Evaluación del proceso de reparación en heridas de · Oral mucosa defects treated with autograft...

Evaluación del proceso de reparación en heridas de

mucosa oral de conejos injertadas con tejido

conjuntivo artificial autólogo elaborado con soportes

de colágeno unidireccionales y multidireccionales

Andrea del Pilar Escalante Herrera

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Microbiología

Bogotá, Colombia

2013

Evaluación del proceso de reparación en heridas de

mucosa oral de conejos injertadas con tejido

conjuntivo artificial autólogo elaborado con soportes

de colágeno unidireccionales y multidireccionales

Andrea del Pilar Escalante Herrera

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias - Microbiología

Directora:

Q. F. Ph.D. Marta Raquel Fontanilla Duque

Línea de Investigación:

Biología Celular

Grupo de Investigación:

Grupo de Trabajo en Ingeniería de Tejidos

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Maestría en Microbiología

Bogotá D.C., Colombia

2013

Agradecimientos

A Dios, mis padres, mis tíos, mi nonita, mi hermana, Jorge, Alejandra y Fabio por su

apoyo incondicional y paciencia desde antes de empezar esta aventura.

A la profe Marta por su guía, apoyo, energía, comprensión y por proveer los medios para

llevar a cabo el trabajo.

A todos los integrantes del Grupo de trabajo en Ingeniería de Tejidos por su colaboración

en cada paso: Lady, Edward, Diana M., Diana N., Rosa, Ronald, José Manuel, Sergio,

Ana Milena, María Elisa, Adriana, Leonardo, Ronald, Bryan, Hector, Don Rafa.

A todos aquellos que se involucraron de una u otra forma brindándome su mano: Itali,

Irene, Jimena, Daniel, Elizabeth, Alejandro, Jenny, Maira, Juan Manuel, Profe María

Teresa, Claudia Parra, Keile, Natalia, Lorena, Anjeli.

A Socorrito porque sin ella uno se perdería en el camino.

A Manuel por su asesoría y largas horas dedicadas a la lectura de biopsias.

Al Bioterio Central de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia a cargo del

profesor Jesús Cortes y muy especialmente a Arturo y sus muchahos, por la inmensa

colaboración.

Al instituto de Biotecnología y a Mauricio por su colaboración con el liofilizador.

Al programa de becas Asistente Docente de la Universidad Nacional de Colombia y a la

Facultad de Odontología.

Al laboratorio equipos comunes de la Facultad de Medicina, por el préstamo de equipos

utilizados para la elaboración de este trabajo.

A la Profesora Constanza Quintero por la asesoría en estadística.

Resumen

Los defectos de mucosa oral son tratados con autoinjertos que generan alta morbilidad

en el sitio donante. Una alternativa de tratamiento es la elaboración de tejidos artificiales,

que podría ayudar a superar algunas restricciones de los tratamientos convencionales. El

objetivo de este trabajo fue evaluar clínica e histomorfométricamente el proceso de

reparación en heridas de mucosa oral injertadas con tejido conjuntivo artificial autólogo

(TCAA) elaborado con soportes de colágeno unidireccionales y multidireccionales, en un

modelo lagomorfo de heridas de espesor parcial en mucosa oral. Con los animales fuente

de los fibroblastos se hicieron tres grupos de estudio, cada uno con 12 conejos. En cada

animal se hicieron dos heridas contralaterales de espesor parcial sobre la zona vestibular

de la mucosa oral. En dos grupos aleatoriamente cada una de las heridas fue injertada

con TCAA elaborado con soportes unidireccionales (TCAA-unidireccional) o

multidireccionales (TCAA-multidireccional) o dejada cerrar por segunda intención. En el

tercer grupo una de las heridas fue injertada con TCAA-unidireccional y la opuesta con

TCAA-multidireccional. Durante el tiempo postquirúrgico se realizaron evaluaciones

clínicas, luego se tomaron biopsias de las heridas donde se analizó

histomorfométricamente teniendo en cuenta el grosor del epitelio y del tejido conjuntivo,

la intensidad de la inflamación y la vascularización. Los datos obtenidos indican que las

heridas tratadas con TCAA elaborado con soportes con fibras orientadas unidireccional o

multidireccionalmente, muestran características histomorfométricas diferentes a las de

las heridas cerradas por segunda intención (Control). Igualmente, que hay diferencias

histológicas y clínicas en las heridas injertadas con tejido unidireccional o

multidireccional, que muestran mayor contracción en las primeras que en estas últimas.

Palabras clave: Tejido conjuntivo artificial autólogo, colágeno unidireccional,

colágeno multidireccional, tejidos artificiales.

Evaluation of the repair process in wounds grafted oral mucosa of rabbits with autologous artificial connective tissue made from collagen scaffolds

unidirectional and multidirectional

Abstract

Oral mucosa defects treated with autograft that generate high morbidity at the donor site.

An alternative treatment is the development of artificial tissues, which could help to

overcome some restrictions of conventional treatments. The aim of this study was to

evaluate clinical and histomorphometrically the repair process in oral mucosal wounds

grafted with autologous artificial connective tissue (AACT) prepared with supports

unidirectional and multidirectional collagen in a lagomorph model partial thickness

wounds in oral mucosa. With the source of fibroblasts animals three study groups, each

with 12 rabbits were made. Were made In each animal two contralateral partial thickness

wounds on the vestibular area of the oral mucosa. Randomly into two groups each wound

was grafted with AACT made with unidirectional media (AACT-way) or multi (multi- AACT)

or left to close by secondary intention. In the third group of the wound was grafted with

AACT- way and the opposite with AACT -multidirectional . During postoperative period the

clinical evaluations were performed, then wound biopsies where histomorphometrically

analyzed considering the thickness of the epithelium and connective tissue, the intensity

of inflammation and vascularization were taken. The data indicate that wounds treated

with AACT prepared with supports unidirectional or multidirectionally oriented fibers show

different histomorphometric characteristics than wounds closed by secondary intention

(Control). Similarly, there is histological and clinical differences in wounds grafted with

unidirectional or multidirectional tissue, showing greater contraction in the former than in

the latter.

Keywords: Autologous Artificial Connective Tissue, Collagen unidirectional,

Collagen multidirectional, Artificial tissues.

Contenido

Resumen…………………………………………………………………………………………

Lista de Figuras…………………………………………………………………………………

Lista de Tablas…………………………………………………………………………………..

Lista de símbolos y abreviaturas…………………………………………………………….

Introducción…………………………………..…………………………………………………..1

1. Marco teórico …………………...………………………………………….…….3

1.1 Mucosa Oral ............................................................................................................ 3

1.1.1 Características clínicas de la mucosa oral.......................................................... 3

1.1.2 Características histológicas de la mucosa oral ................................................... 3

1.2 Reparación de heridas ............................................................................................ 5

1.2.1 Proceso de reparación de heridas ...................................................................... 5

1.2.2 Tipos de cicatrización .......................................................................................... 6

1.2.3 Migración celular en la reparación de heridas .................................................... 7

1.3 Tratamientos de defectos en mucosa oral e ingeniería de tejidos......................... 8

1.4 Soportes y microestructura en ingeniería de tejidos .............................................. 8

1.4.1 Células ............................................................................................................... 11

1.4.2 Reguladores ...................................................................................................... 11

2. Formulación del problema ........................................................................................ 12

3. Hipótesis ...................................................................................................................... 14

4. Objetivos ..................................................................................................................... 15

4.1. Objetivo general ........................................................................................................ 15

4.2. Objetivos específicos ............................................................................................ 15

5. Metodología ................................................................................................................. 16

5.1 Diseño experimental ............................................................................................. 16

5.2 Consideraciones éticas ......................................................................................... 17

5.3 Análisis estadístico ................................................................................................ 17

5.3.1 Definición de variables ...................................................................................... 17

5.4 Elaboración de soportes de colágeno tipo I (SC) y tejido conjuntivo artificial

autólogo (TCAA)............................................................................................................... 18

5.4.1 Elaboración de soportes de colágeno. .............................................................. 18

5.4.2 Aislamiento y cultivo de fibroblastos..................................................................18

5.4.3 Elaboración de tejido conjuntivo artificial autólogo ...........................................19

5.4.4 Evaluación de la reparación de heridas mucosas de espesor parcial..............20

5.4.5 Manejo y cuidado postoperatorio de los conejos ..............................................21

5.4.6 Evaluación clínica de las heridas tratadas ........................................................21

5.4.7 Evaluación histomorfométrica de las heridas tratadas .....................................21

6. Resultados ...................................................................................................................24

6.1 Objetivo específico No. 1: Construir y caracterizar histológicamente TCAA a

partir de fibroblastos y soportes de colágeno unidireccionales y multidireccionales. .... 24

6.1.1 Características morfológicas e histológicas del TCAA .....................................24

6.1.2 Viabilidad celular del TCAA con MTT ................................................................25

6.1.3 Evaluación del TCAA con microscopía confocal...............................................26

6.2 Objetivo específico No. 2: Comparar el cierre de heridas mucosas de espesor

parcial injertadas con tejido conjuntivo artificial autólogo elaborado con soportes de

colágeno unidireccional y multidireccional. ..................................................................... 27

6.2.1 Seguimiento clínico de los tratamientos ............................................................27

6.2.2 Evaluación histológica .......................................................................................48

6.2.3 Análisis histomorfológico del grosor del epitelio, conjuntivo, inflamación y

formación de nuevos vasos sanguíneos ......................................................................52

6.2.3.1 Número de capas del epitelio: ....................................................................52

6.2.3.2 Grosor del tejido conjuntivo: .......................................................................54

6.2.3.3 Inflamación..................................................................................................55

6.2.3.4 Número de vasos sanguíneos....................................................................56

7. Discusión .....................................................................................................................57

8. Conclusiones...............................................................................................................63

9. Recomendaciones ......................................................................................................64

Bibliografía

Lista de Figuras

Figura 1. Histología de la mucosa oral. Principales tejidos de la mucosa oral.

Fotografía original, Grupo de Trabajo en Ingeniería de Tejidos, Universidad Nacional de

Colombia.

Figura 2. Método de análisis de biopsias. A: Disposición de las biopsias en la lámina.

B: Magnificación del corte a evaluar, el cual es dividido en 5 porciones donde II, III y IV es

la zona tratada, I y V son las zonas adyacentes a la zona tratada.

Figura 3. Análisis histológico de TCAA elaborado con soportes de colágeno

unidireccionales y multidireccionales. TCAA-unidireccional (Panel A); imagen con

mayor resolución de la región del TCAA-unidireccional, enmarcada dentro del recuadro

(Panel B). TCAA-multidireccional (Panel C); imagen con mayor resolución de la región

del TCAA-multidireccional, enmarcada dentro del recuadro (Panel D). Convenciones

usadas: Fibras de colágeno del soporte (FCS); fibras de colágeno sintetizadas por los

fibroblastos (FCF); matriz extracelular (MEC) secretada por las células.

Figura 4. Tinción con MTT de TCAA elaborado con soportes unidireccionales o

multidireccionales. Imagen de corte de TCAA-unidireccional; las flechas señalan células

viables aparentemente orientadas en la misma dirección de las fibras unidireccionales

(Panel A). Imagen de corte de tejido multidireccional; las flechas señalan células viables

orientadas en múltiples direcciones (Panel B).

Figura 5. Microscopía confocal de TCAA. La figura presenta imágenes de microscopia

confocal de TCAA elaborado con soportes unidireccionales (Panel A) y TCAA elaborado

con soportes multidireccionales (Panel B).

Figura 6. Progresión temporal del proceso de reparación de heridas injertadas con

TCAA-unidireccional y de control. Apariencia de la herida control y de la herida

injertada al día 0 (Paneles A y B, respectivamente), día 7 (Paneles C y D) y día 14

(Paneles E y F). Las flechas señalan los bordes de la herida control (b) y la zona

injertada (zi) en el día 14.


TCAA-unidireccional y de control. Apariencia de la herida control y de la herida

injertada al día 0 (Paneles A y B, respectivamente), día 7 (Paneles C y D) y día 14

(Paneles E y F). Las flechas muestran los bordes de la herida control (b) y la zona

injertada (zi) en el día 14.


TCAA-multidireccional y TCAA-unidireccional. Apariencia de las heridas injertadas

con soporte multidireccional y unidireccional en el día 0 (Paneles A y B,

respectivamente), día 7 (Paneles C y D) y día 14 (Paneles E y F). La flecha en el Panel

E, muestra la continuidad de la zona injertada con la adyacente. La flecha en el Panel F,

señala los bordes elevados en la zona injertada con el soporte unidireccional.

Figura 9. Apariencia histológica de heridas cerradas por segunda intención

(Control) y de heridas injertadas con TCAA-unidireccional, tinción con H&E. El

Panel A, muestra la histología de la herida control. En el Panel B, se observa la imagen

histológica de la herida injertada con TCAA-unidireccional. Convenciones usadas:

músculo (M), borde de la herida (BH), células inflamatorias (CI), crestas interpapilares

(CIN), epitelio (EP), glándulas salivales (GM), hiperplasia pseudoepiteliomatosa (HP),

vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.

Figura 10. Apariencia histológica de heridas cerradas por segunda intención

(Control) y de heridas injertadas con TCAA-multidireccional, tinción con H&E. El

Panel A, muestra la histología de la herida control. En el Panel B, se observa la imagen

histológica de la herida injertada con TCAA-unidireccional. Convenciones usadas:

músculo (M), borde de la herida (BH), células inflamatorias (CI), crestas interpapilares

(CIN), epitelio (EP), glándulas salivales (GM), hiperplasia pseudoepiteliomatosa (HP),

vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.

Figura 11. Apariencia histológica de heridas injertadas con TCAA-unidireccional o

con TCAA-multidireccional, tinción con H&E. Herida injertada con TCAA-

unidireccional (Panel A); herida injertada con TCAA-multidireccional (Panel B).

Convenciones usadas: músculo (M), borde de la herida (BH), células inflamatorias (CI),

crestas interpapilares (CIN), epitelio (EP), glándulas salivales (GM), hiperplasia

pseudoepiteliomatosa (HP), vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.

Figura 12. Promedios de porcentaje de recuperación del número de capas del

epitelio formado a las dos semanas. En el Panel A, se observan los resultados del

porcentaje de recuperación del grupo de animales en los que una herida se injertó con

TCAA-unidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B,

presenta los datos obtenidos en el grupo en el que una herida se injertó con TCAA-

multidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel C,

muestra el análisis de los datos provenientes del grupo en el que las heridas de un lado

fueron tratadas con TCAA-multidireccional y las contralaterales con TCAA-unidireccional.

Figura 13. Promedios porcentaje de recuperación de del grosor del tejido

conjuntivo formado a las dos semanas. En el Panel A, se observan los resultados del

grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-unidireccional y la

contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B, presenta los datos

obtenidos en el grupo en el que una herida se injertó con TCAA-multidireccional y la

contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel C, muestra el análisis de los

datos provenientes del grupo en el que las heridas de un lado fueron tratadas con TCAA-

multidireccional y las contralaterales con TCAA-unidireccional.

Figura 14. Grado de inflamación en la zona de herida. En el Panel A, se observan los

resultados del grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-

unidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B,





Figura 15. Análisis de la formación de vasos sanguíneos. En el Panel A, se observan

los resultados del grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-

unidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B,



Lista de tablas

Tabla 1. Materiales empleados para la elaboración de soportes para uso en

ingeniería de tejidos.

Tabla 2.Variables de respuesta analizadas en el ensayo preclínico.

Tabla 3. Procedimientos llevados a cabo en cada tratamiento.

Tabla 4. Escala de evaluación del grado de inflamación.

Lista de símbolos y abreviaturas

% Porcentaje

± Más o menos

® Marca registrada

°C Grados centígrados

AVMA American Veterinary Medical Association

BH Borde de la herida

BSA Albúmina sérica bovina

CIN Crestas interpapilares

cm Centímetro

cm2 Centímetro cuadrado

CO2 Dióxido de carbono

DAPI Dilactato 4´, 6-diamidino-2-fenilindol

DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium) Medio de Eagle’s modificado por

Dulbecco’s

DS Desviación estándar

EDTA Ácido etilendiaminotetra-acético

EGF (Epidermal Growth factor) Factor de crecimiento epidermal

ENSAB Estudio Nacional de Salud Bucal

EP Epitelio plano

etc Etcétera

F Fibroblasto

FC Fibra de colágeno

FCN Fibras de colágeno nuevas

FGF Factor de crecimiento de fibroblastos

FITC (Fluorescein isothiocyanate) Isotiocianato de fluoresceína

FSC Fibras del soporte de colágeno

g Gramos

HR Herida reparada

IGF (Insuline Growth Factor) Factor de crecimiento parecido a la Insulina

IL Interleuquina

IFN- Interferón gama

KFG (Keratinocyte Growth Factor) Factor de crecimiento de queratinocitos

kg Kilogramo

M Molar

MEC Matriz extracelular

MEM Medio esencial mínimo

min Minutos

mg Miligramo

mL Mililitro

mm Milímetro

MMP (Matrix metalloproteinase) Metaloproteinasa de matriz

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5 difenil bromuro de tetrazolium

n Número de individuos de un subconjunto de la población.

N Número total de individuos de la población.

NADH Nicotinamida adenina dinucleótido deshidrogenasa

NaOH Hidróxido de sodio

nm Nanómetro

P Paraqueratosis

PBS (Phosphate buffered saline) Buffer salino de fosfatos

PDGF (Platelet-derived growth factor) Factor de crecimiento derivado de

plaquetas

pH Potencial de hidrógeno

SC Soporte de colágeno tipo I

SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio

SFB Suero fetal bovino

TCAA Tejido conjuntivo artificial autólogo

TGF (Transforming Growth Factor-beta) Factor de crecimiento transformante -

beta

TM (Trademark) Marca registrada

TNF- α (Tumor necrosis factor alpha) Factor de necrosis tumoral - alfa

U Unidades

VEGF (Vascular Endotelial Growth Factor) Factor de crecimiento endotelial

vascular

VS Vaso sanguíneo

vs Versus

α Alfa

β Beta

γ Gama

μg Microgramo

μL Microlitro

μm Micrómetro

Introducción

Los defectos de mucosa oral tienen gran prevalencia a nivel mundial; múltiples eventos

llegan a causar este tipo de defectos como alteraciones genéticas entre ellas labio y

paladar hendido, posiciones aberrantes de músculos como frenillos o adquiridos como

pérdida de dientes o ausencia de encía. En todos estos casos el tratamiento

convencional es el de autoinjertos, que son tomados de mucosa oral propia; esto

presenta limitaciones, como son: la extensión que pueden llegar a tener las heridas y la

morbilidad que se genera en el sitio donante. Una alternativa es la elaboración de tejidos

artificiales, que podría ayudar a superar algunas restricciones de los tratamientos

convencionales.

En trabajos previos, el Grupo de Trabajo en Ingeniería de Tejidos estandarizó un método

para elaborar soportes de colágeno (SC) tipo I. A partir de estos soportes con fibroblastos

aislados de mucosa oral de conejos, se desarrolló tejido conjuntivo oral artificial autólogo

(TCAA). Los sustitutos de tejido desarrollados fueron evaluados como injertos en heridas

de espesor parcial de mucosa oral de los conejos fuente de los fibroblastos, donde el

tejido artificial se integró y no produjo rechazo ayudando así al proceso de reparación de

heridas (Espinosa, et al., 2010; Fontanilla, et al., 2012).

La influencia de la microestructura de soportes tridimensionales en la formación in vitro

de tejidos y en la calidad del tejido formado, ha sido explorada (Madaghiele, et al., 2007).

La microestructura está definida por la porosidad, el tamaño de poro, la interconectividad

y la orientación de las fibras del soporte Este último parámetro tiene consecuencias

directas en el tipo de tejido artificial que se forma al sembrar fibroblastos. Con el ánimo

de determinar el efecto que tiene la orientación de las fibras del SC en la cicatrización, el

grupo desarrolló soportes de colágeno laminares con las fibras orientadas

unidireccionalmente (Suesca, 2013). En el mismo trabajo, se sembraron células sobre

soportes unidireccionales y multidireccionales y se comparó la orientación adquirida por

estas al crecer y formar nuevo tejido.

Para completar los estudios hechos in vitro, en esta tesis se comparó la cicatrización de

heridas tratadas con TCAA elaborado con soportes multidireccionales con la observada

en heridas contralaterales tratadas con TCAA elaborado con soportes unidireccionales,

en un modelo animal de herida mucosa de espesor parcial. En los animales fuente de las

células que se usaron para fabricar el tejido conjuntivo, se hicieron dos heridas

contralaterales de espesor parcial sobre la zona vestibular de la mucosa oral.

Aleatoriamente, cada una de las heridas fue injertada con TCAA elaborado con soportes

unidireccionales o multidireccionales. Durante el tiempo postquirúrgico se realizaron

evaluaciones clínicas. Posteriormente a se hicieron sacrificios para obtener biopsias de

las heridas incluyendo tejido sano circundante. Las muestras de tejido se analizaron

histomorfométricamente teniendo en cuenta el grosor del epitelio y el tejido conjuntivo, la

intensidad de la inflamación y la vascularización.

Los datos obtenidos indican que en las heridas injertadas con los dos tipos de TCAA, se

observó tejido conjuntivo más denso que en las zonas que cerraron por segunda

intención. Sin embargo, en las zonas tratadas con el TCAA-unidireccional fue evidente la

presencia de fibras colágenas paralelas a la superficie de la herida, así como de células

elongadas con su eje longitudinal en la misma dirección de las fibras colágenas,

mientras que en las zonas injertadas con TCAA-multidireccional las fibras del tejido

formado se orientaron azarosamente en distintas direcciones. Estos hallazgos sugieren

que en las heridas injertadas con el tejido unidireccional la contractura es mayor que en

las zonas que recibieron TCAA-multidireccional.

1. Marco teórico

1.1 Mucosa Oral

1.1.1 Características clínicas de la mucosa oral

El tejido blando que tapiza la cavidad bucal se denomina mucosa, la cual está compuesta

por epitelio y tejido conjuntivo subyacente que conforma la lámina propia. Estos dos

tejidos están conectados por la lámina basal (Figura 1). La mucosa de la cavidad bucal

puede clasificarse de acuerdo a su localización y función en mucosa de revestimiento,

masticatoria y especializada (Gómez de Ferraris & Campos, 2003; Winning & Townsend,

2000; Squier & Kremer, 2001).

Mucosa de revestimiento: Tapiza las mejillas, el paladar blando, las porciones lateral y

ventral de la lengua e interna de los labios, rara vez recibe el impacto directo del acto

masticatorio, por esta razón el epitelio es plano estratificado, no queratinizado, posee otra

capa conjuntiva denominada submucosa, que brinda gran movilidad (Gómez de Ferraris

& Campos, 2003; Winning and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001).

Mucosa masticatoria: Recubre la zona de paladar duro y encía. Recibe todas las

fuerzas que se realizan durante la masticación, el epitelio presente en ésta es plano

estratificado que puede encontrarse queratinizado o paraqueratinizado, la lámina propia

puede ser más o menos fibrosa; la submucosa está ausente lo cual lo hace carecer de

movilidad (Gómez de Ferraris & Campos, 2003; Winning and Townsend, 2000; Squier

and Kremer, 2001).

Mucosa especializada: Corresponde a la superficie dorsal de la lengua ya que las

papilas linguales poseen corpúsculos gustativos que se encargan de estímulos de

sensaciones gustativas (Gómez de Ferraris & Campos, 2003; Winning and Townsend,

2000; Squier and Kremer, 2001).

1.1.2 Características histológicas de la mucosa oral

Al estar el epitelio y el conjuntivo conectados por la membrana basal, el tejido conjuntivo

emite prolongaciones hacia el epitelio denominadas papilas coriales, a su vez el epitelio

se proyecta hacia la lámina propia en forma de evaginaciones que se interdigitan con las

papilas coriales y reciben el nombre de crestas epiteliales; esta disposición estructural

facilita la nutrición del epitelio oral al permitir una mayor proximidad con el tejido

conjuntivo (Gómez de Ferraris & Campos, 2003; Winning and Townsend, 2000; Squier

and Kremer, 2001).

Epitelio. Constituye uno de los tejidos básicos de los animales; se encuentra cubriendo

cavidades, glándulas y superficies del cuerpo. En la cavidad oral, se identifican los

siguientes tipos de epitelios.

Epitelio plano estratificado queratinizado: Está constituido por dos tipos de poblaciones

celulares: los queratinocitos (90%), células dendríticas o células claras (9%)

(melanocitos, células de Merkel y células de Langerhans) y población transitoria (1%:

granulocitos, linfocitos y monocitos). Los queratinocitos se disponen formando cuatro

estratos: basal, espinoso, corneo y basal (Figura 1). (Gómez de Ferraris & Campos,

2003; Winning and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001).

Epitelio plano estratificado paraqueratinizado: Presenta iguales características que el

queratinizado, las diferencias se observan en las células del estrato córneo puesto que

conservan sus núcleos y también algunos organelos (Gómez de Ferraris & Campos,

2003; Winning and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001).

Epitelio plano estratificado no queratinizado: Se diferencia del epitelio queratinizado

porque no produce la capa superficial córnea y carece además del estrato granuloso

(aunque pueden formarse gránulos incompletos), las capas de un epitelio no

queratinizado son: capa basal, capa intermedia y capa superficial (Gómez de Ferraris &

Campos, 2003; Winning and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001).

Conjuntivo. Las principales células son los fibroblastos, separadas por una abundante

matriz extracelular, la cual es sintetizada por ellas mismas, la matriz está compuesta por

fibras (que tienen proteínas como colágeno, elastina y fibronectina) y sustancia

fundamental amorfa que está formada por ácido hialurónico, proteínas derivadas del

suero, proteoglicanos y factores solubles (Gómez de Ferraris & Campos, 2003; Winning

and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001). Se encuentran otras células como los

histiocitos que son los precursores de los macrófagos; las células endoteliales que

recubren el sistema vascular y linfático, los mastocitos que secretan mediadores

inflamatorios, células dendríticas y macrófagos (Gómez de Ferraris & Campos, 2003;

Winning and Townsend, 2000; Squier and Kremer, 2001).

Figura 1. Histología de la mucosa oral. Principales tejidos de la mucosa oral. Fotografía original,

Grupo de Trabajo en Ingeniería de Tejidos, Universidad Nacional de Colombia.

Colágeno. Son proteínas que forman parte de matrices extracelulares a las que

confieren sus propiedades funcionales, que constituyen la familia de proteínas más

abundante en el cuerpo humano. Hasta el momento, se han identificado 28 tipos de

colágeno, los cuales se han dividido de acuerdo con las características que exhiben en

los tejidos (Ricard-Blum, 2010). Los colágenos fibrilares, están constituidos por los

colágenos I II, III, V, XI, XXIV. El colágeno I es la proteína de matriz extracelular más

abundante de la mucosa oral, el hueso y la piel. Tiene la habilidad de formar redes de

fibras que exhiben alta resistencia a la tensión; es importante en el proceso de

cicatrización, porque reemplaza gradualmente los otros tipos de colágeno cuando el

tejido es remodelado (Abou Neel et. al., 2012).

1.2 Reparación de heridas

Comienza inmediatamente después de una lesión, con el propósito de restaurar la

integridad del tejido afectado. La reparación de la lesión está sujeta a la profundidad y el

tamaño de la herida; por este motivo, la cicatrización puede clasificarse en una

cicatrización primaria (por primera intención) o secundaria (por segunda intención). La

reparación ocurre en cuatro fases sobrepuestas en el tiempo: Hemostasis, fase

inflamatoria, fase proliferativa y remodelamiento y formación de la cicatriz (Beldon, 2010;

Enoch & Leaper, 2008; Reichert, 2008; Mak et al., 2009; Young & McNaugth, 2011;

Strecker-McGraw et al., 2007; Clark & Singer, 2000; Abou Neel, et al. 2012).

1.2.1 Proceso de reparación de heridas

Hemostasis: Como primer paso se produce vasoconstricción para reducir la pérdida de

sangre, entrando inmediatamente las plaquetas que se adhieren al tejido lesionado y se

activan para liberar citoquinas, quimoquinas y factores de crecimiento (factor de

crecimiento derivado de plaquetas - PDGF, factor de crecimiento fibroblástico β - TGF-β)

que estimulan la migración de células del lecho de la herida. Después de su activación y

adhesión, las plaquetas se agregan para formar con las fibras de fibrina el coágulo

sanguíneo. Este constituye una matriz temporal con funciones hemostáticas y de soporte

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Abou%20Neel%20EA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22960357

para la adhesión de las células que migran del lecho de la herida, las cuales se encargan

de recambiar el coágulo por nuevo tejido (Beldon, 2010; Enoch & Leaper, 2008; Reichert,

2008; Mak, et al. 2009; Young & McNaught, 2011; Strecker-McGraw et al., 2007; Clark &

Singer, 2000).

Inflamación: La inflamación puede ser dividida en una fase temprana y otra tardía según

el tiempo y la duración de la respuesta y el tipo de células involucradas. La lesión tisular y

la activación de la cascada de la coagulación estimula la liberación de citoquinas

vasoactivas (como las prostaglandinas, histamina y otras aminas), lo que se traduce en

un aumento de vasodilatación local y la permeabilidad capilar. También, se produce la

migración de leucocitos polimorfonucleares encargados de la fagocitosis de los tejidos

dañados y bacterias, los cuales resultan ser las células más abundantes en la zona.

Luego de estos son los monocitos que, diferenciándose en macrófagos, incrementan el

proceso de fagocitosis e inician el recambio del coágulo formado inicialmente (Reichert,

2008; Mak, et al. 2009; Young & McNaught, 2011; Strecker-McGraw et al., 2007; Clark &

Singer, 2000).

Proliferación: Se inicia alrededor del día 3 y tiene una duración de 2-4 semanas, se

caracteriza por la migración de los fibroblastos atraídos por factores de crecimiento

(PDGF y TGF-α), la deposición de la matriz extracelular y la formación de tejido

conjuntivo altamente vascularizado o tejido de granulación. Se presenta angiogénesis

activada por Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF) y TGF-β, como un

proceso independiente a partir de vasos preexistentes. La epitelización de la herida

representa la etapa final de la fase proliferativa (Reichert, 2008; Mak, et al. 2009; Young

& McNaught, 2011; Strecker-McGraw et al., 2007; Clark & Singer, 2000).

Remodelación: Este proceso se da en el trascurso de varias semanas, la síntesis y la

remodelación de la matriz extracelular se inicia conjuntamente con el desarrollo de tejido

de granulación y continúa durante periodos prolongados, alcanzando un estado

estacionario 21 días después de la lesión. La contracción de la herida se produce a

través de las interacciones entre los fibroblastos y la matriz extracelular circundante y

está influenciada por citoquinas como el factor de crecimiento transformante-β, factor

derivado de las plaquetas y el factor de crecimiento básico de los fibroblastos. En esta

etapa, el colágeno es degradado por metaloproteinasas específicas producidas por los

fibroblastos, neutrófilos y macrófagos presentes en el sitio de la herida; sus fibrillas son

reordenadas y disminuye la proporción de colágeno tipo III, incrementándose la de

colágeno tipo I. Al comienzo las fibras de colágeno se organizan al azar y exhiben baja

resistencia; con el tiempo, el grosor de las fibrillas y las uniones interfibrillas aumentan lo

que incrementa su grosor (Diegleman & Evans, 2004; Hosgood, 2006; Reichert 2008;

Mak et al. 2009; Young & McNaught, 2011, Strecker-McGraw et al., 2007, Clark &

McNaught 2000, Enoch & Leaper, 2008, Beldon, 2010; Schultz & Wysocki, 2009).

1.2.2 Tipos de cicatrización

Cicatrización primaria: Ocurre cuando se causa una disrupción focal de la continuidad

de la membrana basal epitelial y del conjuntivo en el tejido subyacente; presentándose,

un equilibrio adecuado en el proceso de proliferación celular, metabolismo del colágeno y

actividad de las metaloproteinasas de la matriz. En consecuencia, la herida cierra

después de su creación, ayudada por la aproximación de los bordes con sutura o con

algún otro mecanismo mecánico (Beldon, 2010; Enoch & Leaper, 2008; Reichert, 2008).

Cicatrización secundaria: Se presenta cuando hay pérdida extensa de tejido blando. La

regeneración de las células epiteliales por sí sola no puede restaurar la arquitectura

original, por lo que se produce un crecimiento interno de tejido de granulación en el borde

de la herida, seguido por la acumulación de matriz extracelular con la fijación de

colágeno. Este proceso genera contracción de la herida y posterior epitelialización

(Beldon, 2010; Enoch & Leaper, 2008).

1.2.3 Migración celular en la reparación de heridas

La migración de plaquetas, polimorfonucleares, macrófagos, células endoteliales, entre

otras, del lecho de la herida, juega un papel central en su reparación. Propiedades físicas

y químicas de las células, así como la señalización de los componentes de la matriz

extracelular, modulan ese desplazamiento. Durante su locomoción, las células adquieren

una asimetría espacial que conduce a la polarización morfológica inicial, que impulsada

por rearreglos del citoesqueleto de actina forma un seudópodo, que se une a los

componentes del coágulo. Una vez unida la primera parte de la célula, ésta desplaza su

parte distal para terminar el anclaje y comenzar a secretar sustancias que degradan y

reemplazan el coágulo de fibrina que actúa como matriz provisional (Lauffenburger &

Horwitz, 1996; Lauffenburger & Wells, 2003; Friedl & Wolf, 2009). Estos movimientos son

colectivos y producen una migración ordenada, en la que fibroblastos que se encuentran

en el borde de la herida se polarizan simultáneamente y migran en forma laminar. Al

anclarse, las células reemplazan la matriz provisional del coágulo con fibras de colágeno

que inducen la contracción de la herida (Goldman, 2004; Enoch & Leaper, 2005; Sorokin,

2010).

1.3 Tratamientos de defectos en mucosa oral e ingeniería de tejidos

El tratamiento convencional de lesiones de tejidos blandos es el autoinjerto. A pesar de

que no produce rechazo, presenta limitaciones como la morbilidad y cicatrización por

segunda intención del sitio donante, en caso de necesitarse gran cantidad de tejido hace

que la escasez de tejido disponible para injerto sea restrictivo por este motivo deben

tomarse incluso tejidos de otras zonas del cuerpo mostrando en el proceso de reparación

la retención de las características originales del tejido (Janssen, et al., 2013; Lauer, et al.,

1991; Ueda, et al., 1991; Cooper, et al.,1993; Wang, et al., 2005).

La ingeniería de tejidos es un “Campo interdisciplinario que aplica los principios de la

ingeniería y de las ciencias de la vida para el desarrollo de sustitutos biológicos que

restauren, mantengan y mejoren la función de un tejido” (Langer & Vacanti, 1993;

McGuire, 2003), usando herramientas como soportes, células y reguladores (Lamme, et

al., 1998; Lamme, et al., 2000). Varios productos de ingeniería de tejidos han sido

desarrollados para uso en mucosa oral, entre los que se encuentran láminas de

queratinocitos (Lauer, 1994; Tsai, et al., 1997), soportes acelulares, dermis humana y

submucosa gástrica porcina descelularizada (Badylak & Gilbert, 2008), conjuntivo

artificial (Wong, et al., 2007; Rodríguez, et al., 2010; Espinosa, et al., 2010) y mucosa

artificial completa (Izumi, et al., 2003a; Izumi, et al., 2003b). En una revisión reciente

llevada a cabo por nuestro grupo de investigación (Fontanilla, et al., 2013), se

encontraron dos sustitutos celulares de mucosa oral con aprobación terapéutica oficial

para ser distribuidos comercialmente: Bioseed-M® que consiste en un soporte de fibrina

cultivado con células autólogas de mucosa oral (Vanscheidt, et al., 2007) y GINTUITTM

compuesto por fibroblastos y queratinocitos heterólogos de prepucio de neonato en un

soporte de colágeno (McGuire, et al., 2011; Schmidt, 2012).

1.4 Soportes y microestructura en ingeniería de tejidos

Para elaborar sustitutos de mucosa oral y piel, se emplean soportes tridimensionales

elaborados con biomateriales sintéticos o naturales, biodegradables y biocompatibles.

También, se utilizan tejidos naturales descelularizados como válvulas cardíacas. La

Tabla 1, muestra los materiales más empleados para la elaboración de soportes

tridimensionales. Unos y otros exhiben una microestructura característica, que determina

su interacción con las células y su bioactvidad (Zeltinger, 2001).

Tabla 1. Materiales empleados para la elaboración de soportes para uso en

ingeniería de tejidos.

Biomaterial

Referencia

Proteínas: Colágeno, fibrina y elastina

Caves, et al., 2011; Gomes, et al., 2012

Polisacáridos: Glicosaminoglicanos, quitosan

Bhardwaj, et al., 2011

Polihidroxialcanoatos: Polihidroxibutirato

Burkoth, et al., 2000

Poliesteres Petersen, et al., 2011; Griffin, et al., 2010, Buxton, et al., 2007;

Polipéptidos sintéticos Kumada & Zhang, 2010

La microestructura de los soportes está definida por las siguientes características:

Porosidad: Es la medida de la fracción de espacio vacío del soporte y delimita la

cantidad de material que lo compone. Para una adecuada eficiencia de siembra y

crecimiento de células en el soporte, se necesita alta porosidad (Gibson, 2005).

La porosidad afecta la difusión de los nutrientes, factores de crecimiento,

citoquinas, metabolitos y productos de desecho a través del soporte (Karande, et

al., 2004).

Tamaño de poro: Es el tamaño del espacio dejado por la sustancia empleada

como agente porógeno. Debe ser lo suficientemente grande para que las células

migren dentro del soporte y lo pueblen. Esta variable afecta la morfología,

expresión fenotípica y viabilidad celular (Yannas, 2005; O'Brien, et al., 2005;

O'Brien, et al., 2007).

Interconectividad: La interconectividad hace referencia a la existencia de

comunicación entre los poros. La porosidad no interconectada presenta

membranas entre poros adyacentes, aislando el ambiente de cada poro. En

ingeniería de tejidos es deseable que los poros estén interconectados para

permitir la invasión celular, vascularización, interacción y difusión de nutrientes y

productos de desecho (Freyman, et al., 2001).

Orientación: la orientación de las fibras de los soportes debe estar acorde con la

orientación natural de las fibras en los tejidos que se quieren reemplazar. Algunos

tejidos como tendón y nervios son alineados; por eso se han desarrollado

soportes unidireccionales con fibras orientadas longitudinalmente. La fabricación

de soportes unidireccionales ha sido investigada en la regeneración de nervios

periféricos (Stokols & Tuszynski, 2004; Chamberlain, et al., 1998), médula espinal

(Spilker, et al., 2001), tendón (Louie, et al., 1997; Liu, et al. 2007), y córnea (Wray

& Orwin, 2009) y hueso (Silva, et al., 2006; Yunoki, et al. 2007). Estudios en

modelos animales han demostrado que la microestructura afecta el fenotipo de

fibroblastos de córnea, que se logra con la disminución de la expresión de alfa-

actina en fibroblastos corneales de conejo (Wray & Orwin, 2009). Es así como las

matrices de colágeno definen sus propiedades por su estructura, siendo más

popular en el mercado la multidireccionalidad de las fibras, no hay evidencia

directa que la unión de células a matrices orientadas al azar desoriente el eje

longitudinal de estas. (Soller, et al., 2012).

La orientación de las fibras, tiene consecuencias directas en el tipo de tejido que se

forma en una herida. El patrón de deposición de las fibras de colágeno en heridas del

feto es reticular (multidireccional) e indistinguible del tejido normal adyacente, mientras

que en las heridas del adulto, que cierran por segunda intención, es unidireccional y

caracterizado porque los haces de colágeno depositados son largos y paralelos a la

superficie de la herida. Esta organización del tejido cicatrizal del adulto, dificulta la

migración de los fibroblastos a través de la matriz extracelular neo-formada, por lo que

estos se desplazan a lo largo del margen de la herida provocando la contracción (Adzick

& Lorenz, 1994). En contraposición, el tratamiento de las heridas de tejido conjuntivo con

sustitutos de tejido artificiales proporciona un soporte con organización reticular que

estimula una orientación de las células y procesos de deposición de colágeno similares a

los observados en el tejido cuando el individuo se está formando haciendo que se

favorezca su regeneración (Yannas, 1998; Abou Neel, et al., 2012; Yannas, 2013).

Los resultados de estudios pre-clínicos y clínicos de soportes sembrados o no con

células, sugieren la hipótesis de que estos inhiben la contracción debido a que

establecen una conexión temprana con las células contráctiles (miofibroblastos) del lecho

de la herida, que limita su alineación unidireccional y la generación de fuerzas que

aumentan la contractura (Yannas, 1998). De ahí, la importancia de evaluar el efecto que

tiene la organización microestructural de los poros del soporte de colágeno, en el

crecimiento de fibroblastos y la morfología del tejido resultante (Yannas, 2013).

1.4.1 Células

Cuando los daños de los tejidos y órganos son extensos, el uso del soporte solo no

garantiza que se inhiba la cicatrización con contractura y la reparación (Reing, et al.,

2009; Yannas, 2013). Por eso, se ha recurrido a la elaboración de tejido y órganos

artificiales sembrando células en soportes tridimensionales que semejen la estructura

que se quiere reemplazar. En la elaboración de piel o mucosa oral artificial, se usan

células indiferenciadas y células diferenciadas (Berry, et al., 1998; Yannas, 2013). Los

sustitutos que cuentan con aprobación oficial emplean fibroblastos y queratinocitos

aislados de biopsias de piel o de mucosa oral homólogas (Vanscheidt, et al., 2007;

McGuire, et al., 2011; Schmidt, 2012). Las células se usan en pasajes tempranos puesto

que la producción de matriz extracelular disminuye al incrementar el número de pasajes

(Takeda, et al., 1992; Khorramizadeh, et al., 1999, Yannas, 2013). La mayoría de


sustitutos comerciales aprobados son acelulares, debido a que la inclusión de células en

el soporte le confiere las características de un tejido vivo.

1.4.2 Reguladores

La inclusión de células en los soportes obliga a que se utilicen reguladores que señalicen

a las células para que proliferen y diferencien. Estos pueden ser físicos (ej.: Fuerzas

mecánicas, luz ultravioleta, electricidad, campos magnéticos, etc.) y químicos (ej.:

factores de crecimiento, hormonas, citoquinas, nutrientes, etc.). Dentro de los

compuestos químicos más importantes, se encuentran los medios de cultivo encargados

de suplir los nutrientes, factores de crecimiento y citoquinas que las células necesitan

para vivir. Los medios de uso corriente para el cultivo de mucosa oral, son: Medio Eagle

modificado por Dulbecco (DMEM) y Ham F-12 (Izumi, et al., 2000; Espinosa, et al., 2010;

Yannas, 2013).

2. Formulación del problema

El Estudio Nacional de Salud Bucal más reciente (ENSAB III, 1998), refiere que en

Colombia el 50.2% de la población presenta pérdida de inserción gingival (42.0% de las

personas presentan una pérdida localizada y el 8.2% generalizada) y el 45% de las

personas adultas jóvenes han perdido algún diente debido a un accidente o enfermedad

dental o de la encía. La enfermedad congénita labio y paladar hendido, en el país tiene

una prevalencia de 1:1000 (Chavarriaga & González, 2010) y el Instituto Nacional de

Cancerología reportó 146 nuevos casos de cáncer con localización primaria en cavidad

oral y faringe (Instituto Nacional de Cancerología, 2009). Todas estas lesiones llevan a

cirugías periodontales, cirugías preprotésicas, cirugía de implantes dentales y cirugías

reconstructivas que requieren injertos.

Cuando se encuentran lesiones con grandes extensiones, las zonas donantes comienzan

a ser limitadas por la extensión del defecto a cubrir; adicionalmente, el sitio donante

cicatriza por segunda intención provocando alteraciones estéticas y en algunos casos

funcionales. Los productos de ingeniería de tejidos son una fuente alternativa de tejido

para injerto (Clark, 2000; Izumi, et al. 1999; Herson, et al., 2001; Hildebrand, et al., 2002;

Moriyama, et al., 2001; Ma, et al., 2003)

En el Grupo de Trabajo de Ingeniería de Tejidos se ha estandarizado la elaboración de

sustitutos de mucosa oral (soportes de colágeno-SC y tejido conjuntivo artificial autólogo-

TCAA) en evaluación preclínica (Bello, et al., 2004; Fontanilla, et al., 2006; Espinosa, et

al., 2010). Los datos obtenidos muestran que cuando se injertan en heridas que al

dejarse cerrar por segunda intención cicatrizan con contractura, promueven la formación

de tejido conjuntivo con características histológicas similares a las del tejido sano

circundante (Espinosa, et al., 2010).

La influencia de la microestructura de soportes tridimensionales en la formación in vitro

de tejidos y en la calidad del tejido formado, ha sido explorada (Madaghiele, et al., 2007).

Con el ánimo de determinar el efecto que tiene la orientación de las fibras del SC en la

cicatrización, el grupo desarrolló soportes de colágeno laminares con las fibras

orientadas unidireccionalmente (Suesca, 2013). En el mismo trabajo, se sembraron

células sobre soportes unidireccionales y multidireccionales y se comparó la orientación

adquirida por estas al crecer y formar nuevo tejido, mostrando una orientación elongada

en el caso de los soportes unidireccionales paralelas a las fibras colágenas. El desarrollo

de los soportes in vitro hace que deba probarse su respuesta in vivo, por esto surge este

trabajo donde de forma preclínica se comparó la cicatrización de heridas tratadas con

TCAA elaborado con soportes multidireccionales con la observada en heridas

contralaterales tratadas con TCAA elaborado con soportes unidireccionales, en un

modelo animal de herida mucosa de espesor parcial.

3. Hipótesis

La reparación de heridas de espesor parcial de mucosa oral en conejo injertadas

con TCAA elaborado con soportes de colágeno multidireccionales o con soportes

unidireccionales es igual.

4. Objetivos

4.1. Objetivo general

Evaluar clínica e histomorfométricamente el proceso de reparación en heridas de mucosa

oral injertadas con TCAA elaborado con soportes de colágeno unidireccionales y

multidireccionales.

4.2. Objetivos específicos

Construir y caracterizar histológicamente TCAA a partir de fibroblastos y soportes de

colágeno unidireccionales y multidireccionales.

Comparar el cierre de heridas mucosas de espesor parcial injertadas con tejido

conjuntivo artificial autólogo elaborado con soportes de colágeno unidireccionales y

multidireccionales.

5. Metodología

5.1 Diseño experimental

Se llevó a cabo un ensayo preclínico en el que la asignación de las unidades

experimentales a los diferentes tratamientos efectuados fue realizada de una manera

aleatoria. La verificación de supuestos se realizó mediante pruebas no paramétricas

(prueba Kruskal-Wallis) para características de una población que no obedecen a una

distribución normal. El control de error se hizo con un diseño completamente

aleatorizado; además, cada zona de tratamiento fue comparada con una zona adyacente

a este tratamiento, estableciéndose así el control pareado para cada muestra. Las

variables de respuesta evaluadas se incluyen en la Tabla 2. Los datos correspondientes

a estas variables se analizaron usando un nivel de significancia de α=0.05.

Tabla 2.Variables de respuesta analizadas en el ensayo preclínico.

ENSAYO VARIABLES DE RESPUESTA

Análisis histológico Porcentaje de recuperación en el número de capas del epitelio

Porcentaje de recuperación en el grosor del epitelio

Porcentaje de recuperación en el grosor del tejido conjuntivo

Nivel de infiltrado inflamatorio

Nivel de vascularización

Las comparaciones de los tratamientos, llevaron a la definición de 3 procedimientos

diferentes mostrados en la Tabla 3.

Tabla 3. Procedimientos llevados a cabo en cada tratamiento.

TIPOS DE PROCEDIMIENTO

TRATAMIENTO TRATAMIENTO

Procedimiento 1 TCAA-unidireccional Control

Procedimiento 2 TCAA-multidireccional Control

Procedimiento 3 TCAA-unidireccional TCAA-multidireccional

Esta tesis se desarrolló en dos fases. En la primera, se obtuvo y caracterizó

histológicamente el TCAA construido con soportes unidireccionales y multidireccionales.

En la segunda fase, en los conejos fuente de las células se comparó el proceso de

cicatrización de heridas de mucosa oral de espesor parcial injertadas con TCAA,

elaborado con soportes multidireccionales o con soportes unidireccionales.

5.2 Consideraciones éticas

Este trabajo se enmarcó en el proyecto “Estudio del efecto de la microestructura de

soportes de colágeno en el proceso de reparación de heridas inducidas en mucosa oral

de conejo” el cual fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Ciencias el 06

de mayo de 2008 (acta 01).

La manipulación de los animales fue llevada a cabo siguiendo los lineamientos

internacionales [Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos de América (National

Association for Biomedical Research, 2007; National Institute of Health, 1996), ARVO] y

nacionales [Artículo 11 de la Resolución nº 008430 de 1993 del Ministerio de Salud y Ley

84 del 27 de diciembre de 1989] con el fin de minimizar el sufrimiento animal. Todos los

procedimientos fueron llevados a cabo por personal calificado. Los desechos biológicos

se guardaron refrigerados en bolsas rojas, mientras eran recogidos para su incineración.

5.3 Análisis estadístico

5.3.1 Definición de variables

Primera fase: Se observó si hubo o no presencia de células en los soportes.

Segunda fase: La variable independiente fue el tratamiento utilizado en las heridas de

espesor parcial de mucosa oral de los conejos: injerto de TCAA unidireccionado,

multidireccionado y cierre por segunda intención (control). Las variables dependientes o

de respuesta fueron numéricas: porcentaje de recuperación en el número de capas del

epitelio, porcentaje de recuperación en el grosor del tejido conjuntivo, nivel de infiltrado

inflamatorio referido a intensidad (conteo de linfocitos por área) y cambio en la

vascularización (conteo de capilares por área).

5.4 Elaboración de soportes de colágeno tipo I (SC) y tejido conjuntivo artificial autólogo (TCAA)

5.4.1 Elaboración de soportes de colágeno.

Los soportes de colágeno tipo I fueron elaborados con fascia bovina de acuerdo con el

procedimiento estandarizado en el Grupo de Trabajo en Ingeniería de Tejidos (Pérez, et

al., 2001, Suesca, 2013). La fascia se limpió y cortó en pedazos pequeños, que se

sumergieron en ácido acético 0.01M y se mantuvieron a 4°C hasta disolución. La

suspensión se llevó a una concentración de 5mg/mL, se sirvió en moldes, se congeló y

se liofilizó por 48 horas. Los soportes obtenidos se entrecruzaron con glutaraldehído, se

lavaron con agua hasta no detectar agente entrecruzante y se volvieron a liofilizar. En el

congelamiento se usaron dos procedimientos diferentes, con el fin de obtener soportes

multidireccionales (Espinosa, et al., 2010) y soportes unidireccionales (Suesca, 2013).

5.4.2 Aislamiento y cultivo de fibroblastos

Los fibroblastos se aislaron de cada uno de los conejos que se utilizaron en el ensayo

preclínico. Se usaron 36 machos de raza Nueva Zelanda, de 3 meses de edad y un peso

aproximado de 2-4 kg. Bajo anestesia general por inyección intramuscular con clorhidrato

de ketamina (Imalgene® 1000) 35mg/kg y xylazina (Seton®2%) 5mg/kg y anestesia local

infiltrativa con 0.5 mL lidocaína al 1% epinefrina 1:200.000, se tomaron biopsias de

mucosa oral de la zona vestibular de incisivos inferiores, de cada uno de los conejos. El

tejido de aproximadamente 3 x 5 mm se transportó en medio DMEM suplementado con

4x antibióticos y antimicótico (penicilina-estreptomicina, fungizona y gentamicina). En él

laboratorio, las muestras se lavaron 5 veces con solución amortiguadora de fosfatos

salina PBS 1X (pH 7.4), suplementada con 4X [penicilina 200 U/mL, estreptomicina 200

ug/mL y anfotericina a 0,5 g/mL] (Gibco, Invitrogen, Grand Island, NY, USA)]. Después

del lavado, las muestras se cortaron en pequeños fragmentos o explantes (1 x 1 x 1 mm).

Los explantes se sembraron en cajas de 6 pozos y se cubrieron con DMEM (Gibco,

Invitrogen) suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB) (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO, USA), aminoácidos no esenciales 1% (Gibco, Invitrogen), piruvato de

sodio 1% (Gibco, Invitrogen), vitaminas 1% (Sigma Chemical Co.), penicilina 100 UI /mL,

estreptomicina 100 μg /mL (Gibco, Invitrogen) y anfotericina B (0,25 μg/mL) (Gibco,

Invitrogen). Los cultivos se incubaron en atmósfera húmeda (5% de CO2) a 37oC durante

dos semanas y se realizaron dos cambios de medio semanalmente. Después de alcanzar

la confluencia, las células fueron disgregadas con solución de tripsina/ ácido

etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,25%/0,025%) (GibcoBRL, Life Technologies, USA)

por 5min a 37°C. La tripsina fue neutralizada empleando 5 mL de medio de cultivo con

10% de suero fetal bovino. La suspensión celular resultante fue centrifugada, lavada con

PBS y las células contadas empleando una tinción vital (Espinosa et al., 2010; Suesca

2013).

5.4.3 Elaboración de tejido conjuntivo artificial autólogo

Fibroblastos de segundo pasaje, fueron sembrados (500.000 células/cm2) en los soportes

de colágeno e incubados por una semana en atmósfera húmeda (5% de CO2) a 37oC. Al

séptimo día el TCAA obtenido fue injertado, dejando muestras para el análisis histológico

(Espinosa et al., 2010; Suesca 2013).

Análisis histológico. Las muestras de TCAA fueron fijadas en una solución de formol al

10% en PBS, pH 7,4 a 4 °C durante 24 horas. Después de deshidratar usando series

ascendentes de etanol (70%-80%-90%-100%), se transfirieron a una solución de xilol al

100% por 30 minutos, se embebieron en parafina y con ayuda de un micrótomo se

obtuvieron cortes histológicos de cinco micrómetros de espesor que se colocaron en

láminas portaobjetos y fueron teñidos con hematoxilina – eosina. Los cortes fueron

observados con un microscopio de luz.

Viabilidad de las células sembradas en los soportes. La viabilidad fue evaluada

usando el kit Vybrant® MTT bromuro de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-difenil tetrazolium]

Cell Proliferation Assay Kit (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), de forma cualitativa

siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del tratamiento, las muestras fueron

observadas con un microscopio de luz invertido (Nikon Eclipse TS100, Japan).

Paralelamente, el formazán precipitado dentro de las células del tejido artificial fue

solubilizado con 500 µL de isopropanol e incubando por 10 minutos en atmósfera

húmeda (5% de CO2) a 37°C.

Evaluación del tejido artificial con microscopía confocal: El tejido artificial fue fijado

con paraformaldehído 10% por 24 horas y lavado con buffer de fosfatos (PBS) (pH 7,4).

Después de permeabilizar con Tritón X-100 al 0,2% en PBS con Albúmina Sérica Bovina

(BSA) al 1% por 20 minutos, se lavó dos veces con PBS por 10 minutos y se agregó

dilactato 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 30nM (Invitrogen, USA) y faloidina conjugada

con rodamina 41,2nM (Invitrogen, USA), por 20 minutos. La tinción se retiró, se hicieron 6

lavados consecutivos con PBS y las muestras fueron observadas con un microscopio

confocal (Nikon C1Plus ECLIPSE Ti). La excitación de las muestras se hizo con laser

diodo 17 MW de 408nm, laser argón 50 MW de 488nm y laser HeNe 1 MW de 543nm. En

las tinciones fueron incluidos como controles, soportes de colágeno sin células y

fibroblastos de mucosa oral de conejo sembrados en láminas Lab-Tek II (Nalge Nunc,

USA).

5.4.4 Evaluación de la reparación de heridas mucosas de espesor parcial

Para establecer el número de conejos a incluir en este análisis, se llevaron a cabo

simulaciones empleando datos preliminares del grupo, con el software R Project for

Statistical Computing versión 2.6.0, utilizando una diferencia esperada del 5 % (Espinosa,

et al. 2010). Se establecieron tres grupos, cada uno con 12 conejos, los cuales fueron

sacrificados a las dos semanas de haberse realizado el tratamiento. En el primer grupo,

se hicieron dos heridas contralaterales que al azar fueron injertadas con soportes

unidireccionales o dejadas cerrar por segunda intención (Control). En el segundo grupo,

las heridas fueron injertadas con TCAA elaborado con soportes multidireccionales o

dejadas cerrar por segunda intención (Control). En el tercer grupo, las heridas fueron

injertadas al azar con TCAA elaborado con soportes unidireccionales o con TCAA

elaborado con soportes multidireccionales.

Bajo anestesia general por inyección intramuscular de clorhidrato de ketamina

(Imalgene® 1000, 35mg/kg de peso) y xylazina (Seton®2%, 5mg/kg) y anestesia local

infiltrativa con 5 mL de una solución de lidocaína al 1% - epinefrina 1:200.000, se

crearon heridas en la zona vestibular del maxilar superior, en la región ubicada entre la

línea mucogingival y el borde gingival libre de las zonas edéntulas que existen entre

incisivos y premolares. Con un molde se delimitó el área de tejido (1.0 x 0.8 cm), se

hicieron incisiones y se retiró el tejido de espesor parcial preservando el periostio. Todas

las heridas se manejaron con la misma técnica quirúrgica y fueron realizadas por la

misma cirujana. En las heridas se colocó el material para injerto, previamente cortado de

acuerdo al tamaño del defecto, y se inmovilizó mediante puntos simples con suturas

absorbibles de ácido poliglicólico 5-0 (LOOKTM - POLYSYNTM).

5.4.5 Manejo y cuidado postoperatorio de los conejos

Durante el período postoperatorio se realizaron evaluaciones diarias del estado de salud

de los animales (Exámen clínico general y oral, revisión de condiciones de alojamiento,

etc.). Después de la cirugía, se aplicó una dosis única para analgesia con meloxicam de

0,2 mg/kg vía intramuscular (Melocam®, La Francol S.A., Cali, Valle del Cauca,

Colombia).

5.4.6 Evaluación clínica de las heridas tratadas

La evaluación clínica de las heridas fue realizada en compañía de un médico veterinario

los días 3, 7, 11 y 14 post-cirugía. Los parámetros a considerar para la evaluación, fueron

presencia de inflamación y ocurrencia de infección; en las heridas injertadas, también se

determinó la permanencia del injerto y de las suturas.

5.4.7 Evaluación histomorfométrica de las heridas tratadas

Los grupos de animales tratados fueron sacrificados mediante administración, en la vena

marginal de la oreja, de una solución concentrada de anestésicos no inhalantes tipo

barbitúricos [(pentobarbital sódico (200 mg/mL) y fenilhidantoína (Eutanex®, Aprofarm

Ltda., Bogotá D.C., Colombia)], a dosis de 1 mL/ 5 kg de peso. La eutanasia de estos

animales fue realizada por el auxiliar del Bioterio Central de la Facultad de Veterinaria y

Zootécnia de la Universidad Nacional de Colombia, siguiendo los protocolos descritos en

“Report of the AVMA Panel on Eutanasia” (Ministerio de Salud, 1993; American

Veterinary Medical Association, 2007).

Para los análisis histológicos, se tomaron biopsias de espesor total que incluían tejido

mucoso oral del área injertada y el tejido sano circundante, utilizado como control. Las

biopsias se fijaron en una solución de formol al 10% en PBS, pH 7,4 a 4° C, se

deshidrataron en series ascendentes de etanol (70%-80%-90%- 100%) y se transfirieron

a una solución de xilol al 100% por 30 minutos. Posteriormente, las muestras fueron

embebidas en parafina y con ayuda de un micrótomo se obtuvieron cortes histológicos,

de cinco micrómetros de espesor que se colocaron en láminas portaobjetos y fueron

teñidos con hematoxilina – eosina. Para realizar las evaluaciones histológicas, se utilizó

un microscopio de luz (DSF 1-U2; Nikon, Tokyo, Japan) y se tomaron fotografías con una

cámara digital adaptada a este (cámara Digital sight DS-2Mv, Nikon, Japón). En la

imagen obtenida se delimitó el área sana y el área tratada o cerrada por segunda

intención, según el caso y en cada una se realizaron mediciones de las variables

numéricas establecidas con ayuda del software Image J [versión libre obtenida por medio

electrónico del National Institutes of Health (NIH), USA]. Las imágenes histológicas

fueron analizadas llevando a cabo un estudio ciego en el cual participaron dos

observadores (un patólogo oral y una periodoncista).

El espesor del epitelio y del tejido conjuntivo fue medido en las áreas injertadas y las

áreas adyacentes a las injertadas. Para esto se realizó una división imaginaria de la

lámina en 5 secciones, las de cada extremo fueron consideradas como adyacentes o

control interno de la lámina y las tres centrales como el área intervenida (Ver Figura 2). A

cada sección se le tomó una fotografía con el software NIS ELEMENTS AR2.30 Build

309 (Nikon) en el microscopio (DSF 1-U2; Nikon, Tokyo, Japan). De cada imagen digital

se realizaron diez mediciones aleatorias del espesor del epitelio y el tejido conjuntivo, se

compararon los valores promedios de las áreas injertadas con los valores promedios de

las áreas adyacentes (control) para evaluar las diferencias significativas (p valor <0,05).

Figura 2. Método de análisis de biopsias. A: Disposición de las biopsias en la lámina. B:

Magnificación del corte a evaluar, el cual es dividido en 5 porciones donde II, III y IV es la zona

tratada, I y V son las zonas adyacentes a la zona tratada.

Para evaluar el grado de inflamación, en diez campos consecutivos se realizó el conteo

de células inflamatorias y se calculó el valor promedio de estos. Adaptando

procedimientos descritos (Espinosa, et al., 2010; Morton & Dongari-Bagtzoglou, 2001), el

valor promedio obtenido se intercaló en un rango de valores para clasificar la inflamación

como nula, leve, moderada y severa, en función del número de células inflamatorias

observadas. En la Tabla 4 se muestra la relación establecida entre el promedio de

células inflamatorias y el grado de inflamación. La angiogénesis fue determinada

contando los vasos presentes en las zonas tratadas y en las heridas control; este

procedimiento fue llevado a cabo de la misma forma en que se contaron las células

inflamatorias.

Tabla 4. Escala de evaluación del grado de inflamación.

Número de células inflamatorias por campo

microscópico observado

Grado de

Inflamación

Menos de 10 Nula

10 a 30 Leve

30 y 50 Moderada

Más de 50 Marcada

6. Resultados

6.1 Objetivo específico No. 1: Construir y caracterizar

histológicamente TCAA a partir de fibroblastos y soportes de colágeno unidireccionales y multidireccionales.

6.1.1 Características morfológicas e histológicas del TCAA

Para estos análisis se tomaron muestras de los tejidos obtenidos sembrando fibroblastos

de mucosa oral gingival en soportes de colágeno uni y multidireccionales, e incubando

por siete días. Se encontró TCAA con características similares a las encontradas en la

literatura (Espinosa et al., 2010); la Figura 3, muestra imágenes representativas de los

cortes del tejido elaborado con soportes unidireccionales (Paneles A y B) y

multidireccionales (Paneles C y D. En las imágenes del tejido producido con soportes

unidireccionales se observa la direccionalidad de las fibras y fibroblastos adheridas a

estas, que exhiben una morfología elongada (Panel A). La magnificación de una región

del tejido unidireccional, claramente evidencia que el eje mayor de los fibroblastos

elongados se orienta paralelamente a las fibras del soporte (Panel B).

C D

Figura 3. Análisis histológico de TCAA elaborado con soportes de colágeno

unidireccionales y multidireccionales. TCAA-unidireccional (Panel A); imagen con mayor

resolución de la región del TCAA-unidireccional, enmarcada dentro del recuadro (Panel B).

TCAA-multidireccional (Panel C); imagen con mayor resolución de la región del TCAA-

multidireccional, enmarcada dentro del recuadro (Panel D). Convenciones usadas: Fibras de

colágeno del soporte (FCS); fibras de colágeno sintetizadas por los fibroblastos (FCF); matriz

extracelular (MEC) secretada por las células.

6.1.2 Viabilidad celular del TCAA con MTT

Se encuentra viabilidad celular del TCAA, las imágenes de tejidos teñidos con MTT

obtenidas con microscopia de luz, evidencian la viabilidad de los fibroblastos sembrados

(Figura 4). En el tejido obtenido con soportes unidireccionales se observan células

teñidas orientadas unidireccionalmente y en paralelo con las fibras (Panel A); mientras

que, en el tejido elaborado con soportes multidireccionales se observan células teñidas

orientadas en diferentes direcciones (Panel B). TCAA-unidireccional

Figura 4. Tinción con MTT de TCAA elaborado con soportes unidireccionales o

multidireccionales. Imagen de corte de TCAA-unidireccional; las flechas señalan células viables

aparentemente orientadas en la misma dirección de las fibras unidireccionales (Panel A). Imagen

de corte de tejido multidireccional; las flechas señalan células viables orientadas en múltiples

direcciones (Panel B).

A B

6.1.3 Evaluación del TCAA con microscopía confocal

Se usó microscopía confocal para evaluar TCAA elaborado con células inmunoteñidas

con DAPI, tinción fluorescente que se une al DNA. La Figura 5, Panel A, muestra

imágenes representativas de TCAA elaborado con soportes unidireccionales en las que

se observan fibroblastos adheridos a lo largo de las fibras unidireccionales. No se puede

apreciar la morfología elongada de estas, debido a que la tinción es núcleo-específica y

no permite evidenciar el citoplasma celular. El Panel B de la misma figura, muestra

células adheridas a las fibras orientadas multidireccionalmente del soporte. A pesar de no

ser evidente la morfología celular, claramente se aprecia la ubicación aleatoria de las

células adheridas a las fibras orientadas multidireccionalmente; estas imágenes

evidencian la distribución tridimensional de las células compatible con las características

de TCAA.

Figura 5. Microscopía confocal de TCAA. La figura presenta imágenes de microscopia confocal

de TCAA elaborado con soportes unidireccionales (Panel A) y TCAA elaborado con soportes

multidireccionales (Panel B).

A B

6.2 Objetivo específico No. 2: Comparar el cierre de heridas

mucosas de espesor parcial injertadas con tejido conjuntivo artificial autólogo elaborado con soportes de colágeno unidireccional y multidireccional.

6.2.1 Seguimiento clínico de los tratamientos

En todos los conejos se usaron heridas contralaterales de características similares, para

aplicar al azar los tratamientos evaluados. La Figura 6, muestra el seguimiento de una

herida injertada con TCAA-unidireccional y su control (Cierre por segunda intención). En

la herida control y en el injerto posicionado con suturas en la herida tratada, al día 0

(Paneles A y B), son evidentes las características de la herida, el tipo de sutura realizada

en la zona injertada y el efecto hemostático del soporte después de ser fijado en el lecho

de la herida. Al séptimo día en la herida injertada se aprecia tejido de granulación en los

bordes, remodelación parcial del TCAA y remanentes de sutura; también, se puede

apreciar que los bordes de la herida control son más elevados y blancos que los de la

herida que fue injertada (Paneles C y D, respectivamente). En el día 14 se encontró que

la herida control carecía de continuidad entre la zona de cicatrización y la mucosa sana

adyacente (Panel E); mientras que la herida injertada epitelializó con consistencia firme y

resilente y adquirió coloración similar a la de la mucosa sana circundante.

Control TCAA - Unidireccional

Figura 6. Progresión temporal del proceso de reparación de heridas injertadas con TCAA-

unidireccional y de control. Apariencia de la herida control y de la herida injertada al día 0

(Paneles A y B, respectivamente), día 7 (Paneles C y D) y día 14 (Paneles E y F). Las flechas

señalan los bordes de la herida control (b) y la zona injertada (zi) en el día 14.

La Figura 7, muestra las imágenes del seguimiento de la herida injertada con TCAA-

multidireccional y su control. Al igual que en las heridas injertadas con TCAA-

unidireccional, en el día 0 son evidentes las características de la herida, el tipo de sutura

realizada en la zona injertada y el efecto hemostático del soporte (Paneles A y B). En el

séptimo día en los bordes de la herida injertada se aprecia tejido de granulación; así

como, TCAA remodelado y remanentes de sutura. Claramente se ve que los bordes de la

herida control son más elevados y blancos que los de la herida que fue injertada

(Paneles C y D, respectivamente). En el día 14, la herida control no mostró continuidad

con la mucosa sana adyacente (Panel E). Contrariamente, la herida injertada epitelializó

con consistencia firme y resilente y adquirió coloración similar a la de la mucosa sana

circundante.

Día 0

Día 7

Día 14

A B

C D

E F

b zi


unidireccional y de control. Apariencia de la herida control y de la herida injertada al día 0

(Paneles A y B, respectivamente), día 7 (Paneles C y D) y día 14 (Paneles E y F). Las flechas

muestran los bordes de la herida control (b) y la zona injertada (zi) en el día 14.

La Figura 8, muestra imágenes de la comparación de heridas tratadas con TCAA-

multidireccional versus heridas tratadas con TCAA-unidireccional. En los dos

tratamientos se observa epitelización de la zona lesionada; sin embargo, las heridas

injertadas con soportes multidireccionales presentaron bordes continuos y adquirieron

apariencia muy similar a la mucosa sana circundante. Contrariamente, en las heridas

tratadas con los soportes unidireccionales se observó inflamación leve y presencia de

bordes ligeramente elevados.

Día 7

Día 14

Día 0

E F

TCAA - Multidireccional TCAA - Unidireccional

b zi

Control TCAA - Multidireccional


multidireccional y TCAA-unidireccional. Apariencia de las heridas injertadas con soporte

multidireccional y unidireccional en el día 0 (Paneles A y B, respectivamente), día 7 (Paneles C y

D) y día 14 (Paneles E y F). La flecha en el Panel E, muestra la continuidad de la zona injertada

con la adyacente. La flecha en el Panel F, señala los bordes elevados en la zona injertada con el

soporte unidireccional.

6.2.2 Evaluación histológica

En la Figura 9, se ven cortes histológicos de las biopsias tomadas en heridas cerradas

por segunda intención (Control) versus heridas injertadas con TCAA-unidireccional, 14

días después de las cirugías. La herida control presenta una delgada capa de epitelio sin

formación de crestas interpapilares, ni paraqueratosis, orientación paralela de fibras

colágenas, con escaso infiltrado inflamatorio agudo en el tejido conjuntivo (Panel A). En

la región injertada con el TCAA-unidireccional, se observa un epitelio de más de 8 capas

que ha cubierto el tejido conjuntivo expuesto en la herida, tejido conjuntivo fibroso

Día 0

Día 7

Día 14

ligeramente denso con aumento en fibras colágenas y fibroblastos, hiperplasia

pseudoepiteliomatosa, hiperemia, congestión vascular y múltiples vasos sanguíneos

(Panel B).

Figura 9. Apariencia histológica de heridas cerradas por segunda intención (Control) y de

heridas injertadas con TCAA-unidireccional, tinción con H&E. El Panel A, muestra la

histología de la herida control. En el Panel B, se observa la imagen histológica de la herida

injertada con TCAA-unidireccional. Convenciones usadas: músculo (M), borde de la herida (BH),

células inflamatorias (CI), crestas interpapilares (CIN), epitelio (EP), glándulas salivales (GM),

hiperplasia pseudoepiteliomatosa (HP), vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.

La Figura 10, presenta cortes histológicos de las biopsias tomadas en heridas cerradas

por segunda intención (Control) versus heridas injertadas con TCAA-multidireccional, 14

días después de las cirugías. La herida control presenta una delgada capa de epitelio sin

formación de crestas interpapilares, ni paraqueratosis, orientación paralela de fibras

colágenas, con escaso infiltrado inflamatorio agudo en el tejido conjuntivo (Panel A). En

la región injertada con el TCAA-multidireccional, se observa un epitelio de más de 8

capas, tejido conjuntivo fibroso ligeramente denso con aumento en fibras colágenas y

A B

Control TCAA- Unidireccional

fibroblastos, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, hiperemia, congestión vascular y

múltiples vasos sanguíneos (Panel B).

Figura 10. Apariencia histológica de heridas cerradas por segunda intención (Control) y de

heridas injertadas con TCAA-multidireccional, tinción con H&E. El Panel A, muestra la

histología de la herida control. En el Panel B, se observa la imagen histológica de la herida

injertada con TCAA-unidireccional. Convenciones usadas: músculo (M), borde de la herida (BH),

células inflamatorias (CI), crestas interpapilares (CIN), epitelio (EP), glándulas salivales (GM),

hiperplasia pseudoepiteliomatosa (HP), vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.

La Figura 11, muestra cortes histológicos de las biopsias tomadas en heridas injertadas

con TCAA-unidireccional o con TCAA-multidireccional, 14 días después de las cirugías.

En la lesión tratada con TCAA-unidireccional, se observa un epitelio de más de 8 capas

que ha cubierto el tejido conjuntivo expuesto en la herida, tejido conjuntivo fibroso

ligeramente denso con aumento en fibras colágenas y fibroblastos orientados de forma

paralela a la zona de la herida, hiperplasia pseudoepiteliomatosa, hiperemia, congestión

A B

Control TCAA - Multidireccional

vascular y múltiples vasos sanguíneos (Panel A). En la herida injertada con TCAA-

multidireccional, se observa un epitelio con mayor número de capas que ha cubierto el

tejido conjuntivo expuesto en la herida, tejido conjuntivo fibroso ligeramente denso con

aumento en fibras colágenas, organizadas en diferentes direcciones y fibroblastos,

hiperplasia pseudoepiteliomatosa, hiperemia, congestión vascular y múltiples vasos

sanguíneos.

Figura 11. Apariencia histológica de heridas injertadas con TCAA-unidireccional o con

TCAA-multidireccional, tinción con H&E. Herida injertada con TCAA-unidireccional (Panel A);

herida injertada con TCAA-multidireccional (Panel B). Convenciones usadas: músculo (M), borde

de la herida (BH), células inflamatorias (CI), crestas interpapilares (CIN), epitelio (EP), glándulas

salivales (GM), hiperplasia pseudoepiteliomatosa (HP), vasos sanguíneos (VS). Escala: 126μm.

El Anexo 1 incluye cortes de las biopsias provenientes del grupo de 12 conejos en los

que se llevó a cabo la comparación de heridas injertadas con TCAA-unidireccional y

TCAA-multidireccional. En general se observa que en las imágenes de las zonas tratadas

con TCAA-unidireccional hay más zonas en las que las fibras de colágeno se encuentran

paralelas a la superficie de la herida que en las zonas injertadas con TCAA-

multidireccional. Aunque en algunas de las zonas injertadas con este último tejido se

A B

TCAA - Unidireccional TCAA - Multidireccional

observa disposición paralela de algunas fibras de colágeno, la mayoría de las imágenes

de este tratamiento muestran a las fibras de colágeno dispuestas en varias direcciones.

6.2.3 Análisis histomorfométrico del grosor del epitelio, conjuntivo, inflamación y formación de nuevos vasos sanguíneos

El espesor del epitelio y el tejido conjuntivo fue medido en las áreas injertadas y sus

controles. En cada imagen digital se realizaron diez mediciones aleatorias del espesor

del epitelio y del tejido conjuntivo los valores promedios de las áreas injertadas fueron

comparados con los valores promedios de las áreas control para evaluar las diferencias

significativas (p valor <0,05). Al aplicar las pruebas de normalidad se encuentra que los

datos de este estudio no corresponden a una distribución normal; por lo cual, en el

análisis se usaron pruebas no paramétricas.

6.2.3.1 Número de capas del epitelio:

El número de capas de epitelio se evaluó calculando el porcentaje que estas representan

del número de capas original del tejido adyacente a la herida (100%).

# capas de la herida * 100% = Porcentaje de recuperación del epitelio

# capas tejido sano adyacente

La Figura 12, muestra la distribución de los promedios en porcentaje de recuperación

del número de capas del epitelio formado a las dos semanas en los tres grupos de

animales evaluados (heridas injertadas con TCAA-unidireccional vs control, TCAA-

multidireccional vs control y TCAA-multidireccional vs TCAA-unidireccional). El análisis

estadístico realizado con la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis para muestras

independientes, reveló que el número de capas del epitelio formado sobre el tejido

cicatrizal de las heridas injertadas con TCAA-unidireccional (Panel A) y TCAA-

multidireccional (Panel B) fue significativamente mayor que el observado en sus

controles (p= 0.001 y p=0.0001, respectivamente). El análisis de los datos de los

animales que fueron injertados en un lado con TCAA-unidireccional y en la herida

contralateral con TCAA-multidireccional, indica que no hay diferencias significativas

entre ellos (p=0.11) (Panel C).

Figura 12. Promedios de porcentaje de recuperación del número de capas del epitelio

formado a las dos semanas. En el Panel A, se observan los resultados del porcentaje de

recuperación del grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-unidireccional y la

contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel B, presenta los datos obtenidos en el

grupo en el que una herida se injertó con TCAA-multidireccional y la contralateral se dejó cerrar

por segunda intención. El Panel C, muestra el análisis de los datos provenientes del grupo en el

que las heridas de un lado fueron tratadas con TCAA-multidireccional y las contralaterales con

TCAA-unidireccional.

A B

C

p=0.001 p=0.001

p=0.119

6.2.3.2 Grosor del tejido conjuntivo:

El grosor del tejido conjuntivo formado en las heridas, se evaluó calculando el porcentaje

que este representa del grosor de tejido conjuntivo sano adyacente (Grosor tejido

conjuntivo herida/ Grosor tejido conjuntivo sano * 100%). En la Figura 13, se ve

que el grosor del tejido conjuntivo fue significativamente mayor en las heridas injertadas

con TCAA-unidireccional (Panel A) y TCAA-multidireccional (Panel B), que en sus

controles (p= 0.0001 y p=0.005, respectivamente). Contrariamente, en los animales

injertados con TCAA-unidireccional en un lado y con TCAA-multidireccional en él otro, la

diferencia en el grosor no fue significativa (p=1.000) (Panel C).

Figura 13. Promedios porcentaje de recuperación de del grosor del tejido conjuntivo

formado a las dos semanas. En el Panel A, se observan los resultados del grupo de animales en

los que una herida se injertó con TCAA-unidireccional y la contralateral se dejó cerrar por

segunda intención. El Panel B, presenta los datos obtenidos en el grupo en el que una herida se

injertó con TCAA-multidireccional y la contralateral se dejó cerrar por segunda intención. El Panel

A B

C

p=0.0001 p=0.005

p=1.000

C, muestra el análisis de los datos provenientes del grupo en el que las heridas de un lado fueron

tratadas con TCAA-multidireccional y las contralaterales con TCAA-unidireccional.

6.2.3.3 Inflamación

El análisis de los resultados de los conteos de las células inflamatorias presentes en las

zonas injertadas o cerradas por segunda intención, se presenta en la Figura 14. La

comparación de los datos de las heridas injertadas con TCAA-unidireccional con los de

las heridas que cerraron por segunda intención (Panel A), indica que hubo un aumento

significativo del número promedio de células inflamatorias presentes en la zona injertada

con respecto al control (p=0.011). El mismo fenómeno fue observado cuando se

compararon los datos de las zonas injertadas con TCAA-multidireccional con sus

controles (p=0.008) (Panel B). Sin embargo, el análisis de los datos provenientes de los

animales que recibieron en una herida TCCA-multidireccional y en la otra TCAA-

unidireccional indica que el número de células inflamatorias presentes en unas y otras,

no fue significativamente diferente (p=0.885), (Panel C).

Figura 14. Grado de inflamación en la zona de herida. En el Panel A, se observan los

resultados del grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-unidireccional y la

C

B A p=0.011 p=0.008

p=0.885






6.2.3.4 Número de vasos sanguíneos

La medición de vasos sanguíneos presentes en las heridas mostró, que en este parámetro no se

evidencian diferencias significativas entre ninguno de los 3 grupos de animales evaluados (Ver

Figura 15). El Panel A, muestra los resultados obtenidos al comparar las zonas injertadas con

TCAA-unidireccional y sus controles; en el Panel B, se incluyen los resultados obtenidos al injertar

TCAA-multidireccional y compararlo con las heridas control (Panel B). En el Panel C, se incluyen

los datos obtenidos al comparar las heridas injertadas con TCAA-multidireccional con las

contralaterales injertadas con TCAA-unidireccional.

Figura 15. Análisis de la formación de vasos sanguíneos. En el Panel A, se observan los

resultados del grupo de animales en los que una herida se injertó con TCAA-unidireccional y la


p=0.553

p=0.657 p=0.492

C

B A





7. Discusión

Las patologías bucodentales son responsables de morbilidad sin distinción de edad,

género ni estrato socioeconómico dentro de la población colombiana. El sistema de

vigilancia epidemiológico de salud bucal ha establecido que en todas las etapas de la

vida de los colombianos un 65.3% de la población sufre de caries y que la enfermedad

gingival está presente en el 73.4% (Secretaría Distrital de Salud, 2009; ENSAB III, 1998).

Cualquier patología bucodental puede resultar en pérdida de la continuidad de la mucosa

oral. Tratamientos convencionales toman autoinjertos que generan morbilidad en otra

zona del paciente afectándolo funcional e incluso estéticamente, con defectos que

cicatrizan por segunda intención (Clark & Singer, 2000; Izumi, et al., 1999; Herson, et al.,

2001; Hildebrand, et al., 2002; Moriyama, et al., 2001; Ma, et al., 2003). Los

procedimientos más comunes que llegan a requerir de estos injertos son cirugías

periodontales (Al-Juboori, et al., 2012), cirugías de implantes dentales (Holmes & Aponte-

Wesson, 2010) y cirugías reconstructivas (Schultes, et al., 2013; Abdel Fattah & Zaghloul,

2010; Thoma, et al., 2012; Ysunza, et al., 2010; Hashemi, et al., 2012).

El uso de sustitutos artificiales de tejido es un tratamiento alternativo, que evita la

creación de un sitio donante y que en muchos casos mejora la cicatrización de la zona

injertada. Están elaborados a partir de soportes tridimensionales sembrados con células

autólogas u homólogas y poseen características similares a las de la mucosa o la piel

(Sándor, 2013; Payne, et al., 2013; Izumi, et al., 2003b; Liu, et al., 2007; Kriegebaum, et

al., 2012; Moharamzadeh, et al., 2012). Estudios preclínicos y clínicos de sustitutos de

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Al-Juboori%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22338850

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Holmes%20JD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20713271

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Aponte-Wesson%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20713271


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schultes%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23010376

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Abdel%20Fattah%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21863077


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Thoma%20DS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22145767

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ysunza%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20211494

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=S%26%23x000e1%3Bndor%20GK%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Payne%20KF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23601833

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kriegebaum%20U%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23063397

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Moharamzadeh%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22266525

mucosa oral, han mostrado la conveniencia de su uso como nuevos tratamientos de

heridas de espesor total y parcial (Izumi, et al., 2003b; Izumi, et al., 2003a; Liu, et al.,

2007; Kriegebaum, et al., 2012; Moharamzadeh, et al., 2012). De acuerdo con su

composición y estructura pueden ser utilizados en defectos en encía queratinizada,

recesiones gingivales y deficiencia de tejido conjuntivo (Harris, 2001; Harris, 2004; Prato,

et al., 2003; Thoma, et al., 2012; Fowler, et al., 2000), reemplazo del epitelio (Tsai, et al.,

1997; Lauer, 1994; Fowler, et al., 2000), estímulo de epitelialización in vivo (Ueda et al.,

1991; Prato, et al., 1992) y reemplazo de mucosa oral de espesor total (Izumi, et al.,

2003a; Izumi, et al., 2003b; Raghoebar, et al., 1995).

Nuestro grupo de investigación desarrolló un modelo de herida de mucosa oral de

espesor parcial y demostró su utilidad para evaluar el desempeño de tejido conjuntivo

artificial autólogo (TCAA). Usando este modelo se probó que heridas tratadas con

soportes de colágeno (SC) o con TCAA, cicatrizaron mejor que heridas contralaterales

que cerraron por segunda intención (Espinosa, et al., 2010). Paralelamente, el grupo

diseñó y produjo soportes laminares unidireccionales empleados para hacer tejido

conjuntivo artificial en el que los fibroblastos sembrados exhiben orientación

unidireccional y morfología elongada (Bustos, et al., 2013). Con el fin de evaluar si esta

disposición observada in vitro se mantiene al injertar tejidos unidireccionales e incide en

las características clínicas e histológicas de la zona tratada, el objetivo de este trabajo

fue evaluar el desempeño del tejido conjuntivo artificial autólogo (TCAA) de mucosa oral

elaborado con soportes de colágeno tipo I unidireccionales y compararlo con el obtenido

al injertar tejidos elaborados con soportes multidireccionales.

Los resultados histológicos indican que en las heridas injertadas con los tejidos

elaborados con soportes unidireccionales y multidireccionales hay presencia de matriz

extracelular, eosinofilia y nuevas fibras de colágeno; confirmando lo encontrado

previamente al evaluar el desempeño de TCAA multidireccional (Espinosa, et al., 2010;

Fontanilla, et al., 2012), y aportando evidencia de que el TCAA elaborado con soportes

unidireccionales también mejora la cicatrización con respecto a heridas que cierran por

segunda intención. La existencia de tejido conjuntivo ligeramente denso y la recuperación

del grosor del tejido conjuntivo en los sitios tratados, evidencia la integración de los dos

tipos de TCAA al sitio injertado y su recambio por nuevo tejido.



Los datos obtenidos indican que en las heridas injertadas con los dos tipos de TCAA, se

observó tejido conjuntivo más denso que en las zonas que cerraron por segunda

intención; sin embargo, en las zonas tratadas con el TCAA-unidireccional se observó la

presencia de fibras colágenas paralelas a la superficie de la herida, mientras que en las

zonas injertadas con TCAA-multidireccional el tejido formado se orientó en distintas

direcciones. A pesar de esta diferencia entre las heridas injertadas con TCAA-

multidireccional y con TCAA-unidireccional, la calidad del conjuntivo sintetizado fue mejor

que la del formado en las heridas que cicatrizaron por segunda intención.

Probablemente por eso, en las heridas injertadas se observó la formación de crestas

epiteliales interpapilares integradas al tejido conjuntivo subyacente, lo cual se ha

relacionado con la presencia de conjuntivo de buena calidad (Roberts & Mansbridge,

2002; Raguse & Gath, 2005; Moharamzadeh et al., 2007; Novaes, et al., 2007; Arroyo &

Iruela-Arispe, 2010; Sorokin, 2010; Soller, et al., 2012; Abou Neel, et al., 2012). Algunas

de las características halladas en el epitelio estratificado formado sobre el conjuntivo de

las áreas injertadas, fueron la hiperplasia pseudoepiteliomatosa y la espongiosis sin

progresión a la malignidad; las cuales se presentan durante un proceso de reparación

tisular (Nguyen & Yoon, 2006; Soares, et al., 2005; Abu Eid & Landini, 2005).

En la ingeniería de tejidos existen tendencias encontradas acerca de la conveniencia o

no, de usar soportes sembrados con células e incubados para promover la formación de

tejido artificial in vitro que después se injerta. Este y otros trabajos previos del grupo,

proporcionan evidencia que soporta lo encontrado por otros investigadores, acerca de

que las células presentes en sustitutos de tejido conjuntivo propician una eficiente

reparación de heridas (Stephens, et al., 1996; Pageon, et al., 2012; Arroyo & Iruela-

Arispe, 2010; Sorokin, 2010; Kubo & Kuroyanagi, 2003a; Kubo & Kuroyanagi, 2003b;

Wong, et al., 2007; Yamada, et al., 2008). Por este motivo, el uso de soportes sembrados

con fibroblastos se reafirma como una alternativa de los autoinjertos en cirugía oral y

maxilofacial, en especial para defectos de grandes extensiones donde la morbilidad del

sitio donante es mayor.

A pesar de que el TCAA-unidireccional al injertarse mostró buena adaptación al área y al

contorno de la herida, clínicamente se observó una ligera elevación en sus bordes a

diferencia de las heridas injertadas con TCAA-multidireccional; lo cual, puede

relacionarse con el aumento de fibras de colágeno dispuestas paralelamente a la

superficie de la herida en las zonas injertada con el tejido unidirecional. Esta observación

es reforzada por trabajos previos del grupo y de otros autores que reportan que el

aumento de contractura, evidenciada por la presencia de fibras colágenas paralelas a la

superficie del corte, conduce a defectos en la cicatrización (Oliveira et al., 2012; Yannas,

2013; Espinosa et al., 2010; Chamberlain, et al., 2000).

En contraste a lo descrito en el párrafo anterior, el análisis histomorfométrico de los

cortes provenientes de los tejidos formados en las heridas injertadas con TCAA-

unidireccional o multidireccional, mostró que el grosor del epitelio, el grosor del

conjuntivo, el número de células inflamatorias y el número de vasos sanguíneos no

fueron significativamente diferentes. En consecuencia, podemos afirmar que a pesar de

que en las heridas injertadas con TCAA-unidireccional el cierre ocurre con mayor

contractura que en las heridas injertadas con TCAA-multidireccional, los dos tipos de

tejidos artificiales permiten la ocurrencia de angiogénesis y epitelización de manera

similar.

En el proceso de reparación de heridas una fase fundamental es la inflamación, según el

tipo, la duración y la resolución puede modularse el proceso reparativo; es por eso que

una respuesta inflamatoria rápida y transitoria favorece el cierre de la herida sin infección

a diferencia de cuando se prolonga y se presenta excesivamente beneficiando la difícil

cicatrización (Martin & Leibovich, 2005; Davidson & Breyer, 2003; Eming, et al., 2007;

Ophof, et al., 2002; Jansen, et al., 2008; Novaes, et al., 2007). En este trabajo se observó

que con respecto a los controles, el número de células inflamatorias aumenta

significativamente en las heridas injertadas con los dos tipos de tejido artificial evaluados.

Sin embargo, al relacionar el número de células inflamatorias con el tipo de inflamación

(nulo, leve, moderado y severo), esta se mantuvo como inflamación leve debido a que el

aumento en el número de células no fue suficiente para sugerir un grado mayor de

inflamación, de acuerdo con la tabla usada en este trabajo y adaptada de trabajos

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chamberlain%20LJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=9878170

previos del grupo y de otros autores (Morton & Dongari-Bagtzoglou, 2001, Espinosa, et

al., 2010).

La orientación de las fibras es uno de los componentes de la microestructura de los

soportes, que ayuda a definir las características topográficas vistas por las células

cuando son sembradas en estos. En el desarrollo de tejidos artificiales con morfología

fibrosa (Nervios y músculos), se ha estudiado el efecto de la orientación de los poros en

el comportamiento celular y en la regeneración (Madaghiele, et al, 2007). Soportes

tubulares de colágeno I y III con fibras unidireccionales, se usaron con buenos resultados

para promover el crecimiento celular y promover la regeneración guiada de nervios

periféricos (Bozkurt, et al., 2012). Este parámetro también ha sido estudiado en sustitutos

de miocardio, hechos con geles de fibrina constituidos por fibras unidireccionales o

multidireccionales y células cardiacas, encontrándose que la morfología de las células y

las propiedades mecánicas son diferentes (Black, et al., 2009)

La influencia de la orientación de la fibra no ha sido evaluada en soportes laminares de

colágeno I sembrados con fibroblastos orales; por esta razón, nuestro grupo de

investigación desarrolló soportes laminares de colágeno I con poros unidireccionales y

estableció el efecto de esta orientación en la morfología, alineamiento y secreción de

fibroblastos orales sembrados en ellos. La comparación de los datos obtenidos en tejido

conjuntivo artificial (TCA) hecho con soportes unidireccionales con los de TCA hecho con

soportes multidireccionales, mostró que estos parámetros varían (Suesca, 2013; Bustos,

et al., 2013).

En esta tesis de maestría se uso un modelo in vivo, para establecer si la reparación de

heridas de espesor parcial de mucosa oral en conejo injertadas con TCAA elaborado con

soportes de colágeno multidireccionales o con soportes unidireccionales es diferente. Los

resultados muestran que el tejido formado en las heridas injertadas con TCAA-

multidireccional exhibe fibras de colágeno distribuidas aleatoriamente con células

distribuidas de la misma manera. Contrariamente, en las zonas injertadas con TCAA-

unidireccional las fibras se encuentran en su gran mayoría organizadas paralelamente a

la superficie de la herida y se observan células elongadas con su eje longitudinal en la

misma dirección de las fibras colágenas que probablemente están contribuyendo a que

en estas heridas la contractura sea mayor que en las zonas que recibieron TCAA-

multidireccional (Soller, et al., 2012; Yannas, 2013).

8. Conclusiones

Este trabajo muestra que controlando la orientación de las fibras de soportes de colágeno

I, se obtiene tejido conjuntivo artificial que después de ser injertado puede modular la

cicatrización. Los tejidos conjuntivos elaborados con soportes multidireccionales

estimularon más la regeneración que la reparación de las zonas injertadas; mientras que

en los tejidos obtenidos con soportes unidireccionales, fue más evidente la ocurrencia de

reparación. El hecho de que otros parámetros, diferentes a la orientación de las fibras, no

hubieran sido significativamente diferentes en las heridas injertadas con uno u otro tipo

de tejido, soporta esta afirmación. El contar con la tecnología requerida para elaborar

tejido conjuntivo con fibras orientadas en forma diferente, ayuda a que en nuevos

estudios se pueda profundizar en formas de orientar la cicatrización en función de las

direcciones de las fibras que constituyen los soportes con que estos son elaborados.

9. Recomendaciones

Evaluar otro modelo adicional al modelo lagomorfo.

Evaluar el desempeño del TCAA como injerto en heridas de espesor total.

Evaluar los factores de crecimiento y citoquinas del medio producido por el TCAA,

acompañado de evaluación in vivo de estos mismos factores para buscar diferencias

entre los tejidos elaborados con soportes unidireccionales y multidireccionales.

A. Anexo: Comparación histológica de heridas injertadas con TCAA-unidireccional y con TCAA-multidireccional

UNIDIRECCIONAL MULTIDIRECCIONAL

Comparación histológica de heridas injertadas con TCAA-unidireccional (paneles

izquierdos: A, C, E, G, I, K, M, O, Q, S, U, W, Y, AA, AC) y con TCAA-


multidireccional (paneles derechos: B, D, F, H, J, L, N, P, R, T, V, X, Z, AB, AD),

tinción con H&E. Escala: 126μm

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Evaluación del proceso de reparación en heridas de · Oral mucosa defects treated with autograft...

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