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Experiencia con Anticuerpos anti-DFS 70 y su Significado Clínico

Luís Eduardo Coelho Andrade, M.D., Ph.D.

Associate Professor

Rheumatology Division – UNIFESP

[email protected]

WHO/IUIS/AF

Autoantibody Standardizing Committee

XVI Congreso Uruguayo de Patología Clínica

Montevideo – 6 a 8 de Noviembre de 2016

Medical consultant in Immunology

Fleury Medicine & Health

[email protected]

Anti-LKM Hepatitis Autoinmune

Anti-desmogleina III Penfigus vulgaris

Anti-DNA nativo Anti-NC collagen IV LES Goodpasture

Células LE Tejidos animales Cultura células humanas

1948 1950 1980

Hargraves Coons & Kaplan

Detección de anticuerpos antinucleares

http://www.fisicahoy.com/fisicaHoy/bMedicina/celula.jpg

LE cell

Animal

tissue

HEp-2

HEp-2

LE cell

Animal

tissue

Especificidad Sensibilidad

Detección de anticuerpos antinucleares

Prevalencia estimada (IC del 95%) de los anticuerpos

antinucleares (ANA) en grupos de edad por sexo

Satoh M, Chan EKL, Miller FW et al, Arthritis Rheum 2012; 64: 2319

¿Qué clase de médicos especialistas orden una prueba de ANA?

• Antiguamente

– Reumatólogos, Nefrólogos, Dermatólogos

• Hoy en dia

– Ginecólogos, neurólogos, hematólogos

– Gastroenterólogos, ENT, neumólogos

– Psiquiatras, geriatras, pediatras

– Oftalmólogos, ortopédicos, cardiólogos

– Especialistas de Medicina Ocupacional

El síndrome de ANA positivos idiopático

• ANA-HEp-2 es una prueba muy sensible

• Población normal 13% pruebas positivas NO ES FALSO-

POSITIVO

• HEp-2 ANA se hizo muy popular

• Baja probabilidad pre-test “Síndrome do ANA Positivo

Idiopático“

• Patrón Moteado Fino Denso (anti-DFS70/LEDGFp75)

responsable de una parte importante del problema

Pathogenic? Pathologic?

Incidental /

Cross-reactive?

Natural Autoab?

?

?

? ?

Determinación de los anticuerpos antinucleares (ANA) en un laboratorio clínico general

no período de jan/2001 to jan/2003

Positivo (13.641)

44% Negativo (17.087)

56% TOTAL: 30.728

Laboratorio clínico general – 12.000 ANA/mes

Sin bies peculiar para enfermedades autoinmunes

Dilución de rastreo: 1/80

Dellavance A et al, J Rheumatol 2005; 32: 2144–9

Nuclear

91%

Nucléolo

2%

Estructuras mitóticas

< 1%

Citoplasmático

2%

Mixto

5%


Frecuencia de los patrones de imunofluorescência observados

en el período de jan/2001 to jan/2003

Moteado fino

47%

Homogéneo 6%

Moteado grueso – 4%

Centromérico - 2%

Moteado fino denso 41%


Frecuencia de los patrones de imunofluorescência NUCLEARES observados

en el período de jan/2001 to jan/2003

1/80 35%

1/160 22%

1/320 22%

1/640 15% >1/640 6%

Distribución de los patrones Moteado Fino y Moteado Fino

Denso de acuerdo con el título de imunofluorescência

1/80 66%

13% 1/160

8% 1/320

7% 1/640

6% >1/640

Moteado fino denso Moteado fino


Encuesta de características distintivas en pruebas de ANA

positivas en individuos sanos y pacientes autoinmunes

• 918 individuos sanos

– 492 trabajadoras sanas en una planta de energía eléctrica

– 426 donantes de sangre

• Cuidadoso cuestionario clínico-reumatológico y serología para

enfermedades infecciosas virales comunes

• Rastreo en 1/80 en 2 láminas comerciales de HEp-2 distintas

• Dos observadores experimentados independientes

• Resultados positivos ambos observadores y ambas láminas

Mariz HA, Dellavance A, Andrade LEC et al, Arthritis & Rheum, 63: 191-200, 2011

GRUPO

DRAISADIOS

TÍT

UL

O

6000,00

5000,00

4000,00

3000,00

2000,00

1000,00

0,00

Tít

ulo

da r

eaçã

o

Normais DRAI

Individuos sanos 12,8% ANA positivo // SARD 90,1% ANA positivo

Tit

er

Healthy subjects SARD

Mariz HA et al, Arthritis & Rheum, 63: 191-200, 2011

Título de ANA-HEp-2 en 918 individuos sanos y 153 pacientes

con enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas (SARD)

0

10

20

30

40

50

60

80 160 320 640 1280 2560 5120

Normais DRAI

Título da reação

Porc

enta

g

Título

Per

cen

tage

Sanos SARD


Título de imunofluorescência de ANA-HEp-2 en 918 individuos sanos y 153

pacientes con enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas (SARD)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Normais DRAI

Per

cen

tage

Sanos SARD

MF MG MFD QHo Ho Cent No Cyto Misc

Patrón de ANA


Patrón de imunofluorescência de ANA-HEp-2 en 918 individuos sanos y 153



El patrón nuclear moteado fino denso ocurre en uno tercio delos individuos

sanos con una prueba ANA positiva

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Normais DRAI

Per

cen

tage

Sanos SARD

MF MG MFD QHo Ho Cent No Cyto Misc

Patrón de ANA


Patrón de imunofluorescência de ANA-HEp-2 en 918 individuos sanos y 153


4047N =

GRUPO

PF_DRAIPF_SADIOS

TÍTULO

6000

5000

4000

3000

2000

1000

0

-1000

353345423647304

10

21

7

Patrón Moteado Fino Simples

# Individuos sanos tienen menor título que enfermos con SARD #

p<0,001

SANOS SARD

Tit

er


1/80 35%

1/160 22%

1/320 22%

1/640 15% >1/640 6%

Distribución de los patrones Moteado Fino y Moteado Fino

Denso de acuerdo con el título de imunofluorescência

1/80 66%

13% 1/160

8% 1/320

7% 1/640

6% >1/640

Moteado fino denso Moteado fino


Patrón de imunofluorescência

Patrón nuclear moteado fino denso

Incluso en el alto

título, ocurre en

individuos sanos y

no en enfermos

con SARD

DFS/LEDGF - perspectiva histórica

• Ochs et al., 1994: informe original en patrón DFS/70kDa en cistitis intersticial

• Ge et al., Ochs et al., Singh et al., 1998-2000: identificación del antígeno

objetivo como factor de transcripción LEDGF

• Otras asociaciones clínicas: alopecia areata, asma, síndrome de Vogt-Koynage-

Harada, síndrome de Sjögren, dermatitis atópica

• Yamada et al, 2001 5,4% en 650 donantes de sangre

• Watanabe et al., 2004 11% en 597 trabajadores sanos

• Dellavance et al. , 2005 81 casos secuenciales con diagnósticos surtidos

• Mariz et al., 2011 4.2% de 918 trabajadores sanos y donantes de sangre

Frecuencia mundial de anti-LEDGFp75/DFS70

en donantes de sangre (BD)

• 2.628 sangre donantes (Bélgica, Brasil, Alemania, Italia, España, Reino

Unido, Estados Unidos)

• 1.383 enfermos SARD (4 países)

• Anti-DFS70 los anticuerpos por QUANTA Flash

• BD: anti-DFS70 en 1,3% (Italia) a 6,4% (USA)

• Anti-DFS70 mas frecuente en jóvenes BD (< 30y)

• Anti-DFS70 mas frecuente en las mujeres (4,5%) que en hombres (3.0%)

Mahler M et al, ACR, 2015

Frecuencia mundial de anti-LEDGFp75/DFS70

en donantes de sangre (BD)

• 2.628 sangre donantes (Bélgica, Brasil, Alemania, Italia, España, Reino

Unido, Estados Unidos)

• 1.383 enfermos SARD (4 países) ningún caso positivo

• Anti-DFS70 los anticuerpos por QUANTA Flash

• BD: anti-DFS70 en 1,3% (Italia) a 6,4% (USA)

• Anti-DFS70 mas frecuente en jóvenes BD (< 30y)

• Anti-DFS70 mas frecuente en las mujeres (4,5%) que en hombres (3.0%)

Mahler M et al, ACR, 2015

Distribución de patrón en 269 pacientes SLE secuenciales

• Clasificación de SLE según criterios ACR

• ANA negativos 10 (3,7%)

• ANA positivo 259 (96.3%)

• Nuclear homogéneo 76 (29,3%)

• Nuclear moteado fino simple (28.6%)

• Nuclear moteado grueso 38 (14,7%)

• Nuclear moteado fino simple con la placa de metafase tenida 31 (12%)

• Nucleares mezclados 24 (9.3%)

• Patrones varios 16 (6.2%)

• Nuclear moteado fino denso 1 (0.4%) *

* Anti-DFS70/LEDGF reactivity confirmed by ELISA & WB

Agustinelli et al, manuscript in preparation

Lo que sabemos de los anticuerpos anti-DFS?

• Ocurren con frecuencia en individuos sanos

• Ocurren en altos títulos en individuos sanos

• Extremamente raros en los enfermos con SARD

Lo que NO sabemos de los anticuerpos anti-

DFS?

• Ocurren en enfermedades non-autoinmunes?

Distribución de patrones en 558 enfermos non-SARD secuenciales

• Trastornos psiquiátricos (esquizofrenia, psicosis depresiva) – n = 163

• Enfermedades infecciosas (HIV y VHC) – n = 148

• Cáncer (neoplasias hematológicas y sólidas) – n = 95

• Varias enfermedades crónicas comunes (hipertensión arterial sistémica,

diabetes mellitus, dislipidemia) - n = 152


No-SARD

(n=558)

LES

(n=269)

Sujetos sanos

(n=918)

ANA-HEp-2 (%) 102 (18.3) * 259 (96.3) 126 (12.9) *

Enfermos no-SARD

Miscellaneous

(n=152)

Cancer

(n=95)

Infectious

diseases (n=148)

Psychiatric

diseases (163)

ANA-HEp-2 35 (23%) 21 (22.1%) 17 (11.5%) 29 (17.8%)

* p = 0,006

Frecuencia de pruebas ANA-HEp-2 positivas en pacientes

no-SARD, sujetos sanos y pacientes de LES

Not statistically significant


Patrones ANA-HEp-2 ANA-positive

no-SARD

Sujetos sanos ANA-

positivos p

Nuclear Moteado Fino 36 (35.3) 54 (45.8) 0.112

Nuclear Moteado Fino Denso 17 (16.7) 39 (33.1) 0.004

Nucléolo 10 (9.8) 8 (6.8) 0.419

Citoplasmático 19 (18.6) 12 (10.2) 0.075

Nuclear Homogéneo 1 (1.0) 5 (4.2) 0.464

Nuclear Moteado Grueso 0 (0) 0 (0) 1.000

Miscelánea 19 (18.6) 8 (6.8) 0.008

Total 102 (100) 118 (100) * ==//==

* La suma es más de 118 porque en algunas muestras aparecen más de un patrón


Frecuencia de patrones de ANA-HEp-2 en enfermos no-SARD y sujetos sanos

Patrón de ANA-HEp-2 ANA-positive non-

SARD (n = 558)

ANA-positive LES

(n = 269) p

Nuclear Moteado Fino 36 (35.3) 75 (28.9) 0.212

Nuclear Moteado Fino Denso 17 (16.7) 1 (0.4) < 0.001

Nucléolo 10 (9.8) 0 (0,0) < 0.001

Citoplasmático 19 (18.6) 1 (0,4) < 0.001

Nuclear Homogéneo 1 (1.0) 75 (28.9) < 0.001

Nuclear Moteado Grueso 0 (0.0) 49 (18.9) < 0.001

Miscelánea 19 (18.6) 68 (26,3) 0.219

Total 102 (100) 259 (100) ==//==

Frecuencia de patrones de ANA-HEp-2 en enfermos no-SARD y

pacientes con LES


Eso comportamiento de los patrones de ANA-

HEp-2 ocurren en la práctica clínica?

Correlativos clínicos de individuos escogidos de forma aleatoria que

presenta alto título (> 1/640) ANA con dos categorías de patrones de ANA

Category A – DFS

n = 327

Category B – HO & MG

n = 76

Homogéneo

Moteado

Grueso Moteado

Fino Denso

– Chequeo, asintomática 1 (1.3%)

– Las quejas no específicas 1 (1.3%)

– Miscelánea "funcional" 6 (7,9%)

– Enfermedades inflamatorias/autoinmunes órgano-específicas 4 (5,3%)

– Miscelánea con lesión de los tejidos y las células 6 (7,9%) Enfermedades

inflamatorias/autoinmunes sistémicas 58 (76%) *

Mayoría: SLE, MCTD y SSc

ANA-Hep-2 alto título – “CATEGORIA B”

Presentación clínica en 76 muestras

– Check-up 38 (11.6%)

– Las quejas no específicas 106 (32.4%)

– Miscelánea "funcional" 39 (11,9%)

– Miscelánea con lesión a tejidos o células 41 (12,5%)

– Enfermedades inflamatorias/autoinmunes órgano-específicas 91 (27,8%)

– Enfermedades inflamatorias/autoinmunes sistémicas 12 (3,7%)

Presentación clínica en 327 muestras

ANA-Hep-2 alto título – “CATEGORIA A”

* Solo 1 caso de LES “posible”!

Lo que NO sabemos de los anticuerpos anti-

DFS?

• En cuales enfermedades non-autoinmunes ocurren?

Diagnóstico clínico de los pacientes que presentan el patrón DFS

condiciones no inflamatorias

• Artralgia

• Astenia

• Prurito crónico

• Menopausia temprana

• Fibromialgia

• Infertilidad

• Hematuria idiopática

• Dolor de espalda baja

• Mialgia

• Hematuria non-glomerular

• Poli artralgia

– Edema periférico

– Anormalidad psiquiátrica

– Fenómeno de Raynaud

Varios "funcional" - 39 (11,9%)

– Neutropenia

– Hipertensión pulmonar

– Degeneración retiniana

• Telangiectasia

– Trombosis (hemorroides)

– Trombofilia (APS?)

– Cáncer de tiroides

– Nódulo de tiroides

– Enfermedad de Von Willebrandt

– Alopecia

– Ataque isquémico cerebral

– Lesión oscura en piernas

– Diabetes Mellitus

– Pérdida feral

– Pérdida de audición

– Esteatosis de hígado

– Micro calcificaciones pulmonares

– Nódulo pulmonar

– Nefrolitiasis

Otros con lesión de tejido o células - 41 (12,5%)


condiciones no inflamatorias

– Alergias

– Acné pustulosa

– Basedow-Graves

– Mastitis crónica

– Uveítis crónica

– Dermatitis de contacto

– Neuropatía craneal

– Dermo-vasculitis (pequeños vasos)

– LE discoideo

– Eczema

– Gota

– Tiroiditis de Hashimoto

– Cistitis intersticial

– Escleroderma localizado

– Liquen plano

– Neuritis óptica

– Poli neuropatía periférica

– Fasciitis plantar

– Infección recurrente

– Vasculitis retiniana

– Rosácea

– Escleritis

– Tromboflebitis

– Urticaria

– Vitíligo

Enfermedades inflamatorias/autoinmunes localizadas - 91 sujetos (27,8%)


– Enfermedad celíaca

– Enfermedad de Crohn

– Convalecencia de sepsis

– Fiebre + anemia

– Púrpura Trombocitopénica idiopática

– LES (posible)

– Cirrosis biliar primaria

– Enfermedad de Wegener

Enfermedades inflamatorias/autoinmunes sistémicas - 12 sujetos (3,7%)


¿Podría la reactividad DFS representan una

enfermedad subyacente sin aparente evidencia clínica?

Análisis de BIG DATA de pacientes que presentan con

la patrón nuclear moteado fino denso (DFS)

LEDGF/p75 – Transcription co-

factor stimulated by cellular

stress

81 muestras seleccionadas

secuencialmente para el

patrón moteado fino denso

80 reaccionó con la

banda 75kDa

Dellavance A, Andrade LEC et al, J Rheumatol 2005; 32: 2144

Fuerte asociación del patrón de la DFS y autoanticuerpos a LEDGF/p75

Estrategia metodológica

• Estudio retrospectivo del Banco de Datos de Laboratorio Fleury

• (actualmente 12.000 ANA pruebas/mes)

• 8 años (Jan/2006-Dic/2013)

Comparación entre registros con patrón DFS versus ANA-HEp-2 no reactivo y

a patrones ANA sabidamente relacionados a enfermedades autoinmunes:

• Nuclear Homogéneo (DNA nativo, nucleosoma, cromatina, histonas)

• Nuclear Moteado Grueso (Sm y RNP)

Estrategia metodológica

De enero de 2006 a diciembre de 2013

451.364 de registros con la petición de ANA

• No reactivo (NRE) 293.933 (64,9%)

• Título 1/80 y 1/160 131.807 (29.2%)

• Título ≥1/320 57.537 (12,7%)

De enero de 2006 a diciembre de 2013

451.364 de registros con la petición de ANA

Patrones ANA-HEp-2 Categorías

Normal Aumentada

n (%) n (%)

Moteado Fino Denso 4.810 (90,8) 489 (9,2)

Homogéneo 383 (76,8) 116 (23,2)*

Moteado Grueso 332 (83,2) 67 (16,8)*

No reactivo 79.923 (90,4) 8.477 (9,6)

Proteína C Reactiva en muestras con distintos patrones de ANA-HEp-2

* p<0,001

Mathias A et al, manuscrito em preparação


Normal Aumentada

n (%) n (%)


Homogéneo 529 (94,6) 30 (5,4)*

Moteado Grueso 442 (96,7) 15 (3,3)**

No reactivo 92.585 (97,4) 2.503 (2,6)*

Creatinina en muestras con distintos patrones de ANA-HEp-2

* p<0,001


** p=0,002


Normal Disminuida

n (%) n (%)


Homogéneo 454 (84,1)* 86 (15,9)*

Moteado Grueso 437 (92,8)* 34 (7,2)*

No reactivo 51.974 (96,2)* 2.034 (3,8)*

Albumina en muestras con distintos patrones de ANA-HEp-2

* p<0,001



Normal Disminuida

n (%) n (%)


Homogéneo 546 (72,1) 211 (27,9)*

Moteado Grueso 458 (74,6) 156 (25,4)*

No reactivo 127.417 (89,9) 14.258 (10,1)

Hemoglobina en muestras con distintos patrones de ANA-HEp-2

* p<0,001


Personas con el patrón DFS diferenciaron claramente de

aquellos con otro patrón de ANA y se asemejaron de cerca a las

personas con ninguna reactividad de ANA

Conclusiones

• El patrón nuclear moteado fino denso (DFS) es muy frecuente y tiende a ocurrir en altos títulos

• Cuando bien caracterizado, presenta casi invariablemente reactividad para la proteína DFS70 o LEDGFp75

• El patrón DFS ocurre mas frecuentemente en individuos aparentemente sanos, pero también es observado en sujetos con una gran variedad de enfermedades no autoinmunes

• El patrón DFS solo excepcionalmente ocurre en enfermedades autoinmunes sistémicas

• El perfil laboratorial de muestras con el patrón DFS semejase aquello de muestras con prueba ANA-Hep-2 no reactivo

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