extracción de ADN
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BIOLOGIA MOLECULAR EXTRACCIÓN DE ADN
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BIOLOGIA MOLECULAREXTRACCIÓN
DE ADN
ADNEl DNA, está constituido por dos
cadenas de nucleótidos, formando una doble hélice, su
estabilidad se debe a la formación de puentes de
hidrogeno, además existe la presencia de enlaces entre bases nitrogenadas (A-T; G-C) y enlaces
disulfuro.
Las características de un organismo están especificadas en su información genética, la
cual está representada como una secuencia de ácidos nucleicos,
donde la suma total de esta secuencia es lo que conforma el
genoma.
mitocondria Las estructuras de ADN se
pueden extraer de muestras de piel, sangre, cabello, saliva o semen
EXTRACCIÓN DE SANGRE
Extraer la sangre utilizando vacuteiner con anticoagulante EDTA y homogeneizar correctamente la
muestra para evitar la hemólisis y/o coagulación, y la contaminación bacteriana. Una vez obtenida la muestra es importante evitar
movimientos bruscos durante el transporte.
PASOS PARA LA EXTRACCIÓN ADN
HOMOGENIZACIÓN
Permite la disgregación de la estructura celular y
tisular, para facilitar la salida de
los ácidos nucleicos.
SEPARACIÓN Y
PURIFICACIÓN
Permite la eliminación
progresiva de proteínas y
otros contaminantes celulares, y la obtención
de un material
genético cada vez mas limpio.
PRECIPITACIÓN
Permite la obtención de
un acido nucleico listo
para ser almacenado o diluido en
la concentración deseada
para su análisis. Se
suele utilizar etanol o
isopropanol.
MÉTODOS DE
EXTRACCIÓN ADN
SALTING OUT
CHELEXFENOL-CLOROFORMO
FENOL-CLOROFORMO
CHELEX SALTING OUT
TÉCNICA orgánico inorgánico inorgánico
Péptidos y proteínas son extraídas en la fase orgánica (Fenol), después se realiza digestión con proteinasa K.
El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado.
Previene la degradación del ADN por quelación de los iones metálicos durante la ebullición al 5%.
Tiene copo limeros de estireno dibenzeno- inones iminodiacetato.
No se pierde ADN.
Permite visualizar la malla del ADN.
TOXICIDAD DE
REACTIVOS
Alto No son toxico Bajo
DESVENTAJA
Perdidas significativas de ADN y mucho mas si
esta degradado.
El ADN aislado es de cadena sencilla.
Requiere una mayor cantidad
de muestra.
chelex
SALTING OUT
LISIS DE LA CÉLULA
DEGRADACIÓN DE LA FRACCIÓN PROTEICA
Las sales cao trópicas ayudan a romper la
estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su
desnaturalización.
Se consigue mediante la adición
de una proteasa
Precipitación del ADN
El ADN es insoluble en alcohol, por lo
que se puede precipitar en etanol frío o isopropanol.
LAVADO DEL PELLETResuspencion
Se realiza con Buffer lisis frio,
volviendo a centrifugarse
El sedimento se puede
resuspender en agua o tampón
Tris tras ser secado
completamente.
reactivos
LISIS DE LA CÉLULA
Extracción de sangre
El EDTA elimina el calcio de la
sangre e impide la acción de las
enzimas necesarias en la
coagulación.
Lisis Buffer Frio
homogenización
El SDS es un detergente iónico que desnaturaliza las proteínas pero también inhibe la
PCR a concentraciones
mínimas.La proteinasa K
tiene la función de degradar las proteínas y/o enzimas que
potencialmente pueden degradar al
ADN
separación purificación
Fenol: desnaturaliza las proteínas contaminantes
de la muestra. Cloroformo: permite la separación de 2 fases;
el ADN queda en la fase acuosa y en la fase orgánica quedan las
proteínas y otros contaminantes.
Etanol e isopropanol: precipitan los
ácidos nucleicos. precipitación
GRACIAS
