Extracción, Purificación y Cuantificación de Ácidos Nucléicos

7/25/2019 Extraccin, Purificacin y Cuantificacin de cidos Nuclicos

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Genetista y Btlgo. Ruy Chacn Villanueva

TEMA 3: EXTRACCIN, PURIFICACIN Y

CUANTIFICACIN DE CIDOS NUCLICOS

PILARES HISTRICOS

1953: Modelo de ADN de Watson y Crick


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ESTRUCTURA Y COMPOSICIN DE LOS

CIDOS NUCLICOS ANs)

cido Ribonucleico (ARN)azcar ribosa.

ARN monocatenario (ARNm,ARNt, ARNr).

cido Desoxirribonucleico(ADN) azcar desoxirribosa.

ADN bicatenario (lineal ocircular).

Bases nitrogenadas: Adenina,Timina, Guanina, Citosina,Uracilo.

ASPECTOS ESENCIALES PARA UNA BUENA

EXTRACCIN DE AN

OBJETIVOS:

Maximizar la cantidad de Ans. Maximizar la calidad de ANs. Remover inhibidores. Remover o inhibir nucleasas. Priorizar el AN de inters

(ADN, ARN?)

FACTORES INFLUYENTES:

Calidad de muestra. Cantidad requerida para

anlisis.

Pureza requerida paraanlisis. Tiempo disponible. Presupuesto disponible. Equipamiento adecuado.


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INHIBIDORES DE PCR EN ANs

AISLAMIENTO DE ADN: Animacin

https://www.youtube.com/watch?v=8cYvyYOjzOc
https://www.youtube.com/watch?v=8cYvyYOjzOchttps://www.youtube.com/watch?v=8cYvyYOjzOchttps://www.youtube.com/watch?v=8cYvyYOjzOc


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ETAPAS DE LA EXTRACCIN

1. LISIS CELULAR UHOMOGENEIZACIN:

Se requiere provocar lisis celular,inactivar nucleasas intracelularesy separar cidos nucleicos.

MTODOS FSICOS:

trituracin, choque osmtico:lisis hipotnica, choquetrmico, sonicacin.



Se requiere provocar lisis celular,inactivar nucleasas intracelularesy separar cidos nucleicos.

MTODOS QUMICOS:(detergentes: SDS, agentescaotrpicos, reduccin contioles).


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Se requiere provocar lisis celular,inactivar nucleasas intracelulares yseparar cidos nucleicos.

DIGESTIN ENZIMTICA:Proteinasa K, lisozima


2. REMOCIN DEPROTENAS:

Permite la eliminacinprogresiva de protenas y otroscontaminantes celulares.

Extraccin; fenol cloroformopara eliminacin de protenas,salting outcon acetato depotasio, acetato de amonio.


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Permite la eliminacin progresivade protenas y otroscontaminantes celulares.

Centrifugacin; ultracentrifugacin con gradientes.



Permite la eliminacin progresivade protenas y otros

contaminantes celulares. Cromatografa;

penetrabilidad, intercambioinico, adsorcin selectiva.


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Permite la eliminacin progresivade protenas y otroscontaminantes celulares.

Separacin por afinidad; uninde cidos nucleicos a bolas

paramagnticas en presencia desales caotrpicas.


3. PURIFICACIN:

Separa los cidos nucleicos dedetergentes y sales.

Fase de precipitacin; con

etanol fro o isopropanol. Lavado de pellet; alcohol fro y

centrifufado.

Recuperacin o resuspensin:en agua o tampn.


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AISLAMIENTO DE ADN: Ejemplo en Plantas

https://www.youtube.com/watch?v=PgwWuTDaPd4

CUANTIFICACIN DE ANs

ANs y oligonucletidospueden cuantificarse ensoluciones acuosas midiendola absorbancia A (DO) de luzUV.

Utilizar una muestra blancoo patrn.

ANs absorben a 260 nm. Protenas absorben a 280 nm. Contaminantes

(carbohidratos, pptidos,fenoles, compuestosaromticos, otros.) absorbena 230 nm.
https://www.youtube.com/watch?v=PgwWuTDaPd4https://www.youtube.com/watch?v=PgwWuTDaPd4https://www.youtube.com/watch?v=PgwWuTDaPd4


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CUANTIFICACIN DE ANs

A 260 nm, A = 1, corresponden: 50 g/ml de ADN bicatenario. 37 g/ml de ADN monocatenario. 40 g/ml de ARN. 20 g/ml de oligonucletidos.

MEDICIN DE PUREZA

Cociente de pureza: A260/A280. (ADN puro 1.8; ARN

puro 2.0).A 260 / A 280 < 1,7Contaminacin con protenas

A 260 / A 280 > 1,7 < 2Buena calidad

A 260 / A 280 > 2Contaminacin con fenoles, cloroformo, etc,


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MEDICIN DE CALIDAD - DEGRADACIN

Corrida de un gel de agarosa dela muestra

Buena calidad: migracinhomognea a manera de banda.

Mala calidad: migracinheterognea a manera de sombra.

Ausencia: sin bandas ni sombras.

CONTROL DE CALIDAD DE ANs

Degraded RNA

DNA

28S18S

5S rRNA, tRNA,

and other small

RNA molecules

mRNA = background smear

high low MW

100 50 25 ng

Genomic DNA

markers


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Gracias por la atencin

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