PRACTICAS N° 2

Tema: “Examen Físico y Químico de la Orina”

Objetivos:Reconocer el material de laboratorio útil para el examen general de orina.Determinar las propiedades físicas de orina.Determinar las propiedades químicas de la orina.Examinar el sedimento urinario microscópicamente.

Materiales y métodos

1. Biológico:

Muestra de orina a analizar.

2. Equipos: Tubo cónico para centrifuga.

Portaobjetos. Cubreobjetos.

3. Colorantes y reactivos

Cinta reactiva para uroanálisis.

Reporte

EXAMEN FISICOEl examen físico de la orina incluye la determinación de su color, aspecto y gravedad especifica. La observación de estas características provee información preliminar respecto a algunas enfermedades como sangrado glomerular, enfermedades hepáticas, errores innatos del metabolismo e infecciones en el tracto urinario. Estos resultados pueden utilizarse para confirmar o explicar algunos resultados del examen químico y microscópico de la orina.

EXAMEN QUÍMICOEl examen químico de la orina se basa en la metodología de tiras reactivas. Aunque su uso es relativamente sencillo, representa una serie de variadas y complejas reacciones que requieren condiciones específicas para su uso e interpretación Se agita la orina y se coloca en tubos cónicos de plástico de 12 a 12 ml. Anota el color y la turbidez Introducir la cinta reactiva para uroanálisis. Se lee de acuerdo a la escala del colorímetro del envase. EXAMEN MICROSCOPICOEl examen microscópico del sedimento urinario constituye un procedimiento de gran utilidad en el estudio del riñón. Podemos observar cristales orgánicos e inorgánicos poco solubles, células como eritrocitos, leucocitos y células epiteliales, así como material de naturaleza proteica insoluble como los cilindros, además encontrar bacterias, levaduras, parásitos y muchos otros componentes.

Desarrollo de la prácticaExamen físicoColor y aspecto:

Mezcle la muestra, utilice un tubo claro, observe contra un fondo claro, utilice buena iluminación, registre el color y el aspecto.

Gravedad especifica:

Siguiendo las instrucciones del fabricante, determine gravedad especifica según los métodos que se tenga disponible (urinometro, refractómetro y/o reacción en tira reactiva). Compare los resultados obtenidos por diferentes métodos.

QUIMICO

1. Sumergir las tiras reactivas durante un periodo corto 1 segundo de tal forma que todos los campos se humedezcan o en su caso lo que marque el fabricante, siendo importante el leer los insertos o instructivos.

2. Retirar el exceso de orina en el borde del recipiente. Colocar o mantener las tiras de manera horizontal para evitar contaminaciones, (reacciones cruzadas) entres las zonas vecinas.

3. Después de 30 a 60 segundos., para leucocitos 60 a 120 segundos comparar la escala de colores. Las variaciones de color que ocurran después de 2 minutos, así como también las coloraciones de los bordes no tienen significado alguno. El campo blanco existente entre las zonas de ensayo del peso específico y de leucocitos sirve para compensar el color propio de la orina y las valoraciones instrumentales.

4. Realizar el análisis microscópico de las muestras, 10 a 12 ml, se deben centrifugar a 2000 r.p.m. por 5 minutos. Decantar el sobrenandante, dejando 0.5. a 1 ml para re suspender el sedimento. Colocar una gota del sedimento re suspendido sobre un porta objeto y se cubre con cubreobjetos pudiendo utilizar como medio de contraste azul de metileno o toluidina, para luego ser observado al microscopio.

GRAFICOS Y REPORTE QUIMICO

PRACTICAS N° 1

Tema: “Técnica de tinción de Gram”

Objetivos:

Conocer la técnica de la tinción de Gram.

Identificar bacterias Gram positivo y Gram negativo.

Emplear técnicas bacteriológicas simples.

Conocer el fundamento estructural de la Tinción de Gram.

Utilizar colorantes y comprender su utilización.

Utilizar el microscopio con el objetivo de inmersión.

Observar células procariotas

Lograr el óptimo procedimiento para poder aprender la técnica de Tinción Gram de todos los integrantes del grupo y comprender la importancia y la diferencia entra las estructuras de las diferentes bacterias.

Materiales y métodos

1. Biológico:

a) Cultivos bacterianos diversos

2. Equipos:

a) Portaobjetos: varios

b) Agua destilada estéril: 10mL

c) Guantes: varios

d) Asa bacteriológica

e) Mechero de alcohol o gas: uno por mesa

f) Rejilla de tinción

g) Microscopio: dos por mesa

h) Aceite de inmersión para microscopio: uno por mesa

3. Colorantes y reactivos

a) Solución violeta de genciana al 1%

Violeta de genciana................................... 1g

Cristales de ácido carbólico....................... 2g

Alcohol absoluto........................................10 mL

Agua destilada .......................................... 100 mL

Desarrollo de la práctica

PROCEDIMIENTO:

SIEMBRA: Preparar un porta bien limpio y Coger una porción pequeña de muestra con un palillo o una aguja enmangada y hacer una extensión sobre el porta.

Procesamiento de la muestra

1. Se toma cuidadosamente el plato de cultivo bacteriano con las manos cubiertas con guantes como forma de evitar contacto directo con el germen cultivado.

2. Con el asa bacteriológica esterilizada (por flameo), se toma una pequeña muestra del cultivo y se deposita sobre una gota de agua esterilizada en un portaobjetos limpio y debidamente rotulado y se distribuye homogéneamente por la plaquita sin dispersarlo mucho o dejarlo muy compacto para luego proceder al proceso de fijación.

3. Inmediatamente se distribuye el contenido el asa bacteriológica la misma se procede a esterilizar nuevamente previo a su empaquetamiento y almacenaje.

a) Para fijar la muestra a la plaquita o portaobjetos se procede al proceso de.

FROTIS: Se fijo las células de ida y vuelta – hasta que se desagrego - hasta la mitad del portaobjetos.

FIJACIÓN: con esto evitamos que cualquier sustancia infecte nuestra muestra y luego, que nuestra muestra permanezca en el porta objeto (Se fijo por calor – a mechero.

• Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco.

• Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra.

• Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa.

• Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lámina.

• Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

TÉCNICA DE TINCIÓN: Sobre el frotis fijado se vertió la solución de violeta y se deje en reposo 1 minuto.

Tinción GRAM

1. Verter la solución de violeta de genciana, hasta cubrir el frotis, dejando que el colorante actué por espacio de 30 segundos.

Tinción

Con violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C.

2. Lavar la preparación ligeramente con agua corriente.

Enjuague

Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a

un centímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina en posición inclinada hacia abajo.

3. Echar sobre la preparación el lugol de Gram., hasta cubrir el frotis dejando que actué durante 30 segundos.

Mordiente

Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto más. El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias

4. Lavar la lámina con agua corriente.

Echar sobre la preparación el alcohol etílico 95 % o el alcohol acetona al 20 %, hasta que se evidencie que este solvente no extrae más el colorante violeta. Esta operación debe durar aproximadamente de 1 a 2 minutos

DECOLORACIÓN con alcohol al 95 % durante 1 min moviendo el portaobjetos en ambos lados o a cada extremo, hasta que desaparezcan los chorros gris violáceos del colorante. Después lave con agua.

Este paso es fundamental porque en el reside la respuesta diferencial de las Gram + y las Gram –

Sabemos que el alcohol deshidrata y contrae las células por contacto.

Sabemos también que los poros de las Gram + son mas pequeños que los de las Gram -.

Entonces, la solución alcohol, contrae los poros de las bacterias cerrando completamente los de las Gram + y parcialmente los de las Gram -. El resultado es que dicha solución ingresa en estas últimas decolorándolas. Hasta aquí tenemos las Gram + violetas y cerradas y las Gram - incoloras y abiertas.

5. Lavar la lámina con agua corriente.

Lavado y secado

Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.

6. Echar sobre la preparación la solución de safranina, dejándola actuar por espacio de 30 segundo.

Tinción de contraste

Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.

7. Lavar con agua corriente.

Nuevo enjuague

Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.

8. Secado de lámina

Al concluir el proceso de coloración, la lámina se debe colocar de canto para que se escurra. Debe tenerse en cuenta que el agua y en especial, el agua destilada, es un agente decolorante, por lo que si se deja sobre el portaobjetos después de teñirlo demasiado tiempo quita parte del colorante. Lo ideal es escurrir la lámina poniéndola de canto y seguidamente secarla con papel de filtro.

Observar en el microscopio

Gráficos: