink1 y fundc1 ............................................. 42
2.11 Estadística .......................................................................................................................................... 45
3. RESULTADOS ................................................................................................................................. 46
3.1. Determinación del número de copias de ADNmt a las 0, 6, 12 y 48 horas post-transfección de
pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His con partidores “TAKARA” en células HEK293T por qPCR.............................. 46
3.2. Evaluación de los niveles de ADNmt con partidores mtMinArc y mtMajArc a las 24 y 48 horas post-
transfección de pEGFP-ERYM3-N1 y tratamiento con CHX de células HEK293T por qPCR ....................... 50
3.3. Los niveles de ADNmt disminuyen con partidores mtMinArc y MajArc a las 24 y 48 horas post-
transfección de pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His en células HEK293T por qPCR ............................................. 54
3.4. Los niveles de expresión de fundc1 y pink1 no varían 48 horas post- transfección de pCDNA3.1-
ERYM3-Myc-His y con tratamiento CHX en células HEK293T por qPCR .................................................... 57
4.DISCUSIÓN ..................................................................................................................................... 59
5. CONCLUSIONES ........................................................................................................................................ 69
6. MODELO DEL ROL DE ERYM3 EN LA MITOFAGIA ..................................................................................... 70
7. MODELO TEÓRICO PROPUESTO DEL ROL DE ERYM3 EN LA VÍA MITOFÁGICA DE NIX ............................ 72
8. PROYECCIONES DE ESTUDIO DE ERYM3................................................................................................... 74
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................................ 77
ANEXOS ........................................................................................................................................................ 88
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ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
FIGURAS
Figura 1. La maquinaria mitofágica y adaptadores mitocondriales…………..…………………………………. 17
Figura 2. Clasificación de las vías de mitofagia………………………….………………………………………………… 19
Figura 3. Mecanismos moleculares de proteínas que participan en la mitofagia……..……………..…… 23
Figura 4. ERYM3 presenta una distribución tripartita entre mitocondrias, lisosomas y citosol........ 26
Figura 5. Diseño experimental piloto 1 del objetivo específico 1………………………...…………………...... 30
Figura 6. Diseño experimental piloto 2 del objetivo específico 1…………………….………………..……...... 32
Figura 7. Esquema de partidores utilizados para el arco menor y mayor del ADNmt……………......... 33
Figura 8. Diseño experimental final del objetivo específico 1……………..………….………..…………………. 35
Figura 9. Transfecciones y tratamientos realizados en placas de células HEK293T…………….………… 36
Figura 10. Diseño experimental del objetivo específico 2……………………………………..…….……………..... 38
Figura 11. Evaluación de expresión de erym3 a las 48 horas post-transfección en células HEK293T.. 47
Figura 12. Determinación del tiempo adecuado de sobreexpresión de erym3 para medir ADNmt…. 49
Figura 13. Evaluación de niveles de ADNmt al sobreexpresar ERYM3:GFP en HEK293T …………....... 52
Figura 14. Los niveles de ADNmt disminuyen al sobreexpresar erym3 a las 48 horas…….……..……… 55
Figura 15. La sobreexpresión de erym3 no afecta los niveles de expresión de fundc1 y pink1……… 58
Figura 16. Modelo del rol de ERYM3 en la mitofagia…………………………………………………………………… 71
Figura 17. Modelo del rol de ERYM3 en la vía mitofágica programada o por hipoxia de NIX………… 73
Figura 18. Diseño experimental para verificar ERYM3 como regulador de biomasa mitocondrial… 75
Figura 19. Diseño experimental para determinar la participación de ERYM3 en vías mitofágicas…. 76
Figura 20. Plásmido pCDNA3.1 distribuido por “Addgene”…………………………………………………….……….. 88
Figura 21. Plásmido pEGFP-N1 distribuido por “Snapgene”…………………………………………………………….. 89
Figura 22. Modelo bioinformático en 3D de la estructura terciaria de la proteína ERYM3………………… 90
TABLAS
Tabla I. Clasificación de las proteínas de mitofagia según su vía metabólica…………………………….. 22
Tabla II. Partidores utilizados para qPCR……………………………………………………………………….………….. 44
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ABREVIATURAS
ADNc: ADNmt: AMBRA1: AMPK: ANT: ANOVA: ARNm: ATG: ATP: B2M: BCL2: BECLIN1: BLAST: BNIP3: CHDH: CHX: COS-7: COXIV: Ct: ddMDM: ddPCR: DFCp1: D-loop: DMB: DMEM: DRP1: ERYM3: EtOH: FCCP: FIP200: FIS1: FKBP8: FOXO3a: FUNDC1: GFP: GP78: GTP: HBS: HEK293T: HEPES: IL-3 kDa: LB: LC3: LIR: MARCH5:
Ácido desoxirribonucleico complementario Ácido desoxirribonucleico mitocondrial Regulador 1 de Beclina 1 y de autofagia Proteína quinasa activada por adenosín monofosfato Transportador de nucleótido adenina Análisis de varianza Ácido ribonucleico mensajero Proteína relacionada a la autofagia Adenosín trifosfato Beta 2 microglobulina Célula de linfoma B 2 Proteína de dominio Célula de linfoma B 2 homóloga Herramienta de búsqueda por alineamiento local básica BCL2 / adenovirus E1B proteína 3 de interacción con proteínas de 19 kDa Colin deshidrogenasa Cicloheximida Línea celular derivadas de tejido de hígado de mono Citocromo c oxidasa subunidad 4 isoforma 1 Umbral de ciclo Medición de ADN mitocondrial digital por gotas Reacción en cadena de polimerasa digital por gotas Proteína 1 contenedora de doble FYVE Bucle de desplazamiento 6,7-dicloro-2-metilsulfonil-3-N-tert-butilaminoquinoxalina Medio Dulbecco de “Eagle” modificado Proteína 1 relacionada con la dinamina Proteína mitocondrial de la eritropoyesis 3 Etanol Carbonilcianuro-p-trifluorometoxifenilhidrazona Proteína de 200 kDa que interactúa con la familia quinasa FAK Proteína de fisión mitocondrial 1 Proteína de unión isomerasa prolyl FK 8 Caja “Forkhead” subgrupo O 3 a
Proteína Dominio FUN14 que contiene 1 Proteína fluorescente verde Glicoproteína 78 Guanosín trifosfato Solución tampón de HEPES Células de riñón embrionario humano 293 con antígeno T Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanesulfónico Interleuquina 3 Kilo Dalton Medio de cultivo Luria Bertani Proteína asociada a microtúbulo de cadena ligera 3 1A/1B Región de interacción con LC3 Proteína dedo de anillo C3HC4-5 asociado a membrana
8
MAPL: MIRO 1 y 2: MLC: mL: mM: Mst1: mTERF: mtMinArc: mtMajArc: mtRNAP: mtSSB: mTOR: MUL1: mV: NAD+: NBR1: ND1, 4 y 5: NDP52: NFkB: NIX: NLRX1: NRF1: NRF2: OPTN: OXPHOS: P53: p62: PARKIN: PB1: PBS: pCDNA3.1: PCR: PGAM5: PHB2: PI3K III: PI3P: PINK1: PSSM: POLG: qPCR: Rab9: RHES: ROS: SERPINA1: SFB: SIAH1: SLCO2B1: SMURF1: TAE:
Proteína ligasa anclada a la mitocondria / MUL1 GTPasas de rho mitocondriales 1 y 2 Ciclo de vida mitocondrial Mililitros Mili molar Estimulador de macrófago 1 Factor de terminación de transcripción mitocondrial Par de partidores del bucle de desplazamiento del arco menor mitocondrial Par de partidores del gen ND4 del arco mayor mitocondrial Polimerasa de ácido ribonucleico mitocondrial Proteína de unión a ácido desoxiribonucleico de una hebra mitocondrial Objetivo mamífero de rapamicina Proteína ligasa de ubiquitina mitocondrial E3 / MAPL Mili volteos Dinucleótido de nicotinamida y adenina Proteína vecina del gen 1 de cáncer de mama 1 NADH deshidrogenasa subunidad 1, 4 y 5 Proteína de puntos nucleares 52 Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas Proteína X como BNIP3 Dominio de nucleótido de repetición enriquecida en leucina que contiene X1 Factor respiratorio nuclear 1 Factor eritroide nuclear 2 Optineurina Sistema de fosforilación oxidativa Proteína tumoral 53 Secuestosoma 1 / SQSTM1 Proteína ligasa de ubiquitina E3 de enfermedad de Parkinson Proteína básica 1 acídica de polimerasa Solución tampón de fosfato Vector de expresión en mamífero con promotor CMV Reacción en cadena de polimerasa Fosfoglicerato mutasa 5 Prohibitina 2 Fosfoinositol 3-quinasa clase 3 Fosfatidilinositol 3-fosfato Quinasa inducida de PTEN 1 Matriz de puntaje de posición específica Polimerasa gamma de ácido desoxiribonucleico mitocondrial Reacción en cadena de polimerasa cuantitativa Proteína relacionada a Ras 9 Homólogo de Ras enriquecido en el estriado Especies reactivas de oxígeno Proteína miembro de la familia Serpin 1 Suero fetal bovino Proteína homóloga en ausencia dentro de siete 1 Miembro de la familia transportadora de aniones orgánicos portadores de solutos 2B1 Factor regulador de ubiquitina Smad 1 Tampón tris-acetato-EDTA
9
TAX1BP1: TBC1D15 y 17: TFAM: TFBM: TMRE: TOM: Ub: µg: µL: ULK1: VDAC1: VPS13D,15,34: WIPI2:
Proteína de unión 1 a Tax 1 Proteína de la familia miembro 15 y 17 dominio Tre2/Bub2/Cdc 1 Factor de transcripción mitocondrial A Factor de transcricpción mitocondrial B Tetrametilrodamina etil éster Translocasa de la membrana externa mitocondrial Ubiquitina Microgramos Microlitros Quinasa activadora de autofagia parecida a Unc-51 Canal selectivo de aniones dependiente de voltaje 1 Proteína sorteadora vacuolar homóloga D 13, 15 y 34 Proteína interactuante con fosfoinositida de dominio repetitivo WD 2
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RESUMEN
Las mitocondrias son organelos eucariotas que cumplen roles desde la homeostasis del calcio,
producción de ATP, hasta definir la sobrevivencia celular. Las mitocondrias son dinámicas y su morfología
y biomasa se ajustan para satisfacer las demandas energéticas de las células. La biomasa mitocondrial está
balanceada por los procesos de biogénesis, dinámica mitocondrial y autofagia selectiva de mitocondrias
o mitofagia. Uno de los parámetros de biomasa mitocondrial es el número de copias de ADN mitocondrial
(ADNmt) presente en las células, el cual es resultado del balance entre los procesos de biogénesis y
mitofagia, por lo cual al haber una exacerbación de la mitofagia disminuirá la biomasa mitocondrial.
ERYM3 es una nueva proteína putativa de las mitocondrias, monoexónica y exclusiva de los primates
que fue encontrada mediante análisis in silico de microarreglos de la eritropoyesis. Su expresión a nivel
de trascrito aumenta hacia el estadío final de la eritropoyesis. ERYM3 tiene un 86% de probabilidad de ser
importada a la mitocondria, un patrón de expresión similar a las proteínas mitofágicas LC3 y NIX; y un
dominio putativo LIR (Región de interacción con LC3) para la posible unión con LC3-II unido al fagóforo.
Resultados preliminares de la sobreexpresión de la proteína de fusión ERYM3:GFP muestran su
localización en el citosol, colocalización con mitocondrias y lisosomas, disminución de la marca
mitocondrial y aumento en el número de lisosomas al inducirse la mitofagia, lo que sugiere la participación
de ERYM3 en la mitofagia. Por lo tanto, se hipotetiza que ERYM3 estimula la disminución de la biomasa
mitocondrial mediada por mitofagia. El objetivo general es determinar el efecto de la sobreexpresión de
erym3 sobre la biomasa mitocondrial y la expresión de genes mitofágicos.
Los resultados mostraron que a las 48 horas de sobreexpresión de erym3 disminuyó significativamente
la biomasa mitocondrial según la cuantificación del ADNmt, mientras que los niveles de expresión de los
genes mitofágicos medidos, correspondientes a pink1 y fundc1, no mostraron cambios significativos.
La caracterización funcional de ERYM3 sugiere una posible nueva vía de mitofagia que permitirá el
desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas y terapéuticas para disfunciones mitocondriales.
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1. INTRODUCCIÓN
La mitofagia o autofagia selectiva de mitocondrias es el proceso por el cual se degradan las
mitocondrias (Liesa et al., 2013; Westermann et al., 2010; Novak et al., 2012). La disfunción de este
proceso está implicada en el desarrollo de enfermedades, además de estar asociada al proceso de
envejecimiento (Liesa et al., 2013; Kluge et al., 2013; Santos et al., 2014; Kornmann et al., 2014; Bess et
al., 2012). La mitofagia se caracteriza por tener varias vías no redundantes (Palikaras et al., 2018; Zhang et
al., 2019). Dentro de los procesos en los que participa la mitofagia se encuentra la eritropoyesis, la cual se
encarga de la producción de glóbulos rojos y en cuyo estadío final ocurre un aumento de la mitofagia la
cual degrada todas las mitocondrias restantes dentro de los eritrocitos. Los eritrocitos son células de la
sangre que están terminalmente diferenciadas por eritropoyesis y son el producto final de una jerarquía
compleja de progenitores hematopoyéticos que se vuelven progresivamente acotados a linaje eritroide
(Dzierzak et al., 2013). La eritropoyesis comienza con la diferenciación de células madre hematopoyéticas,
estas derivan de una célula multipotente que se diferencia a través de IL-3 y el factor de célula madre a un
progenitor común mieloide multipotente, este luego se convierte en un progenitor más restringido que
tiene la capacidad de sólo de diferenciar a megacariocitos o eritrocitos (Buck et al., 2009).
Mediante un análisis in silico de chips de microarreglos de estudios en eritropoyesis (no publicado aún),
se observó que había genes no descritos que aumentaban su expresión en etapas finales de la
eritropoyesis, cuando ocurre el aumento de mitofagia, y que cuyas características coincidían con la de los
genes mitofágicos nix y lc3, sospechándose que participan en el proceso de mitofagia. Entre los candidatos
descubiertos se encuentra el gen conocido como erym3, el cual obtuvo el mayor puntaje de selección.
1.1 Mitocondrias Las mitocondrias son organelos eucariotas de doble membrana que producen ATP, con un potencial de
membrana alrededor de -140Mv a -180Mv, y que son indispensables para la vida y la salud en la mayoría
de los organismos eucarióticos (Lane et al., 2010; Scheibye-Knudsen et al., 2015; Perry et al., 2011).
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Décadas de estudios sobre destinos celulares (apoptosis, necrosis, diferenciación y división celular) y
enfermedades han expandido vastamente la comprensión de las mitocondrias como organelos
multifacéticos que muestran roles críticos en la homeostasis metabólica, inmunidad innata, regulación del
calcio, comunicaciones núcleo-mitocondria, la decisión de la sobrevivencia celular o su resistencia al estrés
y la muerte (Fang et al., 2016; Mattson et al., 2008; Palikaras et al., 2018). Para cumplir con estos roles es
imprescindible mantener una población mitocondrial saludable, con sus funciones y potencial de
membrana adecuados.
La mantención de la función de las mitocondrias depende de 2 sistemas mitocondriales que colaboran,
estos son: el sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y el ciclo de vida mitocondrial o sistema de
control de calidad (MLC) (Elorza et al., 20201). Ambos se complementan para mantener la función
mitocondrial, la producción de energía (ATP), la detoxificación de especies reactivas de oxígeno (ROS),
metabolismo apropiado y señalización retrógrada. El sistema de fosforilación oxidativa, que corresponde
a la cadena transportadora de electrones, la cual está compuesta por ubiquinona, el citocromo c, 4
complejos proteicos y 1 ATP sintasa, está codificada por 2 materiales genéticos independientes: el ADN
nuclear y el ADN mitocondrial (ADNmt) (Zhao et al., 2019). Las mitocondrias se caracterizan por la
presencia de su propio ADN de 16.569 pares de bases, el cual es una molécula circular y de doble hebra,
excepto por la región no codificante del bucle de desplazamiento que es de triple hebra (Jemt et al., 2015).
Se encuentra presente entre 3 a 10 copias por mitocondria y con la habilidad de replicarse al aumentar la
biomasa mitocondrial en respuesta a las demandas energéticas junto con la coordinación con el ciclo
celular (Brand et al., 2013; Robin et al., 1988). El genoma mitocondrial en mamíferos codifica para 11
proteínas que componen la cadena transportadora de electrones más 2 de la ATP sintasa; así como 22
ARN de transferencia y 2 ARN ribosomales (Anderson et al., 1981; Bibb et al., 1981). El ADNmt se organiza
en las células en complejos ADN-proteína macromoleculares llamados nucleoides con aproximadamente
1 molécula de ADN mitocondrial por nucleoide (Kukat et al., 2011). Los genes mitocondriales están
densamente compactados por las proteínas TFAM, Twinkle, TFBM, mtSSB, mTERF, mtRNAP y POLG a lo
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largo del genoma con la notable excepción de la región reguladora no codificante de bucle de
desplazamiento (“D-loop”) (Shadel et al., 1997; Bogenhagen et al., 2008).
La cantidad de mitocondrias por célula varía según el tipo de célula y así mismo la cantidad de su ADNmt
varía (Veltri et al., 1990; Wachsmuth et al., 2016). El ADNmt está presente entre cientos y miles de copias
por célula acorde al tejido específico (Robin et al., 1988; Pierce et al. 1990; Shay et al., 1990). Por otro lado,
es importante considerar que el número de copias de ADNmt está directamente relacionado a la biomasa
mitocondrial funcionando como un marcador directo de la cantidad de mitocondrias, de tal forma que a
mayor cantidad de ADNmt se observa mayor cantidad de biomasa mitocondrial y viceversa (D'Erchia et
al., 2015; Venegas et al., 2011; Malik et al., 2013). Los niveles de ADNmt están altamente regulados de
acuerdo a los requerimientos de la célula. Dentro del proceso de regulación y mantención del ADNmt, la
cantidad de ADNmt presente en la célula es menor cuando aumenta la mitofagia (Diot et al., 2015;
Medeiros et al., 2019; Medeiros et al., 2018). Cuando se induce la mitofagia, la degradación de la biomasa
mitocondrial es mayor y lo contrario ocurre cuando la mitofagia está inhibida (Sun et al., 2015). Esto se ve
en Caenorhabditis elegans para reparar el daño por rayos ultravioleta en el ADNmt, disminuyendo la
biomasa mitocondrial en el tiempo para degradar el ADNmt dañado (Bess et al., 2012). Mientras que en
eritropoyesis esto ocurre para deshacerse de la población mitocondrial en la diferenciación de las células
rojas sanguíneas maduras (MacVicar et al., 2013) y la disminución del proceso de mitofagia conlleva a una
remoción deficiente de las mitocondrias (Mortensen et al., 2010) y a anemia (Shyamsunder et al., 2016;
Sumpter et al., 2016), siendo entonces clave este proceso para la función de los tejidos. Niveles bajos de
ADNmt están asociados a enfermedad de Párkinson, Huntington, cáncer, condiciones de alteración en
embarazo y de riesgo cardiovascular (Pyle et al., 2016; Ashar et al., 2017; McDermott et al., 2018; Czajka
et al., 2015; Lien et al., 2017; Grady et al., 2013). Importante también es la integridad del ADNmt que tiene
un rol en la función mitocondrial, ya que se ha visto que enfermedades mitocondriales resultan de
mutaciones en el ADNmt, el cual debiese ser degradado dentro de la mitocondria por mitofagia para su
renovación (Dombi et al., 2018).
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1.1.1 Ciclo de vida mitocondrial Las mitocondrias son organelos extremadamente dinámicos y deben mantener su funcionalidad, por
lo que se someten a un sistema de control de calidad el cual corresponde a su ciclo de vida, que incluye el
recambio basal de mitocondrias dañadas por mitocondrias nuevas, funcionales y saludables. Este ciclo de
vida está balanceado por su biogénesis, remodelamiento (consistente en eventos de fusión y fisión o
dinámica mitocondrial) (Liesa et al., 2013; Kluge et al., 2013) y la autofagia selectiva de mitocondrias o
mitofagia (Liesa et al., 2013; Westermann et al., 2010; Novak et al., 2012; Youle et al., 2011; Boles et al.,
2009; Schwartz et al., 2002). Así, las células son capaces de mantener una red mitocondrial saludable a
través de su funcionamiento adecuado y el balance de su dinámica mitocondrial (Youle et al., 2011; Held
et al., 2015; Ashrafi et al., 2012; Ruiz et al., 2016). Una falla en este ciclo de vida se asocia a diversas
enfermedades tales como diabetes, cáncer, Parkinson, Alzheimer y anemia (Liesa et al., 2013; Kluge et al.,
2013; Santos et al., 2014; Kornmann et al., 2014; Bess et al., 2012; Zhang et al., 2015; Twig et al., 2008). Es
por esto, que una interrupción en la mitofagia altera la función mitocondrial, esto a causa de la
acumulación progresiva de organelos mitocondriales defectuosos, lo que resulta en daño celular y tisular
(Palikaras et al., 2018). Esta acumulación de mitocondrias deficientes se asocia a una menor reparación
del daño al ADNmt y también a un aumento de ROS y apoptosis celular (Betin et al., 2014; Mortensen et
al., 2010a; Mortensen et al., 2010b; Zhang et al., 2014; Sandoval et al., 2008; Hirota et al., 2015; Shimizu
et al., 2014; Wang et al., 2016). Así mismo, alteraciones en el balance de la mitofagia en particular resultan
en la acumulación de mitocondrias despolarizadas que contribuyen al desarrollo y progresión del cáncer
(Palikaras et al., 2018). Por lo anterior, dilucidar los mecanismos que gobiernan la mitofagia muestra
potencial para nuevas intervenciones anti-cancerígenas (Chourasia et al., 2015).
1.2. Mitofagia
La autofagia selectiva de mitocondria o mitofagia es un tipo de macroautofagia que envuelve
mitocondrias en unas estructuras de doble membrana llamadas autofagosomas, para luego llevarlas a los
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lisosomas para su degradación. Es esencial para el reciclado mitocondrial y proteger a las mitocondrias
manteniendo así la homeostasis celular y todas las demás funciones mitocondriales. Aunque las vías de
homeostasis median las respuestas celulares al daño mitocondrial, los daños persistentes gatillan la
eliminación del organelo entero a través de la mitofagia (Ashrafi et al., 2013). La mitofagia permite la
remoción de mitocondrias disfuncionales, depolarizadas y/o dañadas para su renovación, manejo de ROS,
despeje mitocondrial programado como se ve en eritropoyesis (Schweers et al., 2007), diferenciación de
las células del lente del ojo (Bassnett et al., 2002) y la maduración de linfocitos T (Pua et al., 2009). La
mitofagia también es esencial para el desarrollo embrionario por medio de la remoción de mitocondrias
paternas de la esperma en ovocitos fertilizados dejando solamente las mitocondrias maternas (Sharpley
et al., 2012; Rojansky et al., 2016).
El proceso de mitofagia requiere de dos sistemas: la maquinaria principal de la autofagia, que es común
a todos los tipos de autofagia, y a los receptores y adaptadores mitocondriales, que consisten en un grupo
de proteínas mitocondriales o citosólicas requeridas para el ensamblaje de la mitocondria con la
maquinaria autofágica principal. La mitofagia inicia por distintas señales desde la mitocondria o del
entorno celular que llevan a la formación de un fagóforo de doble membrana el cual se elonga y se cierra
para generar un autofagosoma maduro de doble membrana que encierra a las mitocondrias. Luego los
autofagosomas se fusionan con lisosomas para degradar su contenido (Tanida et al., 2008).
Se vio en hepatocitos primarios que la mitofagia es primero iniciada a través de la fosforilación
dependiente de su regulador maestro ULK1 (Quinasa activadora de autofagia parecida a Unc-51), realizado
por la AMP-quinasa dependiente, su sensor de energía celular (Egan et al., 2011). ULK1 recluta y se une a
un complejo con otras proteínas relacionadas a la autofagia (ATG’s), denominado el complejo de
nucleación de PI3K III (BECLIN1, BCL2, AMBRA1, VPS15, and VPS34) y el complejo de unión PI3P (ATG2A/B,
ATG9A y WIPI2) para regular la formación de la membrana que llevará a la creación del fagóforo. Los
esfuerzos combinados de ATG12 y la proteína 1A/B de cadena ligera 3 asociada a microtúbulo (LC3) de
16
sistemas similares de conjugación de ubiquitina facilitan la maduración y la elongación del autofagosoma,
el cual rodea las mitocondrias objetivo seleccionadas para degradación (Lou et al., 2020). Una vez que la
mitocondria objetivo fue encerrada dentro del autofagosoma, ocurre la fusión con el lisosoma formando
el autolisosoma sucediendo la degradación completa de la mitocondria y su contenido de proteínas,
lípidos, enzimas, ARNs y ADNmt (Lou et al., 2020). En la figura 1 se representa la maquinaria mitofágica.
17
Figura 1. La maquinaria mitofágica y adaptadores mitocondriales. En la figura se muestra que la mitofagia está comprendida por las etapas de iniciación, nucleación de membrana, formación del fagóforo, su expansión para encerrar a la mitocondria, fusión con el lisosoma y finalmente degradación del contenido. Bajo diferentes estímulos de mitofagia como el ejercicio, ayuno, administración de NAD+ (dinucleótido de adenina nicotinamida), rapamicina, espermidina o putrescina, se activa a AMPK (quinasa activada adenosín mono fosfato) y/o se inhibe a mTOR (objetivo de rapamicina mamífera) activando a ULK1 (quinasa activadora de autofagia parecida a Unc-51) llevando a la formación de su complejo de iniciación que comprende a FIP200 (proteína de interacción quinasa de adhesión focal de 200 kiloDaltons) y las proteínas relacionadas a la autofagia ATG101 y ATG13. Además, ULK1 fosforila a Beclin1 y activa a la proteína quinasa lipídica de vacuola 34 (VPS34) llevando a la formación del complejo de nucleación PI3K III (fosfoinositida quinasa 3) más lípidos entregados en vesículas por la proteína relacionada a la autofagia 9 (ATG9). AMBRA1 (molécula activadora de Beclin1 y reguladora de autofagia 1) puede participar en el proceso anterior para estabilizar la unión de ULK1 y el complejo PIK3 III. El complejo de nucleación PI3K III induce la síntesis de PI3P (fosfatidilinositol 3 fosfato) que tiene las proteínas DFCp1 y WIPIs. El sistema de conjugación de ATG12 se une a DFCP1 y WIPIs. Juntos con el sistema de conjugación de LC3 estos procesos permiten la formación y elongación del fagóforo de doble membrana. El complejo ATG5-12-16L1 promueve la conversión de LC3 en LC3-I, el que conjuga con la fosfatidiletanolamina formando LC3-II. LC3-II permite el reconocimiento y captura de mitocondrias dañadas por los motivos de interacción con LC3 (LIRs) de los receptores mitofágicos. Luego el mitofagosoma se fusiona con el lisosoma y se degradan las mitocondrias. (Lou et al., 2020).
18
Dependiendo del contexto fisiológico la mitofagia se clasifica actualmente como: basal, donde se
encuentra la vía dependiente de ubiquitina, la inducida por estrés y la programada, siendo estas 2 últimas
las correspondientes a vías independientes de ubiquitina por medio de receptores mitocondriales
(Palikaras et al., 2018). La vía basal de mitofagia se refiere al continuo mantenimiento por renovación de
mitocondrias que asegura el reciclado de organelos dañados y despolarizados, la cual corresponde a las
proteínas PINK1 y PARKIN principalmente (McWilliams et al., 2016; Sun et al., 2015). La vía inducida por
estrés corresponde a señales de estrés extracelular que afectan la fisiología mitocondrial y pueden inducir
un despeje mitocondrial agudo por mitofagia, como lo es la pérdida del potencial de membrana
mitocondrial, inanición por falta de nitrógeno o hipoxia por falta de oxígeno a la que responde la proteína
FUNDC1, al igual que NIX (Sekine et al., 2018). Por último, la mitofagia programada se activa en diferentes
tipos celulares durante el desarrollo como en la formación de eritrocitos, maduración de cardiomiocitos y
eliminación de mitocondrias de espermios en ovocitos fertilizados (Schweers et al., 2007; Esteban‐
Martínez et al., 2017; Sandoval et al., 2008). Un ejemplo de cada vía se muestra en la figura 2.
Otra clasificación clásica de las vías de mitofagia corresponden a la vía canónica, la cual es dependiente
de ubiquitina, correspondiente a la vía basal fisiológica, y a las vías no canónicas, que son independientes
de ubiquitina, mediadas por receptores mitocondriales, que corresponden a las vías fisiológicas
señalizadas por estrés y de programación celular (Moyzis et al., 2015). La vía canónica dependiente de
ubiquitina, consistente en la renovación basal de mitocondrias disfuncionales, se basa en la interacción
entre PINK1 y PARKIN, presente en casi todos los tejidos humanos (Stelzer et al., 2016), para ubiquitinizar
la mitocondria, la cual se une finalmente al recepetor mitocondrial p62/SQSTM1 y este a la proteína de
unión LC3-II conjugada que une a la mitocondria al autofagosoma, llevando a la mitocondria para su
degradación en el lisosoma. Las vías no canónicas son independientes de ubiquitnas, en su lugar cuentan
con receptores específicos, como FUNDC1 o NIX en respuesta a hipoxia, los cuales responden a señales de
estrés o programas celulares, uniéndose estos directamente a la proteína LC3-II, uniendo la mitocondria
al autofagosoma y llevándola a degradación en el lisosoma (Moyzis et al., 2015).
19
Figura 2. La clasificación de las vías de mitofagia. En la figura se muestran los distintos contextos fisiológicos de la mitofagia. A) La mitofagia basal corresponde a tejidos con niveles aumentados de mitofagia como el corazón, sistema nervioso, hígado y músculo esquelético. B) La mitofagia inducida por estrés es la que ocurre al disiparse el potencial de membrana mitocondrial, cuando hay inanición o hipoxia. C) La mitofagia programada, es la inducida durante el desarrollo de células ganglionares de la retina, diferenciación reversa hacia la pluripotencialidad durante reprogramación somática, maduración de cardiomiocitos, diferenciación eritroide y eliminación mitocondrial de esperma en ovocitos fertilizados. (Palikaras et al., 2018)
20
1.2.1 Clasificación de las proteínas según vías de mitofagia
Las vías de mitofagia en las cuales se expresan los genes de mitofagia correspondientes a la vía basal
de renovación de mitocondrias dependiente de ubiquitina abarcan a PINK1, PARKIN (presentes en casi
todas las células humanas, Stelzer et al., 2016) y p62, las que responden a despolarización mitocondrial
(Youle et al., 2011; Ashrafi et al., 2012; Jedrak et al., 2017; Reznik et al., 2016). También dependientes de
ubiquitina: MARCH5 (Chen et al., 2017), VPS13D, MUL1, ARIH1, SIAH1 (Yang et al., 2019) MIRO-1 y MIRO-
2 (Oeding et al., 2018; Wang et al., 2011). Además están aquellas de la misma vía que interactúan con LC3:
AMBRA1 (Hamacher-Brady et al., 2016), incluyendo secuestosoma 1 (p62), optineurina (OPTN), proteína
52 de dominio nuclear 10 (NDP52), el gen 1 vecino de cáncer de mama 1 (NBR1) (Hamacher-Brady et al.,
2016; Lazarou et al., 2015) y la proteína unida a TAX1 (TAX1BP1) (Lazarou et al., 2015). Y finalmente están
las proteínas que pertenecen a la vía independiente de PARKIN que también son ubiquitin E3 ligasas: GP78,
SMURF1, SIAH1 y MUL1 (Fu et al., 2013; Orvedahl et al., 2011; Szargel et al., 2016).
Luego están las vías independientes de ubiquitina (Kanki 2010; Kaali y cols., 2018), donde se encuentran
las vías por estímulos de estrés correspondiente a FUNDC1, el cual es un biomarcador prometedor de
varias enfermedades (Zhang 2020), BNIP3 y NIX, los cuales responden a hipoxia (Liu et al., 2012; Sowter et
al., 2001), Bcl2-like13/Bcl-Rambo, FKBP8 y PHB2 los cuales responden a mutaciones del ADNmt por la
pérdida del potencial de membrana mitocondrial y a la inhibición de mTOR (Murakawa et al., 2015; Bian
et al., 2014; Yang et al., 2019). También están cardiolipina y ceramida que responden a rupturas de la
membrana mitocondrial externa, pues quedan expuestas al citoplasma (Yang et al., 2019). Estas son otras
vías independientes de ubiquitina que pueden reconocer mitocondrias dañadas y que corresponden a
adaptadores que sensan el daño mitocondrial y consecuentemente cambian su ubicación subcelular o la
proteína con la que interactúan guiando la mitocondria dañada al autofagosoma. Otra vía del mismo tipo
es la colina deshidrogenasa (CHDH) que está ubicada en las membranas mitocondriales interna y externa
bajo condiciones normales. Cuando el potencial de membrana mitocondrial es interrumpido la CHDH se
acumula en la membrana mitocondrial externa, independiente de PARKIN, e interactúa directamente con
21
p62 a través de su dominio PB1 (“Phox y Bem 1”) lo que lleva a la formación del complejo CHDH-p62-LC3
el cual media la mitofagia (Park et al., 2014). Otra vía independiente de ubiquitina es la de TBC1D15 (“TBC1
domain familiy member 15”) una proteína mitocondrial que forma un complejo con TBC1D17 y que
también migra a la membrana mitocondrial externa por interacción con FIS1 (proteína mitocondrial de
fisión 1). Este complejo luego interactúa con LC3 (Yamano et al., 2014). Estas vías de estrés corresponden
a los receptores de mitofagia que interactúan directamente con LC3, la cual es una proteína de la
membrana autofagosomal, a través de sus regiones LIR (“LC3 interacting region”), mediando la eliminación
mitocondrial (Gatica, D., et al., 2018.) Y por último están las vías programadas que corresponden a: NIX,
que juega un rol esencial en la eritropoyesis en su fase terminal (Yue et al., 2018; Hanna et al., 2012; Liu
et al., 2012; Singh et al., 2014; Liu et al., 2014); la maduración de linfocitos T (Pua et al., 2009a; Pua et al.,
2009b); PHB2 en la eliminación de ADNmt paterno en la fertilización en C. elegans (Wei et al., 2017) y
MUL1 para la eliminación de ADNmt paterno en la fertilización en ratones (Rojansky et al., 2016). Todas
estas proteínas independientes de ubiquitina interaccionan directa o indirectamente con LC3. Además, se
ha descrito una vía independiente de LC3 mediante Rab9 que es una proteína del aparato de Golgi (Honda
et al., 2014; Hirota et al., 2015; Shimizu et al., 2016; Wang et al., 2016). Lo anterior se resume en la Tabla
I, y en la figura 3 se muestra un ejemplo de su mecanismo molecular.
1.3. Expresión de genes mitofágicos
Se ha visto que al sobreexpresar proteínas reguladoras de la mitofagia como RHES, el proceso de
mitofagia aumenta con un consecuente aumento de degradación mitocondrial. Además de ser necesaria
la participación de NIX, para interactuar con RHES en el “striatum”, en este caso para llevar a cabo la
mitofagia (Sharma et al., 2019). Otro ejemplo de sobreexpresión de proteína reguladora de mitofagia es
AMBRA1. Esta proteína se vio que interactuaba con PARKIN en células HEK293, y su interacción al sobre
expresar AMBRA1 aumentaba durante la despolarización mitocondrial prolongada, siendo AMBRA1
necesaria para el consecuente despeje mitocondrial (Van Humbeeck et al., 2011). Otra proteína reguladora
22
Tabla I. Clasificación de las proteínas de mitofagia según su vía metabólica
Vía Relaciones Proteínas
Basal Dependiente de Ub PINK1
PARKIN
p62
MARCH (5)
MIRO-1
MIRO-2
Interactúan con LC3 AMBRA1
p62
OPTN
NDP52
NBR1
TAX1BP1
Ub E3 ligasas Independientes de Parkin
GP78
SMURF1
SIAH1 MUL1
Estímulos de Estrés Independientes de Ub que interactúan con LC3
FUNDC1
BNIP3
NIX
BCL2L13
FKBP8
PHB2
Cardiolipina
Ceramida
CHDH
TBC1D15/FIS1
TBC1D17/FIS1
Programadas Interactúan directa o indirectamente con LC3
NIX
PHB2
MUL1
Independiente de LC3 Rab9
23
Figura 3. Mecanismos moleculares de proteínas que participan en la mitofagia. En la figura se muestran los 2 mecanismos principales de la mitofagia donde participan proteínas diferentes: la dependiente de ubiquitinas y la independiente de ubiquitinas. En la dependiente de ubiquitinas están las proteínas PINK1 y PARKIN. Tras la depolarización mitocondrial PINK1 se acumula en la membrana mitocondrial externa y recluta a PARKIN a la superficie mitocondrial. PINK1 gatilla la actividad de E3 ligasa de PARKIN a través de su fosforilación y ubiquitinación. Luego PARKIN ubiquitina VDAC1 y MFN1/2 en la membrana mitocondrial externa. Estas proteínas poliubiquitinizadas pueden ser reconocidas por p62, OPTN o NDP52, luego estas interactúan con LC3 lipidado (LC3-II) a través del motivo LIR que promueve la encapsulación de la mitocondria dañada por el autofagosoma. Por otro lado, la mitofagia independiente de ubiquitina depende de varios receptores mitofágicos que tienen su propio dominio LIR. Entre estos receptores están FUNDC1, BNIP3, NIX, BCL2L13, FKBP8 y NLRX1, los cuales se sitúan en la membrana externa mitocondrial. Además, están las proteínas de la membrana mitocondrial interna Cardiolipina y PHB2 las que también interactúan con LC3 a través de su dominio LIR. A modo general los adaptadores y receptores mitofágicos se unen a LC3-II en los fagóforos para su mayor expansión y cerrado formando los mitofagosomas, los cuales se fusionan con lisosomas dando lugar a los autolisosomas degradando finalmente las mitocondrias (Song et al., 2020).
24
es MARCH5, la cual al ser sobreexpresada ubiquitina FUNDC1 y la degrada, disminuyendo la mitofagia por
hipoxia (Chen et al., 2017). Mientras que el regulador PGAM5 al sobre expresarlo hace lo contrario,
defosforilando a FUNDC1 y gatillando la mitofagia por hipoxia (Chen et al., 2014). En otros estudios se ha
visto que la expresión de genes mitofágicos también ha aumentado en respuesta a estímulos diferentes
gatillando la mitofagia. Por ejemplo, se ha reportado que el estímulo de 2 horas de bicicleta sin ayuno
aumenta la expresión génica de parkin, bnip3 y nix, inmediatamente posterior al ejercicio (Opichka et al.,
2019). En células de mamíferos se encontró que ante el estímulo de hipoxia aumenta la expresión de
fundc1 el cual se encarga de llevar las mitocondrias a degradación (Liu et al., 2012). En células
transfectadas con la sobreexpresión de pink1 el contenido mitocondrial disminuye, visto por microscopía,
y sugiere protección de la apoptosis inducida por el estrés de la disfunción mitocondrial (Valente et al.,
2004; Vives-Bauza et al., 2010). Según la evidencia anterior encontrada en la literatura, la sobreexpresión
de un gen de mitofagia, ya sea regulador mitofágico, proteína de recambio basal mitocondrial, proteína
receptora mitocondrial por señal de estrés o programación celular, inciden en los niveles de expresión de
otros genes mitofágicos, sin importar si es en su disminución o aumento resultante, ocurriendo esto entre
algunas vías específicas de mitofagia, aunque también hay cambios en los niveles de expresión de algunas
vías que no tienen incidencia en otras. Esto sugiere la utilización del estudio de los niveles de expresión
de vías mitofágicas para conocer su función e interacción con los niveles de expresión de otros genes de
otras vías de mitofagia.
1.4. ERYM3 Como la mitofagia es un proceso complejo con variados actores y vías no redundantes, es posible
que nuevos actores surjan mediante los análisis transcriptómicos y/o proteómicos. De hecho, en un
estudio in silico de chips de microarreglos de la eritropoyesis (datos no publicados) se observó la expresión
de 12 genes, no descritos, que presentaron un patrón de expresión similar a los de genes de mitofagia lc3
y nix, es decir, que aumentan sus transcritos progresivamente hacia los estadíos finales de la maduración
25
eritroide; con al menos un dominio LIR; un péptido señal de importe mitocondrial; y un marco de lectura
abierto de más de 50 aminoácidos. Entre los 12 genes candidatos uno de los elegidos fue el gen erym3 por
presentar los mejores puntajes en cada uno de los criterios mencionados. ERYM3 tiene 86% de
probabilidad de ser importada a la mitocondria, tiene un dominio LIR putativo entre los aminoácidos 13-
18, con un puntaje de 13 de matriz de posición específica (PSSM, por su sigla en inglés), donde entre más
alto el valor es más probable que se trate de un dominio biológico activo (Ahmad et al., 2005; Zhu et al.,
2019). Como ejemplos para comparar, la proteína NIX tiene un valor de 20, BNIP3 de 19, FUNDC1 de 16,
p62 de 24 y OPTN de 15, todas con dominio LIR de interacción con LC3, siendo 9 el valor mínimo de PSSM
(Kalvari et al., 2014). El gen erym3 tiene además un segmento transmembrana putativo ubicado entre los
aminoácidos 40-60, el mínimo para insertarse en la membrana mitocondrial, según su trama de
hidrofobicidad “Kyte-Doolittle plot”. Una característica notable es que erym3 es un gen que se encuentra
exclusivamente en primates, ubicado en el cromosoma 10, y que además es monoexónico, ambos datos
revelados mediante un análisis de alineación BLAST (Basic Local Alignment Tool, por su sigla en inglés).
Resultados preliminares (no publicados aún) de estudio del rol de la proteína ERYM3 en la mitofagia
mostraron que cuando se sobreexpresó ERYM3:GFP y se estimuló la mitofagia hubo un aumento en el
número de lisosomas respecto al grupo control solo con GFP (no mostrado) y hubo una colocalización del
95% de las marcas fluorescentes de ERYM3:GFP con las de los lisosomas (Figura 4 A), significando que
probablemente interactúan y participan durante el proceso de mitofagia. Después, al sobreexpresar
ERYM3:GFP y teñir las mitocondrias se observó fraccionamiento mitocondrial, despolarización de las
mitocondrias por su menor intensidad de fluorescencia y colocalización del 100% de las mitocondrias con
ERYM3:GFP, en comparación al grupo control solo con GFP (Figura 4 B), significando este resultado la
probable realización del proceso de mitofagia, ya que los hitos mencionados son característicos de la
segregación y degradación mitocondrial durante la mitofagia. Lo anterior entonces significa que ERYM3
tiene una distribución tripartita y que probablemente promueve el despeje mitocondrial, translocándose
desde el citosol a las mitocondrias y con las mitocondrias al interior de los lisosomas para su degradación.
26
Figura 4. ERYM3 presenta una distribución tripartita entre mitocondrias, lisosomas y citosol. A) Se muestran células COS7 transfectadas con el plásmido de sobreexpresión pEGFP-ERYM3-N1 y teñidas con “Lysotracker DND-99” para marcar lisosomas y se indujo la mitofagia por medio de 2 horas de inanición. En el panel izquierdo observamos que ERYM3-GFP se muestra en forma de puntos distribuidos por el citosol. En el panel central observamos las marcas lisosomales también en forma de puntos distribuidos por el citosol. En el panel derecho observamos que con la inducción de mitofagia el 95% de las marcas de ERYM3-GFP colocalizan con las de los lisosomas. B) Se muestran células COS7 transfectadas con el plásmido de sobreexpresión pEGFP-ERYM3-N1 o el plásmido control pEGFP-N1, teñidas con sonda
fluorescente “Mytotracker Deep Red” para marcar mitocondrias. En el grupo de sobreexpresión de ERYM3 el panel izquierdo muestra la distribución de ERYM3 por el citosol. En su panel central se ven mitocondrias despolarizadas (baja intensidad de fluorescencia), fragmentadas y disminución de la biomasa mitocondrial, en comparación al grupo control. En su panel derecho se observa la colocalización en un 100% con las mitocondrias. En el grupo control de sobreexpresión de GFP en el panel central se ven las mitocondrias alargadas, interconectadas e intensas. En su panel derecho se ve que no hay colocalización con mitocondrias. Barras 10 µm.
27
Finalmente, en base a todos los antecedentes anteriormente presentados, se realizó la investigación
descrita a continuación debido a las implicancias que tiene la mitofagia en el ciclo de vida y el control de
calidad de las mitocondrias, siendo esta muy relevante, ya que sus alteraciones están asociadas a
disfunción mitocondrial y diferentes enfermedades. Por consiguiente, el objetivo de esta investigación fue
determinar el efecto que tiene la sobreexpresión de erym3 sobre la biomasa mitocondrial, cuyo primer
resultado sugirió una disminución de la biomasa mitocondrial, aunque se requiere la realización de al
menos 1 técnica experimental más, distinta a la ya utilizada, para confirmar esta disminución, y el segundo
resultado sugirió que erym3 no participa en las vías mitofágicas de fundc1, ni de pink1, debiéndose
confirmar lo anterior y determinar su participación en las demás vías mitofágicas por medio del
tratamiento de células con drogas para inducir cada vía o inhibir cada fase de las vías.
28
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
HIPÓTESIS
Tomando en cuenta todos los antecedentes anteriormente mencionados, se hipotetiza que la
sobreexpresión de erym3 estimula la disminución de la biomasa mitocondrial mediada por mitofagia
OBJETIVOS
General
Determinar el efecto de la sobreexpresión de erym3 sobre la biomasa mitocondrial y la expresión de
genes mitofágicos
Específicos
1. Determinar el efecto de la sobreexpresión de erym3 sobre la biomasa mitocondrial medida por la
razón ADNmt/ADN nuclear en la línea celular HEK293T.
2. Determinar el efecto de la sobreexpresión de erym3 sobre la expresión de los genes marcadores de
mitofagia pink1 y fundc1 en la línea celular HEK293T.
29
DISEÑO EXPERIMENTAL
Objetivo específico 1
1. Determinar el efecto de la sobreexpresión de erym3 sobre la biomasa mitocondrial medida por la
razón ADNmt/ADN nuclear en la línea celular HEK293T.
Para la realización de este primer objetivo específico se desarrollaron 2 diseños experimentales piloto
que ayudaron a encontrar las condiciones experimentales adecuadas a fin de dar con el diseño
experimental final para determinar el efecto de la sobreexpresión de erym3 sobre la biomasa
mitocondrial. En el primer diseño piloto se cultivaron células HEK293T hasta obtener una confluencia del
80%. Al alcanzarse esta confluencia se realizó la transfección con el método de fosfato de calcio con el
plásmido pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His como grupo de tratamiento de sobreexpresión de erym3 y con el
plásmido pCDNA3.1 (vector vacío) como grupo control. A las 0, 6, 12 y 48 horas post-transfección las
células fueron cosechadas por tripsinización, lavadas en medio DMEM para bloquear la tripsina,
centrifugadas para su recolección, después resuspendidas y centrifugadas 2 veces en PBS, nuevamente
centrifugadas y almacenadas en 1 tubo de pellet de células a -20°C. Los pellets almacenados a -20°C se
utilizaron para la extracción de ADN genómico total (mitocondrial y nuclear) con un Kit comercial
“QIAGEN”. Luego por medio de espectrofotometría se calculó la concentración y pureza de las
extracciones de ADN total. Con las muestras de ADN total correspondientes se hizo un gel de agarosa
visualizando la expresión de ERYM3 y qPCRs para la determinación del ADNmt. La cantidad de ADNmt se
expresó como veces de cambio respecto al ADN nuclear. Finalmente, los datos obtenidos fueron
analizados y graficados. Lo anterior se resume en un esquema en la Figura 5.
30
Figura 5. Diseño experimental piloto 1 del objetivo específico 1. En la figura se aglomeran de forma lineal todos los experimentos correspondientes al primer objetivo específico con sus etapas y características, siguiendo las células desde su cultivo hasta su análisis final.
Cul vo Transfección Cosecha ElectroforesisExtracción ADN
Espectro‐fotometría
qPCR Análisis
HEK293TCon uente 0
1. 0h2. h3. 12h . h
Post‐transfección
Pure a y concentración
ADN
Grá cos y estadís ca
pcDNA3.1,pcDNA3.1‐ERYM3‐Myc‐His
Total Kit ComercialQIAGEN Gel
Lu Ampli cación
ADN
31
A causa del aumento de número de copias de ADNmt obtenido en algunos resultados, posiblemente
porque la biogénesis mitocondrial fue inducida, y de la variabilidad obtenida en el número de copias de
ADNmt con el diseño anterior, a continuación, se realizó el segundo diseño piloto (Figura 6), similar al
primero, donde esta vez se transfectaron las células con el plásmido pEGFP-ERYM3-N1 como grupo de
tratamiento de sobreexpresión de ERYM3:GFP y con el plásmido pEGFP-N1 como grupo control. Además,
en esta ocasión 12 horas antes de la cosecha celular se aplicó la droga cicloheximida (CHX) como grupo
de tratamiento para inhibir la síntesis de proteínas citosólicas, ya que 99% de las proteínas mitocondriales
se sintetizan en el citosol, mientras que al grupo control se le aplicó el vehículo en el cual esta
resuspendida la CHX, en EtOH y PBS. Luego, la sobreexpresión de GFP se observó por microscopía de
epifluorescencia a las 24 y 48 horas post-transfección y se cosecharon las células en las mismas horas en
que se observaron. Los pasos siguientes fueron los mismos que antes hasta que se extrajo el ADN total
con otro Kit: “NORGEN”, y se hicieron los qPCR, que en esta ocasión se usaron los partidores mtMinArc y
mtMajArc (Figura 7). Tras esto, los pasos finales realizados fueron los mismos que en el diseño anterior.
32
Figura 6. Diseño experimental piloto 2 del objetivo específico 1. En la figura se aglomeran de forma lineal todos los experimentos correspondientes al primer objetivo específico con sus etapas y características, siguiendo las células desde su cultivo hasta su análisis final.
Cul vo TransfecciónMicroscopía y Cosecha
TratamientoExtracción ADN
Espectro‐fotometría
qPCR Análisis
HEK293TCon uente 0
1. 2 h2. h
Post‐transfección
Pure a y concentración
ADN
Grá cos y estadís ca
pEGFP‐N1,pEGFP‐ERYM3‐N1
Total Kit Comercial NORGEN
CHX o ehículo control
Ampli cación ADN
33
Figura 7. Esquema correspondiente a partidores utilizados para el arco menor y mayor del ADNmt. En la figura se muestra la ubicación de unión de los partidores mitocondriales mtMajArc y mtMinArc con el ADNmt. El partidor mtMajArc está ubicado en el gen ND4 dentro del arco mayor mitocondrial representado por el arco negro entre los orígenes de replicación OH y OL que abarca el 84% de las deleciones reportadas, incluyendo la deleción más común representada por el arco rojo. El partidor mtMinArc está ubicado en el bucle de desplazamiento mitocondrial o región control no codificante donde no se han reportado deleciones (Phillips et al., 2014).
34
Los niveles de ADNmt obtenidos del diseño experimental anterior resultaron menos variables, aunque
su irregularidad persistió, por lo que se realizó el diseño experimental final (Figura 8), en el que se
realizaron 3 réplicas biológicas (Figura 9). Se mantuvieron los pasos iniciales anteriores hasta que se
realizó la transfección, que esta vez fue con los plásmidos iniciales: pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His como
grupo de tratamiento y el plásmido pCDNA3.1 como grupo control. Los pasos siguientes fueron los mismos
anteriores hasta la cosecha, donde se cosecharon las células 1 vez a las 24 horas post-transfección y 3
veces a las 48 horas post-transfección. Esta vez, la resuspensión en PBS de las células cosechadas a las 48h
post-transfección se separó por pipeteo a la mitad en 2 tubos falcon cada vez, los cuales se centrifugaron
y cuyos pellets de células se almacenaron en 3 tubos a -20°C y en otros 3 tubos a -80°C. Los pellets
guardados a -80°C se utilizaron para el objetivo específico 2 y los pellets almacenados a -20°C se utilizaron
para la extracción de ADN genómico total (mitocondrial y nuclear). Los pasos siguientes se realizaron de
igual manera al diseño anterior.
35
Figura 8. Diseño experimental final del objetivo específico 1. En la figura se aglomeran de forma lineal todos los experimentos correspondientes al primer objetivo específico con sus etapas y características, siguiendo las células desde su cultivo hasta su análisis final.
Cul vo Transfección CosechaTratamientoExtracción ADN
Espectro‐fotometría
qPCR Análisis
HEK293TCon uente 0
2 h (1x) h (3x)
Post‐transfección
Pure a y concentración
ADN
Grá cos y estadís ca
pcDNA3.1,pcDNA3.1‐ERYM3‐Myc‐His
Total Kit ComercialNORGEN
CHX o ehículo control
Ampli cación ADN
36
Figura 9. Transfecciones y tratamientos realizados en placas de células HEK293T. La figura representa la transfección y tratamiento con CHX que se realizó a las células HEK293T donde se utilizaron 4 pocillos (35mm por pocillo) confluentes al 80% para cada réplica biológica del diseño experimental final.
37
Objetivo específico 2
2. Determinar el efecto de la sobreexpresión de erym3 sobre la expresión de los genes marcadores
de mitofagia pink1 y fundc1 en la línea celular HEK293T.
A los pellets almacenados a -80°C se les extrajo el ARN total, después estas extracciones se
cuantificaron y se revisaron sus purezas por espectrofotometría para luego utilizar las extracciones lo
suficientemente puras con las que se realizó la síntesis de ADNc. Con las muestras de ADNc se hicieron los
qPCR para amplificar y cuantificar los transcritos de los genes erym3, fundc1, pink1 y 18s para así obtener
los umbrales de ciclo respectivos de cada reacción. Finalmente, los umbrales fueron analizados y
graficados para calcular los niveles de expresión de los genes respectivos ya mencionados, para ver si
había alguna interacción entre la expresión de las vías mitofágicas fundc1 y pink1 con la sobreexpresión
de erym3, usando la expresión del gen 18s como normalizador, lo que pudo haber sugerido la
participación de erym3 en estas vías. Lo anterior se representa en un esquema en la Figura 10.
38
Figura 10. Diseño experimental del objetivo específico 2. En la figura se aglomeran de forma lineal todos los experimentos correspondientes al segundo objetivo específico con sus etapas y características respectivas, siguiendo las células desde su cultivo hasta su análisis final.
39
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Amplificación y Purificación del ADN plasmidial
Bacterias Escherichia coli DH5 alfa quimiocompetentes fueron sometidas al método de transformación
química al agregar CaCl2 0,1 M estéril y frío. Luego se agregaron 0,5 uL de cada plasmidio (pCDNA3.1-
ERYM3-Myc-His, pCDNA3.1, pEGFP-N1 y pEGFP-ERYM3-N1) en muestras diferentes, dejando una sin
transformar como control de transformación. Luego se incubó la mezcla en hielo por 30 minutos, tras lo
que se aplicó un shock térmico 42°C por 45 segundos. Después se dejó enfriar en hielo 5 minutos. Luego
se agregó 1 mL de medio LB (Difco™ LB Broth, Miller “Luria Bertani”, REF#244620) y se incubó por 1,5
horas a 37°C con agitación a 180 rpm. Después se centrifugó por 3 minutos a 3000 rpm y se descartó el
sobrenadante, dejando aproximadamente 100 µL de este para resuspender las bacterias. El pellet
resuspendido fue sembrado en placas agar LB con ampicilina 100 mg/mL (1X) (Gibco,
#15140148) correspondiente a la resistencia conferida por el plasmidio. Las placas fueron incubadas a
37°C por 16 horas. Luego, se picaron las colonias y se escalaron los cultivos a medio líquido hasta conseguir
cultivos de 10 mL, los que se incubaron a 37°C y agitación de 150 rpm por 16 horas. Luego se traspasaron
500 µL de estas bacterias a un matraz con 500 mL de LB y ampicilina 1X (Gibco, #15140148). Nuevamente
las bacterias se incubaron a 37°C agitadas a 150 rpm por 16 horas. Las bacterias fueron cosechadas por
centrifugación a 4500 rpm por 15 min a 4°C para proceder con la extracción de ADN plasmidial libre de
endotoxinas a través de Midi-Prep (“NucleoBond Xtra midi, Machery Nagel, Lote1 05/003”), según
recomendaciones del fabricante. El mapa de los plásmidos pCDNA3.1 y pEGFP-N1 se muestran en el anexo
como las “Figuras 19 y 20”, respectivamente.
2.2 Modelo celular y condiciones de cultivo celular
Se cultivaron células HEK293T (Paul et al., 1970) en placas de pocillos (“Falcon, # REF3530 7”) en
una incubadora NUAIRE a 37°C, con 5% CO2, en 2 mL de medio DMEM (Dulbecco’s Modified Medium) bajo
en glucosa (1g/L) (“Lon a BioSciences, #: BE12-70 F”) suplementado con 10% SFB (suero fetal bovino)
40
(“Thermo Fisher, #2 1 0079”), estreptomicina y penicilina 1x (“Gibco, #15140148”), Glutamax 1 (“Gibco,
#35050-0 1”), plasmocin 0,1 (“InvivoGen Plasmocin”) y piruvato 1 mM (“Thermo Fisher, #151 0122”).
2.3 Método de transfección
La transfección se hizo con el método de fosfato de calcio según el protocolo de Kingston et al. (1999).
Brevemente, en tubos de centrifuga de 1,5 mL se mezclaron 197 µL de Cloruro de Calcio 0,25M con 3 µL
del plásmido respectivo (1000 ng/µL). Luego a cada tubo se le agregó gota a gota 200 µL de HBS 2X (Hepes
Buffer Solution) manteniéndose en agitación constante con la ayuda de un dispositivo “ ortex”. Luego, la
mezcla completa se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después, se agregaron los
400 µL resultantes de los precipitados de cristales de fosfato de calcio con plásmidos respectivos a cada
pocillo correspondiente con 2mL de medio de cultivo. Las transfecciones se incubaron por 24 horas en
una incubadora NUAIRE a 37°C, con 5% CO2, en el medio DMEM tras lo cual se renovó el medio de cultivo.
2.4 Inhibición de la Biogénesis Mitocondrial
Para atenuar el posible efecto de biogénesis mitocondrial de 1500 proteínas mitocondriales
sintetizadas en el citosol (Pfanner et al., 2019) se utilizó la droga CHX que se caracteriza por inhibir la
síntesis de proteínas citosólicas bloqueando la unidad 60s de los ribosomas en su sitio P (Obrig et al., 1971;
Bae et al., 2018; Yang et al., 2013; Suzuki et al., 2008). Se preparó un tubo stock de CHX a una
concentración de 10 mM (“Sigma-Aldrich CAS 66-81-9”) diluido en etanol analítico (EtOH 100%). Para el
tratamiento de las células se agregó 100 µM de CHX (20 µl) a los 2 mL de medio de cultivo en los pocillos
respectivos, o EtOH analítico (2 µl) más PBS 1X (18 µl) como grupo control (correspondientes al vehículo
en el que se resuspendió la CHX), por 12 horas previas a la cosecha de las células (Sharma, M., et al., 2019).
2.5 Aislación de ADN total
Las muestras recolectadas de pellets de células HEK293T post transfección guardadas a -20ºC se
procesaron inicialmente con el Kit “Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit (50) Cat No. /ID: 69504” y luego
41
con el Kit “Norgen Biotek Corp.; Cells and Tissue DNA Isolation Kit (Cat. 53100)”. Con ambos kits se
siguieron las instrucciones del fabricante, aislándose ADN genómico, el que contenía tanto ADN nuclear
como ADN mitocondrial. Además, se hizo el paso adicional de tratamiento con RNasa A (incluida en los
kits) para degradar el ARN contaminante.
2.6 Aislación de ARN total
Los pellets rescatados de HEK293T post transfección guardados a -80ºC se sometieron al protocolo de
aislación de ARN total con el Kit “Omega Biotek; E.Z.N.A. Total RNA Kit I, Cat.R6834-01” siguiendo las
instrucciones del fabricante. Además, se hi o el paso adicional de tratamiento con “DNAsa I, Promega,
Cód. M 10A”, que consistió en me clar µL de extracción de ARN total más agua (ultrapura, estéril, libre
de ARNasas) con 1 µL de “RQ1 DNAase Buffer 10X”, más 1 µL de “RQ1 RNAase free DNAase” (donde 1
unidad contenido en 1 µL elimina 1 µg de ADN). Luego se incubó la mezcla a 37°C por 30 minutos. Acto
seguido se le agregó 1 µL de la solución de detención “RQ1 DNAase Stop Solution”. Después se dejó
incubar a 65ºC por 10 minutos y se almacenó finalmente a -80ºC.
2.7 Geles de Agarosa para ADN
Se prepararon geles de agarosa al 0,5%, con TAE 1X, más solución RedGel 1X, que se montaron en
cámara de electroforesis. Se cargaron 100 ng de muestras respectivas de ADN y ADNc amplificadas,
producto de reacciones de PCR a partir de las extracciones de ADN total y ARN total de HEK293T, con
buffer de carga 1X y se utilizó un estándar de peso molecular de 1Kb de DNA Invitrogen. Se corrieron los
geles a 80 voltios por 45 minutos. El gel resultante se visualizó en un trans-iluminador ultravioleta.
2.8 Cuantificación ARN y ADN
Las muestras de ARN y ADN totales fueron cuantificadas por medio de espectrofotometría (Heptinstall
et al., 2000) con el equipo “Infinite TECAN NANO”, determinando así su concentración. La pureza de las
42
muestras se determinó por la razón 260/280 de absorbancia donde valores entre 1,8 - 2,0 para el ADN y
entre 1,9 - 2,1 para el ARN, fueron considerados adecuados para los siguientes experimentos.
2.9 Síntesis de ADNc
El ADN complementario se sintetizó con el Kit “5X All-In-One RT Master Mix de AbmGood Cat# ”
(el cual usa partidores aleatorios) siguiendo las instrucciones del fabricante. Primero, las muestras de ARN
total se dejaron descongelar sobre hielo. Luego, se mezclaron gentil y completamente 2 µL de la muestra
de ARN total respectiva con 4 µL de la solución “Master Mix” provista por el Kit y con 14 µL de agua
ultrapura estéril libre de ARNasas. Después la mezcla se incubó en un termociclador programado primero
a 25°C durante 10 min, luego a 42°c por 15 min (para qPCR) o a 42°C por 50 minutos (para PCR) para
sintetizar el ADNc y finalmente se detuvo la reacción al calentarla a 85°c por 5 min. Acto seguido se
almacenaron las muestras de ADNc a -20°C.
2.10 Cuantificación de ADNmt y de la expresión de erym3, pink1 y fundc1
Tanto el ADN mitocondrial de cada muestra de ADN total como la expresión de erym3, pink1 y fundc1
de las muestras de ADNc, fueron cuantificados mediante la técnica de qPCR en tiempo real usando el kit
“Brilliant II SYBRGreen, Cat#600828, de Agilent Tech”, usando tubos ópticos para qPCR en un medio estéril
libre de contaminación y por duplicado para cada reacción en el equipo “Agilent Aria Mx”.
Inicialmente, en el primer experimento piloto para cuantificar el número de copias de ADNmt se
utilizaron los partidores provistos por el Kit comercial “Takara; Human Mitochondrial DNA (mtDNA)
Monitoring Primer Set, Cat. # 72 ”, el cual trae pares de partidores para genes específicamente
humanos: 2 genes nucleares (SLCO2B1, SERPINA1) para normalizar y 2 genes de ADN mitocondrial (ND1 y
ND5). Las secuencias de los partidores no son provistas. Las reacciones de qPCR en tiempo real con estos
partidores se hicieron con 5 µL de tecnología “Brilliant II SYBRGreen, Agilent Tech”, con 0,5 µL de cada uno
de los partidores sentido y anti-sentido respectivos, con 2 µL de la muestra de ADN total respectiva y 2 µL
de agua ultrapura libre de nucleasas para completar los 10 µL de reacción final. El programa de qPCR
43
realizado fue de 2 etapas con 10 minutos de activación de la ADN polimerasa a 95°C, luego 30 segundos
de denaturación de la doble hebra de ADN a 95°C, y por último 1 minuto de hibridación y extensión a 60°C.
Esto se repitió por 40 ciclos.
Luego, en el segundo experimento piloto y en experimentos finales, se utilizaron los partidores
mitocondriales mtMinArc y mtMajArc para cuantificar los niveles de ADNmt y el partidor para el gen
nuclear b2m para normalizar los niveles, mostrados en la “Tabla II”. La programación para los qPCR fue de
2 etapas igual que la anterior con 10 min a 95ºC, luego 30 s a 95ºC y por último 1 min a 60ºC, por 40 ciclos.
Por último, para ver los niveles de expresión de erym3, de los genes mitofágicos fundc1 y pink1 y del
gen 18s constitutivo para normalizar los niveles de expresión y ver su correlación con la sobreexpresión
de erym3 en los diferentes grupos de tratamiento de cada réplica biológica, primero, se mezclaron 5 µL
de tecnología “Brilliant II SYBRGreen, Agilent Tech.”, con 0,5 µL de cada uno de los partidores sentido y
anti-sentido respectivos, mostrados en la “Tabla II”, en el caso de erym3 3’-ATGGGAGGGCTTTATCCACT-5’
y 3’-TCAGGGTTGGATCTTTTTGC-5’, con 1 µL de muestra de ADNc respectivo, correspondiente a 20 ng de
ADNc, más 3 µL de agua ultrapura libre de nucleasas para completar los 10 µL de reacción final. El
programa de qPCR en estos casos fue de 3 etapas. Primero de 10 minutos a 95°C, luego 30 segundos a
95°C, después 1 minuto a 60°C y la tercera etapa, de extensión del ADN, 30 segundos a 72°C por 40 ciclos.
Los valores de Ct (umbral de ciclo en inglés) de cada experimento de qPCR del equipo “Agilent Aria
Mx” fueron obtenidos mediante el software del equipo “AriaMx Electronic Tracking & HRM Software”.
Los valores se ingresaron al software “Excel” de “Microsoft Office” donde se reali aron los cálculos para
obtener los niveles de ADN mitocondrial por medio del método de doble delta de Ct, normalizando los
valores obtenidos por el ADN nuclear. De esta forma se determinó el número relativo de copias de ADN
mitocondrial. Cada muestra se corrió por duplicado y se consideraron como válidos los valores de Ct de
no más de 1 ciclo de diferencia entre ellos.
44
Tabla II: Partidores utilizados para qPCR
Gen Sentido Anti-sentido
erym3 ATGGGAGGGCTTTATCCACT
58.4°C
TCAGGGTTGGATCTTTTTGC
58°C
fundc1
(mitofágico)
TGGTGGAATCGAGTGTTTGG
61.9 °C
AAGAAAGCCACCACCTACTGC
60.7 °C
pink1
(mitofágico)
ACCTGGAGGTGACAAAGAGC
59.3 °C
TTGTGTTCAAGATGGCTTCG
59.8 °C
18s
(constitutivo)
CTCAACACGGGAACCTCAC
60 ºC
CGCTCCACCAACTAAGAAGC
60 ºC
b2m
(nuclear)
GCTGGGTAGCTCTAAACAATGTATTCA
60 ºC
CCATGTACTAACAAATGTCTAAAATGGT
60 ºC
d-loop
(mtMinArc)
(mitocondrial)
CTAAATAGCCCACAACGTTCCC
60 ºC
AGAGCTCCCGTGAGTGGTTA
60 ºC
nd4 (mtMajArc)
(mitocondrial)
CTGTTCCCCAACCTTTTCCT
60 ºC
CCATGATTGTGAGGGGTAGG
60 ºC
slco2b1
(nuclear)
No descrito (TAKARA ©) No descrito (TAKARA ©)
serpina1
(nuclear)
No descrito (TAKARA ©) No descrito (TAKARA ©)
nd1
(mitocondrial)
No descrito (TAKARA ©) No descrito (TAKARA ©)
nd5
(mitocondrial)
No descrito (TAKARA ©) No descrito (TAKARA ©)
45
2.11 Estadística
Los valores de doble delta Ct calculados en el programa “Excel, Microsoft Office” fueron anali ados a
través del programa “Graph Pad PRISM versión 9.0”, donde primero se calcularon y luego se
representaron los valores promedio +/- su desviación estándar. Después se utilizó el test paramétrico
ANOVA de una vía, para comparar el número de copias de ADNmt y comparar los niveles de expresión de
los genes respectivos, y se usó el test ANOVA de dos vías para comparar los niveles de ADNmt al usar CHX.
A continuación, se aplicó el “Tukey Test” con un valor de “p-value” de “P<0.05” de significancia, para
rechazar la hipótesis nula, con un n=3 de réplicas biológicas.
46
3. RESULTADOS
3.1. Determinación del número de copias de ADNmt a las 0, 6, 12 y 48 horas post-transfección de
pCDNA3.1-ERYM3-Myc-H c p r d r “TAKARA” cé u HEK 93T p r q CR.
Para lograr el primer objetivo específico células HEK293T fueron transfectadas con el plasmidio
pCDNA3.1 (vacío) como condición control o con el plasmidio pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His como grupo de
tratamiento, que sobreexpresa el gen de interés erym3. Luego, 48 horas post-transfección se hizo una
cosecha celular, seguida de una extracción de ARN total, con posterior RT-PCR y luego amplificación del
ADNc por PCR convencional con los partidores de erym3, mostrados en la “Tabla II”, para ver su nivel de
expresión en un gel de agarosa (figura 11). La amplificación observada en el control vacío obedece a la
expresión endógena de erym3, significando que erym3 se expresa en células HEK293T, siendo esta línea
celular entonces adecuada para el estudio de sobreexpresión de erym3. En el experimento además se
evaluó el nivel de expresión del gen erym3 cada 5 ciclos, pesquisando así el ciclo en que aparecieron las
bandas en el gel donde se observó la aparición de bandas 5 ciclos antes, más gruesas e intensas en el grupo
de sobreexpresión de erym3 en comparación al grupo control, el cual además mostró bandas más delgadas
y más tenues correspondiente a una menor cantidad de copias de ARNm de erym3. Lo anterior confirma
la transfección y sobreexpresión exitosas de erym3 en los grupos de tratamiento de los experimentos
piloto iniciales, significando entonces que estas células transfectadas con la metodología usada son aptas
para estudiar el efecto de sobreexpresión de erym3 en las mitocondrias. Todas las bandas se corresponden
con sus tamaños respectivos, el gel no mostró contaminación y el control positivo mostró una banda
intensa y definida, significando la correcta realización del PCR.
Para cuantificar el número de copias de ADNmt se hicieron los experimentos pilotos de qPCR de células
HEK293T con los partidores mitocondriales y nucleares “TAKARA ©”, nombrados anteriormente, según la
cinética de tiempo de cosecha celular a las 0, 6, 12 y 48 horas posterior a su transfección. Estos
47
Figura 11. Evaluación de la expresión de erym3 a las 48 horas post-transfección en células HEK293T. A) En la figura se muestra un gel de agarosa con el producto de PCR o amplicon de erym3 para observar su expresión en células HEK293T 48 horas post-transfección de plásmidos pCDNA3.1 (control vacío) y pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His (sobreexpresión de ERYM3). El primer carril corresponde al “Ladder de 1Kb Invitrogen”. El segundo carril es el control negativo. El tercer carril es el control positivo de amplificación del ADNc del gen atg5. Los carriles 4-8 y 9-13 muestran la amplificación cada 5 ciclos del PCR desde los 20 ciclos hasta los 40 ciclos. Los carriles 4 a 8 corresponden al nivel de expresión de erym3 endógeno al transfectar con el plásmido control de vector vacío pCDNA3.1. Los carriles 9 a 13 corresponden a la transfección para sobreexpresar erym3. Las bandas dentro del rectángulo muestran la amplificación del ADNc de erym3 sobreexpresado.
48
experimentos piloto cuentan con solo 1 réplica biológica pues se hicieron para orientar los experimentos
posteriores según los resultados obtenidos. En el grupo control se esperaba medir una cantidad fija o
rango acotado de entre un 20-40% de número de copias de ADNmt, para usarlo como nivel basal de
comparación con los grupos de tratamiento, el cual resultó ser variable hasta un 110% a lo largo del tiempo
de cultivo celular post transfección, por lo que se descartó usarlo para su comparación (Figura 12 A).
En el grupo de tratamiento se esperaba observar un patrón de disminución progresiva y paulatina del
número de copias de ADNmt a medida que se sobreexpresaba el gen erym3, suponiendo que a mayor
nivel de expresión de erym3 en el tiempo habría mayor inducción de mitofagia y menor cantidad de
ADNmt. Sin embargo, contrario a lo que esperábamos, se observa un aumento progresivo entre las 0, 6 y
12 horas en el número de copias de ADNmt a medida que se sobreexpresó el gen erym3. Mientras que a
las 48 horas post-transfección, cuando el plásmido llevaba el mayor tiempo expresándose, el número de
copias de ADNmt disminuyó hasta los niveles iniciales vistos a las 0 horas post-transfección (Figura 12 B).
Este resultado sugiere un efecto de compensación por la pérdida de mitocondrias a través de la activación
de biogénesis mitocondrial al inducir la mitofagia, el cual se revertiría a las 48 horas post-transfección
cuando el plásmido lleva su mayor tiempo de sobreexpresión, alcanzando un balance entre la actividad de
los procesos de mitofagia y biogénesis mitocondrial (Palikaras et al., 2015; Carelli et al., 2015; Ploumi et
al., 2017; Palikaras et al., 2014), o quizás se debe a la variabilidad en el número de copias de ADNmt en
esta línea celular (O'Hara et al., 2019) o a la variabilidad del método de cuantificación (Longchamps et al.,
2020), significando este resultado la necesidad de modificación del diseño experimental incial.
Debido a los resultados piloto anteriores se repitió el experimento esta vez con 3 réplicas biológicas
para medir el número de copias de ADNmt a las 0 y 48 horas post-transfección, antes de que el plásmido
se exprese y cuando definitivamente ya se sobreexpresó, respectivamente (Wang et al., 2016; Chi et al.,
2017). No se hizo a las 72 hrs post-transfección porque era posible que hubiesen muerto las células por
sobreexpresión de la proteína (Mori et al., 2020). En estos resultados se observa una alta variabilidad en
el número de copias del ADNmt, con un promedio similar entre las 0 y 48 horas post-transfección con una
49
Figura 12. Determinación del tiempo adecuado de sobreexpresión de erym3 para medir ADNmt. En la figura se muestran los niveles de ADNmt medidos en células HEK293T en distintos tiempos post-transfección con y sin sobreexpresión de erym3. A) qPCR piloto de 1 sola réplica biológica de HEK293T cosechadas a las 0, 6, 12 y 48 horas post-transfección del plásmido control pCDNA3.1 (vacío). Los resultados sugieren que el número de copias de ADNmt es variable e irregular en el tiempo, su cantidad oscila entre 1100 copias a las 0h p.t., 500 copias a las 6h p.t., 1000 copias a las 12h p.t. y 700 copias a las 48h p.t. B) qPCR piloto de 1 sola réplica biológica de HEK293T cosechadas a las 0, 6, 12 y 48 horas post-transfección del plásmido de sobreexpresión pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His, para definir el efecto de sobreexpresión de erym3 en el número de mitocondrias en esta línea celular. En este caso el número de copias de ADNmt vio un aumento progresivo desde las 200 copias a las 0h p.t., luego a 1200 a las 6h p.t. y hasta 2200 a las 12h p.t., volviendo a 200 copias a las 48h p.t. C) qPCR de HEK293T cosechadas a las 0 y 48 horas post-transfección del plásmido de sobreexpresión pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His. Los niveles de ADNmt no muestran diferencias significativas y poseen una variación entre las 200 y 1400 copias. n=3. Los valores corresponden al promedio +/- la desviación estándar, p < 0,05, con test de ANOVA-one way. h= horas. p.t.= post-transfección
50
desviación estándar de la media muy grande de 54.33 ± 515.3, sin un patrón observable (Figura 12 C), aun
cuando el gen erym3 dentro del plásmido no se había sobreexpresado a las 0 horas post-transfección y
aun cuando el gen de erym3 ya llevaba 48 horas sobreexpresándose. Este resultado significa que, según
estas condiciones experimentales, la sobreexpresión del gen erym3 es variable y no reproducible, por lo
que se debió modificar el diseño experimental original a fin de obtener datos más robustos, al no verse
diferencias significativas entre las 0 y 48 horas de sobreexpresión de erym3.
3.2. Evaluación de los niveles de ADNmt con partidores mtMinArc y mtMajArc a las 24 y 48 horas
post-transfección de pEGFP-ERYM3-N1 y tratamiento con CHX de células HEK293T por qPCR
Debido a los resultados anteriores se cambió el diseño experimental, nuevamente con experimentos
piloto de 1 sola réplica biológica para guiar los experimentos posteriores considerando que los resultados
previos sugieren la posibilidad de la variación en el número de ADNmt, posiblemente dada por el proceso
de biogénesis mitocondrial que estaría activo al inducir la mitofagia por la sobreexpresión de erym3. Por
lo anterior se trataron las células HEK293T con la droga cicloheximida (CHX) la cual inhibe la síntesis de
proteínas citosólicas (Yang et al., 2013), con la que se buscó bloquear el mecanismo de compensación por
biogénesis mitocondrial, evitando la reposición de proteínas nuevas de mitocondrias, ya que casi todas
las proteínas que componen las mitocondrias se sintetizan en el citosol y luego se dirigen a las
mitocondrias al activarse la biogénesis mitocondrial, pudiendo observarse así entonces si ocurre el
proceso de mitofagia sin reposición de proteínas mitocondriales nuevas que la oculten (Wu et al., 2007).
Esta vez las células HEK293T se transfectaron de manera independiente con los plásmidos pEGFP-N1,
como grupo control, y pEGFP-ERYM3-N1, como grupo de tratamiento, y se cosecharon a las 24 y 48 horas
post-transfección. Estos plásmidos sobreexpresan la proteína fluorescente verde “GFP” fusionada a
ERYM3 (ERYM3:GFP) para observar la sobreexpresión por microscopía de epifluorescencia. Además, y en
adelante, se utilizaron los pares de partidores mtMinArc y mtMajArc correspondientes al arco menor y
51
mayor mitocondrial respectivamente recomendados por la colaboradora mitocondrióloga Dra. Roberta
A. Gottlieb (Gottlieb et al., 2017; Gottlieb et al., 2011; Gottlieb et al., 2010) y utilizados en la literatura
(Phillips et al., 2014; Rygiel et al., 2015). En la “Figura 13 A” se muestra un gel de agarosa con ADNc
amplificado por PCR de los partidores mtMinArc y mtMajArc (arco menor y mayor) del ADNmt y b2m (ADN
nuclear) cuyo control negativo no presentó contaminación, la amplificación de los partidores muestra
bandas gruesas, intensas, definidas y en su peso correspondiente, mostrando la correcta realización del
del PCR. Esto significa que estos partidores, utilizados en los siguientes experimentos, estaban en aptas
condiciones de utilización. La microscopía de epifluorescencia muestra un 40% de células transfectadas
con éxito, suficiente para estudiar el efecto de la sobreexpresión de erym3 en mitocondrias (Figura 13 B).
Para evaluar los efectos de 100 µM de CHX 12 horas pre-cosecha sobre los niveles de ADNmt se hizo
un experimento piloto de 1 sola réplica biológica de qPCR de células HEK293T a las 24 horas post-
transfección. Al usar los partidores mtMinArc se ve una disminución en el nivel de ADNmt posiblemente
porque la CHX disminuyó el número de copias de ADNmt (Figura 13 C), como esta descrito en la literatura
(Suzuki et al., 2008; Higuchi et al., 1995), aunque no se esperaba disminución total, significa que CHX sirve
para disminuir el nivel de ADNmt. Luego, al usar los partidores mtMajArc se observó un aumento del 60%
en el nivel de ADNmt, contrario a lo esperado, sugiriendo que, al ser solo 1 réplica biológica insuficiente,
al haber variación de ADNmt en las células HEK293T, y el uso de partidores distintos a los anteriores, la
medición del número de copias de ADNmt se vuelve irregular, interfiriendo en el resultado obtenido.
Los resultados de los experimentos piloto de qPCR a las 24 horas post-transfección de pEGFP-ERYM3-
N1 muestran que con los partidores del arco menor mitocondrial hay un aumento de un 350% del nivel
de ADNmt al sobreexpresar ERYM3:GFP en comparación al grupo control (Figura 13 E). Para los partidores
del arco mayor mitocondrial también se ve un aumento, del 220% en el grupo ERYM3:GFP y del 230% en
el grupo ERYM3:GFP con CHX en relación al grupo control (Figura 13 F). A las 48 horas post-transfección
de pEGFP-ERYM3-N1 al medir los niveles de ADNmt con los partidores del arco menor en el grupo de
sobreexpresión de ERYM3:GFP de nuevo hubo un aumento, menor esta vez, del 50%, en relación al grupo
52
Figura 13. Evaluación de niveles de ADNmt al sobreexpresar ERYM3:GFP en HEK293T. A) Control de amplificación de partidores por medio de un gel de agarosa con productos de PCR con partidores de los arcos “menor” y “mayor” del ADNmt y del gen nuclear “b2m” de células HEK293T. El primer carril es del “Ladder 1Kb Invitrogen”, donde fragmentos de 1000pb migraron engrosando su banda. El carril “1” corresponde al control negativo, libre de contaminación, el “2” al producto de amplificación con partidores mtMinArc, el “3” con partidores mtMajArc y el “4” con partidores para b2m. Los productos de PCR se ven íntegros y en el peso correspondiente de 100pb. B) Control de transfección por microscopía de epifluorescencia con magnificación 60X de células HEK293T 48h p.t. del plásmido pEGFP-ERYM3-N1. La transfección fue exitosa por fluorescencia verde, intensa y definida de alrededor de un 40% de las células. C) qPCR piloto con partidores mtMinArc y CHX 100 µM 12h pre-cosecha en HEK293T. El nivel de ADNmt disminuyó un 100%. n=1. D) Experimento anterior, pero con partidores mtMajArc. El nivel de ADNmt aumentó un 60%. E) qPCR con partidores mtMinArc 24h p.t. de pEGFP-ERYM3-N1 y CHX 100 µM 12h pre-cosecha en HEK293T. El Eje “Y” corresponde a nivel de ADNmt, el eje “X” a grupos de tratamiento y control. El grupo ERYM3:GFP aumentó un 350% su nivel de ADNmt, el grupo ERYM3:GFP con CHX aumentó un 100%, el grupo CHX disminuyó un 10%, en relación al control. n=1. F) Mismo experimento anterior, pero con partidores mtMajArc. El grupo CHX aumentó un 450% su nivel de ADNmt, el grupo ERYM3:GFP aumentó un 220%, el grupo ERYM3:GFP con CHX aumentó un 230%. n=1. G) Mismo experimento que en “E”, pero a las 48h p.t. Los grupos CHX y ERYM3:GFP con CHX disminuyeron un 20% su nivel de ADNmt, el grupo ERYM3:GFP aumentó un 50%. n=1. H) Mismo experimento que en “F”, pero 48h p.t. El grupo CHX aumentó un 200% su nivel de ADNmt, los grupos ERYM3:GFP y ERYM3:GFP con CHX aumentaron un 10% y un 20% respectivamente. n=1. P.t.= post-transfección. Pb = pares de bases. h= horas. n=número de réplicas biológicas.
53
control (Figura 13 G). Al usar los partidores del arco mayor mitocondrial los grupos ERYM3:GFP y
ERYM3:GFP con CHX aumentaron los niveles de ADNmt, menos esta vez, en un 10% y 20% respectivamente
en relación al grupo control (Figura 13 H). Estos resultados sugieren una compensación por biogénesis
mitocondrial al sobreexpresar ERYM3:GFP, manteniéndose la biogénesis a las 24 horas post-transfección,
aun cuando se trataron las células con CHX 100 µM por 12 horas, pero que a las 48 horas post-transfección
sí disminuyen los niveles de ADNmt al medir con el partidor del “Arco Menor”, aunque con los partidores
del “Arco Mayor” los niveles de ADNmt permanecieron similares al grupo control. Esto significa que
posiblemente 24 horas de sobreexpresión de ERYM3 no sería suficiente tiempo para ver el efecto putativo
de mitofagia, pero sí sería suficiente tiempo a las 48 horas de sobreexpresión. Además, la actividad
putativa de mitofagia de ERYM3 podría verse interrumpida por estar fusionada con GFP, ya que el peso y
tamaño de GFP es de 27 kDa, casi el doble que el de ERYM3, de 14,4 kDa, permitiendo esto el efecto de
biogénesis mitocondrial como compensación ante la actividad mitofágica inducida. Otra explicación
posible es que la concentración y/o tiempo de CHX no hayan sido suficientes para inhibir síntesis proteica.
A pesar de lo anterior, en las mediciones con partidores del arco menor mitocondrial a las 24 horas
post-transfección, al aplicar la droga CHX se observó: una atenuación en el aumento de los niveles de
ADNmt en el grupo ERYM3:GFP con CHX en relación al grupo de solo ERYM3:GFP, la disminución del 10%
en el nivel de ADNmt en el grupo CHX con GFP (Figura 13 E) y la disminución del 20% de los niveles de
ADNmt a las 48 horas post-transfección de los grupos CHX con GFP y ERYM3:GFP con CHX (Figura 13 G),
significando que la disminución en los niveles de ADNmt es a causa de la inhibición de síntesis de proteínas
y no por la disminución de la biogénesis mitocondrial. Sin embargo, con los partidores del arco mayor
mitocondrial los niveles de ADNmt aumentaron, visto en los grupos de CHX con GFP en un 450% a las 24
horas post-transfección (Figura 13 F) y del 200% a las 48 horas post-transfección (Figura 13 H). Lo anterior
ocurre incluso al aplicar CHX, significando una irregularidad en el resultado posiblemente por la
intervención de la proteína GFP, la variación del ADNmt en HEK293T, la variación en la cuantificación por
qPCR, el uso de partidores del arco mayor mitocondrial y/o porque el tratamiento de CHX fue insuficiente.
54
Finalmente, es importante mencionar que aunque el aumento en el nivel de ADNmt para el grupo
ERYM3:GFP persiste a las 48h post-transfección al usar los partidores del arco menor mitocondrial (Figura
13 G), este es menor que a las 24h post transfección (Figura 13 E). Similarmente, al usar los partidores para
el arco mayor mitocondrial a las 48h post-transfección (Figura 13 H) los niveles de ADNmt también
disminuyen en los grupos de tratamiento CHX con GFP, ERYM3:GFP y ERYM3:GFP con CHX en comparación
a las 24 horas post-transfección (Figura 13 F), significando estos resultados que tras 48h post-transfección
el estímulo de biogénesis mitocondrial se atenúa y el proceso de mitofagia se acentúa acercándose a un
balance entre estos dos procesos interdependientes. Esta vez tampoco se hizo a las 72h post-transfección
porque era posible que hubiesen muerto las células por sobreexpresión de GFP (Mori et al., 2020).
3.3. Los niveles de ADNmt disminuyen con partidores mtMinArc y MajArc a las 24 y 48 horas post-
transfección de pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His en células HEK293T por qPCR
Con los resultados pilotos anteriores en consideración se diseñó el experimento final donde se hizo
nuevamente qPCR para cuantificar los niveles de ADNmt a las 24 y 48 horas post-transfección, esperando
ver una disminución progresiva del ADNmt al igual que antes, pero esta vez con los plásmidos pCDNA3.1
y pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His, por separado, con los mismos partidores de los arcos menor y mayor
mitocondriales y con tratamiento de CHX (Figura 14). Luego, se midieron los niveles de expresión de erym3
a las 48 horas post-transfección por medio de qPCR como control de transfección para la sobreexpresión
de erym3. Se observó que el grupo de sobreexpresión de erym3 tiene un aumento del 200% muy
significativo en relación al grupo control (Figura 14 C), significando que la transfección fue exitosa y las
células son aptas para estudiar el efecto de la sobreexpresión de erym3 en las mitocondrias. En cambio,
en el grupo de sobreexpresión con CHX, no se vio un aumento significativo en los niveles de erym3 en
comparación al grupo control, significando que este grupo no es apto para estudiar el efecto de
sobreexpresión de erym3. Luego, para ver el efecto a las 24 horas post-transfección sobre los niveles de
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Figura 14. Los niveles de ADNmt disminuyen al sobreexpresar erym3 a las 48 horas post-transfección. En la figura se muestran los niveles de ADNmt y de erym3. A) qPCR de 1 sola réplica biológica 24h p.t. de pCDNA3.1 y pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His, por separado, y CHX 100 µM 12 horas pre-cosecha con partidores del arco menor mitoondrial. Se observa que el nivel de ADNmt aumenta un 30% en el grupo de CHX, un 20% en el grupo erym3 OX y disminuye un 30% en el grupo erym3 OX junto con CHX, en relación al grupo control. B) Mismo experimento anterior, pero con partidores de arco mayor mitocondrial. Se ve que el nivel de ADNmt del grupo de CHX subió un 20%, el grupo erym3 OX no varió en su nivel de ADNmt y el grupo erym3 OX con CHX disminuyó un 50%, en relación al control. C) qPCR que muestra el nivel de expresión de erym3 48h p.t. de los plásmidos pCDNA3.1 y pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His, por separado, y 12 horas de CHX 100 µM pre-cosecha. El grupo erym3 OX aumentó un 200% significativamente en sus niveles de ARNm de erym3. Los grupos con CHX no mostraron diferencias significativas respecto al grupo control. n = 3. Los valores corresponden al promedio +/- la desviación estándar, p < 0,05, con test de ANOVA-one way. D) Mismo experimento anterior, pero se midieron niveles de ADNmt con partidores del arco menor mitocondrial, se observa que el nivel de ADNmt disminuye significativamente en un 60% al sobreexpresar el gen erym3 en relación al grupo control. n=3. Los valores corresponden al promedio +/- la desviación estándar, p < 0,05, con test de ANOVA-two way. E) Similar al experimento anterior, pero con partidores del arco mayor mitocondrial, se ve que no hay diferencias significativas, aunque el nivel de ADNmt baja un 30% cuando se sobreexpresa erym3 en relación al grupo control. Los valores corresponden al promedio +/- la desviación estándar, p < 0,05, con test de ANOVA-two way. P.t. = post-transfección. h = horas.
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ADNmt al sobreexpresar erym3 sin GFP, a diferencia de los experimentos piloto anteriores, con los mismos
partidores del arco menor y mayor mitocondriales, se realizaron experimentos de qPCR de 1 sola réplica
biológica (Figura 14 A y B). Al usar los partidores del arco menor mitocondrial se observó un aumento en
el nivel de ADNmt, menor que en el experimento anterior, del 30% en el grupo de CHX y del 20% en el
grupo de sobreexpresión de erym3, y además esta vez se vio una disminución del 30% en el grupo que
sobreexpresa erym3 junto con CHX, en relación al grupo control (Figura 14 A). Luego, al usar los partidores
del arco mayor mitocondrial, el nivel de ADNmt en el grupo de CHX aumentó esta vez un 20%, en el grupo
de sobreexpresión de erym3 se mantuvo su nivel de ADNmt, pero el de sobreexpresión de erym3 con CHX
disminuyó un 50%, todos en relación al grupo control (Figura 14 B). Este resultado aún sugiere un aumento
de la biogénesis mitocondrial, aunque menor que en presencia de GFP, persiste, gatillada como
compensación frente al estímulo de mitofagia, y que es disminuida por la inhibición de síntesis de
proteínas citosólicas. Después se hicieron los qPCR finales con 3 réplicas biológicas de células HEK293T a
las 48 horas post-transfección, y que fueron tratadas con CHX. Al usar el par de partidores del arco menor
mitocondrial, en el grupo de sobreexpresión de erym3 se observa una disminución en los niveles de
ADNmt muy significativa del 60% en relación al grupo control, en los grupos de CHX con vector vacío y
ERYM3 con CHX se vieron disminuciones también muy significativas del 80% y 70% respectivamente
(Figura 14 D). En cambio, al usar el par de partidores del arco mayor mitocondrial, no se observaron
diferencias significativas en relación el grupo control, ni entre los grupos de tratamiento, a pesar de que
se ve un patrón similar, de disminución en los niveles de ADNmt, al de los partidores del arco menor
(Figura 14 E). Estos resultados significan que la sobreexpresión de erym3 disminuye los niveles de ADNmt
y sugieren su participación en el proceso de mitofagia. Además, en conjunto, los resultados de la Figura
14 muestran que la inhibición de la síntesis de proteínas con CHX disminuye los niveles de ADNmt.
57
3.4. Los niveles de expresión de fundc1 y pink1 no varían 48 horas post- transfección de pCDNA3.1-
ERYM3-Myc-His y con tratamiento CHX en células HEK293T por qPCR
Finalmente, para lograr el segundo objetivo específico correspondiente a determinar el efecto de la
sobreexpresión de erym3 en la expresión de genes marcadores de mitofagia, lo que podría sugerir la
participación de ERYM3 en vías de mitofagia, se midieron a través de qPCR los niveles de expresión del
gen mitofágico fundc1, el cual es regulado por la señal de estrés de hipoxia, que funciona como un
receptor de mitofagia perteneciente a una vía no canónica, al igual que nix, y del gen mitofágico pink1,
perteneciente a la vía basal y canónica de renovación mitocondrial por medio de ubiquitinas presente en
casi todas las células humanas. Este experimento se hizo a partir de las muestras de ADNc de las mismas
réplicas biológicas anteriores donde se sobreexpresó erym3 48 horas post-transfección de los plásmidos
pCDNA3.1 y pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His, por separado, y con y sin tratamiento de CHX, para así buscar
diferencias entre los grupos de tratamiento y con el grupo control. Como control de transfección a las 48
horas post-transfección se usó el mismo qPCR anterior, donde se midieron los niveles de expresión de
erym3 en todos los experimentos y que al sobreexpresar erym3 hubo un aumento del 200%, muy
significativo, en relación al grupo control (Figura 15 A), siendo estas células adecuadas para estudiar el
efecto de la sobreexpresión de erym3 en la expresión de los genes mitofágicos fundc1 y pink1.
En el gráfico de los resultados del nivel de expresión del gen mitofágico fundc1 se muestra que no hubo
diferencias significativas entre los grupos de tratamiento, ni con el grupo control (Figura 15 B). Luego, al
medir los niveles de expresión del gen mitofágico pink1 se vio que tampoco hubo diferencias significativas
entre ninguno de los grupos de tratamiento, ni con el grupo control, a pesar de que en los grupos de CHX
y de sobreexpresión de erym3 se vio un aumento del 200% en la expresión de pink1 (Figura 15 C). Estos
resultados significan que no existe una relación entre la expresión de erym3 y la expresión de la vía no
canónica mitofágica de fundc1, la cual responde a hipoxia, ni con la expresión de la vía canónica mitofágica
de pink1, correspondiente a renovación basal de mitocondrias, lo que sugiere que ERYM3 no participa en
ninguna de estas dos vías.
58
Figura 15. La sobreexpresión de erym3 no afecta los niveles de expresión de fundc1 y pink1. En la figura se muestran qPCRs de células HEK293T 48 horas post-transfección de pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His o pCDNA3.1 (control y vector vacío) y aplicación de CHX 100 µM 12 horas pre-cosecha o vehículo control de CHX. A) Se ve el nivel de expresión de erym3 por qPCR con un aumento significativo del 200% en los niveles de ARNm de erym3 en el grupo de tratamiento de solo sobreexpresión de erym3. Los grupos con CHX no mostraron diferencias significativas respecto al grupo control. n = 3. Los valores corresponden al promedio +/- la desviación estándar, p < 0,05, con test de ANOVA-one way. B) Se ve el nivel de expresión del gen fundc1 por qPCR, observándose que no se obtuvieron diferencias significativas en los niveles de fundc1 entre los grupos de tratamiento, ni en relación al grupo control, a pesar de que aumentó un 30% en el grupo de CHX, mientras que en el grupo de sobreexpresión de erym3 disminuyó un 15% y en el de sobreexpresión de erym3 con CHX tuvo un 25% de disminución. Los valores corresponden al promedio +/- la desviación estándar, p < 0,05, con test de ANOVA-one way. n=3. C) Se muestra el nivel de expresión del gen pink1 por qPCR, mostrando que no se obtuvieron diferencias significativas en los niveles de pink1 entre los grupos de tratamiento, ni en relación al grupo control, a pesar de que en los grupos de CHX y de solo sobreexpresión de erym3 se ve un aumento del 200% en la expresión de pink1. n = 3. Los valores corresponden al promedio +/- la desviación estándar, p < 0,05, con test de ANOVA-one way.
59
4.DISCUSIÓN
Encontrar una nueva proteína que participa en la mitofagia es muy relevante debido a sus implicancias
en el ciclo de vida y el control de calidad de las mitocondrias, cuyas alteraciones están asociadas a daño y
disfunción mitocondrial, daño celular y tisular, apoptosis y diferentes enfermedades. Como se describió
anteriormente, las mitocondrias poseen un ciclo de vida comprendido por los procesos de biogénesis
mitocondrial, dinámica mitocondrial y mitofagia, los cuales controlan la cantidad de biomasa mitocondrial,
representada directamente por el número de copias de ADNmt. El proceso de mitofagia disminuye la
biomasa mitocondrial y se ve activado durante condiciones fisiológicas: basales, ante estímulos de estrés
y de programación celular. Se han identificado distintas proteínas en las condiciones fisiológicas
mencionadas que participan en la mitofagia y que corresponden a vías particulares de mitofagia no
redundantes, observándose que al sobreexpresar proteínas mitofágicas disminuye la biomasa
mitocondrial y que al bloquear las vías conocidas la mitofagia no es bloqueada por completo (Zhang et al.,
2019), lo que significa que aún quedan por describir nuevas vías y proteínas que participan en la mitofagia.
Por consiguiente, en este trabajo se estudió la sobreexpresión de erym3, un gen codificante para una
nueva proteína putativa de las mitocondrias que probablemente está involucrada en el proceso de
mitofagia dadas sus características y patrón de expresión similares a las proteínas de mitofagia NIX y LC3.
Entre las distintas formas de cuantificar la biomasa mitocondrial está la cuantificación del ADNmt
(D'Erchia et al., 2015), este método incluye la técnica de qPCR, la cual cuenta con variantes que
comprenden: El método Ct, considerado como el estándar, que es rápido, sensible, simple y cuantifica
relativamente el ADNmt (Quiros et al., 2017; Refinetti et al., 2017). El de regresión robusta de PCR, es más
preciso que el anterior, pero requiere de al menos 24 réplicas técnicas para alcanzar un intervalo de
confianza del 95% (Refinetti et al., 2017). Y por último el de PCR gota digital con su método de medición
de ADNmt gota digital (“ddPCR” y “ddMDM”, por sus siglas en inglés), que es aun más preciso que el
anterior permitiendo cuantificar ADNmt en células individuales sin tener que purificar el ADN o usar genes
60
nucleares de referencia, pero el costo de la máquina de “ddPCR” y de sus reactivos lo hace de más difícil
acceso (O'Hara et al., 2019; Li et al., 2018). También para cuantificar ADNmt está la genotipificación de
microarreglos, la secuenciación completa del genoma y la secuenciación completa del exoma, los cuales
están significativamente asociados al número de copias de ADNmt, pero son de alto costo, requieren de
mucho tiempo, son complejos de hacer y analizar por la gran cantidad de información entregada
(Longchamps et al., 2020). Otras formas de cuantificar la biomasa mitocondrial son: La citometría de flujo,
con sondas fluorescentes como “Mytotracker green”, nonalicridina naranja (NAO), tetrametilrodamina etil
éster (TMRE) o la proteína fluorescente roja mitocondrial (mtRFP), pero que se acumulan en la mitocondria
según la variación del potencial de membrana y luego permanecen unidas (excepto por TMRE que no se
une), aunque se sugiere mtRFP porque se acumula independiente del potencial (Doherty et al., 2017;
Costanzini et al., 2019; Jacobson et al., 2002; Widlansky et al., 2010). La microscopía electrónica es una
forma que cuantifica las mitocondrias usando programas de análisis de imagen, pero la cantidad de células
analizadas es muy inferior a los otros métodos (Widlansky et al., 2010). La microscopía confocal, esta usa
cationes selectivos mitocondriales fluorescentes, como la rodamina 123, que permiten además analizar
morfología, potencial de membrana y motilidad en tiempo real en células vivas, aunque se ven afectadas
por la variación en el potencial de membrana mitocondrial (Koopman et al., 2006). Otro método
establecido es el ensayo de la actividad de la enzima mitocondrial citrato sintasa, medida por
espectrofotometría, esta requiere más tiempo para la aislación de las mitocondrias y luego de la enzima,
junto con grandes cantidades en microgramos de muestra (Costanzini et al., 2019). Y finalmente está la
inmunotransferencia “Western Blot”, que cuantifica la masa de proteínas mitocondriales típicas como las
subunidades de TOM, VDAC, ANT, COXIV (por sus siglas en inglés) y Citocromo C, requiriendo de una mayor
cantidad de tiempo para su realización (Costanzini et al., 2019; Wyckelsma et al., 2017; Bingol et al., 2014;
Doherty et al., 2017). Al cuantificar biomasa mitocondrial se recomienda usar dos o más métodos de
cuantificación y que uno de estos métodos sea el ensayo de la actividad de citrato sintasa medida por
espectrofotometría (Quiros et al., 2017; Quiros et al., 2012).
61
Teniendo lo anterior en consideración, en este trabajo se utilizó la técnica de qPCR en tiempo real con
el método de Ct, reportado como el estándar comúnmente utilizado para cuantificar el número de copias
de ADNmt (Longchamps et al., 2020; Refinetti et al., 2017) debido a que esta técnica es un ensayo
cuantitativo, accesible, rápido, sensible y simple, que determina los umbrales de ciclo en que amplifican
fragmentos de ADN en relación a un gen constitutivo (Refinetti et al., 2017; Nicklas et al., 2004; Andreu et
al., 2009; Fernandez-Jimenez et al., 2011), consistiendo esta técnica en amplificar uno o más fragmentos
de ADNmt y un fragmento de ADN nuclear en reacciones separadas de templados de ADN extraídos y
aislados de una misma muestra biológica (Fernandez-Jimenez et al., 2011; Grady et al., 2014) y después
elevar el número 2 a la potencia negativa del doble delta de los Ct de las reacciones (Quiros et al., 2017).
En el presente estudio el resultado de número de copias de ADNmt observado varió en los
experimentos piloto. En cambio, en los experimentos finales los niveles de ADNmt disminuyeron y se
observaron más estables. Según la literatura los valores de ADNmt en células HEK293T varían entre un
20% y un 40% (O'Hara et al., 2019; Mueller et al., 2012), siendo esta línea celular la que se utilizó en este
trabajo. De acuerdo a lo anterior, entre las explicaciones para esto está que el número de copias de ADNmt
es en efecto variable: a lo largo del ciclo celular y del número de pasaje celular (Dewey et al., 1976; Sweet
et al., 1999; Martínez-Diez et al., 2006; Trinei et al., 2006), según el tipo celular y según el estadio de
desarrollo (Montier et al., 2009). Siguiendo la misma línea que los estudios anteriores, los diferentes
métodos y Kits comerciales de extracción y aislación de ADN total también hacen variar la cantidad de
ADNmt obtenido (Longchamps et al., 2020), siendo importante destacar que los Kits que se utilizaron en
el experimento piloto inicial y los experimentos finales de este trabajo son distintos. También hay que
considerar que la técnica de qPCR tiene una variación inherente a la hora de estimar la cantidad de número
de copias de ADNmt (O'Hara et al., 2019; Refinetti et al., 2017; Rygiel et al., 2015; Phillips et al., 2014), que
a su vez dependen también de las distintas técnicas de ejecución y principalmente de las diferentes
eficiencias de amplificación al usar distintos partidores en las reacciones de qPCR entre los genes
constitutivos y los genes de interés, lo que conlleva a una diferencia en la razón de normalización entre
62
estos genes (Regier et al., 2010; Kiselinova et al. 2014), siendo esto último importante y debe considerarse
puesto que los conjuntos de partidores que se utilizaron en el experimento piloto inicial y en los
experimentos finales son distintos. Debido a lo anterior, una solución propuesta en la literatura para las
diferencias en las amplificaciones de las reacciones de qPCR es incorporar mayor cantidad de réplicas
técnicas para promediar los valores atípicos de umbral de ciclo de cada par de partidores (Malik et al.,
2011). Por consiguiente, es importante y se debe tener en cuenta que a causa de las diferencias entre los
experimentos piloto y los experimentos finales es que se obtuvieron números de copias de ADNmt
variables y niveles de ADNmt disminuidos, respectivamente. Lo anterior posiblemente se debió entonces
a que las réplicas biológicas que se utilizaron y la cantidad de réplicas que se hicieron entre los
experimentos piloto y finales fueron diferentes.
La droga Cicloheximida (CHX) fue utilizada como tratamiento en el segundo experimento piloto y en el
experimento final en los que se cuantificó el ADNmt (Figuras 13 y 14, respectivamente). En el segundo
experimento piloto, cuando se usaron los partidores del arco menor mitocondrial, se observó una
disminución del 100% del nivel de ADNmt (Figura 13 C). En este contexto, en la literatura se ha descrito
que CHX detiene la síntesis de ADNmt y además fragmenta el ADNmt, lo que disminuye finalmente su
abundancia (Suzuki et al., 2008; Higuchi et al., 1995). Aunque no se reportó una disminución completa del
nivel de ADNmt, este experimento constó de solo 1 réplica biológica, sin ser este resultado concluyente.
En cambio, al usar los partidores del arco mayor mitocondrial se vio un aumento del 60% en el nivel de
ADNmt al aplicar la droga CHX (Figura 13 D), lo que se podría explicar por las variaciones de ADNmt
reportadas en la literatura en las células HEK293T (O'Hara et al., 2019; Mueller et al., 2012), al realizar la
técnica de qPCR (O'Hara et al., 2019; Refinetti et al., 2017; Rygiel et al., 2015; Phillips et al., 2014), por la
diferente eficiencia de amplificación al usar otro par de partidores distinto al anterior (Regier et al., 2010;
Kiselinova et al. 2014), aunque cabe mencionar que fueron los mismos pares de partidores que se
utilizaron en los estudios de Phillips et al., 2014 y Rygiel et al., 2015, este resultado también constó de
solo 1 réplica biológica, sin ser concluyente. Siguiendo la misma línea anterior, respecto a las células que
63
se trataron con la droga CHX y en las que se sobreexpresó erym3, es importante destacar que se observó
una disminución en los niveles de ADNmt. Lo anterior se explicaría posiblemente a que al haberse utilizado
la droga cicloheximida se habría detenido el proceso de biogénesis mitocondrial que ocurre para renovar
la pérdida de mitocondrias en respuesta al estímulo de mitofagia (Fu et al., 2019; Webb et al., 2020; Scott
et al., 2014; Chengqun et al. 2020; Lee et al., 2017), ya sea por la vía basal, programada o por estrés (Diot
et al., 2015; Bess et al., 2012; MacVicar et al., 2013; Ashrafi et al., 2013; Schweers et al., 2007), y que en
esta ocasión habría sido provocada por la sobreexpresión de erym3. Estos resultados son apoyados por la
literatura donde se muestra que el tratamiento con CHX disminuye los niveles de ADNmt y su síntesis
(Suzuki et al., 2008; Higuchi et al., 1995), debiéndose destacar que la CHX inhibe la síntesis de proteínas
citosólicas al bloquear el sitio P de la unidad 60s de los ribosomas (Obrig et al., 1971; Bae et al., 2018; Yang
et al., 2013), por lo que aproximadamente 1500 proteínas mitocondriales codificadas en el núcleo no se
incorporaron a las mitocondrias, incluso al estimularse la biogénesis mitocondrial, ya que se sintetizan en
el citosol, siendo estas proteínas las que conforman casi la totalidad de las mitocondrias (99%), dado que
solo 13 proteínas están codificadas en el ADNmt y se sintetizan al interior de la mitocondria (Eslamieh et
al., 2017; Boengler et al., 2011). En concordancia con lo descrito anteriormente, es posible que, al no
haberse incorporado las proteínas mitocondriales se detuvo la renovación de las mitocondrias con la
consecuente detención de la replicación del ADNmt y que al haberse mantenido la mitofagia o verse
estimulada por la sobreexpresión de erym3 disminuyeron finalmente los niveles de ADNmt.
Al solo sobreexpresarse erym3 a las 48 horas post-transfección el nivel de ADNmt disminuyó muy
significativamente en un 60% (Figura 14 D), estando este resultado apoyado por la literatura donde se ve
que la sobreexpresión de una proteína que participa en la mitofagia aumenta el proceso de mitofagia con
la consecuente degradación mitocondrial, ocurriendo esto en las diferentes vías mitofágicas basal,
programada o por estrés, ya sea una proteína reguladora como AMBRA1, RHES, PGAM5, PINK1 o PARKIN
(Sharma et al., 2019; Van Humbeeck et al., 2011; Chen et al., 2014; Valente et al., 2004; Vives-Bauza et
al., 2010; Narendra et al., 2008), adaptadora como p62/SQSTM1 (Aparicio et al., 2019) o receptora como
64
CHDH, FUNDC1 o NIX (Park et al., 2014; Wang et al., 2014; Gordon et al., 2019). Aun así, al sobreexpresarse
erym3 a las 6h, 12h, y ERYM3:GFP, a las 24 horas post-transfección, en los resultados piloto, se observaron
aumentos en los niveles de ADNmt. Esto podría explicarse también porque pudo haber ocurrido una
compensación aguda a la pérdida de mitocondrias con la inducción de la biogénesis mitocondrial (Fu et
al., 2019; Webb et al., 2020; Scott et al., 2014; Chengqun et al. 2020; Lee et al., 2017) en respuesta al
estímulo de mitofagia de ERYM3 a través de alguna vía basal, programada y/o por estrés (Diot et al., 2015;
Bess et al., 2012; MacVicar et al., 2013; Ashrafi et al., 2013; Schweers et al., 2007). En cambio, al
sobreexpresarse ERYM3:GFP a las 48 horas post-transfección, aunque se vio un aumento, en los niveles
de ADNmt, este fue menor en hasta un 310% en comparación al tiempo previo de 24 horas, ambos
correspondientes al segundo diseño piloto, lo que podría explicarse porque ERYM3:GFP llevaba 24 horas
más sobreexpresándose pudiendo haber superado la compensación aguda de la biogénesis mitocondrial
y de la posible interferencia de GFP en la función mitofágica de ERYM3. Siguiendo la misma tendencia, en
los resultados finales donde solo se sobreexpresó erym3 a las 24 horas post-transfección se llegó a ver
que el nivel de ADNmt, aunque aumentó un 20%, lo hizo un 330% menos que en los resultados previos
del mismo tiempo del segundo diseño piloto e incluso llegó a no variar con respecto al grupo control. Por
consiguiente, los resultados anteriores mencionados apoyan entonces que el tiempo de sobreexpresión
requerido para que ERYM3 cumpla su función en la mitofagia debe ser mayor a las 24 horas post-
transfección y sin la presencia de GFP unida a ERYM3.
Según lo anterior, el conjunto de los resultados presentados en este trabajo sugiere que la
sobreexpresión de erym3 generó una disminución de los niveles de ADNmt, lo que representa una
disminución de la biomasa mitocondrial y apoya a la hipótesis planteada en esta investigación.
Se propuso que ERYM3 quizás participaba en la vía mitofágica de FUNDC1, porque responde a hipoxia
al igual que NIX (Liu et al., 2012; Sowter et al., 2001), o en la de PINK1, ya que está presente en casi todos
los tejidos humanos (Stelzer et al., 2016). Por lo que en el segundo experimento final se cuantificaron los
niveles de expresión de los genes fundc1 y pink1 en los grupos de tratamiento en los que se sobreexpresó
65
erym3 y/o se aplicó CHX para ver si había alguna interacción entre sus niveles de expresión, como ocurre
con los de otras proteínas mitofágicas (Sharma et al., 2019; Van Humbeeck et al., 2011; Chen et al., 2017;
Chen et al., 2014). En el resultado de fundc1 se vio una disminución del 15% al solo haber sobreexpresado
erym3 (Figura 15 B), sin embargo, no hubo diferencias significativas entre los grupos de tratamiento, ni
en relación al grupo control. En el resultado de pink1, aunque tampoco hubo diferencias significativas en
sus niveles de expresión, cuando solo se sobreexpresó erym3 la expresión de pink1 aumentó un 200%
(Figura 15 C). Una explicación posible para el aumento del 200% en el nivel de expresión de pink1 cuando
sólo se sobreexpresó erym3 y que además abarca la no variación del nivel de expresión de pink1 cuando
se agregó el tratamiento con CHX es posiblemente debido a la regulación de la biogénesis mitocondrial a
través de la vía PINK1/PARKIN/PARIS/PGC-1α (Yin et al., 2018; Lee et al., 2017; Shin et al., 2011; Cherry et
al., 2014). En esta vía PINK1 ubiquitina y elimina a PARKIN y fosforila a PARIS (Lee et al., 2017), entonces
PARKIN deja de degradar a PARIS, el cual reprime a PGC-1 α, disminuyendo su transcripción (Shin et al.,
2011), siendo este último descrito como el maestro regulador de la biogénesis mitocondrial y que permite
la replicación del ADNmt (Cherry et al., 2014). Esta vía se habría activado al estimularse la mitofagia por
la sobreexpresión de erym3, el cual habría generado la disminución de mitocondrias con la consecuente
activación de la biogénesis mitocondrial para suplir la pérdida de mitocondrias (Fu et al., 2019; Webb et
al., 2020; Scott et al., 2014; Chengqun et al. 2020; Lee et al., 2017), pero al haberse activado la biogénesis
los niveles de pink1 aumentaron para regularla y disminuir los niveles de ADNmt, lo que concuerda con
los resultados observados en la “Figura 1 D y E” y con estudios donde se describe que estos dos procesos
ocurren simultáneamente, como en la diferenciación de células C2C12 (Sin et al., 2015), al usar la droga
dicloro metilsulfonil butilaminoquinoxalina (DMB) cuando hay una pérdida de PARKIN (Chengqun et al.,
2020), en neuronas humanas donde la pérdida de PARKIN causa un aumento de PARIS y este un declive
en PGC-1α (Kumar et al., 2020) y en ratones donde el noqueo de PARKIN aumenta los niveles de PARIS y
este reprime la transcripción de PGC-1α (Lin et al., 2020). En cambio, cuando se sobreexpresó erym3 y se
agregó el tratamiento de CHX, esta podría haber inhibido la biogénesis mitocondrial, como se planteó en
66
esta discusión anteriormente, según lo descrito en varios estudios (Suzuki et al., 2008; Higuchi et al., 1995;
Obrig et al., 1971; Bae et al., 2018; Yang et al., 2013), lo que explicaría que el nivel de expresión de pink1
no haya aumentado en el grupo que se aplicó CHX y se sobreexpresó erym3 (Figura 15 C).
En conjunto, los resultados correspondientes a los niveles de expresión de genes mitofágicos, sugieren
que erym3 no participa en la vía mitofágica de fundc1, ni de pink1. Quizás hay una relación entre erym3 y
la vía de pink1 debido a la posibilidad planteada que explicaría la tendencia que se observó de aumento
de la expresión de pink1, pero solo con los resultados obtenidos no se puede concluir nada al respecto.
Lo anterior sugiere que ERYM3 está participando en otras vías de mitofagia y no en las de PINK1 y FUNDC1,
siendo probable que participe en la vía de mitofagia programada de diferenciación celular en
eritropoyesis, en el cual fue descubierto el ARNm de ERYM3 y donde se vio que su expresión aumenta en
los estadios finales de eritropoyesis al igual que la expresión de LC3 y NIX (Schweers et al., 2007; Wu et
al., 2017), siendo NIX la principal proteína mitofágica que realiza el despeje mitocondrial total durante la
eritropoyesis y que también degrada mitocondrias en respuesta a la señal de hipoxia (Schweers et al.,
2007; Sandoval et al., 2008; Sowter et al., 2001; Ding et al., 2010). NIX es una proteína receptora de
mitofagia que se une, a través de su dominio LIR, a LC3 para unir la mitocondria al fagóforo y formar el
mitofagosoma (Rogov et al., 2017; Novak et al., 2010). La proteína mitofágica NIX está regulada por la
proteína RHES, la cual tiene un dominio SUMO-E3 ligasa, o sea de sumoilación, a través del cual RHES se
une a NIX (Sharma et al., 2019; Subramaniam et al., 2020). MUL1/MAPL es otra proteína mitofágica con
dominio SUMO-E3 ligasa, que sumoila a DRP1 para la fisión mitocondrial durante la mitofagia (He et al.,
2020; Braschi et al., 2009), y que también despeja por completo las mitocondrias, aunque en la vía
programada del desarrollo embrionario durante la fertilización (Rojansky et al., 2016). Estas 3 proteínas,
RHES, NIX y MUL1, se expresan en riñón y en casi todos los tejidos humanos (Stelzer et al., 2016). Posterior
al desarrollo experimental de este trabajo de tesis se hizo el análisis bioinformático del modelamiento de
la estructura proteica terciaria tridimensional de ERYM3 (no publicado), la cual corresponde a un dipolo
molecular muy estable, mostrado en la sección de anexos (Figura 22). ERYM3 posee un dominio
67
inestructurado que podría ser sumoilado en su extremo C-terminal correspondiente a su polo negativo
formado por aminoácidos ácidos hidrofílicos de carga negativa, el cual queda expuesto al citosol como
una antena de señalización y que entonces podría ser sumoilado por la proteína RHES o MUL1 para que
ERYM3 cumpla su función en la mitofagia, posiblemente junto con NIX durante los estadios finales de
eritropoyesis o hipoxia, o quizás con otras proteínas mitofágicas a través de su sumoilación (He et al.,
2020; Wilkinson et al., 2020). En cambio, en el extremo N-terminal de ERYM3 que corresponde al polo
positivo, su dominio LIR putativo está ubicado al interior del pliego de aminoácidos básicos hidrofóbicos
de carga positiva formado por el segmento transmembrana putativo, por lo que el dominio LIR putativo
no queda expuesto al citosol para unirse a LC3 y el segmento transmembrana putativo no queda
conformado para insertarse en la membrana mitocondrial, pero que al tener carga positiva por los
aminoácidos básicos hidrofóbicos este polo se vería atraído por la carga negativa del potencial de
membrana mitocondrial y tendría contacto con la superficie mitocondrial pudiendo unirse a esta,
actuando como la base de la antena de señalización sumoilada para que ERYM3 ejerza su rol en la
mitofagia. El modelo estructural de dipolo molecular de ERYM3 muestra que tiene mayoritariamente
cargas positivas, por lo que si ERYM3 se acumula en la superficie mitocondrial y permanece ahí podría
disminuir la carga negativa del potencial de membrana mitocondrial, que si llega a disminuir bajo -108mV
de ΔΨM (Zorova et al., 2018; Gerencser et al., 2012; Ramzan et al., 2010) gatillaría las vías mitofágicas
correspondientes a despolarización de membrana mitocondrial entra las que se encuentra FKBP8, PHB2
y CHDH, las cuales son independientes de ubiquitinas e interactúan con LC3 (Murakawa et al., 2015; Bian
et al., 2014; Yang et al., 2019; Park et al., 2014) o la de PINK1/PARKIN (Youle et al., 2011; Ashrafi et al.,
2012; Jedrak et al., 2017; Reznik et al., 2016; McWilliams et al., 2016; Sun et al., 2015), aunque esta última
vía probablemente no esté involucrada debido a que sus niveles de expresión génica no tuvieron cambios
significativos al sobreexpresar erym3.
Debido a las restricciones impuestas por la pandemia el desarrollo experimental de este trabajo de
tesis se vio afectado habiendo quedado pendientes experimentos para confirmar la disminución de
68
biomasa mitocondrial por sobreexpresión de ERYM3 y para determinar su participación en las vías
mitofágicas. En su lugar, se realizó trabajo teórico que consistió en la escritura de 2 artículos científicos
de revisión literaria, o “Reviews”, ambos sobre el ADNmt, su relación con la mitofagia, con el ciclo de vida
mitocondrial y las implicancias de su heteroplasmía, derivando en la posterior publicación de uno de los
dos artículos por el momento. Ambos artículos están referenciados en la sección de anexos y el artículo
publicado completo se encuentra adjunto al final de la sección.
Considerando todos los resultados anteriores, a futuro se proyecta incorporar al menos el ensayo de
actividad de la citrato sintasa (Quiros et al., 2017) o la técnica de microscopía confocal, la cual además
entrega información sobre la morfología y potencial de membrana mitocondrial, para corroborar la
función de ERYM3 como proteína reguladora de la biomasa mitocondrial en células de linaje eritroide
K562. También se proyecta determinar la relación de erym3 con las otras vías de mitofagia por medio de
tratamientos con drogas inductoras de cada vía mitofágica e inhibidoras de cada fase mitofágica, para
dilucidar en cuáles participa o si pertenece a su propia y nueva vía, midiendo los niveles de expresión de
erym3 y de los demás genes mitofágicos a través de la técnica de qPCR y su método Ct, también en células
de linaje eritroide K562.
Los hallazgos encontrados en este trabajo sugieren que ERYM3 regula la biomasa mitocondrial y
participa en la mitofagia. El nuevo gen erym3 recién descrito y su proteína quedan aún por ser explorados
en su función, características, actividad y estructura, pudiendo quizás tener su propia vía de mitofagia y
ser útil para intervenciones terapéuticas y diagnósticas que involucren la disfunción mitocondrial o
enfermedades asociadas a una alteración en la mitofagia.
69
5. CONCLUSIONES
1. Los niveles de ADNmt disminuyen al sobreexpresar erym3 en células HEK293T a las 48 horas post-
transfección del plásmido pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His.
2. La sobreexpresión de erym3 no modifica los niveles de expresión de los genes mitofágicos fundc1 y
pink1 en células HEK293T a las 48 horas post-transfección del plásmido pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His.
70
6. MODELO DEL ROL DE ERYM3 EN LA MITOFAGIA
Ante un estímulo de mitofagia, posiblemente de programación para diferenciación eritroide en
estadíos finales de eritropoyesis o ante señal de estrés por hipoxia, erym3 aumenta su nivel de expresión,
lo que conlleva a un aumento en la síntesis de su proteína en el citosol. Desde el citosol ERYM3 se transloca
a la mitocondria a causa del estímulo mitofágico, su péptido señal mitocondrial y su carga neta positiva,
ya que la mayoría de sus aminoácidos son hidrofóbicos. Luego, ERYM3 se acumula en la superficie
mitocondrial y promueve el proceso de mitofagia de estas disminuyendo la cantidad de mitocondrias con
la consecuente degradación de su ADN mitocondrial. Este modelo se representa en un esquema de la
participación de ERYM3 en la mitofagia en la Figura 16.
71
Figura 16. Modelo del rol de ERYM3 en la mitofagia. En la figura se representa un esquema de la participación de ERYM3 en la mitofagia. En condiciones fisiológicas sin estímulo de mitofagia ERYM3 se expresa endógenamente, situándose en el citosol y con baja colocalización mitocondrial, sin generar el efecto de mitofagia. Ante el estímulo de mitofagia ERYM3 aumenta su síntesis en el citosol, tras lo cual es translocado a la mitocondria acumulándose en su superficie promoviendo la mitofagia, reclutando al fagóforo, llevando a las mitocondrias a degradación junto con su ADN mitocondrial. El estímulo de mitofagia inicia la formación del fagóforo, el cual es reclutado a la mitocondria con la consecuente formación del mitofoagosoma, fusión del mitofagosoma con el lisosoma, formación del mitolisosoma y degradación de su contenido mitocondrial y reciclaje de este.
72
7. MODELO TEÓRICO PROPUESTO DEL ROL DE ERYM3 EN LA VÍA MITOFÁGICA DE NIX
Este modelo se basa en la literatura publicada, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis y
resultados del laboratorio de medicina mitocondrial aún no publicados. Se muestra que la señal de
mitofagia programada por diferenciación celular en estadios finales de eritropoyesis o por hipoxia gatilla
la transcripción de erym3, lo que da inicio a su transcripción a ARNm dentro del núcleo. Luego de su
procesamiento post-transcripcional es exportado fuera del núcleo al citosol, donde es traducido por los
ribosomas de la célula a su forma proteica primaria de cadena polipeptídica. Después de plegarse y
alcanzar su forma terciaria ERYM3 se sitúa en el citosol desde donde es translocado a la mitocondria, a
causa del estímulo mitofágico, su carga neta positiva por sus aminoácidos hidrofóbicos y su péptido señal
mitocondrial, donde se acumula en su superficie. Al acumularse ERYM3 en la superficie de la mitocondria
es sumoilada y así activada por RHES. Después ERYM3 y RHES, en conjunto con la señal de mitofagia
generada previamente, reclutan a los receptores mitofágicos NIX a la mitocondria y los activan, uniéndose
los receptores a la membrana externa mitocondrial. La señal de mitofagia generada previamente inicia la
formación del fagóforo el cual es reclutado a la mitocondria y se une a los receptores mitofágicos NIX
activados, elongándose después el fagóforo hasta encerrar a la mitocondria en su interior. Después el
mitofagosoma formado se fusiona con el lisosoma, degradándose finalmente la mitocondria, ERYM3 y los
receptores por las enzimas lisosomales. Este modelo se representa en un esquema de la participación de
ERYM3, y su ciclo de vida, en la mitofagia junto con NIX, RHES y SUMO en la Figura 17.
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Figura 17. Modelo del rol de ERYM3 en la vía mitofágica programada o por hipoxia de la proteína NIX. En la figura se representa un esquema de la participación de ERYM3 en la mitofagia gatillada por hipoxia o por el programa diferenciación celular en estadios finales de la eritropoyesis mostrando el ciclo de vida de vida de ERYM3 desde su transcripción, exportación del ARNm, su traducción, síntesis, plegamiento y conformación de la estructura terciaria de ERYM3, translocación mitocondrial, acumulación en la superficie mitocondrial, activación por RHES, reclutamiento y activación de receptores mitofágicos NIX, formación del fagóforo y su reclutamiento a la mitocondria, unión de receptores NIX con proteína de unión LC3-II del fagóforo, formación del mitofoagosoma, fusión del mitofagosoma con el lisosoma, formación del mitolisosoma y degradación de su contenido mitocondrial y reciclaje de este.
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8. PROYECCIONES DE ESTUDIO DE ERYM3
Acorde al primer objetivo específico, que buscaba ver el efecto de la sobreexpresión de erym3 sobre la
biomasa mitocondrial donde se encontró que a las 48 horas de sobreexpresión de erym3 disminuyen los
niveles de ADNmt, se proyecta realizar un estudio de cuantificación de la biomasa mitocondrial por medio
de microscopía confocal en células K562 de linaje eritroide al sobreexpresar y silenciar ERYM3, tiñendo las
mitocondrias y lisosomas previamente a la microscopía de cultivos celulares correspondientes a las 0, 12,
24, 36 y 48 horas post-transfección de los plásmidos de sobreexpresión o silenciamiento. Para determinar
la biomasa mitocondrial y su morfología se observarán las marcas fluorescentes de las mitocondrias
teñidas con “Mytotracker Deep Red” para después cuantificarlas y analizarlas por análisis de imagen,
mientras que para analizar su potencial de membrana se teñirán las mitocondrias con TMRE. Luego, para
hacer una correlación de los resultados anteriores con el proceso de mitofagia se teñirán los lisosomas con
“Lysotracker DND-99” para anali ar su distribución, cantidad y colocali ación con las mitocondrias.
Acorde al segundo objetivo específico, que buscaba ver el efecto de la sobreexpresión de erym3 en las
vías mitofágicas de fundc1 y pink1 pudiendo haber sugerido la participación de ERYM3 en estas vías, se
propone determinar, también en células K562 de linaje eritroide, la o las vías mitofágicas y la fase de la
mitofagia en que participa ERYM3 específicamente midiendo los niveles de expresión de todos los genes
mitofágicos por qPCR luego del tratamiento con drogas estimuladoras de vías específicas funcionalmente
diferentes: FCCP de vía basal por despolarización mitocondrial para PINK1, PARKIN, FKBP8 y PHB2; cloruro
de cobalto de vía de estrés por hipoxia para NIX, BNIP3 y FUNDC1; y 6-OHDA vía de estrés por ruptura de
membrana mitocondrial para cardiolipina, ceramida y CHDH. Luego se aplicarán drogas inhibidoras de
diferentes fases de la mitofagia en cada vía que fue estimulada para determinar en qué fase participa
ERYM3, según sus niveles de expresión y de los otros genes mitofágicos, usando 3-MA para evitar la
formación inicial del mitofagosoma, Bafilomicina A1 para evitar la fusión y formación del mitolisosoma y
cloroquina para evitar la acidificación final del mitolisosoma.
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Figura 18. Diseño experimental para verificar a ERYM3 como regulador de biomasa mitocondrial. En la figura se representa un esquema del flujo del diseño experimental junto con algunas características de su metodología.
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Figura 19. Diseño experimental para determinar la participación de ERYM3 en vías mitofágicas. En la figura se representa un esquema del flujo del diseño experimental junto con algunas características de su metodología
Cul vo Fármacos Cosecha Extracción ARN
Electrofores is RT‐PCR qPCR Anál is i s
K5 2Cul vo 0
FCCP/ 3h/20 MCoCl2 /2 h/100 M ‐OHDA/3h/ 100 MBa l./3h/100nMCloroq./3h/50 M3‐MA/3h/10mM
1. 0h2. h3. 12h . 2 h5. 3 h . hPost‐es mulo
GELL Z IntegridadARN
Ampli cación ADN
Grá cos y estadís ca
Síntesis ADNc
Kit comercial
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88
ANEXOS
Figura 20. Plásmido pCDNA3.1 distribuido por “Addg . rg”. En la figura se representa un esquema de plásmido pCDNA3.1 el cual está disponible en la página web: https://www.addgene.org/113442/. El plásmido pCDNA3.1-ERYM3-Myc-His deriva de este y tiene inserta la secuencia del gen erym3 después del promotor entre los sitios EcoRI y XhoI.
89
Figura 21. Plásmido pEGFP-N1 autor “Clontech”. En la figura se representa un esquema de plásmido pEGFP-N1 el cual está disponible en la página web: https://www.snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=fluorescent_protein_genes_and_plasmids&plasmid=pEGFP-N1. El plásmido pEGFP-ERYM3-N1, deriva de este y tiene inserta la secuencia del gen erym3 en el sitio de clonación múltiple.
90
Figura 22. Modelo bioinformático en 3D de la estructura terciaria de la proteína ERYM3. En la figura se muestra una representación de la proteína ERYM3 luego de plegarse y adquirir su estructura terciaria en el citosol. Esta proteína es un dipolo molecular con cargas positivas en su extremo N-terminal y cargas negativas en su extremo C-terminal, el cual se considera tiene un dominio inestructurado que puede ser sumoilado. La simulación molecular corresponde a 100 nanosegundos la cual indica que esta configuración es muy estable. En el extremo N-terminal el dominio LIR putativo de la proteína termina ubicado al interior del pliego de aminoácidos básicos formado por el segmento transmembrana putativo y que corresponde al polo positivo, por lo que el dominio LIR putativo no queda expuesto al citosol para unirse a LC3 y el segmento transmembrana putativo no queda conformado para insertarse en la membrana mitocondrial, pero que al tener carga positiva por los aminoácidos básicos hidrofóbicos, este es el polo que se ve atraído por la carga negativa mitocondrial y tiene contacto con la superficie mitocondrial pudiendo unirse a la membrana mitocondrial. En cambio, en el extremo C-terminal se encuentra el dominio inestructurado que puede ser sumoilado, el cual al ser formado por aminoácidos ácidos hidrofílicos de carga negativa queda expuesto al citosol para interactuar con otras proteínas o moléculas como RHES y MUL1, ambas SUMO-E3 ligasas, a través de su sitio de sumoilación.
91
Otros trabajos realizados durante el desarrollo de la presente Tesis de Magíster 1. Elorza, A. A., & Soffia, J. P. (2021). mtDNA Heteroplasmy at the Core of Aging-Associated Heart Failure.
An Integrative View of OXPHOS and Mitochondrial Life Cycle in Cardiac Mitochondrial
Physiology. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 9, 230.
2. Juan Pablo Soffia and Álvaro A. Elorza. (2021). The Mitochondrial Clock Gear Mechanism, a model of
Aging: The Link among ROS, mtDNA and Mitophagy. Institute of Biomedical Sciences, Faculty of
Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andres Bello. Millennium Institute on Immunology
and Immunotherapy. Santiago, Chile. (Manuscrito en progreso)
92
REVIEW article Front. Cell Dev. Biol., 22 February 2021 https://doi.org/10.3389/fcell.2021.625020
REVIEW: mtDNA Heteroplasmy at the Core of Aging-Associated Heart Failure. An Integrative View of
OXPHOS and Mitochondrial Life Cycle in Cardiac Mitochondrial Physiology
Alvaro A. Elorza1,2* and Juan Pablo Soffia1,2
• 1Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Institute of Biomedical Sciences, Universidad Andres Bello, Santiago, Chile
• 2Millennium Institute on Immunology and Immunotherapy, Santiago, Chile
The most common aging-associated diseases are cardiovascular diseases which affect 40% of elderly
people. Elderly people are prone to suffer aging-associated diseases which are not only related to health
and medical cost but also to labor, household productivity and mortality cost. Aging is becoming a world
problem and it is estimated that 21.8% of global population will be older than 65 years old in 2050; and
for the first time in human history, there will be more elderly people than children. It is well accepted that
the origin of aging-associated cardiovascular diseases is mitochondrial dysfunction. Mitochondria have
their own genome (mtDNA) that is circular, double-stranded, and 16,569 bp long in humans. There are
between 500 to 6000 mtDNA copies per cell which are tissue-specific. As a by-product of ATP production,
reactive oxygen species (ROS) are generated which damage proteins, lipids, and mtDNA. ROS-mutated
mtDNA co-existing with wild type mtDNA is called mtDNA heteroplasmy. The progressive increase in
mtDNA heteroplasmy causes progressive mitochondrial dysfunction leading to a loss in their bioenergetic
capacity, disruption in the balance of mitochondrial fusion and fission events (mitochondrial dynamics,
MtDy) and decreased mitophagy. This failure in mitochondrial physiology leads to the accumulation of
depolarized and ROS-generating mitochondria. Thus, besides attenuated ATP production, dysfunctional
mitochondria interfere with proper cellular metabolism and signaling pathways in cardiac cells,
contributing to the development of aging-associated cardiovascular diseases. In this context, there is a
growing interest to enhance mitochondrial function by decreasing mtDNA heteroplasmy. Reduction in
mtDNA heteroplasmy is associated with increased mitophagy, proper MtDy balance and mitochondrial
93
biogenesis; and those processes can delay the onset or progression of cardiovascular diseases. This has
led to the development of mitochondrial therapies based on the application of nutritional,
pharmacological and genetic treatments. Those seeking to have a positive impact on mtDNA integrity,
mitochondrial biogenesis, dynamics and mitophagy in old and sick hearts. This review covers the current
knowledge of mitochondrial physiopathology in aging, how disruption of OXPHOS or mitochondrial life
cycle alter mtDNA and cardiac cell function; and novel mitochondrial therapies to protect and rescue our
heart from cardiovascular diseases.
Introduction
The world is aging at a very high speed and with it, the aging-associated diseases are going up. According
to Lutz et al. (2008), the proportion of the global population of 60 + years was 10% in 2000 but is projected
to be 21.8% in 2050 and then to 32.2% in 2100. Current projections on aging show that in 2050 there will
be more elderly people (65+) than children (0-14 years old) for the first time in human history. This is
enormous pressure for the health care system and for the economy of any country because older adults
are affected by several and diverse chronic diseases - aging-associated diseases- that contribute to
disability, diminish the quality of life and increase health- and long term- care costs. The cost of aging-
associated diseases is not only related to medical care but also to labor and household productivity losses
and mortality costs. Furthermore, old people in many cases are affected by a combination of diseases
which increases the cost even more. Older people are more susceptible to get ill when they work or live
under environmental risk factors such as air pollution, tobacco smoke, particulate matter and ozone
and/or under low quality of life risk factors such as sedentarism and bad food quality, leading to obesity.
This negative environmental exposure may cause or exacerbate respiratory and cardiovascular diseases
(Van Houtven et al., 2008). Cardiovascular diseases are the leading cause of death among older people
reaching up to 40% of deaths in people over 65 years old (Van Houtven et al., 2008; Ginneken, 2017).
Therefore, new heart failure treatments are of high relevance to improve the life quality and lifespan of
94
older people and also to decrease the pressure and costs on the public health system. Working on new
methodologies and technologies will make a contribution to expediting and advancing drug discovery and
genetic therapies in this area.
Our heart is a wonderful organ built at the beginning of our existence, during embryonic development,
and never ever stops working until we die. It is a perfect machine that pumps, day and night, blood into
all tissues, resting only between beats. Furthermore, if we exercise or have an increase in oxygen demand,
our heart beats even harder to satisfy tissue demands. It has been estimated that our heart beats 36
million times per year and to support such a high load of work, our heart must be able to produce an
enormous amount of ATP that has been estimated in about 30-40 Kg per day (Ferrari et al., 2003) which is
about one-third of total ATP produced by our body (a normal individual produces 90-100 Kg of ATP daily).
Cardiac cells are contractile striated cells with an average render cell volume of 30.5 pL (picoLiters) and
1 0 μm × 32 μm × 13 μm (LxWxD) average dimension in mammals. The cardiac cell capacitance, which is
proportional to the amount of membrane and membrane invaginations, varies among different mammal
species between 138 and 300 pF (picoFaraday). The amount of membrane invaginations is explained by
the presence of T-tubules (50% membrane), endoplasmic reticulum and mitochondria which are all
involved in cardiac cell contraction (Satoh et al., 1996). The ultrastructural analysis of cardiac cells also
reveals that the volume density of mitochondria is over 25.3%, the myofibrils 52.3% and the cytoplasm
22.3%. One-third of the cardiac volume is filled with mitochondria (Barth et al., 1992); although Huang et
al. (2013) estimate mitochondrial volume to be up to 40%.
Keeping Healthy and Happy Mitochondria: OXPHOS and MLC
Mitochondria are cellular organelles that are well known as the powerhouse of the cell in charge of
satisfying ATP demands. However, today, mitochondria are also acknowledged as a metabolic hub that
integrates intracellular signaling to elaborate and execute a cellular response to adapt cell metabolism to
external or internal environmental changes, taking primary action in cell fate determination. Fit and
95
healthy mitochondria will be able to satisfy the heart’s energy demands, but dysfunctional mitochondria
won’t, therefore a cardiac failure is expected.
In general, for all of our cells (excluding erythrocytes that do not have mitochondria) two convoluted
mitochondrial systems work collaboratively to maintain a healthy mitochondrial population. The Oxidative
Phosphorylation (OXPHOS) system and the Mitochondrial Quality Control System also known as the
Mitochondrial Life Cycle (MLC). Together they complement each other to keep mitochondrial function i.e.,
energy production (ATP), reactive oxygen species (ROS) detoxification, proper metabolism and retrograde
signaling (Figure 1).
96
Figure 1. Keeping a healthy mitochondrial population. Mitochondria’s health depends on two complementary systems. The first system is the OXPHOS. This will provide energy (ATP) and reactive oxygen species (ROS) which are both necessary to drive the second system: The Mitochondrial Life cycle. Through mitochondrial fusion and fission events (Mitochondrial dynamics, MtDy), mitochondria are segregated to be eliminated by mitophagy. The induction of mitophagy is coupled with mitochondrial biogenesis which involves mitochondrial DNA (mtDNA) replication. mtDNA encodes for 11 respiratory complex subunits (7 subunits for complex I, 1 for complex III, 3 for complex IV) plus 2 subunits of the ATP synthase that will allow OXPHOS assembly to keep going the virtuous circle. Any disruption or delay in this running circle will end up in the loss of energy, mutations in mtDNA, decrease in mtDNA copy number and increased ROS leading to mitochondrial dysfunction, cell death, aging and aging-associated diseases.
97
OXPHOS is made of the Electron Transport Chain (ETC) to generate the proton motive force (mitochondrial
membrane potential) and the ATP synthase that utilizes the proton motive force to generate ATP. The ETC
or respiratory chain is formed by 4 respiratory complexes plus the ubiquinone and the cytochrome c,
located in the inner mitochondrial membrane that forms cristae. OXPHOS is fed by NADH at the level of
complex I and FADH2 at the level of complex II. Both reductant equivalents are mostly generated by the
Krebs (TCA) cycle which in turn is dependent on calcium and respiratory substrates such as carbohydrates
and lipids. As a byproduct of the respiratory chain, the superoxide radical (a ROS molecule) is generated,
which has been involved in aging and aging-associated diseases. In this way, a very simplistic OXPHOS
equation is:
Respiratory Substrates + Calcium = NADH + FADH2 = ATP + ROS + Heat Respiratory Substrates + Calcium
= NADH +FADH2 = ATP + ROS + Heat
The OXPHOS system is encoded by two independent genetic material: nuclear DNA and mitochondrial
DNA (mtDNA). The mtDNA is a plasmid DNA of 16 kb (circular, closed), doubled stranded and codes for 37
genes (13 OXPHOS protein-encoding mRNA, 2 rRNA and 22 tRNA). It is composed of a heavy strand and a
light strand based on the proportion of heavier nucleotides (adenine and guanine). It also has a large non-
coding region (around 1 kb) that contains the regulatory elements for the initiation and termination of the
transcription of both strands. The D-Loop (Displacement Loop) or control region, is within this non-coding
zone and contains the origin of replication of the heavy strand and high-variability zones called HVRI, HVR
II and HVR III where most of the polymorphisms associated with mtDNA occur. Each molecule of mtDNA
is packaged in structures called nucleoids made of proteins involved in their replication and transcription,
such as TFAM. Nucleoids are located in the mitochondrial matrix associated with the internal membrane
and the oxidative phosphorylation system (Brown et al., 2011).
Mitochondria have their own genome is maternally inherited and this configures each individual with their
own maternal surname - called a haplogroup. All mitochondrial haplogroups derive from a common
98
ancestor, from a black African woman, called “The Mitochondrial Eve” from 200,000 years ago (Cann et
al., 1987). At present, a total of 20 haplogroups are recognized, each with its respective subdivisions, which
were established by the acquisition of mutations and natural selection, according to the patterns of
migration and human settlement, and fixed in each of the different ethnic groups. This is how the
haplogroup J, D4a, D4b2b, D5 have been associated with longevity; the H5 and United Kingdom, at risk of
suffering from Al heimer’s disease; the U, with a predisposition to psychosis in bipolar disorders; and
others associated with resistance to altitude, with athletic performance, predisposition to diabetes, cancer
or cardiovascular diseases (Hiona, 2008; Lakatos et al., 2010; Nishigaki et al., 2010; Picard et al.,
2016; Chocron et al., 2019). Knowing that the haplogroup confers adaptive advantages and/or disease
propensity and, therefore, their identification can also become a tool of preventive diagnosis that can be
applied since the birth of a new being.
mtDNA is prone to oxidative or replicative damage. Each mitochondrion has 3 to 10 mtDNA copies which
undergo mutations by either the reactive oxygen species (ROS) generated as a byproduct of electron
transfer chain due to electron leak mainly from respiratory complex I and III (Brand et al., 2013) or
alterations in the mtDNA replication or repair. A higher mutation load in mtDNA means lower OXPHOS
functionality giving rise to more ROS and more mtDNA mutations in a vicious cycle. The coexistence of
wild type mtDNA and mutated mtDNA in the same mitochondrion is known as heteroplasmy. As the
percentage of mutant mtDNA rises above certain thresholds (60-70%), cellular homeostatic mechanisms
are disrupted, leading to mitochondrial dysfunction, cellular atrophy, and death, contributing to age-
related diseases. Heteroplasmy also leads to broad changes in gene expression that can shift abruptly as
the percentage of mutant mtDNA increases (Lakshmanan et al., 2018). To date, more than 400 mtDNA
mutations have been associated with human diseases (Li et al., 2010).
The mitochondrial life cycle involves three processes: mitochondrial dynamics, mitochondrial selective
autophagy (mitophagy) and mitochondrial biogenesis. Through MtDy, mitochondria share or dilute
99
components and also segregate dysfunctional mitochondrial units for degradation by mitophagy (Legros
et al., 2002; Liesa et al., 2009). While mitochondria are being degraded, mitochondrial biogenesis is turned
on to maintain mitochondrial population and homeostasis (Palikaras et al., 2015a; Sin et al., 2016). In
addition, mitochondrial biogenesis responds to energy demands and environmental factors such as cold
and hypoxia (Tohme et al., 2017; Gureev, 2019).
Mitochondrial Dynamics (MtDy) refers to the ability of two mitochondria to fuse each other (fusion) or
one mitochondrion to divide into two daughter mitochondria (fission). Mitochondrial morphology and size
are dependent on mitochondrial fusion and fission events. Importantly, changes in MtDy regulate
bioenergetics outputs including respiratory rate, energy expenditure and ATP synthesis as well as
apoptosis and the segregation and elimination of dysfunctional mitochondrial units by mitophagy (Bénard
et al., 2007; Sheridan and Martin, 2010; Westermann, 2012). Mitochondrial fission is dependent on the
protein DRP1 that has been recognized as a mitochondrial fission promoter (Smirnova et al., 2001). It is
located in the cytosol, but translocate to mitochondria through its binding to the mitochondrial receptor
proteins FIS1, MFF, MiD49, and MiD51 (Losón et al., 2013), which are all located in the mitochondrial outer
membrane (MOM). Mitochondrial fusion is dependent on MFN1 and MFN2, located in the MOM, and
OPA1, which is located in the mitochondrial inner membrane (Liesa et al., 2009). A fusion event is often
followed by a fission event generating one hyperpolarized and one depolarized daughter mitochondrion.
The depolarized unit loses OPA1, MFN1, and MFN2 and thus its ability to fuse, becoming a target for
degradation by mitophagy; while the hyperpolarized unit remains in the cytosol and can fuse again. In this
way, cells keep a more active, healthier and functional mitochondrial web (Twig et al., 2008).
Mitochondrial Selective Autophagy or Mitophagy is a type of macroautophagy that delivers mitochondria
to lysosomes for degradation. It is essential for the recycling and protective process of mitochondria to
maintain cellular homeostasis. Mitophagy initiates with the formation of a double-membrane phagophore
which elongates and closes to generate a mature, double-membrane autophagosome that engulfs
100
mitochondria. Then, autophagosomes are fused to lysosomes for content degradation (Youle and
Narendra, 2011). Mitophagy allows the removal of dysfunctional, depolarized and/or damaged
mitochondria for mitochondrial turnover, ROS management, and programmed mitochondrial clearance,
as seen in erythropoiesis (Schweers et al., 2007), lens differentiation (Bassnett, 2002), and mature T-
lymphocytes (Pua et al., 2009). Mitophagy is also essential for embryonic development by removal of
paternal sperm mitochondria from the fertilized eggs, leaving only the maternal ones (Rojansky et al.,
2016; Pickles et al., 2018). In this regard, cells display basal mitophagy, stress-induced mitophagy and
programmed mitophagy, being the cardiac muscle one of the tissues with enhanced basal mitophagy
(Palikaras et al., 2018).
The process of mitophagy requires two systems: The autophagic core machinery, which is common to all
types of autophagy; and the mitochondrial receptors and adaptors, a specific set of mitochondrial and/or
cytosolic proteins needed for the assembly of mitochondria with the autophagic core machinery. The
Autophagic Core Machinery is composed of ATG proteins that are found from yeast to mammals,
indicating that autophagy is an evolutionarily conserved process. Phagophore initiation and formation is
dependent on the ATG16L1 complex, made of ATG16L1, ATG5, and ATG12 which localize to the isolation
membrane and dissociates from it upon the completion of autophagosome formation; and ATG8/LC3,
which upon the formation of autophagosome, remains in on both sides—inside and outside of the double-
membrane structure. While in yeast there is a single ATG8 protein, in mammals there are seven orthologs
of ATG8 named LC3A, LC3B, LC3C, GABARAP, GABARAPL1, GABARAPL2, GABARAPL3 (thereafter they will
be called LC3) suggesting a complex diversification of their function. LC3/ATG8 can be found in two
isoforms: LC3-I and LC3-II. LC3-I is the inactive form that is constitutively expressed and found in the
cytosol. Upon induction of autophagy, LC3-I is converted to LC3-II by site-specific proteolysis and lipidation
near to the C-terminus to generate the autophagosome. LC3 is considered a reliable marker for on-going
autophagy (Ashrafi and Schwarz, 2013; Lee and Lee, 2016).
101
The Mitochondrial Receptors interact directly or indirectly through adaptors, with LC3 via the LC3-
interacting Region (LIR), a tetrapeptide sequence W/YXXL/I. Independent and non-redundant mitophagy
pathways have been defined according to the mitochondrial receptors and adaptors that are involved in
it. Those are (i) Ubiquitin-Dependent Mitophagy, with the PINK1-PARKIN protein axis. PINK1 (PTEN-
induced putative protein kinase 1) is a mitochondrial protein whose import is dependent on mitochondrial
membrane potential. Once imported, PINK1 is degraded by mitochondrial proteases. However, if
mitochondria become depolarized, PINK1 is no longer imported and accumulates on the mitochondrial
surface to phosphorylate ubiquitin and Mfn2, allowing the recruitment of the E3 ubiquitin ligase PARKIN
from the cytosol. PARKIN mediates a hyper-ubiquitination of the mitochondrial outer membrane proteins,
which are recognized by ubiquitin-binding adaptors such as P62/SQSTM1, OPTN, TAX1BP1, NDP52, NBR1,
TOLLIP and HDAC6. These adaptor proteins interact and bind LC3 by means of their LIR domain. Of note,
P62/SQSTM1 has been also used as a reliable indicator of the mitophagic flux, because under mitophagic
defects it accumulates in response to stress stimuli (Xu et al., 2015; Yamaguchi et al., 2016). This
PINK/PARKIN mitophagy is the canonical pathway for mitochondrial turnover and mitochondrial quality
control. (ii) Ubiquitin-Independent Mitophagy is dependent on mitochondrial receptors interacting
directly with LC3 through the LIR domain. Several and diverse mitochondrial LC3 receptors have been
discovered, which also account for the complexity of mitophagy. NIX, BNIP3 (Zhang and Ney, 2009), FUNDC
(Liu et al., 2012), FKBP8 (Bhujabal et al., 2017; Yoo et al., 2020), NLRX1 (Zhang et al., 2019) are located in
the MOM; Prohibitins (Wei et al., 2017), in the MIM and, MsrB2 in the mitochondrial matrix (Lee et al.,
2019). Not only proteins may bind LC3, but also the membrane phospholipid cardiolipin (Chu et al., 2013)
mainly found in the MIM. NIX protein is highly expressed in erythroid precursors and is needed for
erythropoiesis (Novak et al., 2009). Also, NIX, BNIP3 and FUNDC trigger mitophagy in response to hypoxia
(Sowter et al., 2001; Bellot et al., 2009; Liu et al., 2012), Prohibitins, MsrB2 and cardiolipin could be
accessible to cytosolic proteins if MOM or MIM are disrupted.
102
Mitochondrial dynamics and the mitophagy pathways with their mitochondrial receptors, adaptors and
regulator proteins that localize to mitochondria, seem to have not redundant functions and might act
cooperatively, providing multiple mechanisms to clear out damaged mitochondria under different
conditions. In fact, the mitophagy protein FUNDC1 has been shown to interact with the MtDy proteins
DRP1 or OPA1 to coordinate mitochondrial fission or fusion and mitophagy. Upon mitochondrial stress,
FUNDC1-OPA1 interaction is dismissed, promoting DRP1 translocation to mitochondria for fission and a
new association FUNDC1-DRP1 for mitophagy. This reveals the complexity and importance that MtDy and
Mitophagy play for cellular physiology.
Mitochondrial Biogenesis: When mitochondria are eliminated by mitophagy or when more mitochondria
are needed to meet energy demands, the mitochondrial biogenesis program is started. Interestingly,
mitochondrial biogenesis involves four independent processes: mtDNA replication, mtDNA transcription,
protein translation and mitochondrial membrane biogenesis, which are not necessarily synchronized
adding more complexity and regulation capabilities to mitochondria. Unfortunately, the mechanisms
controlling these three processes are not fully understood or discovered. In fish acclimated to cold, it was
shown that mitochondria are able to remodel differentially according to ATP demands, oxygen demands,
or both. Under oxygen demands, membrane biogenesis is upregulated increasing the mitochondrial
volume/mass but not OXPHOS protein densities. Having an extra membrane improves oxygen diffusion
since oxygen diffuses easily and faster in lipidic than in an aqueous environment. Under ATP demand,
mitochondria increase the OXPHOS densities without increasing their volume. In the case of ATP and
oxygen demands, both protein density and membrane are increased (O’Brien, 2010). On the other hand,
it has been reported that mtDNA replication is controlled by oxidative damage in the D-loop region which
favors TFAM (a mitochondrial transcription factor) binding to mtDNA for replication. This oxidative
damage may be caused by hypoxia, linking the lack of oxygen to mtDNA replication (Pastukh et al., 2016).
103
Mitochondria in Cardiac Cells
The aforementioned mitochondrial features for OXPHOS and mitochondrial life cycle are general for all
mitochondria. But what is distinctive for heart mitochondria? (Table 1). Heart striated cells are special and
different from other cell types. They have a particular shape and contract throughout our lives from early
development until we die. Heart cells demand an enormous amount of energy and then mitochondria
must do the work. Mitochondria in cardiac cells have been subdivided into interfibrillar, subsarcolemmal
and perinuclear mitochondria, according to their distribution in the cell; and are tightly packed between
myofibrils with almost no chance of free or flexible movement. However, Hendgen-Cotta et al.
(2018) claimed that all cardiac mitochondria in mice are interconnected and, therefore, they are not
different populations. Cardiac mitochondria seen under transmission electron microscopy look well
organized to each other and actually mitochondrial cristae seem to be aligned between two adjacent
mitochondria. Three-dimensional reconstruction of murine heart mitochondria has shown that they have
an oval but irregular shape. Changes in mitochondrial morphology have been associated with metabolic
and bioenergetic reprogramming. The heart is not the exception since most of the cardiopathies are
associated with alteration in mitochondrial morphology. Fragmented, swollen, reduced mitochondrial
number, reduced cristae densities are the main morphological features of human heart failure which are
nicely tabulated in Daghistani et al. (2018). Interestingly, different cardiac pathologies have shown distinct
morphological mitochondria and cristae patterns. Heart mitochondrial cristae are very long, mostly going
all throughout the mitochondrial matrix. In comparison, cristae length in non-cardiac mitochondria is
about 1/3-1/4 of mitochondrial width. Cristae hold the OXPHOS system and considering the length of
cristae and the electrodense nature of mitochondrial matrix seen by TEM (in accordance with condense
mitochondrial state and opposed to orthodox one), it is possible to suggest that cardiac mitochondria are
fully packed with OXPHOS having a highly oxidative metabolism. In fact, nice work from Williams et al.
(2018) analyzed the mitochondrial proteome from 5 different mouse tissues and showed that in heart
tissues half of the total proteome (55%) correspond to mitochondrial proteins, which was higher than
104
brain, liver, skeletal muscle and brown adipose tissue. When looking at OXPHOS protein expression,
cardiac mitochondria displayed the highest OXPHOS protein density for both all ETC respiratory complexes
and the ATP synthase as compared with other tissues.
105
Table 1. Summary of main characteristics found in mitochondria from non-cardiac cells, cardiomyocytes and aged cardiomyocytes.
106
The super oxidative metabolism of cardiac cells is explained by the use of triacylglycerols and fatty acids
as the main oxidative fuels, followed by glucose and other carbohydrates, which enter to the TCA cycle-
OXPHOS to produce 80-90% of total ATP. The relative contribution of fat and carbohydrate to energy
provision for the heart is 70% and 30%, respectively (Stoll et al., 2018) (Taegtmeyer et al., 2016).
Furthermore, OXPHOS in cardiac mitochondria is equipped with specific subunit isoforms for the
cytochrome c oxidase (complex IV) to make the ETC more efficient (Sinkler et al., 2017). The assembly of
respiratory complexes in supercomplexes or respirosomes, reported for bovine, ovine and porcine hearts
(Letts et al., 2016; Sousa et al., 2016) plus post-translational modifications in respiratory complexes such
as O-GlcNAcylation, the ability to increase calcium uptake, and de-sensitize the opening of the mPTP can
also improve OXPHOS efficiency (Ma et al., 2015; Stoll et al., 2018). OXPHOS efficiency is not exclusively
dependent on OXPHOS proteins but also on other proteins involved in the bioenergetic capacity of cardiac
cells. This is the case of the Adenine Nucleotide Transporter (ANT) protein, which is nuclear-encoded and
allows the exchange of ATP by ADP through the inner mitochondrial membrane. ANT KO mouse display
impaired activity of complex I, increase in ROS and oxidative damage. They also display a reduction in OPA1
leading to a fragmented mitochondrial web and sensitization to the opening of mPTP which has been
associated with cardiopathies (Strauss et al., 2013).
Heart mitochondria have an active mitochondrial life cycle. Albeit to be highly packed with almost no
freedom for movement, mitochondrial dynamics, mitophagy and biogenesis are critical for heart function
(Eisner et al., 2017; Wu et al., 2019). Heart and skeletal muscle mitochondria feature specialized structures
called nanotunnels that allow component mixing between mitochondria which resemble a fusion event
(Huang et al., 2013). Disruption of MtDy has drastic consequences for cell physiology which are mainly
associated with the accumulation of dysfunctional and ROS-generating mitochondria and heart failure. In
humans, mutations in MFN2 and OPA1 cause Charcot–Marie–Tooth disease type 2A and dominant optic
atrophy respectively. Also, complete loss of mitochondrial fusion results in a dramatic decrease in mtDNA
107
content, loss of membrane potential and reduced respiratory chain function in both cultured cells and
tissues. After conditionally knocking out Mfn1 and Mfn2 genes in adult rats, the mitochondrial fission in
cardiomyocytes increased leading to abnormal cellular respiration, eventually leading to progressive
dilated cardiomyopathy. Excessive mitochondrial fission has been associated with decreased
mitochondrial function and increased ROS (Jheng et al., 2011; Haileselassie et al., 2019). FIS1 up-regulation
decreased cellular ATP levels in anoxic cardiomyocytes (Wang et al., 2012). On the other hand, an excessive
fusion is also deleterious for cardiac cells. MFF mutant mice died at 13 weeks due to heart failure caused
by severe dilated cardiomyopathy. Mutant tissues showed decreased mitochondrial density and
respiratory chain activity, and increased mitochondria size (García-Palmer, 2008; Zhou et al., 2017; Zhou
and Tian, 2018). A thoughtful review on mitochondrial dynamics and cardiac biology is found in Vasquez-
Trincado et al. (2016).
Although the role and the importance of the proper balance of MtDy for cell physiology are well accepted,
there is no clarity about the signaling mechanisms that might be associated with heart failure. In our
laboratory studying the role of MtDy in erythropoiesis, it was discovered a link between the mPTP and
MtDy to control cell differentiation in erythropoiesis (Gonzalez-Ibanez et al., 2020). Interestingly, the role
of the mPTP in cellular differentiation has been reported in the past for early embryonic cardiomyocytes,
where a frequent opening of the mPTP is needed to maintain an immature mitochondrial morphology with
low oxidative capacity. On the other hand, the closure of the pore was required for proper differentiation
into cardiac muscle cells (Hom et al., 2011; Folmes et al., 2012). One of the triggers of mPTP opening is an
elevated Ca++ concentration in the mitochondrial matrix (Bernardi and Di Lisa, 2015) and the up-regulation
of FIS-1 by means of its interaction with the ER protein BAP31 might favor calcium entrance. In fact,
mitochondrial calcium overload is a key determinant in heart failure (Iwasawa et al., 2011; Santulli et al.,
2015).
108
Mitophagy is the cellular process to dismiss dysfunctional mitochondria and secure ATP demand for heart
cells. As it was discussed before, many pathways and proteins are implicated in mitophagy which responds
to different stimuli like ROS, hypoxia and mitochondrial depolarization. The great variability and diversity
of proteins and pathways controlling mitochondria elimination reflect the importance and complexity of
mitophagy for cell function that we are still far to fully understand. In cardiac cells, it is clear that mitophagy
plays a major role in keeping healthy mitochondria and many or all known mitophagy pathways have been
shown to play a critical role. In fact, it was recently published a novel and astonishing mechanism in cardiac
cells to get rid of dysfunctional mitochondria, especially under cardiac stress. Dysfunctional mitochondria
are expelled out from cardiomyocytes in special vesicles called exophers which are made by means of the
cardiac mitophagic machinery. These expelled mitochondria are engulfed by macrophages which are
resident in the cardiac tissue. Blocking the mitophagy machinery, reduction of macrophages or ablation of
the specific exopher receptor caused and accumulation of damaged mitochondria and dysfunction in the
heart (Nicolás-Ávila et al., 2020). In general, disruption of mitophagy is associated with heart failure and
cardiopathies Deep details on mitophagy and cardiovascular diseases can be found in Morciano et al.
(2020). On the other hand, induction of mitophagy, by any means (exercise, food, specific drugs or
hypothermia), has shown a protective effect on many cardiovascular diseases.
Cardiac Mitochondria in Aging
Much of the cardiac literature describes a relationship between different cardiopathies and mitochondrial
dysfunction. Daghistani et al. (2018), Chaanine (2019) showed that mitochondria changed their
morphology from elongated to fragmented in heart failures. Lin and Kerkelä (2020), that there is a
reduction in ETC and bioenergetic capacity in cardiomyopathies; and Vasquez-Trincado et al.
(2016), Bravo-San Pedro et al. (2017) that mitochondrial dynamics and mitophagy are altered or reduced
in cardiovascular diseases. In the end, most of those pathologies are related to an exacerbated amount of
ROS, dysregulation of calcium homeostasis and the aperture of the mPTP. Mitochondria are constantly
109
adapting bioenergetics, metabolism and signaling to allow cell function and survival. Thus, aged
mitochondria (Table 1), with altered ROS and calcium homeostasis and dysregulation of the mPTP leading
to ATP crisis, are one of the main causes of heart failure (Brand et al., 2013). Recently, the ANT protein
was shown to increase mitochondrial proton leak - mitoflashes - in aged cardiomyocytes. This pathological
proton leak is associated with inefficient ATP synthesis and increased electron flux and oxygen
consumption, increasing ROS production and mPTP sensitivity. Interestingly, the treatment with the drug
SS-31, a tetrapeptide that binds to cardiolipin-containing membranes and improves membrane stability
and cristae curvatures (Birk et al., 2014), arrested proton leak, restored mitochondrial functionality,
reduced ROS production and more surprisingly rejuvenated old cardiomyocytes (Zhang et al., 2020).
Cardiac aging is characterized by a decrease in the number of mitochondria in the heart and a reduction
in the area of the inner mitochondrial membrane implicating OXPHOS at the center of cardiac
mitochondrial metabolism deficiency during aging. Respiratory complex III and IV deficiency in aging
caused a decreased efficiency of OXPHOS, affecting also the number and mass of interfibrillar myofibrils
(Stoll et al., 2018; Lin and Kerkelä, 2020).
The main driver of mitochondrial dysfunction in aging is the mtDNA, which progressively accumulates
mutations and reduces its copy number as humans are getting old. In fact, mtDNA mutations cause aging,
heart failure and many other aging-associated diseases. In 2004, it was published in Nature journal the
“mutator mouse” whose mitochondrial DNA polymerase (POLG) had a dysfunctional proofreading domain
which introduced random point mutations in the mtDNA, increasing mtDNA heteroplasmy (Trifunovic et
al., 2004). The “mutator mouse” at the early age of months, presented all the symptoms of old age such
as blindness, deafness, alopecia, muscular atrophy, anemia, hump development and heart hypertrophy.
The creation of this mutator mouse is an irrefutable proof that mtDNA mutations are a cause of aging and
cardiovascular diseases. mtDNA mutations lead to OXPHOS inefficiency and then energy shortages
especially in the tissues with the highest energy demands such as the heart, muscle and brain, which are
110
the most vulnerable. By 40 weeks of age, mutator mice presented an enlarged volume of the left ventricle
along with an increase in weight in relation to body weight. Histochemical analysis of the mutator mouse’s
heart revealed a mosaic pattern with cytochrome c oxidase deficiency in some cardiomyocytes, which also
occurs in the aged human hearts. TEM analysis of mitochondria ultrastructure confirmed the accumulation
of fragmented, abnormal mitochondria. In addition, a decreased ATP production rate was noted
(Trifunovic et al., 2004).
Another form of mtDNA damage during aging in humans is large mtDNA deletions. Mitochondrial diseases
are usually associated with 5kb deletions of mtDNA which have been shown to accumulate in the human’s
brain, muscle and heart (Chocron et al., 2019). Mutant mtDNA co-exists with wild type mtDNA giving rise
to mtDNA heteroplasmy affecting the proper function of OXPHOS in a vicious cycle. Some pathogenic
mtDNA mutations and a reduction in their copy number in cardiac cells have been specifically associated
with impaired cardiac function and cardiac diseases and then, mtDNA mutations and copy number can be
used as potential biomarkers of heart diseases (Ashar et al., 2017; Bray and Ballinger, 2017; Elosua,
2018; Galera-Monge et al., 2019). In fact, Elosua (2018) is emphatic when claiming that “mtDNA has been
largely forgotten in cardiovascular research.”
The increase in mtDNA heteroplasmy not only affects mitochondrial function but also affects and
influences nuclear genome mutations and the severity of cardiovascular diseases. This is also proof of
mitochondria acting as a powerful signaling platform regulating both transcriptional and epigenetic
nuclear gene expression. This mitochondria-nucleus retrograde communication acts in a synergistic way
to produce cardiomyopathies or increase their severity. McManus et al. (2019) showed that ablation of
ANT (the mitochondrial Adenine Nucleotide Transporter) in nuclear DNA is associated with cardiopathies
where OXPHOS, MtDy and mitochondrial morphology are affected. However, in the presence of mtDNA
mutations, cardiopathies are much more severe. mtDNA-related mitochondrial genetic diseases are
associated with the development of cardiomyopathies in 40% approximately (Bates et al., 2012). Along
111
with mtDNA mutations, the mtDNA haplogroups are also predictors of both lifespan and risk of several
age diseases. Dr. Wallace’s group showed the type of mitochondrial haplogroups influences the severity
of cardiovascular diseases with haplogroups U and H being the most affected (Strauss et al., 2013). On the
other hand, the haplogroups J and T are associated with a reduced risk of cardiovascular disease (Veronese
et al., 2019).
Reduction in heteroplasmy and restoration of mtDNA copy number is achieved by the coupling of OXPHOS
with the Mitochondrial Life Cycle. It has been reported damaged DNA invokes mitophagy (Dan et al., 2020)
and that adult post-mitotic tissue can eliminate mitochondria carrying damaged mtDNA by mitophagy
which help to preserve cellular and mitochondrial function, suggesting that removal of the mutant mtDNA
is protective for cells (Kandul et al., 2016). Mitochondrial turnover decreases with age, so there is growing
interest in enhancing the pathways of mitophagy by discovering new pharmacological targets or cell
mechanisms to counteract mitochondrial heteroplasmy (Diot et al., 2016). The aggravation of cardiac aging
together with the accumulation of damaged mitochondria in cells can be caused by impaired and deficient
mitophagy that results in increased heteroplasmy and altered mitochondrial metabolism (Quan et al.,
2020). In fact, many of the pathways that improve health and extend longevity in various organisms all
converge on mitophagy which is dependent on mitochondrial biogenesis and dynamics. A decrease in
mitochondrial fission, functional mitochondria and NIX and FUNDC-1 receptor-mediated mitophagy may
result from mtDNA mutations associated with aging (Lampert et al., 2019; Wu et al., 2019).
Furthermore, Woodall et al. (2019) examined the role and expression levels of Parkin on accelerated
cardiac failure in the mtDNA POLG mutator mice. It was observed that Parkin decreases in the mutator
mouse’s heart with age. However, the restoration of Parkin level by means of its overexpression did not
rescue the cardiac hypertrophy in the POLG mouse. Besides, deletion of parkin did not worsen heart
disease. The authors claimed that mitochondria were not altered in their bioenergetics and that their
function did not decline with age. This author’s interpretation is controversial since they observed a clear
112
and significant decrease in complex II and IV protein levels, and TEM images showed altered cristae
morphology in mutant mice with age, which might be indicative of mitochondrial dysfunction. An
interesting discovery in the POLG mutant mouse’s heart is the upregulation of the receptor-mediated
mitophagy genes and the appearance of larger mitochondria, which is in agreement with the upregulation
of NIX protein myocardial hypertrophy (Yussman et al., 2002). This larger mitochondrial phenotype might
be due, among other causes, to a decreased production and expulsion of exospheres that are dependent
on the autophagic machinery (Nicolás-Ávila et al., 2020). However, the reduction of parkin in aging may
be compensated by the upregulation of MUL1, a ubiquitin E3 ligase that is involved in regulating
mitochondrial dynamics by promoting MFN2 degradation and leading to mitochondrial fragmentation and
Parkin independent-mitophagy (Yun et al., 2014; Cai and Jeong, 2020). In cardiac cells, upregulation of
MUL1 has been shown to fragment mitochondria and alter cristae structure, reduce mitochondrial
membrane potential, promote cytochrome c release and sensitize mPTP, making it a potential mechanism
of cell death and heart failure in aging (Yang et al., 2016; Wang et al., 2020).
Stressed mitochondria have been shown to release mtDNA into cytosol which is recognized as a Damage-
Associated Mitochondrial Patterns (DAMPs), that trigger an inflammatory response. This pro-
inflammatory environment may activate fibroblast proliferation and excessive production of extracellular
matrix proteins which correlates with cardiomyopathies (West et al., 2011; Lin and Kerkelä, 2020). These
alterations at molecular levels are associated with cellular changes such as hypertrophy, fibrosis,
accumulation of misfolded proteins, loss of cardiac cells, extracellular matrix remodeling and amyloid
deposition and structural changes in the myocardium like left ventricle hypertrophy and left auricle
hypertrophy, which causes diastolic dysfunction (Steenman and Lande, 2017; Liang and Gustafsson, 2020).
It has also been reported that mtDNA and whole mitochondria are released into bloodstream which offers
a new biomarker of mitochondrial function and stress. mtDNA may travel naked (circulating cell-free
mtDNA) which is recognized by immune cells to initiate the immune response, or they can go inside
113
extracellular vesicles (EVs). Circulating EVs have been described as a novel mechanism of intercellular
communication. In aging, Lazo et al. (2020) showed that mtDNA in EVs is diminished as compared with
young people and even more, EVs containing old and damaged mtDNA affects mitochondrial bioenergetic
in other cells and tissues. Picca et al. (2019) pointed out that EVs allow the elimination of dysfunctional or
damage mitochondrial components; and Freeman et al. (2018) proved that EV secretion is dependent on
autophagy. All these antecedents support the hypothesis that a decline in mtDNA containing EVs is due to
a defect in mitophagy with aging.
Linking OXPHOS, Mitochondrial Life Cycle and mtDNA: Signaling Pathways
The master regulator of mitochondrial biogenesis is the protein PGC-1α which is a transcriptional co-
activator that induces nuclear- and mitochondrial- encoded gene transcription coordinating both
genomes. PGC-1α can be stimulated/induced by physical exercise, cold and hypoxia. The signaling
pathways to activate PGC-1α are diverse and well described (see Gureev, 2019; Oka et al., 2020). In
mammals, an increase in the AMP/ATP ratio given by an overwhelming ATP demand or reduction in ATP
synthesis activates AMPK (AMP protein kinase) which in turn will activate PGC-1α and inhibit mTOR
(mechanistic target of rapamycin kinase). In this way, AMPK activation stimulates mitochondrial biogenesis
and mitophagy (Kupr and Handschin, 2015). As a transcriptional co-activator, PGC-1α does not bind
directly to DNA promoters but interacts and activates the transcription factors Nuclear Respiratory Factor
1 and 2 (NRF1 and NRF2), Estrogen-Related Receptor (ERR) and Peroxisome Proliferator Activated
Receptor (PPAR). In general, NRF2 induces nuclear-encoded OXPHOS protein expression and NRF1 induces
the expression of mitochondrial transcription factors TFAM and TFB to initiate mtDNA replication and
transcription. ERR and PPAR are involved in mitochondrial biogenesis and dynamics, Krebs’ cycle and
mitochondrial fatty acid oxidation expression genes. Furthermore, the increase in NAD + /NADH ratio as a
result of the electron transport chain induces SIRT1 that also stimulates PGC-1α.
114
An essential component in mitochondrial signaling is ROS. In addition, ROS regulates mitochondrial
dynamics by promoting mitochondrial fission and disrupting mitochondrial fusion, decreasing the OPA1
active isoform and degrading MFN1/2; and mitophagy. In cardiac myocytes, increased ROS induces a non-
canonical function of the human Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT), which reversibly translocate
from the nucleus to the mitochondria to bind and protect mtDNA, reduce ROS production and increase
OXPHOS efficiency (Haendeler et al., 2009; Ait-Aissa et al., 2019). Besides, the up-regulation of TERT is
dependent on PGC-1α (Zhang et al., 2018) and positively regulates PINK1 function and stabilizes its
mitochondrial localization to promote mitophagy (Shin and Chung, 2020). PINK1 other than
phosphorylating ubiquitin and Parkin to initiate mitophagy, phosphorylates PARIS and leads to its Parkin
ubiquitination and elimination. Therefore, when the PINK/Parkin axis is inhibited, PARIS accumulates and
represses PGC-1α (Lee et al., 2017); and the knockdown of PARIS with CRISPR/Cas9 regains mitochondrial
biogenesis (Kumar et al., 2020).
There is another parallel and independent pathway in controlling mitochondrial biogenesis given by the
transcription factor Nuclear Erythroid-Related Factor 2 (NFE2L2. ∗It is also named NRF2, but in this work
will be called NFE2L2 to avoid confusion). It has been described that NFE2L2 can translocate to the nucleus
under an increase in ROS, specifically H2O2 and binds to the antioxidant response elements (ARE) in the
promotor of NRF1 to induce TFAM. In nematodes, it was found that the orthologous protein of human
NIX/BNIP3, named DCT-1 that works together with PINK and PRD (Parkin orthologous) is controlled by
SKN-1, which is also linked to mtDNA replication. SKN-1 deficient nematodes display reduced mitophagy
and reduced mitochondrial biogenesis. Even stimulation of mitophagy does not work in SKN-1 KO cells
(Palikaras et al., 2015b). SKN-1 is a sensor of oxidative stress generated by defective mitochondria and is
required for the expression of several genes related to mitochondrial biogenesis. SKN-1 is the orthologous
of human NFE2L2 (Palikaras et al., 2015b). In mammals, Ivankovic et al. (2016) established the relationship
among mitochondrial damage, NFE2L2 induction, P62, mitochondrial biogenesis (mtDNA replication) and
115
protection against oxidative stress, in addition to lysosomal biogenesis to support the formation and
degradation of autolysosomes. Increased autophagy involves an interaction between the autophagy
adaptor p62/SQSTM1 and KEAP1, the cytosolic inhibitor of NFE2L2 allowing the accumulation of NFE2L2
in the nucleus, and then increased expression of nuclear-encoded mitochondrial genes needed for
mitochondrial biogenesis and antioxidant response (Ichimura et al., 2013; Katsuragi et al., 2016).
In aging, it has been widely reported a decreased mitophagy (Wu et al., 2019; Bakula and Scheibye-
Knudsen, 2020) commanded by a reduction of Parkin protein expression and the concomitant
upregulation of the Nuclear Receptor Corepressor 1 (NCoR1) and its homologous protein SMRT, which
counteracts the transcriptional control commanded by the SIRT1-AMPK/PGC1-alpha axis. In addition,
NCoR1 will downregulate lipogenic and antioxidant genes favoring the metabolic switch from lipid
oxidation to glucose oxidation and diminishing the antioxidant capacity of cells. NCoR1 KO animal models
have greater mitochondrial biogenesis, mitophagy and lifespan (Perez-Schindler et al., 2012; Fan et al.,
2013; Liu et al., 2013; Ou-Yang et al., 2018). The stabilization of NCoR1 in aging is because this corepressor
is normally bound to LC3 family protein and degraded by mitophagy. Arrested mitophagy will cause its
accumulation and downstream effects (Saito et al., 2019). Despite these antecedents, the role of NCoR1
in cardiac aging is still controversial and needs more research. Li et al. (2019a) suggested that NCoR1 has
a protective cardiac effect by suppressing cardiac hypertrophy and Wang et al. (2018) have shown that
NCoR1 is downregulated in old mouse hearts. In this regard, NCoR1 is not the only transcriptional co-
repressor involved in aging but also there is SMRT and RIP140 that might play a relevant role (Fan et al.,
2013; Liu et al., 2013).
Proposed Model of Cardiac Aging
The core of our model and the main driver of aging is mtDNA heteroplasmy (Figure 2). In young people
with a healthy heart and cardiomyocytes, OXPHOS efficiency is high and the mtDNA mutation level, is low
(mutated mtDNA is represented with one or more “X” on the double-stranded circular DNA). Under this
116
scenario operates the mitochondrial life cycle to dilute mutated copies of mtDNA by means of MtDy and
mitophagy. This is what it is called in our model The Virtuous Cycle. One of the main controllers of
mitophagy is the PINK/PARKIN/P62 axis. When active, two repressors of mitochondrial biogenesis, PARIS
and KEAP1 are inhibited and degraded, unleashing the transcriptional coactivator PGC-1α and the
transcription factor NFE2L2 which are also activated by AMPK -via increased AMP/ATP ratio- and ROS
respectively. AMPK will also inhibit the mTOR pathway to induce mitophagy. In addition, increased
NAD+/NADH activates SIRT1 which also induces PGC-1α for mitochondrial biogenesis. Once the
autophagosomes are formed, they are eliminated via their fusion with lysosomes or expelled out of the
cell as exospheres, to be engulfed by macrophages. The latter is a new mechanism described only for
cardiomyocytes.
117
Figure 2. Proposed Model of Cardiac Aging. The core of our model and the main driver of aging is mtDNA heteroplasmy. In aging, two vicious cycles were defined. Vicious cycle No1 will progressively increase the
118
level of mtDNA heteroplasmy and decrease OXPHOS efficiency at the point to affect mitophagy and set the onset of Vicious cycle No2 that will progressively inhibit mitochondrial biogenesis and antioxidant response due to inhibition of PGC-1α and stimulation and upregulation of NCoR1. As a result, dysfunctional mitochondria will accumulate, increasing the number of mitoflashes and pathological ROS to finally trigger the mPTP opening and the release of DAMPs to initiate an inflammatory cell response and an apoptotic/necrotic stimulus. Furthermore, a metabolic switch from fatty acid oxidation to glucose oxidation will occur. Altogether, these events lead to cardiovascular diseases and cardiac failure. On the other hand, in young people, a low level of mtDNA heteroplasmy will keep the efficiency of the OXPHOS system which will maintain low NAD + /NADH and AMP/ATP ratios and a physiological amount of ROS. These conditions allow the Virtuous Cycle where MtDy will segregate dysfunctional mitochondrial units for degradation by mitophagy and will activate PGC-1α and NFE2L2 for mitochondrial biogenesis. Of note, cardiac cells are able to expel out mitochondria in vesicles called exospheres that are degraded by surrounding macrophages. In this model, we hypothesized that exosphere release, which is dependent on the autophagic machinery, is decreased in aging. Also, it is not clear yet whether in cardiac aging the protein MUL1 is involved in mitophagy, but it has been shown to be upregulated under cardiac damage. Along with NCoR1, another transcriptional corepressor like SMRT has been shown to be involved in aging.
119
As mtDNA heteroplasmy exceeds 60%, mtDNA replication and transcription will be affected, reducing
mtDNA copy number and proteins needed for respiratory chain assembly, leading to mitochondrial
dysfunction and disruption of mitophagy. As a result, dysfunctional mitochondria will accumulate within
cells, and cellular bioenergetics needs will not be satisfied causing an ATP-crisis, cell atrophy or death,
ultimately leading to aging and aging-associated diseases. In fact, aging-associated diseases such as cancer,
diabetes, heart disease, muscle weakness or atrophy, Al heimer’s disease and Parkinson’s disease among
others, are mainly due to a loss of mtDNA integrity and a failure in the mitochondrial life cycle (biogenesis,
MtDy, mitophagy). To date, more than 400 mtDNA mutations, as well as a reduction in mtDNA copy
number and a decrease in mitophagy, have been associated with human diseases (Tuppen et al., 2010; Li
et al., 2019b). mtDNA mutations and heteroplasmy will affect the performance of the OXPHOS system
reducing its efficiency due to the progressive loss of respiratory complex assembly and coupling,
generating an abnormal amount of ROS. This ROS will produce more mtDNA mutations, increasing
progressively the level of mtDNA heteroplasmy. This process corresponds to the Vicious Cycle No1 in our
model. ROS not only affect mtDNA but also proteins and lipids. Thus, the mtDNA replication machinery, as
well as membrane proteins and membrane phospholipids, including cardiolipin will be damaged. In this
regard, ANT protein has been associated with increased mitoflash generation (transient mitochondrial
depolarization), which uncouples ATP synthesis from the electron transport chain and ROS generation.
Under these conditions, the mPTP is prone to open, collapse mitochondrial function, release mtDNA and
other DAMPs, and trigger an inflammatory response and cell death. In parallel, an excessive amount of
ROS inhibits the PINK/PARKIN/P62 axis meaning that PARIS and KEAP1 will be active and then NFE2L2 and
PGC-1α inactive. Then, mitochondrial biogenesis will be reduced. In addition, inhibition of the
PINK/PARKIN/P62 axis will activate NCoR1 which in turn blocks PGC-1α and mitochondrial biogenesis. This
is called the vicious cycle No2. As mitophagy gets decreased, it is expected that exosphere release is also
affected, accumulating in the cytosol many dysfunctional mitochondria prone to release more DAMPs and
to induce cell death. Another important feature, in aging, is the metabolic switch from fatty acid oxidation
120
to glucose oxidation, given the inhibition of NFE2L2 and PGC-1α which upregulates the fatty acid oxidation
and antioxidant genes; and the activation of NCoR1 which down-regulates the lipogenic and ketogenic
genes, and also the antioxidant genes. All these metabolic changes occurring in aging find their onset in
the heteroplasmic mtDNA; and the final consequence of this, is having dysfunctional and hypertrophic
cardiomyocytes leading to heart failure.
Mitochondrial Therapies for a Healthy Heart
Decreased heteroplasmy, increased mtDNA copy number, increased mitochondrial biogenesis and
mitophagy have been shown to cause rejuvenation. Old mice that had a substantial loss of mtDNA copy
number and reduced mtDNA gene expression showed improved memory performance after mtDNA
replication and transcription were stimulated. The transgenic mouse called “mtDNA depleter” evidenced
skin wrinkles and hair loss, associated with reduced copies of mtDNA. However, by restoring mtDNA
copies, the same animal rejuvenated and returned to normal. In transgenic mice expressing PGC-1α under
the MKC promoter, overexpression of PGC-1α promoted mitochondrial biogenesis in skeletal and cardiac
muscle from fetal life onward, ameliorated aging phenotypes and prevented aging-associated
cardiomyopathies in adults (Yuan et al., 2016). Regarding mitophagy, pharmaceutic compounds, calorie
restriction or genetic manipulation have been proven to augment lifespan in different organisms via
increased mitophagy. Upregulation of systemic ATG5 expression, a protein involved in autophagosome
formation, in transgenic mice have increased mitophagy resulting in improved health, longer life spans
and less weight gain with aging (Pyo et al., 2019). Besides, enhanced mitophagy and less fibrosis during
aging were found in those mouse hearts. This was also established by the Levine group and others that
constitutive activation of the autophagic gene Beclin1 enhanced autophagy resulting in remarkable health
improvement and a longer lifespan in mice. Additionally, those mutant mice when aged, have less
interstitial fibrosis and cardiac hypertrophy, meaning that maintenance of autophagy in the heart
postpones or avoids cardiac aging and protects the heart during sepsis (Fernández et al., 2018; Sun et al.,
121
2018). Even in injured cardiac tissue, mitophagy stimulation improves cellular function via a decrease in
ROS and apoptosis, and mitochondrial function improvement (Torrealba et al., 2017). After
ischemia/reperfusion injured heart, hypothermia has been shown to protect the cardiac tissues by
increasing autophagy, autophagy flux and mitochondrial content in farm pigs (Marek-Iannucci et al., 2019).
On the other hand, autophagy and autophagic flux impairment in the heart caused its accelerated aging,
remodeling it toward heart hypertrophy and dysfunctional mitochondria, which are associated with heart
failure and cardiomyocyte degeneration (Takemura et al., 2018; Liang and Gustafsson, 2020).
In the biomedical field, there is a growing interest in enhancing mitochondrial function to combat aging-
associated diseases and improve lifespan. This has led to the development of nutraceutical therapies based
on the application of antioxidants, vitamins or respiratory substrates and the discovery of new drugs,
which have shown a positive antiaging effect. Some of the well-known compounds are resveratrol, an
antioxidant found in red fruits and red wines; and rapamycin, a macrolide compound that is a blocker of
the mTOR pathway, and then a powerful inducer of mitophagy, prolonging life in mice and other model
organisms and it prevents age-associated symptoms in mammals including humans. The ketogenic diets
(low glucose, high ketone bodies), albeit their mechanism of action is not well understood, have been
shown to inhibit mTOR, stimulate mitophagy, mitochondrial biogenesis and mtDNA replication, and
reduce oxidative stress (Santra et al., 2004; Wallace et al., 2010; Gano et al., 2014). The novel discoveries,
drugs or technologies include the catechinic acid, a polyphenol widely present in tea and fruits, that is able
to induce mitophagy, improve fitness and extend lifespan in aged nematodes (C. elegans) (Wu et al., 2020);
the catalpol, an iridoid glucoside widely abundant in the root of Rehmannia glutinosa, that has a powerful
antioxidant effect, decreases DNA damage and stimulates the PGC-1α TERT axis (Zhang et al., 2018). The
Telomerase Activator 65 (TA-65), a compound extracted from Astragalus membranaceus has been also
shown to extend lifespan by increasing TERT expression and reducing markers of cardiovascular disease
and inflammation (Fernandez et al., 2018). The tetrapeptide SS-31 binds to cardiolipin from the inner
122
mitochondrial membrane, stabilizing membranes and the integral membrane mitochondrial proteins, in
particular, ANT protein to prevent and even revert aging-associated mitochondrial dysfunction in
cardiomyocytes (Szeto, 2006; Birk et al., 2014; Zhang et al., 2020). Finally, the thiazolidinedione
pioglitazone has been shown to be a potent inductor of the PGC-1α, mitochondrial biogenesis and
antioxidant mitochondrial defense (Bogacka et al., 2005; Butterick et al., 2016).
The correlation between mtDNA integrity loss and aging has allowed the development of experimental
strategies that seek to eliminate mutated mtDNA or increase wild type mtDNA to restore mitochondrial
function and reverse the aging phenotype. The rationale of these strategies is that, if the ratio between
the wild type mtDNA and the mutated mtDNA can be adjusted, the presence of wild type molecules will
mitigate the effect of the mutants and therefore the defect will be corrected. Four different strategies
have been developed (Taylor and Turnbull, 2005; Patananan et al., 2016; Aravintha Siva et al., 2019),”
seems to be incomplete. Kindly check and advise. (i) Transfer of isolated xenogeneic mitochondria, which
are deposited in the cell culture medium and enter the cells by macropinocytosis (Kitani et al., 2014). It
has recently been shown that mitochondria therapy is capable of promoting the regeneration of damaged
hippocampal neurons (Katrangi et al., 2007; Chien et al., 2018; Kim et al., 2018). Other mitochondria
transfer technique is by centrifugation and also by the generation of mitocytoplasts (Yang and Koob, 2012).
(ii) Transfer of exogenous wild type mtDNA, by direct microinjection of mtDNA into the host cell or by the
use of “carriers” such as the mitochondrial transduction domain (MTD) conjugated to the mitochondrial
transcription factor A (MTD-TFAM), MITO Porters, DQAsomes, and nanoagents (Niazi et al., 2013; Zhang
and Zhang, 2016; Aravintha Siva et al., 2019). Exogenous mtDNA has also been transferred into muscle
cells via hydrodynamic limb venous injection (Yasuzaki et al., 2013). These methodologies have shown
promising and surprising results in the rescue of mitochondrial and cellular function. (iii) Elimination of
heteroplasmy. These techniques are named the antigenomic mtDNA Therapy; the mitochondrial-targeted
restriction endonucleases; zinc-finger nucleases type; and the effector nucleases of the transcription
123
activator type (Transcription Activator-like effector Endonucleases), are all based on the delivery of
endonucleases into mitochondria, which will specifically recognize and degrade the mutated mtDNA. An
attempt has also been made to carry out the CRISPR/Cas9 technology in mitochondria, but the results have
not been reproducible (Jo et al., 2015). (iv) Mixed mtDNA transfer system. This technology proposes direct
electroporation of isolated exogenous mitochondria with wild type mtDNA. Next, mitochondria must then
be transferred to the zygotes or cultured cells through microinjections (Collombet et al., 1997; Yoon et al.,
2010). Recently, it was published in Nature journal a new technology to edit mitochondrial DNA which
combines mitotalen proteins, Cas9 and the Uracyl glycosidase inhibitor with a bacterial cytidine deaminase
toxin. This technology acts as a repair/edit system on mutant forms of mtDNA. It does not eliminate
mtDNA copies, but rather, restore them (Mok et al., 2020). This revolutionary system was tested in
HEK293T cells and it remains open to the question if it will also be efficient in other cellular models like
cardiac cells.
In summary, heart mitochondria must satisfy an enormous amount of energy to keep the heart beating
from conception to death. To do that, mitochondria are equipped with two complex systems that work
collaboratively, the OXPHOS system and the Mitochondrial Life Cycle to keep safe and healthy the mtDNA
and then mitochondria. Any disruption of these processes is associated with heart failure. On the other
hand, the potentiation of these is beneficial to improve heart health. In aging, mtDNA is prone to undergo
mutations leading to heteroplasmy which is associated with increased ROS affecting negatively both
OXPHOS and the mitochondrial life cycle. Mitochondrial therapies have been developed to deal with
mtDNA heteroplasmy. Many of them focus on Mitophagy stimulation which decreases mtDNA
heteroplasmy and has a protective effect in cardiac cells. The development of new therapies aims to
decrease mtDNA heteroplasmy in cells either by the transfer of mutation-free wild type mtDNA or by the
direct elimination of mutant mtDNA. The results of these new technologies are promising in restoring
124
mitochondrial and cellular function in vitro and open a new era in the field of mitochondrial medicine to
combat aging-associated heart failure.
Author Contributions JS helped with the writing and discussion of the manuscript. AE conceived, wrote, and funded the manuscript. Both authors contributed to the article and approved the submitted version.
Funding This work was funded by the grants: Fondecyt 1180983 (AE) and Millennium Institute on Immunology and Immunotherapy P09-016-F (AE).
Conflict of Interest The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.
Acknowledgments We thank Dr. Roberta Gottlieb from Cedars-Sinai Medical Center for her valuable comments and suggestions on the manuscript.
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Received: 02 November 2020; Accepted: 25 January 2021; Published: 22 February 2021.
Edited by: Giampaolo Morciano, University of Ferrara, Italy Reviewed by: Vito De Pinto, University of Catania, Italy Anna Atlante, National Research Council (CNR), Italy Copyright © 2021 Elorza and Soffia. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) and the copyright owner(s) are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.
*Correspondence: Alvaro A. Elorza, [email protected]
