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Exploracion del genoma de cancer en plasma:Deteccion de los tumores asociados a las aberraciones del

numero de copias, variantes de nucleotido unico yheterogeneidad tumoral mediante la secuenciacion masiva

en paraleloK.C. Allen Chan,1,2,3 Peiyong Jiang,1,2 Yama W.L. Zheng,1,2 Gary J.W. Liao,1,2 Hao Sun,1,2 John Wong,4

Shing Shun N. Siu,5 Wing C. Chan,6 Stephen L. Chan,3,7 Anthony T.C. Chan,3,7 Paul B.S. Lai,4

Rossa W.K. Chiu,1,2 y Y.M.D. Lo1,2,3*

ANTECEDENTES: El ADN de origen tumoral puede en-contrarse en el plasma de pacientes con cancer. En esteestudio, investigamos el uso de una secuenciacionshotgun masiva en paralelo (MPS) de ADN en plasmade pacientes con cancer para examinar un genoma decancer no invasivo.

METODOS: Se incorporaron cuatro pacientes con carci-noma hepatocelular y una paciente con cancer sin-cronico de mama y ovarios. Se extrajo el ADN de lostejidos tumorales y se analizaron las muestras deplasma anteriores y posteriores a la operacion de esospacientes mediante MPS shotgun.

RESULTADOS: Logramos obtener el perfil genomico delas aberraciones del numero de copias y mutacionespuntuales en el plasma de pacientes con cancer. Al de-tectar y cuantificar las mutaciones puntuales y la per-dida alelica agregadas del genoma, determinamos lasconcentraciones fraccionales de ADN de origen tu-moral en plasma y correlacionamos estos valores con eltamano del tumor y el tratamiento quirurgico. Tam-bien demostramos la utilidad potencial de este enfoquepara el analisis de escenarios oncologicos complejos alestudiar al paciente con dos tipos de cancer sincronico.A traves del uso de secuenciacion multiregional de teji-dos tumorales y de secuenciacion shotgun de ADN enplasma, hemos mostrado que la secuenciacion de ADN

en plasma es un enfoque valioso para estudiar la hete-rogeneidad tumoral.

CONCLUSIONES: La secuenciacion shotgun de ADN enplasma es una herramienta potencialmente poderosapara la deteccion, el control y la investigacion delcancer.© 2013 American Association for Clinical Chemistry

La presencia de ADN de origen tumoral en el plasma depacientes con cancer ofrece magnıficas oportunidadespara la deteccion y el control del cancer (1, 2 ). Dehecho, se han encontrado alteraciones de microsateliteasociadas con el cancer (3, 4 ), mutaciones geneticas(5–9 ), cambios de metilacion de ADN (10, 11 ) y losacidos nucleicos virales (12 ) en el plasma de pacientescon distintos tipos de cancer. La mayorıa de los trabajosanteriormente publicados sobre ADN en plasma comoun marcador del cancer se han enfocado en la deteccionde objetivos moleculares especıficos y predetermina-dos conocidos por su asociacion con el cancer por me-dio de metodos tales como PCR (3, 4, 12 ), PCR digital(5–7 ) y ensayos de ligadura digitales (9 ). Con la llegadade la secuenciacion masiva en paralelo (MPS),8 diver-sos grupos han incorporado este enfoque para desarro-llar nuevos marcadores de cancer basados en ADN de

1 Li Ka Shing Institute of Health Sciences; 2 Departamento de Patologıa Quımica;3 State Key Laboratory in Oncology en China del Sur, Sir Y.K. Pao Centre forCancer; 4 Departamento de Cirugıa, y; 5 Departamento de Obstetricia yGinecologıa, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital,Shatin, Nuevos Territorios, RAE de Hong Kong, China; 6 Departamento deCirugıa, North District Hospital, Sheung Shui, Nuevos Territorios, RAE de HongKong, China; 7 Departamento de Oncologıa Clınica, The Chinese University ofHong Kong, Prince of Wales Hospital, Shatin, Nuevos Territorios, RAE de HongKong, China.

* Dirigir correspondencia para estos autores a: Department of Chemical Pathol-ogy, The Chinese University of Hong Kong, Prince of Wales Hospital, 30-32Ngan Shing St., Shatin, New Territories, Hong Kong SAR. Fax �852-26365090;correo electronico: [email protected].

Recibido para la publicacion el 6 de septiembre de 2012. Aceptado para lapublicacion el 27 de septiembre de 2012.Previously published online at DOI: 10.1373/clinchem.2012.1960148 Abreviaturas no estandar: MPS, secuenciacion masiva en paralelo (massively

parallel sequencing); HCC, carcinoma hepatocelular (hepatocellular carcinoma);SOAP2, programa de alineamiento de oligonucleotidos corto 2 (Short Oligonu-cleotide Alignment Program 2); SNP, polimorfismo de nucleotido unico (single-nucleotide polymorphism); LOH, perdida de heterocigosidad (loss of heterozy-gosity); LOESS, suavizado por ponderacion local del grafico de registros (locallyweighted scatterplot smoothing); SNV, variantes de nucleotido unico (singlenucleotide variant); GAAL, perdida alelica agregada de genotipo (genomewideaggregated allelic loss).

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Diagnostico del cancer

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plasma. Uno de los enfoques consiste en usar la MPS enlas muestras del tumor para identificar primero losreajustes que pueden detectarse posteriormente en elplasma (13, 14 ). Otro enfoque esta basado en el uso dela secuenciacion de amplicones dirigida para buscar lasmutaciones de genes que se encuentran comunmenteen el cancer (8 ).

Debido a su naturaleza especıfica, los enfoquesdefinidos anteriormente pueden brindar solo una mi-rada parcial del genoma del tumor en el plasma de pa-cientes con cancer. Para obtener una vista genomicacompleta del genoma del tumor en la circulacion, serıaconveniente un enfoque de secuenciacion aleatoria nodirigida (o shotgun). En este sentido, ha habidograndes avances en el campo del diagnostico prenatalno invasivo gracias a los resultados obtenidos con MPSshotgun de ADN a partir del plasma de mujeres em-barazadas (15 ). Este enfoque ha permitido la deteccionno invasiva de aneuploidıas cromosomicas fetales (16 –18 ) y la exploracion genomica fetal (19, 20 ).

En el presente artıculo, informamos acerca deluso de MPS shotgun para obtener una vista geno-mica no invasiva de las variaciones en el numero decopias asociadas con cancer y mutaciones en el ADNen plasma. Tambien hemos intentado demostrar eluso de este enfoque para esclarecer las caracterısticastumorales importantes, con la heterogeneidad tu-moral usada como ejemplo.

Materiales y metodos

OBTENCION DE MUESTRAS

Se seleccionaron pacientes con carcinoma hepatocelu-lar (HCC) y portadores de hepatitis B cronica del De-partamento de Cirugıa y del Departamento de Me-dicina y Terapia, respectivamente, del hospital Princeof Wales Hospital, Hong Kong, y se obtuvieron los con-sentimientos informados y la aprobacion de la juntainstitucional de revision. Todos los pacientes con HCCpresentaban la enfermedad en la etapa A1 conforme alsistema Barcelona Clinic Liver Cancer. El consenti-miento informado se obtuvo despues de haber expli-cado la naturaleza y las posibles consecuencias de losestudios. La paciente con cancer sincronico de mama yovarios se selecciono del Departamento de OncologıaClınica del hospital Prince of Wales Hospital. Lasmuestras de sangre periferica de todos los participantesse extrajeron en tubos colectores de EDTA. Los tejidostumorales de los pacientes con HCC se obtuvieron du-rante las cirugıas de reseccion de cancer.

PROCESAMIENTO DE LA SANGRE

Las muestras de sangre periferica se centrifugaron a1600 g durante 10 minutos a 4 °C. La porcion de plasmase volvio a centrifugar a 16 000 g durante 10 minutos a

4 °C y luego se realizo el almacenamiento a �80 °C. Lasmoleculas de ADN de celulas libres de 4.8 mL deplasma se extrajeron de acuerdo con el protocolo san-gre y lıquido corporal del kit QIAamp DSP DNA BloodMini Kit (Qiagen). El ADN en plasma se concentromediante SpeedVac® Concentrator (Savant DNA120;Thermo Scientific) en un volumen final de 40-�L porcaso para la preparacion posterior de la genoteca desecuenciacion de ADN.

EXTRACCION DE ADN GENOMICO

El ADN genomico se obtuvo de las muestras de capaleucocitaria de los pacientes de acuerdo con el proto-colo de sangre y lıquido corporal del kit QIAamp DSPDNA Blood Mini Kit. El ADN se obtuvo de los tejidostumorales con el QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen).

SECUENCIACION DEL ADN

Las genotecas de secuenciacion de las muestras de ADNgenomicoserealizaronconelKitdepreparaciondemues-tras de extremos emparejados (Illumina) de acuerdocon las instrucciones del fabricante. En pocas palabras,en primer lugar, se cizallo 1–5 �g de ADN genomicocon un ultrasonicador centrado Covaris S220 en frag-mentos de 200-bp. Despues, se volvieron a emparejarlos extremos de las moleculas de ADN con ADN poli-merasa T4 y polimerasa Klenow; luego se utilizo T4 po-linucleotido quinasa para fosforilar los extremos de 5�.Se creo un saliente de 3�con un fragmento Klenow de-ficiente de exonucleasa de 3� a 5�. Los oligonucleotidosdel adaptador Illumina se ligaron con los extremospegajosos. El ADN ligado al adaptador se enriqueciocon PCR de 12 ciclos. Debido a que las moleculas deADN en plasma fueron fragmentos pequenos (21 ) y lascantidades del ADN total en las muestras de plasmafueron relativamente pequenas, omitimos los pasos defragmentacion y usamos una PCR de 15 ciclos al crearlas genotecas de ADN de las muestras de plasma.

Se utilizo un Bioanalizador Agilent 2100 (AgilentTechnologies) para comprobar la calidad y el tamanode las genotecas de ADN ligado al adaptador. Las geno-tecas de ADN se midieron luego con un Kit de cuanti-ficacion de genotecas KAPA (KAPA Library Quantifi-cation Kit, Kapa Biosystems) de acuerdo con lasinstrucciones del fabricante.

La genoteca de ADN se diluyo e hibrido a las celu-las del flujo de secuenciacion de extremos empareja-dos. Los grupos de ADN se generaron sobre un sistemade generacion de grupos cBot (Illumina) con el kit v2de generacion de grupos TruSeq PE (TruSeq PE ClusterGeneration Kit v2, Illumina), seguido por 51 � 2 cicloso 76 � 2 ciclos de secuenciacion sobre un sistemaHiSeq 2000 (Illumina) con el kit TruSeq SBS Kit v2(Illumina).

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FILTRACION Y ALINEACION DE SECUENCIAS

Los datos de secuenciacion de extremos emparejadosse analizaron mediante el Programa de alineamiento deoligonucleotidos corto 2 (SOAP2) (Short Oligonucle-otide Alignment Program 2) en el modo de extremosemparejados (22 ). Para cada lectura de extremos em-parejados, se alinearon 50 bp o 75 bp de cada extremoal genoma humano de referencia de enmascaramientosin repeticion (Hg18). Se permitieron hasta 2 empare-jamientos incorrectos de nucleotidos para la alinea-cion de cada extremo. Luego, se analizaron las co-ordenadas genomicas de estas alineaciones posibles delos 2 extremos para determinar si alguna combinacionpermitirıa la alineacion de los 2 extremos al mismocromosoma con la orientacion correcta, que abarqueun tamano de insercion � 600 bp y que se equipare aunica locacion en el genoma humano de referencia. Laslecturas duplicadas se definieron como lecturas de ex-tremos emparejados en las cuales la molecula de ADNde insercion demostro identicas ubicaciones de inicio yfinalizacion en el genoma humano; las lecturas dupli-cadas se eliminaron como se describio anteriormente(19 ).

ANALISIS DE MICROMATRIZ

Se determino el genotipo del ADN extraıdo de la capaleucocitaria y los tejidos tumorales de los pacientes conHCC con el sistema Affymetrix Genome-Wide HumanSNP Array 6.0, como se describio anteriormente (23 ).Los datos de micromatriz se procesaron con la consolade genotipificacion de Affymetrix (Affymetrix Geno-typing Console) version 4.1. Se realizo el analisis degenotipificacion y la invocacion de polimorfismo denucleotido unico (SNP) con el algoritmo Birdseed v2,como se describio anteriormente (24 ). Se usaron losdatos de genotipificacion de la capa leucocitaria y lostejidos tumorales para identificar las regiones de per-dida de heterocigosidad (LOH) y para realizar el anali-sis de numero de copias. El analisis de numero de co-pias se realizo mediante la consola de genotipificacioncon parametros predeterminados de Affymetrix y conun tamano de segmento genomico mınimo de 100 bp yun mınimo de 5 marcadores geneticos dentro del seg-mento. Las regiones con LOH se identificaron comoregiones con 1 copia en el tejido tumoral y 2 copias en lacapa leucocitaria, y los SNP dentro de estas regioneseran heterocigotos en la capa leucocitaria pero ho-mocigoticos en el tejido tumoral. Para una regiongenomica que presenta LOH en un tejido tumoral,los alelos de SNP que estuvieron presentes en la capaleucocitaria pero ausentes, o en intensidad reducida,en los tejidos tumorales se consideraron como losalelos en el segmento eliminado de la regioncromosomica. Los alelos que estuvieron presentes en lacapa leucocitaria y el tejido tumoral se consideraron

derivados del segmento no eliminado de la regioncromosomica.

ANALISIS DE HIBRIDACION GENOMICA COMPARATIVO DE

MATRICES

Las muestras de ADN obtenidas de la capa leucocitariay los tejidos tumorales de los pacientes con HCC seanalizaron con el kit de microensayo humano de altaresolucion G3 SurePrint (SurePrint G3 Human HighResolution Microarray Kit, Agilent) como se describioanteriormente (25 ). Se analizaron los datos de hibrida-cion genomica comparativa de matrices para lospacientes con HCC a fin de obtener la variacion en elnumero de copias con Partek® Genomics Suite. Enpocas palabras, las intensidades primarias de la sondase ajustaron de acuerdo con el contenido de GC de lasecuencia. Este ajuste estuvo seguido por la normali-zacion al nivel de sonda de la intensidad de la senaldurante el ajuste simultaneo de la longitud del frag-mento y las secuencias de sonda a traves de todas lasmuestras. Se detectaron las ganancias y perdidas delnumero de copias al aplicar los parametros predeter-minados del algoritmo de segmentacion genomicaGenomic Segmentation disponible en Partek Genom-ics Suite version 6.5 para obtener las diferentes parti-ciones del estado del numero de copias.

DETECCION DE ABERRACION DEL NUMERO DE COPIAS EN LAS

MUESTRAS DEL TEJIDO TUMORAL MEDIANTE SECUENCIACION

Para investigar las aberraciones del numero de copiasgenomicas (p. ej., ganancias y perdidas del numero decopias), dividimos el genoma en segmentos de igualtamano (1 Mb por ventana/recipiente) y llevamos lacuenta del numero de asignacion de lecturas de secuen-cia para cada recipiente. Debido a la presencia de lossesgos de secuenciacion dependientes de GC contecnologıas de secuenciacion de alto rendimiento (26 ),usamos un metodo de correccion estadıstica, sua-vizado por ponderacion local del grafico de registros(LOESS), para corregir el sesgo asociado con GC (27 ).En este metodo, se calcula un factor de correccion paracada recipiente de acuerdo con el modelo de regresionLOESS, como se describio anteriormente (28 ). Luego,los recuentos de lecturas de cada recipiente se ajustaroncon el factor de correccion especıfico segun el recipien-te y se normalizo con los recuentos de lectura medianade todos los recipientes. Despues de la correccion deGC, se calculo una proporcion de los recuentos de lec-tura ajustados del tumor en relacion con aquellos de lacapa leucocitaria mediante la siguiente ecuacion:

R �Atumor

ABC,

Genoma del cancer detectado en plasma

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donde Atumor representa los recuentos de lectura conajuste de GC normalizado del tejido tumoral y ABC

constituye los recuentos de lectura con ajuste de GCnormalizado de la capa leucocitaria.

Luego, elaboramos una distribucion de frecuenciade log2 (R) para todos los recipientes. Este lote de dis-tribucion se uso para estimar la proporcion de las celu-las tumorales (F) en el tejido tumoral que demostrouna distribucion particular del numero de copias y,posteriormente, el cambio del numero de copias encada recipiente.

En el lote de distribucion de frecuencia, se identi-fico un pico central en el cual R es aproximadamenteigual a 1 [es decir, log2(R) � 0]; este pico representa lasregiones genomicas sin las aberraciones del numero decopias. Luego, se identificaron los picos que se ubican ala izquierda y derecha del pico central. Estos picos re-presentaron regiones con una perdida de 1 copia y unaganancia de 1 copia, respectivamente. Las distancias delos picos de la izquierda y la derecha desde el pico cen-tral se usaron para determinar la proporcion de las ce-lulas tumorales (F) en el tejido tumoral, de acuerdo conla siguiente ecuacion:

F � Rright � R left,

donde Rright es el valor R del pico derecho y Rleft es elvalor de R del pico izquierdo.

Luego, los valores del cambio de valores delnumero de copias (CN) para todos los recipientes de1-Mb se calcularon con la siguiente ecuacion:

CN �Rbin � Rcen

0.5 � F,

donde Rbin es el valor de R del recipiente y Rcen es elvalor de R del pico central.

DETECCION DE ABERRACIONES DEL NUMERO DE COPIAS EN

PLASMA

Analizamos la representacion genomica del ADN enplasma para diferentes regiones genomicas. Primero, sedividio el genoma completo en ventanas de 1-Mb,similar al analisis de aberraciones del numero de copiasen los tejidos tumorales. Luego se determino el re-cuento de lectura con correccion de GC (como se de-scribe anteriormente) para cada ventana de 1-Mb. Seuso una estadıstica de puntuacion z para determinar sila representacion de ADN en plasma en una ventana de1-Mb se aumentarıa o reducirıa significativamente alcompararse con el grupo de referencia. El grupo dereferencia incluyo muestras de plasma de 16 individuosde control sanos. En el estudio actual, los recuentos delectura con correccion de GC de cada recipiente de1-Mb se normalizaron conforme a los recuentos de lec-turas con correccion de GC medianas de todos losrecipientes de la muestra. La representacion de ADN

en plasma normalizado se comparo luego con losdatos de los controles. A continuacion, se calculouna puntuacion z para cada ventana de 1-Mb medi-ante el uso de la media y SD de los controles. Las regio-nes con puntuaciones z ��3 y �3 se consideraronsignificativamente por debajo y por encima de la rep-resentacion, respectivamente.

NUMERO DE MOLECULAS NECESARIAS PARA IDENTIFICAR

ABERRACIONES DEL NUMERO DE COPIAS EN PLASMA

Para el analisis de aberracion de numero de copias, lasensibilidad y especificidad de la deteccion de las abe-rraciones en el numero de copias en plasma relacio-nada con el tumor se determinaron mediante la pre-cision en la medicion de la representacion del ADN enplasma en una region cromosomica y la concentracionfraccional del ADN de origen tumoral en el pasma delpaciente con cancer. La precision en la medicion de larepresentacion del ADN en plasma a su vez se vioafectada por el numero de moleculas de ADN enplasma analizadas. En relacion con esto, realizamosanalisis de simulacion para determinar la relacion entreel numero de moleculas de ADN en plasma necesariaspara el analisis y la concentracion fraccional del ADNde origen tumoral en el plasma para poder lograr unasensibilidad de 95% para la deteccion de las aberracio-nes en el numero de copias relacionadas con el tumor.Se realizaron simulaciones de computadora para esce-narios en los cuales la region afectada tuvo un cambiode numero de copias de �1, �1, y �2 y para concen-traciones fraccionales del ADN de origen tumoral enun rango del 1% al 50%. En cada analisis de simu-lacion, el genoma completo se dividio en 3000 recipi-entes. Este numero fue similar al que usamos en elanalisis experimental real cuando se uso una resolucionde 1-Mb.

Asumimos que el 10% de los recipientes exhibirıaaberraciones cromosomicas en el tejido tumoral. En eltejido tumoral, la fraccion esperada (P) de las molecu-las totales que recaen en un recipiente dentro unaregion afectada serıa:

P �2 � CN

2 � 3000 � 3000 � 10% � CN,

donde CN es el cambio de numero de copias. A partirde esta informacion, calculamos el cambio esperado enel plasma.

En el plasma, la proporcion esperada de lasmoleculas totales (E) que recaen en un recipiente den-tro una region afectada puede calcularse de la siguienteforma:

E � P � f �1 � f

3000,


donde f es la concentracion fraccional del ADN de ori-gen tumoral en plasma.

Las simulaciones de 1000 casos normales y 1000casos de cancer se realizaron asumiendo una distri-bucion binominal de las moleculas de ADN en plasma,con las representaciones de plasma esperadas con-forme al calculo superior y con un numero creciente demoleculas bajo analisis hasta alcanzar la tasa de detec-cion del 95%. La simulacion se condujo con la funcionrbinom en R (http://www.r-project.org/).

DETECCION DE LAS VARIANTES DE NUCLEOTIDO UNICO DE

ORIGEN TUMORAL

Realizamos la secuenciacion del tumor emparejado y lasmuestras de ADN general para identificar las variantesde nucleotido unico relacionadas con el tumor (SNV).Nos enfocamos en las SNV producidas en los sitios ho-mocigoticos en el ADN general (p. ej., ADN de capaleucocitaria). En principio, cualquier variacion denucleotido detectada en los datos de secuenciacion deltejido tumoral pero ausente en el ADN general podrıaser una posible mutacion (p. ej., una SNV). No obs-tante, debido a los errores de secuenciacion (0.1%–0.3% de los nucleotidos secuenciados) (29 ), seidentificarıan millones de falsos positivos en el genomasi una unica manifestacion de cualquier cambio denucleotido en los datos de secuenciacion del tejido tu-moral fuera a considerarse como SNV relacionada conel tumor. Una manera de reducir el numero de falsospositivos podrıa ser establecer el criterio de observa-cion de multiples manifestaciones del mismo cambiode nucleotido en los datos de secuenciacion del tejidotumoral antes de que pueda invocarse una SNV rela-cionada con un tumor. Dado que la manifestacion delos errores de secuenciacion es un proceso estocastico,el numero de falsos positivos causados por errores desecuenciacion se disminuirıa exponencialmente con elincremento del numero de manifestaciones requeridaspara que una SNV observada califique como SNV rela-cionada con un tumor. Por otra parte, el numero defalsos positivos aumentarıa exponencialmente con elaumento en la profundidad de la secuenciacion. Estasrelaciones podrıan predecirse con las funciones de dis-tribucion binomiales o Poisson. En relacion con esto,hemos desarrollado un algoritmo matematico para de-terminar el umbral dinamico de manifestaciones paracalificar a una SNV observada como tumor relacio-nado. Este algoritmo toma en cuenta la cobertura exis-tente del nucleotido particular en los datos de secuen-ciacion del tumor, la proporcion de errores desecuenciacion, la proporcion maxima de falsos positi-vos permitidos y la sensibilidad deseada para la detec-cion de la mutacion.

En este estudio, definimos criterios muy estrictospara reducir los falsos positivos. Necesitabamos que la

mutacion estuviera completamente ausente en lasecuenciacion de ADN general y la profundidad de lasecuenciacion para la posicion particular del nucleo-tido tenıa que ser mas de 20 veces mayor. Este umbralde manifestacion fue necesario para controlar la pro-porcion de deteccion de falsos positivos a �1 � 10�7.En este algoritmo tambien filtramos las SNV queestuvieron dentro de las regiones centromericas, te-lomericas y de baja complexidad para minimizar fal-sos positivos debidos a los artefactos de secuenciacion.Asimismo, se elimino la presunta cartografıa de SNV aSNP conocidos en la base de datos de SNP dbSNPBuild135.

Resultados

ABERRACIONES DEL NUMERO DE COPIAS RELACIONADAS CON

EL TUMOR EN PLASMA

Investigamos si las aberraciones del numero de copiasrelacionadas con el tumor podrıan detectarse en elplasma de pacientes con cancer mediante MPS shot-gun. Las muestras de sangre periferica se obtuvierontanto antes como 1 semana despues de la reseccionquirurgica con propositos curativos en 4 pacientes conHCC. Las muestras de sangre se fraccionaron en celulassanguıneas y plasma. El ADN tambien se obtuvo decada uno de los tumores. Se analizaron las aberracionesdel numero de copias en las 4 muestras del tumor conMPS y con 1 o 2 plataformas de micromatriz (Af-fymetrix y Agilent). Las aberraciones del numero decopias se analizaron en ventanas de 1-Mb a traves delgenoma en los tejidos tumorales y se compararoncon las muestras de plasma de un grupo de 16 indi-viduos de control sanos. Los datos fueron uniformes enlas 3 plataformas (ver Fig. 1 en el Suplemento de datosanexo a la version en lınea de este artıculo enhttp://www.clinchem.org/content/vol59/issue1).

A continuacion, usamos la MPS para analizar lasmuestras de plasma anteriores y posteriores a la resec-cion obtenidas de los 4 pacientes con HCC. La profun-didad de secuenciacion media fue de una cobertura 17veces mayor del genoma humano haploide (rango,15.2 veces a 18.5 veces). La Fig. 1 muestra los lotes Cir-cos (30 ) de las aberraciones del numero de copias atraves del genoma en el tumor, la muestra de plasmaanterior a la reseccion y la muestra de plasma posteriora la reseccion de cada paciente. En cada caso, las abe-rraciones del numero de copias caracterısticas observa-das en la muestra de tejido tumoral tambien se obser-varon en pacientes en la muestra de plasma anterior a lareseccion (Fig. 1). Un cambio significativo en la repre-sentacion regional del ADN en plasma se definio como�3 SD de la representacion media de los 16 controlessanos para la correspondiente ventana de 1-Mb.



http://www.clinchem.org/content/vol59/issue1

Fig. 1. Aberraciones del numero de copias detectadas en la muestra de tejido tumoral (anillo interno), muestra de plasmaanterior a la cirugıa (anillo medio) y muestra de plasma posterior a la cirugıa (anillo externo) para los 4 casos de HCC (A-D) yrepresentacion genomica de muestras de ADN en plasma para un portador del virus de hepatitis B (HBV1) sin HCC (E).

Los ideogramas de cromosomas (afuera de las graficas) estan orientados de pter a qter en la direccion de las agujas del reloj. Paralos tejidos tumorales, estan presentes los numeros de copias ganadas (verde) o perdidas (rojo). Para las muestras de plasma, lasregiones con representacion en plasma ampliadas y reducidas se muestran en verde y rojo, respectivamente. Las regiones con laspuntuaciones z entre �3 y �3 estan representadas por puntos grises. Para HCC1, la distancia entre las 2 lıneas horizontalesconsecutivas representa una puntuacion z de 30. Para los demas casos, la distancia representa una puntuacion z de 10.


En todos los casos, tales aberraciones del numero decopias desaparecieron casi por completo en la muestra deplasma posterior a la reseccion (Fig. 1). La detectabilidadde las diferentes clases de alteraciones geneticas relaciona-das con el tumor en plasma se observan en la Fig. 2. Para lacomparacion, usamos el mismo enfoque para analizar lasmuestras de ADN en plasma de 4 portadores de hepatitisB sin HCC (Fig. 1E; ver Fig. 2 en el Suplemento de datosen lınea). Se realizo un seguimiento de estos individuos

durante 1 ano mas despues del muestreo de sangre y no sedemostro evidencia de HCC. Para estos individuos, el99% de los recipientes secuenciados demostro represen-taciones normales en plasma (ver Tabla 1 en el Suple-mento de datos en lınea). De forma similar, una media del98.9% de los recipientes secuenciados en los 16 controlessanos demostro representaciones normales en plasma(ver Tabla 2 y Fig. 3 en el Suplemento de datos en lınea).Estos resultados indican que el analisis de las aberraciones

Fig. 2. (A), Tasas de deteccion para diferentes clases de aberraciones del numero de copias relacionadas con eltumor en el plasma de pacientes con HCC.

La concentracion fraccional del ADN de origen tumoral (entre parentesis) determinada para cada caso mediante analisis GAAL.(B), Numero de moleculas requeridas para el analisis de cada region de interes (ventana de 1-Mb) para detectar el 95% de lasaberraciones del numero de copias relacionada con el cancer en plasma.

Tabla 1. Concentracion fraccional del ADN de origen tumoral en plasma mediante el analisis GAAL.

CasoDimension maxima

del tumor, cmSNP con LOH en

el tumor, n

Plasma

Tiempo de laobtencion Nnondela Ndel

Concentracion fraccional delADN de origen tumoral

HCC1 13.0 11 310 Antes de la cirugıa 88 499 42 829 52%

Despues de la cirugıa 94 442 93 584 0.9%

HCC2 6.2 6040 Antes de la cirugıa 56 611 53 428 5.6%


HCC3 4.2 24 783 Antes de la cirugıa 198 688 190 163 4.3%


HCC4 6.2 498 Antes de la cirugıa 2465 2277 7.6%

Despues de la cirugıa 2773 2699 2.7%

a Un numero Nnondel, de lecturas secuenciadas portadoras de los alelos no eliminados en los tejidos tumorales; numero Ndel, de lecturas secuenciadas portadorasde los alelos eliminados en los tejidos tumorales.



del numero de copias en plasma es especıfico para la dife-renciacion entre los pacientes con cancer y los individuosque no presentan cancer; sin embargo, la especificidadpara el analisis del numero de copias de plasma parecioreducirse en los pacientes con HCC. Por consiguiente, enlos 4 pacientes con HCC, una mediana del 15% (rango,2%–48%) de las regiones en las cuales no ocurrieron abe-rraciones del numero del copias en el tejido tumoral co-rrespondiente demostro una representacion de ADN enplasma aberrante (ver Tabla 1 en el Suplemento de datosen lınea). Este tema se analizara en mayor detalle en laseccion Analisis.

CONCENTRACION FRACCIONAL DEL ADN TUMORAL EN PLASMA

DETERMINADO MEDIANTE EL ANALISIS DE PERDIDA ALELICA

AGREGADA DE GENOTIPO

Las concentraciones fraccionales de ADN en plasma deorigen tumoral se determinaron mediante el analisis,de manera genomica, de los recuentos alelicos de lasSNP que presentaban LOH en los datos de MPS deshotgun en plasma, al que denominamos analisis de“perdida alelica agregada de genotipo” (GAAL). Paradicho analisis, escogimos las SNP que presentabanLOH en los tumores como se demostro con la micro-matriz Affymetrix SNP 6.0. Los alelos eliminados en lostumores tendrıan concentraciones mas bajas en elplasma que aquellos que no se eliminaron. La diferen-cia en sus concentraciones se relaciono con la concen-tracion de ADN de origen tumoral en la muestra de

plasma. Por lo tanto, la concentracion de plasma delADN de origen tumoral (C) puede deducirse con lasiguiente ecuacion:

C �Nnondel � Ndel

Nnondel,

donde Nnondel representa el numero de lecturas secuen-ciadas portadoras de los alelos no eliminados en lostejidos tumorales y Ndel representa el numero de lectu-ras secuenciadas portadoras de los alelos eliminados enlos tejidos tumorales.

La Tabla 1 enumera las concentraciones fracciona-les del ADN en las muestras de plasma para cada uno delos 4 casos. El tamano del tumor parece correlacionarsecon la concentracion fraccional estimada del ADN deorigen tumoral en plasma antes de la reseccion quirur-gica. Por ejemplo, estimamos que el ADN de origentumoral registro el 52% del ADN en plasma total en elpaciente que presentaba el tumor de mayor tamano (13cm) de los 4 casos con HCC. Para cada uno de los 4casos, se observo una reduccion en la concentracionfraccional del ADN de origen tumoral despues de lareseccion quirurgica del tumor (Tabla 1).

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA DETECCION DE ABERRACIONES

DEL NUMERO DE COPIAS EN PLASMA

La concentracion fraccional del ADN tumoral enplasma y la clase de aberraciones del numero de copias

Tabla 2. Concentraciones fraccionales de ADN de origen tumoral en plasma determinado mediante analisisde SNV.

Caso

N.° de SNVdetectadasen tejidotumoral Punto temporal

N.° de SNVrelacionadas con eltumor secuenciadas

del plasma(porcentaje de SNV

observadas entejidos tumorales)

N.° de lecturasde secuenciade ADN enplasma que

muestran SNV(p)

N.° de lecturasde secuenciade ADN enplasma quemuestransecuencias

naturales (q)

Concentracionfraccional

deducida deADN deorigen

tumoralmedianteanalisis de

SNV


deducida deADN deorigen

tumoralmediante

analisis GAAL

HCC1 2840 Antes de la cirugıa 2569 (94%) 11 389 31 602 53% 52%

Despues de la cirugıa 44 (1.5%) 91 46 898 0.4% 0.9%

HCC2 3105 Antes de la cirugıa 1097 (35%) 1490 57 865 5.0% 5.6%



Despues de la cirugıa 31 (1%) 67 58 862 0.2% 1.4%



Para estimar la especificidad del enfoque de analisis de SNV, analizamos el plasma de los controles sanos para las SNV relacionadas con el tumor (ver Tabla 4 enel Suplemento de datos en lınea). La presencia de un numero reducido de estas posibles mutaciones relacionadas con el tumor en el plasma de los 16 controlessanos represento el “ruido estocastico” de este metodo y fue probable debido a errores de secuenciacion. La concentracion fraccional media estimada de dichoruido fue del 0.38%.


influyeron ampliamente en la detectabilidad de talesalteraciones en plasma. La Fig. 1 y Fig. 2A demuestranque las proporciones de las aberraciones geneticas rela-cionadas con el tumor que podrıan observarse en losresultados de secuenciacion de ADN en plasma se cor-relacionaron con las concentraciones fraccionales delADN tumoral en plasma. Por ejemplo, el caso HCC1,que tenıa el tumor mas grande y la concentracion frac-cional mas alta de ADN tumoral en plasma, tambientenıa la mayor proporcion de aberraciones del numerode copias detectadas en plasma (Fig. 1A).

El caso HCC1 presentaba una concentracion frac-cional de ADN de origen tumoral del 52%. Antes deltratamiento, la mayorıa de las aberraciones del numerode copias de tumor tambien podıan observarse en elplasma. En la mayorıa de las regiones cromosomicascon una ganancia de copia unica en el tumor (p. ej.,cromosomas 1p, 3 y 6), las puntuaciones z fueron �20,lo que indica que la representacion de plasma fue de 20SD sobre la representacion media de los individuoscontrol sanos para estas regiones. Por otro lado, el casoHCC3 presento una concentracion de ADN tumoralfraccional en plasma del 4.3%, y podrıa observarse unaproporcion mas reducida de aberraciones relacionadascon el cancer en el plasma. Ninguna de las regiones conuna ganancia de copia unica (7q, 8q, 13q y 14p) tenıauna puntuacion z de �10 en el plasma.

Las clases de aberraciones del numero de copiasque se estudiaron incluyeron perdidas de 1 copia, ga-nancias de 1 copia y ganancias de 2 copias. Los porcen-tajes de dichos cambios que se detectaron en el plasmade cada uno de los cuatro casos de HCC estan repre-sentados en la Fig. 2A y enumerados en la Tabla 3 delSuplemento de datos en lınea. Para cada caso, podrıandetectarse ganancias de 2 copias con mayor sensibili-dad en plasma que en los cambios de 1 copia. En los 4

Fig. 3. Ilustracion que muestra las ubicaciones de lostumores en una paciente con cancer sincronico demama y ovarios.

Se obtuvieron muestras de cuatro regiones (A, B, C y D) delos tumores ovaricos. Se muestran las concentracionesfraccionales del ADN en plasma de origen tumoral esti-mado con SNV asociadas con cada una de las regiones delos tumores ovaricos. La concentracion fraccional calculadadel ADN tumoral en plasma se incrementa cuando elcalculo esta basado en SNV asociadas con multiples regio-nes del tumor.

Tabla 3. Analisis de SNV de multiples regiones del cancer de ovario en la paciente con cancer sincronico.

Grupode

SNVN.° de SNVen tumor

Plasma anterior a la cirugıa Plasma posterior a la cirugıa

N.° de lecturasde secuenciaque muestran

las SNV enplasma (p)

N.° de lecturasde secuenciaque muestranla secuencianatural enplasma (q)


deducida de ADNde origentumoral

N.° de lecturasde secuencia

que muestranlas SNV enplasma (p)

N.° de lecturasde secuencia

que muestranla secuencianatural enplasma (q)


deducida de ADNde origentumoral

A 71 37 3321 2.2% 5 2149 0.46%

B 122 8 5633 0.28% 1 3516 0.06%

C 168 51 8507 1.2% 2 5438 0.07%

D 248 26 10 880 0.48% 2 7060 0.06%

AB 10 21 423 9.5% 0 297 0%

CD 12 3 569 1.1% 0 333 0%

ABCD 2216 21 344 70 940 46% 54 61 417 0.18%



pacientes con HCC, la mayorıa de estas aberracionescromosomicas relacionadas con el tumor desaparecie-ron despues de la reseccion quirurgica del tumor (Fig.1; ver Tabla 3 en el Suplemento de datos en lınea).

Un trabajo anterior sobre el diagnostico prenatalno invasivo ha demostrado que una mayor profundi-dad en la secuenciacion posibilitarıa la deteccion enplasma de un feto aneuploide a una menor concen-tracion de ADN fetal fraccional (31 ). Mediante lasimulacion por computadora, exploramos la relacionentre las profundidades de la secuenciacion que serıanecesaria para detectar diferentes clases de aberracio-nes del numero de copias en plasma relacionadas con eltumor a concentraciones fraccionales diferentes delADN tumoral en plasma (Fig. 2B). Con fines ilustrati-vos, hemos fijado la tasa de deteccion al 95% y ex-ploramos 3 clases de aberraciones geneticas: perdida de1 copia, ganancia de 1 copia y ganancia de 2 copias.Cuando la concentracion fraccional de ADN de origentumoral fuera del 40%, la deteccion de aberracionescon ganancias de 2 copias y de 1 copia requerirıa elanalisis de aproximadamente 180 y 800 moleculas, res-pectivamente, por ventana de 1-Mb. Cuando la con-centracion fraccional del ADN de origen tumoral cae al10%, es necesario el analisis de aproximadamente2500 y 12000 moleculas por ventana de 1-Mb para de-tectar estos cambios respectivos. El requisito de un in-cremento exponencial en el numero de moleculas conuna concentracion fraccional decreciente del ADN deorigen tumoral fue consistente con el requisito para eldiagnostico prenatal no invasivo de aneuploidescromosomicos fetales mediante el analisis de ADN enplasma materno (32 ).

SNV EN PLASMA DE ORIGEN TUMORAL

A continuacion, exploramos la deteccion genomica delas SNV en plasma de origen tumoral de 4 pacientescon HCC. Secuenciamos el ADN tumoral y ADN decapa leucocitaria a profundidades medias de 29.5 veces(rango, 27 veces a 33 veces) y 43 veces (rango, 39 vecesa 46 veces) de la cobertura del genoma haploide, res-pectivamente. Se compararon los datos de MPS delADN tumoral y el ADN de la capa leucocitaria de cadauno de los 4 pacientes con HCC, y se extrajeron las SNVpresentes en el ADN tumoral pero no en la capa leu-cocitaria con un riguroso algoritmo de bioinformatica.Este algoritmo requirio la presencia de una posibleSNV por lo menos en un numero maximo de fragmen-tos de ADN tumoral secuenciado antes de que pudieraclasificarse como una SNV verdadera. El numeromaximo se determino teniendo en cuenta la profundi-dad de secuenciacion de un nucleotido particular y laproporcion de errores de secuenciacion.

El numero de SNV relacionadas con el tumor os-cilo de 1334 a 3171 en los 4 casos de HCC. Las propor-

ciones de tales SNV detectables en plasma se enumeranen la Tabla 2. En forma previa al tratamiento, se de-tectaron en el plasma del 15 al 94% de las SNV relacio-nadas con el tumor. Las concentraciones fraccionalesde ADN de origen tumoral en plasma se determinaronmediante recuentos fraccionales del mutante en rela-cion con las secuencias totales (es decir, tipo mutantemas natural) (Tabla 2). Estas concentraciones fraccio-nales se correlacionaron adecuadamente con aquellasdeterminadas mediante analisis GAAL y se redujerondespues de la cirugıa (Tabla 2).

ANALISIS DE ADN DE PLASMA EN UNA PACIENTE CON CANCER

SINCRONICO MULTIPLE

Para ilustrar el uso de MPS shotgun de ADN en plasmapara controlar un escenario oncogenico complejo, es-tudiamos una paciente de 58 anos de edad con mu-tacion de BRCA1 (cancer de mama 1, inicio temprano)(p.Cys1697*) que presentaba cancer sincronico demama y ovarios (Fig. 3). El cancer de mama fue uncarcinoma ductal infiltrante de 3 cm localizado en lamama izquierda. La paciente presentaba adenocarci-nomas serosos en ambos ovarios. El tumor en el ovarioizquierdo medıa 6 cm en la dimension mas larga y eltumor ubicado en el lado derecho medıa 12 cm. Tam-bien se observaron multiples depositos tumorales in-traabdominales que comprometıan al epiplon y al co-lon. Se realizaron resecciones quirurgicas del tumor demama y de los tumores de ovarios, junto con el epiplony el colon sigmoide en el mismo dıa. Se obtuvieron lostejidos del tumor de mama y de los tumores de ovariosdel lado izquierdo y derecho para este estudio. Tam-bien se obtuvieron muestras de plasma en el momentodel diagnostico y 1 dıa despues de la operacion. Se re-alizo el analisis del ADN del tumor de mama y 4 regio-nes de los tumores de ovarios (2 del ovario izquierdo y2 del ovario derecho) mediante MPS. Las regiones delas que se obtuvieron muestras del tumor de ovario enel mismo lado tuvieron una separacion de 4 cm.

Las aberraciones del numero de copias para elcancer de mama y ovarios se representan en la Fig. 4A.Las 4 regiones tumorales ovaricas mostraron patronesaltamente similares de aberraciones del numero de co-pias. Por el otro lado, el cancer de mama exhibio unpatron diferente de las aberraciones del numero de co-pias. El patron de aberraciones en la muestra de plasmaanterior a la cirugıa fue un compuesto de los patronesde aberraciones en el cancer de mama y ovarios (Fig.4B). Los ejemplos de aberraciones geneticas especıficosdel cancer de mama incluyeron un segmento elimi-nado en el cromosoma 6p y amplificaciones en cromo-somas 1q, 7p y 15q (Fig. 4A). Por otro lado, los ejemp-los de aberraciones geneticas especıficos de los tumoresde ovarios incluyeron supresiones en los cromosomas2, 4p, 11p, 12q, 18q y 22q y las amplificaciones en los


cromosomas 3q, 5p y 21q (Fig. 4B). Estas aberracionesgeneticas especıficas del cancer de mama o del cancerde ovario se observaron en la muestra de plasma ante-rior a la cirugıa pero se aclararon en la muestra deplasma posterior a la cirugıa (Fig. 4A). Una vista am-pliada de 2 regiones genomicas que exhibieron aberra-

ciones del numero de copias presentes en el cancer demama pero ausentes en los tumores de ovarios semuestra en la Fig. 4C.

Para examinar las contribuciones relativas realiza-das por el cancer de mama y de ovarios al ADN enplasma del paciente, se llevaron a cabo analisis GAAL

Fig. 4. (A), Aberraciones del numero de copias detectadas en el cancer de mama (anillo mas interno) y los tumoresovaricos (segundo anillo mas interno hacia afuera: regiones A, B, C y D).

(B), Aberraciones del numero de copias en el tumor de mama, tumor ovarico (region A), plasma anterior a la cirugıa y plasmaposterior a la cirugıa (de adentro hacia afuera). Dos regiones genomicas que presentan aberraciones del numero de copiasespecıficas para el cancer de mama estan marcadas con un cuadro (cromosoma 1q) y una flecha (cromosoma 6p). (C), Vistaampliada de las regiones del cromosoma 1q y 6p en las muestras del tumor y el plasma.



de las regiones genomicas que exhibieron delecionesespecıficas en el tumor de mama o los tumores deovarios. Estos resultados indicaron que el cancer demama y el cancer de ovario contribuyeron en un 2.1 y46%, respectivamente, del ADN en plasma anterior a lacirugıa (ver Tabla 5 en el Suplemento de datos enlınea). Las concentraciones fraccionales del ADN apor-tadas por cada uno de estos tumores cayeron a 1.3 y0.66%, respectivamente, despues de la cirugıa (verTabla 5 en el Suplemento de datos en lınea).

INVESTIGACION DE HETEROGENEIDAD TUMORAL

A continuacion, exploramos el fenomeno de heteroge-neidad tumoral (33 ) mediante el estudio de las 4 regio-nes de las que se obtuvieron muestras de los tumores deovarios. No hubo diferencias observables entre estas 4regiones en terminos de aberraciones del numero decopias (Fig. 4A). Comparamos el perfil de SNV de cadauna de estas regiones con el ADN de la capa leucocitariadel paciente. Clasificamos las SNV en 7 grupos: 4 gru-pos que contienen mutaciones que fueron unicas paracada region (es decir, grupos A, B, C y D), 2 grupos queincluıan mutaciones compartidas por las 2 regiones decada lado del cuerpo (es decir, grupos AB y CD) y ungrupo final que incluıa las mutaciones compartidas porlas 4 regiones (es decir, grupo ABCD) (Tabla 3 y Fig. 3).Seleccionamos aleatoriamente aproximadamente 10SNV para cada uno de los 7 grupos de SNV para lavalidacion con un metodo de extension de nucleotidounico basado en espectrometrıa (analisis iPLEX; Se-quenom) (ver Tabla 6 en el Suplemento de datos enlınea). Un total de 67 mutaciones estuvieron sujetas avalidacion. Mas del 95% de los resultados de SNV fue-ron determinados mediante analisis iPLEX.

Las SNV de cada uno de estos grupos se buscaronluego en los datos de MPS shotgun en plasma. Se de-terminaron las concentraciones fraccionales del ADNtumoral circulante con cada grupo de SNV (Tabla 3).Las concentraciones fraccionales del ADN tumoral enplasma anterior y posterior a la cirugıa, como se deter-mino mediante las SNV compartidas por las 4 regiones(es decir, el grupo ABCD), fueron del 46 y 0.18%, res-pectivamente. Estos ultimos porcentajes se correla-cionaron adecuadamente con aquellos obtenidos enlos analisis GAAL (ver Tabla 5 en el Suplemento dedatos en lınea). Las concentraciones fraccionales deADN de origen tumoral en el plasma anterior a lacirugıa determinadas con las SNV de los grupos AB yCD fueron del 9.5% y 1.1%, respectivamente (Tabla 3).Estas concentraciones fueron consistentes con lostamanos relativos de los tumores de ovario derecho eizquierdo (Fig. 3). Las concentraciones fraccionales delADN de origen tumoral determinadas con las SNVunicas de la region, es decir, aquellas de los grupos A, B,C y D, fueron generalmente bajas. La tendencia de una

reduccion en el ADN de origen tumoral fraccional ob-servada en plasma como se midio con las SNV demayor “especificidad regional” se estudiara en elAnalisis.

ANALISIS

Nuestros datos indican que la secuenciacion shotgunde muestras de plasma de pacientes con cancer podrıapermitir el analisis de mutaciones y aberraciones delnumero de copias relacionadas con el cancer de formagenomica no invasiva (Figs. 1 y 4). Este hallazgo es unimportante avance del trabajo previo, que por lo gene-ral se ha enfocado en la deteccion de un reducidonumero de cambios geneticos relacionados con el tu-mor en plasma (1 ). Este enfoque permitirıa la ex-ploracion de las aberraciones genomicas almacenadaspor las celulas tumorales en un paciente a diferentesniveles de resolucion, que van de una vista global de lasaberraciones del numero de copias relacionadas con elcancer hasta mutaciones puntuales trasmitidas pordiferentes clones de celulas tumorales. Este enfoquepermitira el seguimiento serial de los aspectos cualita-tivos y cuantitativos de tales aberraciones, como lodemostraron los cambios observados en las muestrasde plasmas anteriores y posteriores a la cirugıa. El me-todo tambien permitirıa la valuacion de la carga deltumor, como se indico mediante la correlacion entrela concentracion de ADN fraccional del tumor me-dida y el tamano del tumor. En este estudio, estascaracterısticas generales se observaron en los perfiles deADN en plasma derivados del HCC, cancer de mama ycancer de ovario.

Tanto el analisis GAAL como SNV permiten lamedicion de las concentraciones fraccionales del ADNde origen tumoral en plasma para cualquier cancer.Estos enfoques permitirıan comparar el ADN liberadoen el plasma de distintos tipos de tumores. A traves dela acumulacion de los recuentos de secuencia de SNPinvolucradas en la LOH y en las mutaciones puntualesa traves del genoma, se espera que las medicioneshechas por estos analisis sean mucho mas precisas queaquellas realizadas sobre la base de los cambios gene-ticos individuales relacionados con el tumor.

El grupo de control para el establecimiento delvalor de referencia del analisis del numero de copiasbasado en plasma incluyo individuos sanos sin cancer.La especificidad de este tipo de analisis para individuossin cancer puede observarse a partir del analisis de re-muestreo de este grupo de control, al igual que en losportadores de hepatitis B cronica sin HCC. Para estos 2grupos, solo una fraccion reducida de regiones pre-sento una representacion aberrante de ADN en plasmacon una puntuacion z ��3 o � 3. Estos resultadosindicaron que este enfoque es especıfico para la dife-renciacion entre pacientes con cancer e individuos sin


cancer. Sin embargo, cuando se uso este enfoque paraanalizar el plasma de pacientes con HCC, la especifi-cidad parecio ser menor que aquella para el estudio departicipantes sin cancer. La explicacion de esta obser-vacion no esta completamente clara actualmente; sinembargo, podemos considerar al menos 2 explicacio-nes posibles. Primero, la presencia del ADN tumoralcon regiones que presentan aberraciones del numerode copias en plasma de pacientes con cancer podrıaafectar a la contribucion relativa observada de ADN deregiones que no presentan aberraciones del numero decopias. Por ejemplo, en un tumor que presenta diversasperdidas del numero de copias en el genoma, se podrıaobservar una contribucion relativamente mayor delADN en plasma con origen en las regiones genomicascon un numero de copias normal. Este efecto podrıa sermayor en muestras de plasma con concentraciones al-tas de ADN tumoral. En efecto, los porcentajes declasificacion erronea de las regiones normales son lasmayores para el caso de HCC1 (ver Tabla 1 en el Suple-mento de datos en lınea), el cual tiene la mayor concen-tracion de ADN tumoral fraccional en plasma (52%).Segundo, el fenomeno de heterogeneidad tumoralpodrıa explicar una proporcion de tales resultados fal-sos positivos aparentes. En otras palabras, la region tu-moral unica de la que se obtuvieron muestras para cadatumor de HCC podrıa no contener una aberracion delnumero de copias particular que se libero en el plasmade otro clon de tumor no incluido en la region de lamuestra Si bien el fenomeno mencionado en este pa-rrafo requiere mas estudio, actualmente no pareceafectar de forma adversa la capacidad para distinguirseentre individuos con cancer y aquellos sin cancer.

La paciente con cancer sincronico de mama yovarios es particularmente digna de mencionar, dadoque el caso ilustra un numero de conceptos impor-tantes. Primero, demuestra que el analisis cuidadoso delos datos de secuenciacion permiten diseccionar lapresencia del ADN en el plasma con origen en pobla-ciones de celulas tumorales individuales. Las regionesgenomicas dirigidas que presentan aberraciones delnumero de copias especıficas del cancer de mama yovarios permitieron la explicacion de las contribucio-nes relativas de estos tumores al grupo de ADN circu-lante (Fig. 4B; ver Tabla 5 en el Suplemento de datos enlınea).

Para estudiar el efecto de heterogeneidad tumoralen el perfil de ADN en plasma, analizamos el perfilmutacional de las 4 regiones del cancer de ovario bila-teral mediante comparaciones con el ADN general de lapaciente. Pudimos agrupar estas mutaciones en 7categorıas de acuerdo con el grado de uso compartidode estas mutaciones entre las 4 regiones. Resulta inte-resante que las mutaciones compartidas por las 4 regio-nes (es decir, grupo ABCD) aportaron la mayor contri-

bucion fraccional del ADN de origen tumoral alplasma. Por otro lado, las mutaciones mas especıficassegun la region aportaron una contribucion reducida alplasma. Por lo tanto, no resulto sorprendente que elanalisis GAAL, el cual se basa en la adicion de la canti-dad de perdida alelica a traves del genoma, produjerauna concentracion de ADN tumoral fraccional similara la del analisis basado en SNV de la categorıa ABCD.Estos datos sugieren que para una medicion precisa dela carga tumoral total en un paciente con cancer, el usode un enfoque shotgun de genotipo amplio podrıabrindar una imagen mas representativa, en com-paracion con el enfoque mas tradicional de orientacionhacia las mutaciones especıficas relacionadas con el tu-mor. Para el ultimo enfoque, si solo un subgrupo de lascelulas tumorales posee las mutaciones dirigidas, sepodrıa omitir informacion importante en relacion conla recaıda inminente o la progresion de la enfermedadcausada por las celulas tumorales que no poseen lasmutaciones dirigidas, o se podrıa perder la emergenciade un clon resistente al tratamiento.

De hecho, el fenomeno de heterogeneidad tu-moral (33 ) ha creado desafıos para el desarrollo demarcadores tumorales verdaderamente representati-vos para propositos de supervision. Debido a que elplasma recibe el ADN de los distintos clones heteroge-neos del tumor en el cuerpo, la secuenciacion shotgundel ADN en plasma podrıa ser un metodo facilmentedisponible y no invasivo para estudiar y controlar laheterogeneidad tumoral y la carga total del tumor en elcuerpo.

En este trabajo, utilizamos las SNV relacionadascon el tumor como marcadores tumorales y no nosenfocamos en aclarar la biologıa del panorama muta-cional de los tipos de cancer estudiados. De este modo,el trabajo actual no ha llevado a cabo una caracter-izacion detallada de las secuencias mutadas. Sin em-bargo, esperabamos que la mayorıa de las SNV relacio-nadas con el tumor que detectamos fueran mutaciones“pasajeras” en lugar de “conductoras”. El objetivo deeste estudio fue el de desarrollar un enfoque no inva-sivo para evaluar la carga tumoral en el cuerpo. Por lotanto, creemos que la deteccion de mutaciones, pasa-jeras y conductoras, de forma genomica amplia, pro-porciona una ventaja numerica que tiene el potencialpara alcanzar una deteccion del ADN tumoral enplasma mas sensible, precisa y representativa. Por otrolado, los analisis selectivos de mutaciones conductoraspueden permitir una identificacion mas rapida de ob-jetivos que requieren acciones medicas (8 ). Por con-siguiente, el enfoque de genoma completo no selectivopuede combinarse de manera sinergica con las estrate-gias mas convencionales de deteccion de objetivos se-lectivos para lograr un mejor tratamiento del cancer.



Dado que el ADN en plasma de pacientes concancer consiste en una mezcla de ADN tumoral y notumoral, y que el primero se presenta como una po-blacion minoritaria en muchos pacientes, se necesitarealizar una secuenciacion relativamente profundapara obtener el poder analıtico necesario. Por lo tanto,como se implemento actualmente, el enfoque desecuenciacion shotgun que hemos descrito es relativa-mente costoso en comparacion con diversos enfoquesdirigidos (8 ). Con la reduccion continua y, hasta elmomento, rapida en los costos de secuenciacion, no seespera que el costo sea un gran obstaculo en el futurocercano. Tambien puede preverse la posibilidad de usarla secuenciacion shotgun de una muestra de plasmatras la presentacion de un paciente con cancer y extraerlos datos de secuenciacion shotgun del ADN en plasmapara aberraciones del numero de copias y SNV, y luegodirigir especıficamente dichas secuencias con proposi-tos de supervision en serie. En este sentido, los en-foques de captura basados en hibridacion en fase desolucion ya se han usado satisfactoriamente a fin deenriquecer el ADN en plasma para el diagnostico pre-natal no invasivo (34, 35 ). Por lo tanto, vemos que losenfoques dirigidos y de shotgun pueden usarse enforma combinada para la deteccion y supervision delcancer.

En resumen, hemos demostrado el funciona-miento de la exploracion genomica del cancer me-diante secuenciacion shotgun de ADN en plasma. Estedesarrollo tiene numerosas aplicaciones clınicas y parala investigacion. Por consiguiente, podrıa ser una prio-ridad de la investigacion evaluar este enfoque en co-hortes de gran tamano de diferentes tipos de cancer.

Contribuciones de los autores: Todos los autores confirmaron quehan contribuido al contenido intelectual de este documento y han cum-plido con los siguientes 3 requerimientos: (a) contribuciones significati-vas a la concepcion y el diseno, la adquisicion de datos o el analisis e

interpretacion de estos; (b) redaccion o revision del artıculo en relacioncon su contenido intelectual; y (c) aprobacion final del artıculopublicado.

Declaraciones de los autores o posibles conflictos de interes: Tras lapresentacion del manuscrito, todos los autores completaron el formu-lario de declaracion del autor. Declaraciones o posibles conflictos deinteres:

Empleo o liderazgo: Y.M.D. Lo, Clinical Chemistry, AACC.Papel del consultor o asesor: R.W.K. Chiu, Sequenom; Y.M.D. Lo,Sequenom.Propiedad de acciones: R.W.K. Chiu, Sequenom; Y.M.D. Lo,Sequenom.Honorarios: R.W.K. Chiu, Life Technologies (subsidios de viajes) eIllumina (subsidios de viajes); Y.M.D. Lo, Illumina y LifeTechnologies.Financiamiento de la investigacion: K.C.A. Chan, Hong Kong Re-search Grants Council Theme-based Research Scheme (T12-CUHK05/10); H. Sun, Hong Kong Research Grants Council Theme-based Research Scheme (T12-CUHK05/10); A.T.C. Chan, HongKong Research Grants Council Theme-based Research Scheme(T12-CUHK05/10) e Innovation and Technology Fund bajo el pro-grama State Key Laboratory Programme; R.W.K. Chiu, Hong KongResearch Grants Council Theme-based Research Scheme (T12-CUHK05/10) y S.K. Yee Foundation; Y.M.D. Lo, Hong Kong Re-search Grants Council Theme-based Research Scheme (T12-CUHK05/10), S.K. Yee Foundation, Innovation and TechnologyFund bajo el programa State Key Laboratory Programme y catedrasubvencionada de Li Ka Shing Foundation.Testimonio de expertos: No se declara.Patentes: K.C.A. Chan, P. Jiang, R.W.K. Chiu e Y.M.D. Lo han de-clarado el mismo equipo de 5 campos de aplicacion de patentes en losEE. UU. en este trabajo: 13/308473, 61/662878, 61/682725, 61/695795 y 61/711172.Disponibilidad de materiales y datos: Los datos de secuenciacion ylos datos de genotipo se depositaron en el archivo EuropeanGenome-Phenome Archive (EGA http://www.ebi.ac.uk/ega/), quecuenta con el patrocinio de European Bioinformatics Institute (EBI),bajo el numero de acceso EGAS00001000370.

Papel del patrocinador: Las organizaciones de financiamiento notuvieron ninguna participacion en el diseno de estudio, la eleccion delos pacientes involucrados, la revision e interpretacion de datos ni enla preparacion o aprobacion del manuscrito.

Agradecemos a L. Chan, Y. Jin, C. Lee, K. Chow, S.-W. Yeung, X. Su,y C. Chan por la asistencia tecnica.

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Exploracio´n del genoma de ca´ncer en plasma: Deteccio...

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