Experimentos de Microarreglos: desde la biología molecular a la

estadística

Diana M. Kelmansky

Instituto de Cálculo

FCEN-UBA

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¿Qué son los microarreglos?

• Microarreglos: pequeños soportes sólidos

• sobre los que se inmobilizan ó pegan, miles de secuencias de diferentes genes,

• en posiciones fijas ordenadas

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Dos tecnologías

http://www.kbrin.louisville.edu/archives/fellows/dobbins.html

gslc.genetics.utah.edu

Delivery Synthesis

arrays chips

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• spotted: oligonucleotidos (oligos) son “espoteados” –spotted- directamente sobre el arreglo

• síntesis directa base por base: los oligonucleótidos se fabrican in situ utilizando métodos tales como fotolitografía (ej. Affymetrix chips)

o síntesis química (ej., ink-jet Agilent)

• ?????????????????????????????????

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Portaobjeto y cabezal de impresión - print head

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http://www.stat.berkeley.edu/~sandrine/Docs/Talks/MBI04/Lects/lect1MarrayTech.pdf

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Un segmento de un spot de un microarreglo - las hebras son las moléculas de ADN depositadas - figura tomada de (Duggan et al., Nature Genetics 21: 10-14, 1999)

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Objetivo: Identificar genes expresados diferencialmente

Cambios en la abundancia de:

• genes expresados: mRNA – arreglo de transcriptomas

• ADN genomico

entre condiciones diferentes

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¡Grandes Esperanzas!

Datos obtenidos en PubMed

Schena M,et al. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (1995)

Cantidad de publicaciones por año

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¡Grandes Esperanzas!

Mark Schena Microarray Analysis – Wiley 2003

Al final de la introducción:“Fifty years from now, and long after human

disease has been eradicated, we will look back incredulously at the start of this millennium and wonder how we ever endured cancer, heart disease, AIDS and thousands of other illnesses that compromise our well-being”

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• ¿De qué se trata todo esto?

• ¿Cómo está relacionado con estadística?

Comencemos

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Expresión de un gen• Casi todas las células de nuestro cuerpo contienen un conjunto completo de cromosomas y genes idénticos.

• Sólo una fracción de estos genes están “encendidos” .

• Este subconjunto, que está “expresado”, le confiere propiedades específicas a cada tipo de célula.

•"Gene expression“ . Términos utilizados para describir la transcripción de la información contenida dentro de los cromosomas en moléculas de ARN mensajero.

• Luego estas son traducidas a las proteinas que realizan principales funciones de las células

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Adenina

Timina

Guanina

Citosina

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ROSALIND FRANKLIN la fotógrafa del ADN •Francis Crick, James Watson y Maurice Wilkins -modelo del ADN 1953- en base al• trabajo de Rosalind Franklin como bióloga molecular y cristalógrafa

Murió de cáncer en 1958 con 37 años

Premio Nobel de Medicina -1962-

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Transcripción

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Doble cadena de ADN

transcripción o expresión

Simple cadena de ARNm

traducción

Proteína

Dogma central de la biología molecular

Microarreglo

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¿Cómo funciona un microarreglo?

• Utiliza la capacidad de las moléculas de ARNm de adherirse específicamente, o hibridar a su cadena complementaria de ADN

cADN probe ...AAAAAGCTAGTCGATGCTAG...

ARN target ...UUUUUCGAUCAGCUACGAUC...

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two color spotted microarrayun microarreglo de dos colores

Al finalizar el experimento tenemos

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Datos

¿Cuáles son los datos en un experimento de microarreglos ?

Archivos tiff de las imágenes digitales escaneadas

Una para cada color

La intensidad de cada pixel representa la abundancia del gen transcripto en el sitio correspondiente del arreglo

Procesamiento de la imagen

Datos Crudos

Imagen superpuesta de un sector de un Microarreglo

con colores artificiales

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Imperfecciones de los spots

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Redondeamos – microarrays de dos canales-

ARNm tejido patógeno de hígado cADN etiqueta fluorescente (label) (Cy5) reverseARNm tejido sano de hígado cADN etiqueta fluorescente (label) (Cy3) transcription

Hibridice igual cantidad de mARN para cada muestra sobre el microarreglo

Lave el microarray para eliminar pegado inespecífico - unspecific binding.

Escanee el microarray con longitudes de onda diferentes para exitar a cada uno de los tintes

2 imágenes digitales, una para el fluor Cy3 y la otra para el Cy5 representan las intensidades para cada una de las muestras en el estudio

datos crudos pixel por pixel

Señal de fluorescencia “Promedio” para cada gen = nivel de expresión del gen

+ otros estadísticos datos iniciales gen por gen

Este experimento tiene muchos errores sistemáticos y aleatorios

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MA-plot• Diagrama de dispersión (Scatter plot) de ◦ M = log2 ( Xred / Xgreen )

= log2 ( Xred ) - log2 ( Xgreen )

versus

◦ A = (log2 ( Xred ) + log2 ( Xgreen )) / 2 Intensidad

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MA plot MXY plot

Experimento SELF-SELF ideal

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MA plot MXY plot

sesgo espacial Sesgo dependiente de la intensidad

Experimento SELF-SELF real

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Objetivo: Identificación de genes expresados diferencialmente

Requiere múltiples tests

con un nivel global razonable

(false discovery rate)

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Algunos aspectos estadísticos de los experimentos y análisis de datos de microarrays

A.Diseño. El diseño del experimento afecta la validez y la eficiencia de los resultados.

“In other contexts, and possibly in these, the results have been driven by study inadequacies rather than by biology. Beware! (T. Speed 2005)”

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Algunos aspectos estadísticos de los experimentos y análisis de datos de microarrays

B. Preprocesamiento. • análisis de imágen cuantificación de los

“spots”: distinguir las intensidades del foreground de las del background y los artifacts. Medidas resumen.

• normalización - control del sesgo dentro y entre microarreglos, transformaciones de los datos.

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Algunos aspectos estadísticos de los experimentos y análisis de datos de microarrays

C. Inferencia. Procedimientos de tests simultáneos Multiple testing procedures. Generalmente respecto a qué genes están expresados diferencialmente.

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D. Clustering y discriminación

(llamados Clasificación por “microarray biologists”).

Clases (categorías, etiquetas): pueden ser

muestras ( 1 - cientos)

o

genes . (10000 - 40000)

Algunos aspectos estadísticos de los experimentos y análisis de datos de microarrays

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D. Clustering y discriminación - cont

Clases desconocidas –

clasificación no supervisada:

cluster analysis por los estadísticos,

unsupervised learning por los computadores científicos

class discovery por biólogos de microarreglos.

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Clustering y discriminación - cont

Clases definidas de antemano – clasificación supervisada - supervised classification – sobre por lo menos una parte de los datos:

Los objetivos incluyen describir diferencias entre clases y/o clasificar observaciones fututas. Llamadas clasificación o discriminación y class prediction por microarray biologists.

Los datos para los que las clases son conocidas forman el llamado training o learning set, aquellos datos cuyas clases no son utilizadas pero conocidas forman el test set. También se utiliza Allocation para describir la asignación de clases a los nuevos datos.

Estas distinciones no son universales.

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A) Diseño. Consenso 1: La replicación biologica es indispensable.

Pueden realizarse dos tipos de replicaciones

• replicación técnica: el ARNm de un único caso biológico es utilizado en múltiples microarreglos

• replicaciones biológicas: se extrae ARNm de diferentes sujetos

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A) Diseño. Consenso 2: Es necesario aumentar la potencia mediante el tamaño de la muestra.

• Deben realizarse análisis de potencia: Aplicando estimaciones específicas para experimentos de microarrays Más replicaciones proveen mayor potencia.

• No hay concenso respecto de cuales procedimientos para hallar el tamaño de la muestra son los mejores.

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A) Diseño. Consenso 3: “Pooling” muestras biologicas puede ser útil.

La variabilidad entre arreglos puede ser reducida “pooling” ARNm de replicaciones biológicas.

Por ejemplo:

15 casos divididos en 5 pools de 3, cada pool corrido en un array por separado tendrá:

más potencia que 5 casos corridos an arreglos diferentes menos potencia que cuando los 15 casos son corridos en arregos diferentes

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Sin embargo: Pooling ARN de n casos y creando n replicaciones técnicas no es una estrategia mejor que hibridizar n arrays a las n muestras individuales de RNA:

A) Diseño. Consenso 3: “Pooling” muestras biologicas puede ser útil. Cont

Problema potencial: el ‘poisoned pool’, un outlier puede arruinar los resultados.

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A) Diseño. Consenso 4: Evite los factores de confusión - confounding

Las mediciones de Microarrays pueden estar muy influenciadas por factores externos.

Por ejemplo:Si dos tratamientos son aplicados a dos grupos de pacientes cuando los factores externos no están totalmente balanceados entre los grupos esto puede confundir el estudio y llevar a conclusiones falsas. (Confounding – epidemiología)

Los arreglos deberían provenir de un únco lote y procesados en el mismo día por el mismo técnico.

Analizar la misma cantidad de muestras de los dos grupos en estudio y aleatorizar los casos a los niveles de estos factores (lotes de arreglos, técnicos, día)

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B) Preprocesamiento • Análisis de la imagen. Hay diferentes propuestas,

fundamentalmente en la distinción entre las intensidades del forward y el backward – segmentation.

• Normalization. Diversos procedimientos para permitir las comparaciones entre los arreglos.

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C) Inferencia . Consenso

• Solo fold change |M| > k, no es adecuado

Mi = log2(Ri/Gi)

• Utilice un estadístico que incorpore la variabilidad

t =

• Use “variance shrinkage”

• Use métodos de estimación del FDR en las comparaciones múltiples

sMn /

sa

Mnt

*

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D) Classificación Consenso 1

La clasificación no supervisada se utiliza en exceso. Es una de las primeras técnicas estadísticas utilizadas en el análisis de microarrays y es una de las preferidas.

El investigador tiene garantizada la obtención de un agrupamiento (clustering) de genes, sin importar

•el tamaño de la muestra, •la calidad de los datos, •el diseño del experimento o •cualquier otra validez biológica que esté asociada con el agrupamiento.

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•Clasificación no supervisada, debería ser validada utilizando procedimientos basados en re-muestreo (resampling-based procedures).

•Si la clasificación no supervisada es inevitable, debería proveerse algún tipo de medida de reproducibilidad. Aquellos procedimientos que re-muestrean a nivel de caso – más que a nivel de gen- todos tienen una performance razonable y ninguno es considerado el mejor.

D) Clasificación Consenso 1. Cont.

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D) Classificación Consenso 2Los procedimientos de clasificación supervisada requieren cross-validación independiente.

•Las reglas de predicción están basadas en una cantidad relativamente pequeña de muestras de distintos tejidos de tipos conocidos que contienen los datos de expresión de muchos (posiblemente miles) de genes.

•Problemas posibles: •sobreajuste (overfitting),•sesgo de selección (selection bias)

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Estudios futuros

Microarray data analysis: from disarray to consolidation and consensusAllison D, Cui X, Page G, Sabripour M (2006) Nature Reviews |

Genetics Vol 7 Jan

Sugieren estudiar

• If and how the vast number of genes assayed in microarray experiments could be used to partially compensate for small sample sizes when using resampling-based inference.

• For all statistical procedures, the fact that transcripts are not necessarily independent (co-regulation) should be considered.

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Semilinear High-Dimensional Model for Normalization of Microarray Data: A Theoretical Analysis and Partial Consistency (2005) Fan J, Peng H, Huang T. JASA, vol. 100, no. 471, pp. 781-796. With discussion.

“All of the discussants call for more statistical understanding of various procedures in use.

We agree whole heartedly with this and contribute the article under discussion in the hope that it will stimulate more statisticians to work on this area.”

MÁS ESTADÍSTICA

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¿Recuerdan?

¿Cuántos incluyen análisis estadístico?

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Statistical Analysis

Microarrays

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A Model Based Background Adjustement for Oligonucleotide Expression Arrays. Wu Z, Irizarry RA, Gentleman R, Martinez Murillo F, Spencer F (2004) JASA, 99, 909-917.

Semilinear High-Dimensional Model for Normalization of Microarray Data: A Theoretical Analysis and Partial Consistency (2005) Fan J, Peng H, Huang T. JASA, vol. 100, no. 471, pp. 781-796

Selection bias in gene extraction on the basis of microarray gene-expression data. Ambroise C, McLachlan G (2002) PNAS

Prediction by Supervised Principal Components. Bair E, Hastie T, Paul D, Tibshirani T (2006) JASA, vol. 101, no. 473, pp. 119-137 Microarray data analysis: from disarray to consolidation and consensusAllison D, Cui X, Page G, Sabripour M (2006) Nature Reviews | Genetics Vol 7 Jan

Algunas referencias

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¡MUCHAS GRACIAS!