Evaluación del efecto del tratamiento con carbón activo en...
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1 . Facultad de Ciencias Experimentales UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales Trabajo Fin de Grado Alumna: Sonia Aguilar Molina Evaluación del efecto del tratamiento con carbón activo en la composición de polifenoles durante la eliminación de clorofilas en extractos de plantas.
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UNIVERSIDAD DE JAÉN
Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Alumna: Sonia Aguilar Molina
Evaluación del efecto del tratamiento con carbón activo en la composición de polifenoles durante la eliminación de clorofilas en extractos de plantas.
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Evaluación del efecto del
tratamiento con carbón activo en
la composición de polifenoles
durante la eliminación de
clorofilas en extractos de plantas.
Trabajo Fin de Grado presentado por
Sonia Aguilar Molina
Jaén, Febrero de 2018.
UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
GRADO EN QUÍMICA Trabajo Fin de Grado
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ÍNDICE.
1. Resumen…………………………………………………………………………..6
2. Introducción……………………………………………………………………….7
3. Objetivos…………………………………………………………………………..12
4. Materiales y métodos…………………………………………………………….12
4.1. Material vegetal utilizado………………………………………………...12
4.2. Aparatos e instrumentación……………………………………………..13
4.3. Material y reactivos……………………………………………………….13
5. Procedimiento experimental…………………………………………………….13
5.1. Tratamiento de muestra………………………………………………….13
5.2. Determinación de los compuestos fenólicos por HPLC-MS…………20
6. Clasificación de los compuestos fenólicos………………………………….....21
6.1. Fenoles simples…………………………………………………………...22
6.2. Fenoles ácidos……………………………………………………….……22
6.2.1. Ácidos hidroxibenzoicos………………………………………….….23
6.2.2. Ácidos hidroxicinámicos……………………………………………..23
6.3. Cumarinas…………………………………………………………………24
6.4. Xantonas, estilbenos y benzofenonas…………………………………24
6.5. Quinonas…………………………………………………………………..25
6.6. Taninos…………………………………………………………………….26
6.7. Lignanos y ligninas………………………………………………………27
6.8. Flavonoides……………………………………………………………….27
7. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)………………………….....28
7.1. Instrumentación general…………………………………………………28
7.2. Detector…………………………………………………………………….28
7.2.1. Analizador de trampa de iones……………………………………...29
8. Resultados y discusiones………………………………………………………..31
8.1. Cumarinas…………………………………………………………………35
8.2. Flavonoides………………………………………………………………..35
8.3. Lignanos…………………………………………………………………...35
8.4. Secoiridoides……………………………………………………………....36
8.5. Esculina……………………………………………………………………36
8.6. Esculetina………………………………………………………………….36
8.7. Rutina...…………………………………………………………………….37
5
.
8.8. Quercetina…………………………………………………………………37
8.9. Oleuropeína……………………………………………………………….37
8.10. Ligstrósido…………………………………………………………………38
9. Conclusión………………………………………………………………………...46
10. Bibliografía………………………………………………………………………....47
6
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1. RESUMEN.
En las últimas décadas, la importancia de los tés de hierbas se ha disparado
por diversas razones, como por ejemplo por sus características en el campo de la
medicina. Estas hierbas son sobre todo una fuente excelente de compuestos
fenólicos. Para el análisis de compuestos fenólicos, generalmente se eliminan las
clorofilas después del procedimiento de extracción para evitar posibles interferencias
en el análisis.
En este trabajo estudiaré el efecto del uso del carbón activado para la
eliminación de clorofilas, ya que su uso puede resultar indeseable en una extracción
de polifenoles.
Por lo tanto, se estudiarán diferentes tiempos de reacción y diferentes
cantidades de carbón activado con el fin de eliminar las clorofilas quedando el perfil
polifenólico inalterado.
Después de la preparación de la muestra, se llevó a cabo una extracción
sólido-líquido empleando para ello metano. La identificación de los compuestos
fenólicos fue realizada por HPLC con espectrometría de masas (trampa iónica con
electrospray, donde la ionización se realizará en modo negativo).
El porcentaje más alto de compuestos en los extractos de Fraxinus Oxycarpa
correspondió a cumarinas, secoiridoides y flavonoides.
La separación cromatográfica se realizó utilizando una columna C18
modificada que proporcionó mejores resultados que una columna de HPLC
tradicional C18.
ABSTRACT.
In recent decades, the relevance of herbal teas has increased for a variety of
reasons, such as its characteristics in the field of medicine. These herbs are mostly
an excellent source of phenolic compounds. For the analysis of phenolic compounds,
chlorophylls are usually removed after the extraction procedure to avoid potential
interferences in the analysis. In this work, I will study the effect of the use of activated
charcoal for the elimination of chlorophylls, as its use can result in an undesirable
removal of polyphenols. Hence, different reaction times and different amounts of
activated carbon will be studied, in order to eliminate chlorophylls, remaining the
phenolic profile unaltered.After the preparation of the sample by a solid-liquid
7
.
extraction with methanol. The identification of the phenolic compounds was carried
out by HPLC with mass spectrometry (ionic trap with electrospray; negative ion
mode) detection.
The highest percentage of compounds (using DAD detection) in Fraxinus
Oxycarpa extracts corresponded to coumarins, secoiridoids, and flavonoids.
Chromatographic separation was performed using a modified C18 column,
which provided better results than a traditional C18 HPLC column.
2. INTRODUCCIÓN.
Los compuestos fenólicos se encuentran formando parte de uno de los grupos
de micronutrientes que están integrados en el reino vegetal. Establecen un inmenso
grupo de sustancias químicas considerados metabolitos secundarios de la planta
(Martínez- Valverde, Periago, y Ros, 2000).
Su principal función en las células vegetales es la de actuar como metabolitos
secundarios para la reproducción y el crecimiento y como agente protector frente a
diversos patógenos, que serán expulsados al exterior como mecanismo de defensa
(Martínez- Valverde et al., 2000).
Las plantas presentan un gran número de compuestos fenólicos, que tienen la
capacidad de ejercer actividad antioxidante y actividad anti-inflamatoria entre otras
como son el caso de aumentar el potencial inmune, de modificar las enzimas
metabolizadoras de drogas, etc (Muñoz, A. Mª. y Ramos, F., 2007).
La actividad antioxidante de los distintos grupos de los compuestos fenólicos
va a depender de su estructura, del número de sustituyentes oxidrilos así como de
su peso molecular.
Desde el punto de vista químico, los compuestos fenólicos tienen un anillo
bencénico que puede tener uno o varios grupos OH (Valls, Lampreave, Nadal, y
Arola, 2018).
Tienen en su estructura química una variedad de grupos hidroxilos y unas
magníficas propiedades de quelación del hierro y otros metales de transición, que le
aportan dicha capacidad antioxidante.
Debido a esto presentan un importante papel en la protección frente a los
efectos oxidativos, ampliando su variedad de efectos terapéuticos en muchas
patologías (Martínez-Flórez, González-Gallego, Culebras, y Tuñón, 2002).
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.
La capacidad de los polifenoles para modular la actividad de diferentes
enzimas y para interrumpir en mecanismos de señalización y en distintos procesos
celulares, se puede deber a la características fisicoquímicas que presentan que
hacen que sean útiles para intervenir en reacciones de oxidación-reducción
(Quiñones, Miguel y Aleixandre, 2012).
El estudio de dichos compuestos sobre los alimentos, radica en la importancia
de los efectos beneficiosos que aportan a la salud. Una de las principales fuentes de
compuestos fenólicos se encuentra en las frutas y verduras, aunque también se
pueden encontrar en los tés y en los vinos (Muñoz et al., 2007).
Las especies vegetales, en mayor medida las frutas, contienen una variedad
de compuestos químicos que actúan como antioxidantes inhibiendo a las especies
reactivas de oxígeno que pueden provocar enfermedades cardiovasculares. Todas
las frutas y verduras que contienen antioxidantes se convierten en unas fuentes
potenciales de beneficios para la salud (Rodríguez, López, y García, 2010).
Consumir alimentos ricos en polifenoles es una buena idea para prevenir
ciertas enfermedades, como por ejemplo una gran variedad de cánceres. La
presencia de antioxidantes en las plantas constituye uno de los componentes activos
de los alimentos, cuya principal fuente de obtención se encuentra en diversas partes
de la planta (Muñoz et al., 2007)
La especie humana tiene que ingerir estos compuestos en forma de alimento
o en forma de suplemento debido a la incapacidad que presentan los humanos para
sintetizar estos compuesto (Martínez-Flórez et al., 2002).
Se conocen más de 8000 compuestos fenólicos distribuidos en toda la
naturaleza. El consumo medio en Europa se estima en 23 mg/día (Gracia, s.f.).
Existen varias clases y subclases de polifenoles en función del número de
anillos fenólicos que contengan y de los elementos estructurales que presenten cada
anillo.
Uno de los principales tratamientos de muestra que se hace es el empleo de
carbón activo para eliminar las clorofilas por dos motivos. Por un lado, en HPLC
porque pueden producir efecto matriz, que consiste en un aumento o una
disminución de la respuesta proporcionada por el analito debido a la presencia de
otros componentes (Boqué, 2005), y por otro lado, la capacidad antioxidante (que
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suele medirse junto con el perfil polifenólico) que puede verse afectada por la
presencia de las clorofilas.
Entre los compuestos fenólicos destacan principalmente los flavonoides que
además de su actividad antioxidante se les ha atribuido una gran cantidad de efectos
terapéuticos, a esto se debe la importancia del estudio de la actividad antioxidante
de los vegetales utilizados en la industria alimentaria humana y también en el ámbito
animal (Gutiérrez Avella, Ortiz García, y Mendoza Cisneros, 2008).
La muestra a tratar es un tipo de té, de la especie Fraxinus, más
concretamente Fraxinus Oxycarpa. Se ha seleccionado una muestra de té por dos
motivos que se desarrollarán a continuación. Por un lado, por su destacada
importancia y por otro lado, porque tienen distintos compuestos fenólicos de distintas
familias, es especialmente útil para evaluar el efecto del carbón activo sobre
diferentes compuestos fenólicos.
La importancia de los tés de hierbas se ha disparado en la actualidad por
diversas razones. Principalmente se utilizan como tratamientos para la medicina,
pero también en muchos casos se utilizan como suplementos dietéticos por sus
propiedades bien sea en forma de pastillas o en forma de infusiones. Estos
productos presentan una gran aceptación por parte de la sociedad debido a que son
productos naturales y por lo tanto no van a provocar efectos adversos. Su consumo
también se ha disparado por la facilidad que presentan para ser adquiridos ya que
no precisan de receta médica y se pueden obtener en cualquier supermercado o
herbolario (Carrillo Esper, Lara Caldera y Ruiz Morales, 2010).
Las hierbas tienen muchas propiedades que hacen que sean mejores que las
drogas sintéticas como por ejemplo permanecer más tiempo en el organismo y
provocar menos efectos secundarios. Éstas tienen muchos usos que les confiere la
capacidad de tener muchos efectos beneficiosos para la salud, más que
perjudiciales. Algunos casos más destacados de hierbas son, por ejemplo el caso
del ginkgo que no solo es favorable para la memoria sino que también mejora la
circulación de la sangre. El ajo por un lado fortalece el sistema inmunológico y por
otro lado reduce el colesterol (Cass, 2008).
Todas estas propiedades curativas que contienen los tés de hierbas se deben
a su composición, en mayor medida a la presencia de los compuesto fenólicos.
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En este trabajo se va a ver la influencia del carbón activo sobre los
compuestos fenólico y para ello es necesario el estudio del perfil polifenólico de las
hojas de fresno utilizadas como infusión.
El fresno es originario del Norte de África y de la Península Ibérica. Es
característico de zonas templadas de toda Europa y Asia. El fresno crece en los
márgenes de los arroyos, prados, en los bosques y en las calles, alcanzando una
importancia comercial en Europa, América del Norte y Japón. Es un árbol de tamaño
no muy resaltado por lo que se suele encontrar en jardines de dimensiones no muy
excesivas (Fresno (Fraxinus Excelsior), s.f.).
El fresno es un árbol de gran porte de hoja caduca y con el tronco coloreado
de un tono grisáceo. Se encuentra en
aquellos bosques en los cuales
permanecen a expensas del sol y no hay
problemas de humedad. Los foliolos tienen
forma ovalada o elíptica, tienen el perímetro
dentado y un tono blanquecino en el envés.
Las hojas del fresno se recolectan a
último de primavera o a primero de verano,
cuando aparecen envueltas por una fina capa viscosa, y deben dejarse secar a la
sombra en un lugar que esté bien aireado; los frutos obtenidos también son
recogidos en la misma temporada cuando aún son verdes y jóvenes
(Infusionesmedicinales, 2014), ya que en el caso contrario se produciría un
oscurecimiento de la muestra que provoca la pérdida de sus propiedades y, por
tanto, su valor.
Los foliolos contienen polifenoles, ricos en tanino y catequinos, de ahí su
acción astringente. También contienen flavonoides como el rutósido y pequeñas
cantidades de cumarinas como la fraxina. Por otro lado, también se puede apreciar
una pequeña cantidad de matinol.
A todos estos compuestos se debe su efecto diurético, pero no solo presenta
este efecto sino que tiene, en menor medida, otros efectos como son el efecto
antirreumático, analgésico, antiinflamatorio, etc, por lo que normalmente destaca en
el uso de problema de varices, hemorroides, casos de gota, reumatismo, cistitis, etc.
Se puede administrar de distintas formas como por ejemplo en forma de
infusión para lograr un efecto diurético. También podemos administrarlo como
Ilustración 1: Foliolos de fresno.
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extracto fluido, y por último, se pueden tomar en forma de polvo de la planta para
lograr un efecto diurético y antiinflamatorio (Fresno (Fraxinus oxycarpa) Información,
s.f.).
Para la identificación de los compuestos fenólicos se ha empleado la técnica
de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) que es una técnica más sensible
que la cromatografía de gases. Se trata de una técnica versátil y rápida para
cuantificar los polifenoles en la especie vegetal. Normalmente se utiliza HPLC con
espectrofotometría de masas con trampa iónica para la identificación (Jiménez,
López, Ruiz, Medina, Ortega-Barrales y Llorent-Martínez, 2017) y con detector UV
para la cuantificación.
Ilustración 2: Sistema de HPLC-MS con el cual se han realizado los análisis para la
identificación de los compuestos fenólicos.
Debido a la compleja composición de los extractos de plantas, en ocasiones
es necesario realizar un clean-up previo al análisis de los extractos por HPLC, como
ocurre en nuestro caso con las hojas de fresno, que presentan una alta coloración
verde intenso debido a una elevada concentración de clorofilas que pueden interferir
en la determinación del perfil polifenólico así como de su capacidad antioxidante
(Jiménez, López et al., 2017).
Ambos están relacionados entre sí, por lo que es importante eliminar las
clorofilas pero sin verse afectados los compuestos de interés, que en nuestro caso
serían los compuestos fenólicos. Para ello, uno de los métodos más comunes es el
empleo del carbón activo.
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El carbón activo se trata de un carbón poroso que atrapa compuestos,
normalmente orgánicos, que se encuentran en un líquido o en un gas, es un sólido
adsorbente ya que tiene la capacidad de adherir en sus paredes la molécula que
fluye. Las moléculas que adsorbe son, en su mayoría, covalentes; no iónicas, porque
éstas últimas se encargarían de robar o donar electrones a átomos de carbono. La
razón por la cual el carbón activo es uno de las sustancias aptas para adsorber
moléculas orgánicas es debido a que las uniones entre los átomos de carbono e
hidrógeno son uniones covalentes (Carbotecnia, 2014).
3. OBJETIVOS.
El principal objetivo de este Trabajo Fin de Grado será evaluar cómo afecta el
carbón activo al contenido en polifenoles durante la eliminación de las clorofilas. El
resultado ideal es conseguir eliminar todas las clorofilas, sin que los compuestos
fenólicos se vean afectados.
Para ello se va a efectuar una extracción sólido-líquido, con un clean-up de
los extractos a distintos tiempos de reacción y distintas cantidades de carbón activo,
se filtrarán y se llevarán a sequedad con ayuda de un rotavapor para un posterior
análisis por HPLC-MS y UV. Con esto se observará si el tratamiento llevado a cabo
puede tener algún efecto negativo sobre los polifenoles que puedan quedar
retenidos junto con las clorofilas en el carbón activo.
Lo que se quiere conseguir es la obtención de un tiempo de reacción óptimo
junto con una cantidad de carbón activo óptima en las cuales se tengan la mínima
cantidad de clorofilas posibles y a la vez perder la mínima cantidad de compuesto
fenólicos.
4. MATERIAL Y MÉTODOS.
4.1. Material vegetal utilizado.
La muestra empleada para el análisis se trata de hojas de fresno
concretamente de la especie oxycarpa (Fraxinus Oxycarpa), obtenida en un
herbolario situado en la provincia de Jaén, de la casa Granadiet.
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Ilustración 3: Árbol Fraxinus Oxycarpa. Ilustración 4: Hojas de la especie.
4.2. Aparatos e instrumentación.
Aparatos e instrumentos Imagen
Balanza analítica.
Molinillo de aspas metálicas
Baño ultrasonidos.
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Rotavapor
Espectrofotómetro UV/Vis
VarianCary 50
Espectrómetro de masas Bruker modelo
Esquire 6000 unido a un cromatógrafo
de líquidos de alta resolución (HPLC)
Agilent 1100.
Tabla 1: Aparatos e instrumentación que han sido utilizados durante el ensayo.
4.3. Material y reactivos.
Los reactivos y materiales empleados durante el ensayo fueron los
siguientes: metanol adquirido de Panreac (Barcelona, España), carbón activo
adquirido de Sigma-Aldrich (Madrid, España), filtros whatman de 125 mm de
diámetro del número 1 (Barcelona, España) y, por último, agua ultra pura (Sistema
de purificación de agua mili-Q de Milipore, Milford (EEUU))
5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
5.1. Tratamiento de muestra.
Se trituró la muestra y se utilizó metanol para la extracción. Se llevó a cabo
una extracción sólido-líquido asistida por ultrasonidos durante 60 min. Después, se
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filtraron los extractos y se llevaron a sequedad con rotapavor a 40ºC. Por último, los
extractos fueron analizados por HPLC-MS.
La extracción de los compuestos fenólicos se realizó siguiendo el
procedimiento que se esquematiza a continuación (Jiménez, López et al., 2017):
La muestra de fresno se trituró con ayuda de un
molinillo de aspas metálicas de acero inoxidable
hasta obtener un aspecto de polvo.
Se llevó a cabo una extracción
sólido-líquido, utilizando, para
ello 2,5 g de fresno y 50 mL de
metanol.
Matraz
Erlenmeyer
Ultrasonidos, durante
60 min.
Pretratamiento.
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Ilustración 5: Materiales empleados para la extracción.
En el momento en el que el matraz se introduce en el ultrasonidos hay que
tener precaución con la temperatura. La temperatura ideal del ultrasonidos es, en
torno a los 25-30ºC. Cuando sube la temperatura (que sube muy rápida, ya que está
mucho rato funcionando, pudiendo alcanzar ,a veces, incluso los 45º) hay que añadir
hielo picado para ir bajando la temperatura, y a la vez ir retirando agua del
ultrasonidos par evitar que rebose. Por otro lado, el ultrasonidos nos va a favorecer
la extracción. Una vez finalizada la extracción, se procede a filtrar los extractos.
Los extractos de Fraxinus Oxycarpa tras filtrarlos presentaban un color
verde intenso debido a las clorofilas, para su eliminación se utilizó carbón activo.
Los extractos son filtrados
con filtros Whatman.
Conservar en frascos de plástico
de 50 mL en frigorífico hasta
completarlas todas.
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Ilustración 6: Extracto de una muestra de fresno una vez filtrada que muestra el color
verde intenso característico de la presencia de clorofilas.
El procedimiento general que se ha comentado anteriormente se modificó
en la etapa de añadir el carbón activo, empleando distintos tiempos de contacto con
el carbón activo, así como diferentes pesos de carbón activo.
Añadimos carbón activo Filtrar con
filtros
Whatman
Se concentra a sequedad
con rotavapor a 40ºC
18
.
Justo antes de introducir los extractos en el rotavapor se hizo de forma
adicional un ensayo por espectrofotometría UV/Vis que será comentado
posteriormente.
Los tiempos estudiados fueron:
Tiempo (min) Peso de carbón
activo (g)
0 0
0.5 0.5
2 0.5
7 0.5
12 0.5
Tabla 2: Tiempos empleados en el primer ensayo para una cantidad de carbón
activo.
Las cantidades de carbón activo estudiadas fueron:
Tiempo (min) Peso de carbón activo (g)
0.5 0.2
0.5 0.5
0.5 0.75
0.5 1.0
Tabla 3: Peso de carbón activo para un mismo tiempo de contacto durante el
segundo ensayo.
Como se pudo observar, los extractos de Fraxinus Oxycarpa una vez filtrados,
se le añaden sus correspondientes cantidades de carbón activo a cada matraz
erlenmeyer adquiriendo cada vez un tonalidad amarilla más clara.
Esto nos va indicando que el carbón activo va adsorbiendo las clorofilas al
aumentar el tiempo de contacto de la muestra de hierba con el carbón.
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.
Se recogió el extracto seco. Previo análisis se redisolvieron
los extractos utilizando metanol para HPLC. Los extractos
son filtrados colocando un pequeño filtro en la boca de la
jeringa.
Viales.
5 mg
1 mL CH3OH
Se introduce en un nuevo vial
y se disuelve con ayuda del
ultrasonido.
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Ilustración 7: Material para redisolver los extractos.
5.2. Determinación de los compuestos fenólicos por HPLC-MS.
Los extractos se llevaron a analizar por HPLC-MS. El sistema de HPLC es un
Agilent Serie 1100, compuesto de un desgasificador de vacío, un muestreador
automático, una bomba binaria, y un detector de matriz de diodos G1315B (Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). Se utilizó una columna cromatográfica de
fase reversa Luna Omega Polar C18 de 150 x 3,0 mm y 5 micras de tamaño de
partícula (Phenomenex, Torrance, CA, EE.UU.) y una precolumna Polar C18
(Phenomenex) de 4 x 3,0 mm. La mejor separación se logró con una fase móvil de
ácido fórmico agua (100: v / v 0,1) y CH3CN. Se utilizó el siguiente programa:
a) fase móvil inicial, 10% de CH3CN;
b) aumento lineal de 10% a 25% de CH3CN (0-25 min);
c) 25% de CH3CN (25-30 min);
d) aumento lineal de 25% a 50% de CH3CN (30-40 min);
e) aumento lineal de 50% a 100% de CH3CN (40-42 min);
f) 100% de CH3CN (42-47 min).
Al finalizar se regresó la fase móvil al porcentaje inicial de acetonitrilo, con un
tiempo de estabilización de 7 minutos antes de la siguiente inyección. El caudal fue
de 0,4 ml min-1.
Con la introducción de la fase estacionaria Luna Omega 1,6 μm polar C18 se
ha conseguido una mejor separación de los compuestos de interés. Esta fase
estacionaria es capaz de proporcionar una selectividad única dentro de un amplio
rango de elución y una mayor retención tanto para los analitos polares como los
analitos no polares. A diferencia de las fases tradicionales de C18, la superficie polar
21
.
modificada de la Luna Omega le proporciona estabilidad en condiciones de fase
móvil acuosa del 100% (Lomas, 2016).
No es nuestro caso pero sí en la siguiente ilustración se puede observar las
diferencias que conlleva emplear una columna u otra.
Ilustración 8: Comparación del empleo de una columna Kinetex core-shell C18 con el
empleo de una columna Luna Omega Polar C18 donde se observa que en la
columna Luma Omega los compuestos está mejor separados y salen a mayores
tiempos de retención.
6. CLASIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS.
Para comprender la estructura de los
compuestos fenólicos es necesario comenzar con
el grupo fenol. El fenol está formado por un anillo
aromático unido a un grupo hidroxilo. Esta
molécula le aporta un papel importante en la
actividad antioxidante (Peñarrieta, Tejeda,
Mollinedo, Vila, y Bravo, 2014).
Se pueden distinguir las siguientes familias de
compuestos fenólicos:
Ilustración 9: Estructura del fenol.
22
.
6.1. Fenoles simples.
Los fenoles simples son aquellos que tienen dos o tres grupos hidroxilo en su
anillo aromático. Además de actividades antioxidantes hay pruebas de que estos
compuestos tienen una actividad biológica importante, como los citotóxicos,
antiparásitos y antibióticos. Las distintas posibilidades de fenoles simples se
muestran en la siguiente ilustración: (Peñarrieta et al., 2014).
Ilustración 10: Estructuras de los distintos fenoles simples
6.2. Fenoles ácidos.
La estructura de este grupo está formada por un anillo aromático y un grupo
hidroxilo comunes a todos los tipos y un grupo carboxílico (Sánchez-Paniagua,
2008). Dentro de este grupo podemos encontrar dos tipos: los ácidos
hidroxibenzóicos y los ácidos hidroxicinámicos. La capacidad antioxidante de estos
fenoles se ve aumentada cuando el anillo aromático cuenta con más de un grupo
hidroxilo y la separación del grupo carbonilo sea mayor. Por otro lado, los ácidos
hidroxibenzóicos son menos oxidantes que los ácidos hidroxicinámicos (Peñarrieta
et al., 2014).
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6.2.1. Ácidos hidroxibenzóicos.
Los ácidos hidroxibenzóicos son compuestos formados por un grupo carboxilo
y uno o más grupos hidroxilos en un mismo anillo aromático. Se pueden encontrar
por ejemplo en las frutas, verduras y cereales (Peñarrieta et al., 2014). Algunos
ejemplos de compuestos son:
Ilustración 11: Ácidos hidroxibenzóicos.
6.2.2. Ácidos hidroxicinámicos.
Los ácidos hidroxicinámicos se caracterizan por tener un grupo CH=CH-
COOH en vez del grupo COOH. El doble enlace aumenta la resonancia debido a la
deslocalización de los electrones π en el doble enlace estabilizando la molécula y
aumentando así su capacidad antioxidante. Estos compuestos se pueden encontrar
en algunas frutas, verduras, café y cereales (Peñarrieta et al., 2014). Algunos
ejemplos de estos compuestos son:
Ilustración 12: Ácidos hidroxicinámicos.
24
.
6.3. Cumarinas.
Las cumarinas están formadas por un anillo aromático unido a un heterociclo
oxígeno. Se consideran fenoles cuando el
grupo hidroxilo está unido al esqueleto de una
cumarina. Se pueden encontrar en la fruta y
hortaliza. (Peñarrieta et al., 2014). La
cumarina más simple es la que se encuentra
formando parte del aceite de bergamota
(Ávalos García y Pérez-Urria, 2009).
Todas las cumarinas, excepto la
cumarina, tienen un grupo hidroxilo en la
posición 7 libre. En la posición 6 u 8 están ocupados por radicales isoprenílicos de 5,
10 o incluso 15 átomos de carbono. Aunque algunas son tóxicas tienen un elevado
efecto farmacológico (Sanchez-Paniagua, 2008). Éstas se pueden encontrar en
diversas plantas y esto pare estar relacionado con la capacidad que presentan para
inhibir el crecimiento de algunos patógenos en las plantas (Sullivan, López-González
et al., 2000).
6.4. Xantonas, estilbenos y benzofenonas.
Estos tres compuestos se encuentran
en diversas partes de las plantas. Las
xantonas y las benzofenonas se encuentran
en las raíces y en las frutas exóticas,
mientras que los estilbenos se encuentran en
algunas futas y alimentos. Sus estructuras
están relacionadas, ya que tienen dos anillos
aromáticos unidos por cetona, heterocíclicas o grupos vinilo (Peñarrieta et al.,
2014).
Las xantonas presentan efectos beneficiosos en las enfermedades
cardiovasculares debido a su potente actividad antioxidante y su actividad
antiagregante vaso relajante y plaquetaria (Sanchez-Paniagua, 2008).
Ilustración 13: Estructura de la cumarina.
Ilustración 14: Tipo de xantona.
25
.
El estilbeno es un compuesto que ayuda a frenar el envejecimiento y a
prevenir las enfermedades
cardiovasculares además de tener
propiedades antiinflamatorias y
antitumorales (Sanchez-Paniagua,
2008).
Las benzofenonas son
compuestos formados por dos
anillos aromáticos unidos mediante
un átomo de carbono y sus derivados se utilizan como fotoprotectores en cremas
solares.
Ilustración 16: Ejemplo de benzofenona.
6.5. Quinonas.
Este grupo de compuestos se caracteriza por presentar un anillo diona
conjugado. Se pueden distinguir entre las ubiquinonas, con la coenzima Q10 como
por ejemplo, las antraquinonas cuando tienen dos anillos fenólicos y naftoquinonas
cuando tienen un solo anillo ligado al anillo conjugado por un grupo cetona doble. Se
ha llegado a demostrar que las quinonas tienen propiedades redox y la coenzima Q
es un gran antioxidante.
Ilustración 15: Ejemplo de estilbeno.
Ilustración 17: Quinonas.
26
.
6.6. Taninos.
Son compuestos fenólicos poliméricos que se unen a proteínas provocando
su desnaturalización. Podemos distinguir dos tipos:
Taninos condensados: son polímeros de unidades de flavonoides unidas por
enlaces C-C que no pueden ser oxidados pero si hidrolizados por un ácido
fuerte.
Taninos hidrolizables: son polímeros heterogéneos que presentan ácidos
fenólicos, son más pequeños y se hidrolizan con mayor facilidad (Ávalos,
García y Pérez-Urria, 2009)
Ilustración 18: Ácido gálico, un ejemplo de taninos.
Se pueden encontrar taninos compatibles con el humano pero la mayoría de
ellos son tóxicos (Sanchez-Paniagua, 2008). Ésta toxicidad se debe a su unión con
las proteínas. También pueden actuar como repelentes alimenticios de muchos
animales facilidad (Ávalos, García y Pérez-Urria, Carril, 2009)
6.7. Lignanos y ligninas.
Los Lignanos son compuestos fenólicos dímeros, derivados de la fenilalanina
y de los alcoholes cinámicos que contienen muchos alimentos. Han demostrado
presentar una actividad antioxidante representativa (Peñarrieta et al., 2014).
27
.
Ilustración 19: Ejemplo de lignano.
Las ligninas, por otro lado, son polímeros cuya principal función es aportar
apoyo estructural a las plantas. Sus estructuras químicas son muy complejas porque
están formadas por polímeros complejos (Peñarrieta et al., 2014).
Otra de sus funciones es su acción protectora debido a que su resistencia mecánica
evita que las plantas sean alimento de muchos animales (Ávalos, García y Pérez-
Urria, Carril, 2009).
6.8. Flavonoides.
Son un tipo especial de polifenoles que se encuentran en las plantas y son los
causantes del color de las flores y de las
frutas (Peñarrieta et al., 2014). Su estructura
química está formada por un anillo A, un
anillo B y 3 átomos que unen ambos anillos.
La estructura puede formar un
heterociclo que son los mayoritarios
(flavonas, flavonoles, flavanoles, flavanonas,
antocianinas) o una cadena abierta
(chalconas). Tienen varios grupos OH unidos
a los anillos y se encuentran como glicósidos. Se pueden encontrar en las frutas y
verduras (Sanchez-Paniagua, 2008).
Ilustración 20: Estructura de los flavonoides.
28
.
7. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC).
La cromatografía líquida de alta resolución es una técnica que permite
separar, identificar y cuantificar los componentes de una mezcla compleja. Con ella
se realizan análisis cualitativos y cuantitativos de polifenoles y carotenos (Vega,
2013).
Para aquellas técnicas cromatográficas en las cuales tenemos una fase móvil
líquida la cromatografía líquida de alta resolución es la más utilizada. Esta técnica
deriva de una evolución de la cromatografía preparativa en columna (Ayora Cañada,
s.f.). La cromatografía líquida de alta resolución tiene una serie de características:
Elevada sensibilidad.
Elevada aplicabilidad.
Permite realizar análisis cualitativos exactos.
Es adecuada para la separación de especies termolábiles y no volátiles.
No hay ninguna limitación para la muestra (Vega, 2013).
7.1. Instrumentación general.
Un cromatógrafo de líquidos consta de una serie de elementos
indispensables, normalmente constituyendo módulos con funciones bien definidas.
(Ayora Cañada, s.f.).
Los elementos indispensables en cualquier cromatógrafo de HPLC son:
sistema de suministro de fase móvil (con depósito de disolventes y bomba de alta
presión), sistema de inyección y detector continuo. Existen además otros elementos
adicionales que pueden mejorar algunos aspectos de la separación o detección
(Ayora Cañada, s.f.).
7.2. Detector.
En cuanto a los detectores, estos pueden ser espectrofotométricos como el
UV/Vis, fluorescencia o un espectrofotómetro de masas. Hay diferentes tipos de
detectores de masas: cuadrupolo, trampa iónica, tiempo de vuelo, entre otros, etc.
En nuestro caso se trabaja con una trampa iónica.
La trampa de iones aplica diferentes voltajes dando lugar a un campo
electromagnético tridimensional en la cavidad de la trampa que atrapa y concentra
los iones. La aplicación de una rampa lineal de radiofrecuencia provoca inestabilidad
29
.
en la trayectoria de los iones y son expulsados en función de su relación m/z
originando un espectro de masas. Una vez que los iones quedan atrapados dentro
del analizador se puede llevar a cabo el análisis de masas o el aislamiento de sus
precursores y su posterior fragmentación obteniendo un patrón que nos va a aportar
información de la estructura de las moléculas.
Ilustración 21: Trampa de iones.
7.2.1. Analizador de trampa de iones.
Está formado por un electrodo que consiste en un anillo central y dos
electrodos colectores, la separación de los iones se produce almacenando los iones
en el espacio central y manipulando su movimiento en el tiempo. El campo se crea
aplicando un sistema de radiofrecuencias al anillo central. Los iones del analito
procedentes de la fuente de ionización penetran a través de una rejilla en el
electrodo colector y según su m/z y el campo aplicado, circulan en una órbita estable
o se desestabilizan pasando al detector.
Los instrumentos de IT se caracterizan por tener una elevada sensibilidad y
obtener una rápida adquisición de datos, sin embargo, los analizadores IT tienen una
resolución limitada y una relativamente baja capacidad de atrapar iones (Fernández-
Arroyo, 2012).
30
.
Ilustración 22: Equipo de HPLC-MS empleando para el análisis de los compuestos
fenólicos.
El equipo disponible en el CICT (Centro de Instrumentación Científico-
Técnica) ubicado en la dependencia A2-116 es un espectrómetro de masas Bruker
modelo Esquire 6000 unido a un cromatógrafo de líquidos de alta resolución (HPLC)
Agilent 1100. Como el nombre del equipo indica, el analizador de iones es una
trampa de iones. La fuente de iones es tipo electrospray (ESI) intercambiable con
una fuente de iones APCI. El rango de masas del analizador es de 50 a hasta 6000
uma, en modo extendido, con una velocidad máxima de barrido de hasta 27000
uma/s. Al tratarse de una trampa iónica puede hacer experimentos MSn. El equipo
admite muestras provenientes del HPLC o alternativamente de una bomba de
jeringa. El HPLC consta de un automuestreador con capacidad para automatizar la
inyección de hasta 90 muestras. El software “ChemStation” permite controlar
simultáneamente el HPLC y el espectrómetro, que puede también manejarse
independientemente con el software “esquireControl”. El tratamiento posterior de los
datos obtenidos se lleva a cabo con el software “DataAnalysis” (DM03-
Espectrómetro de masas trampa iónica-HPLC, s.f.).
La cromatografía HPLC en fase inversa realiza las separaciones con una
resolución alta y es adecuada para trabajar con ESI (Martín, Gómez y Ballesteros,
González, s.f.).
31
.
8. RESULTADOS Y DISCUSIONES.
Para la identificación de los compuestos fenólicos se utilizó la técnica de
HPLC-MS, empleando la ionización por electrospray, trabajando en modo negativo
por lo que el pico base corresponde con el ión desprotonado.
Se emplearon distintos tiempos y distintas cantidades de carbón activo que se
reflejan en el apartado de procedimiento experimental. Para el análisis por UV se
emplearon distintas longitudes de onda en función de la familia correspondiente para
cada compuesto fenólico. Las longitudes de onda empleadas fueron:
Familia de compuestos. Longitud de onda (λ)
Cumarinas 330
Flavonoides 350
Secoiridoides 240
Tabla 4: Longitudes de onda para las distintas familias.
El primer paso para la identificación de los compuestos fenólicos consiste en
la determinación de la masa del ion desprotonado. Para ello se utiliza el trabajo de
investigación (Jiménez, López et al., 2017).
Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:
No tR
(min)
[M-H]-
(m/z)
m/z (% pico base) Identificaciónasignada
1. 3.1 339 MS2 [339]: 177 (100), 133
(1)
Esculin
2. 3.7 315 MS2 [315]: 153 (100), 135
(56), 123 (5)
MS3 [315→153]: 123 (100)
Hydroxytyrosol-O-
hexoside
3. 7.5 389 MS2 [389]: 345 (100), 209
(99)
MS3 [389→345]: 165 (38),
119 (30)
Oleoside/secologanoside
4. 10.1 369 MS2 [369]: 207 (100), 192
(32)
Fraxin
32
.
5. 10.3 403 MS2 [403]: 371 (8), 223
(100), 179 (74), 121 (7)
Secoxyloganin
6. 10.6 177 MS2 [177]: 177 (100), 133
(7)
Esculetin
7. 10.8 377 MS2 [377]: 197 (100), 153
(16)
MS3 [377→197]: 153 (100)
Oleuropein aglycone
derivative
8. 11.2 431 MS2 [431]: 385 (100), 223
(13)
MS3 [431→385]: 223 (61),
205 (100), 153 (32)
Roseoside (formando un
aducto)
9. 15.1 515 MS2 [515]: 353 (100)
MS3 [515→353]: 353 (89),
281 (11), 177 (100)
Desconocido
10. 16.6 535 MS2 [535]: 373 (100), 343
(11)
MS3 [535→373]: 343 (100),
313 (10)
MS4 [535→373→343]: 328
(25), 313(44), 285 (100),
207 (40)
(+)-8-hydroxypinoresinol
4-O-β-D-
glucopyranoside
11. 19.3 609 MS2 [609]: 301 (61), 300
(20)
MS3 [609→301]: 255 (40),
179 (100), 151 (63)
Rutin
12. 20.5 463 MS2 [463]: 301 (100), 300
(25)
MS3 [463→301]: 271 (46),
255 (14), 179 (49), 151
(100)
Quercetin-O-hexoside
13. 21.2 477 MS2 [477]: 315 (6), 179 (3),
161 (100), 135 (3)
Calceolarioside B
14. 21.5 519 MS2 [519]: 357 (100) Pinoresinol-O-hexoside
33
.
MS3 [519→357]: 342 (8),
151 (100), 136 (95)
15. 22.4 701 MS2 [701]: 539 (100), 377
(23), 307 (15), 275 (18)
MS3 [701→539]: 377 (100),
345 (7), 307 (53), 275 (50)
Oleuropein hexoxide
16. 23.0 593 MS2 [593]: 286 (17), 285
(100)
MS3 [593→285]: 257 (100),
229 (12)
Kaempferol-O-rutinoside
17. 23.5 725 MS2 [725]: 563 (16), 403
(1), 339 (100)
MS3 [725→339]: 177 (100),
133 (4)
Escuside
18. 27.3 539 MS2 [539]: 377 (100), 307
(55), 275 (84)
MS3 [539→377]: 307 (100),
275 (76), 149 (7)
MS4 [539→377→307]: 275
(100)
Oleuropein
19. 28.4 545 MS2 [545]: 339 (8), 177
(100)
Esculin-acetylhexoside
20. 29.0 719 MS2 [719]: 675 (100), 347
(50), 329 (14)
MS3 [719→675]: 675 (80),
347 (10), 345 (26), 329 (37)
Desconocido
21. 31.1 789 MS2 [789]: 627 (100)
MS3 [789→627]: 465 (100),
395 (57)
MS4 [789→627→465]: 395
(100)
Insularoside-3’-O-β-D-
glucoside
22. 32.7 523 MS2 [523]: 361 (100), 291
(62), 259 (22)
Ligstroside
34
.
MS3 [523→361]: 291 (100),
259 (55)
23. 33.8 643 MS2 [643]: 481 (100), 463
(11), 411 (58)
MS3 [643→481]: 411 (100)
Desconocido
24. 35.7 615 MS2 [615]: 569 (22), 241
(100)
MS3 [615→241]: 139 (100),
127 (68)
Desconocido
25. 37.4 701 MS2 [701]: 539 (100), 377
(32), 307 (65), 275 (17)
MS3 [701→539]: 377 (94),
307 (76), 275 (100)
Oleuropein hexoxide
26. 37.6 645 MS2 [645]: 483 (100), 413
(83), 275 (43)
MS3 [645→483]: 413 (100)
MS4 [645→483→413]: 275
(100)
Desconocido
27. 39.3 327 MS2 [327]: 291 (29), 229
(52), 211 (33), 183 (18),
171 (100)
Oxo-dihydroxy-
octadecenoic acid
28. 40.4 627 MS2 [627]: 465 (77), 447
(8), 395 (100)
MS3 [627→465]: 395 (100)
MS4 [627→465→395]:
323(100)
Desconocido
Tabla 5: Compuestos fenólicos obtenido por HPLC-MS
35
.
El cromatograma de los extractos con metanol se muestra en la siguiente ilustración:
Ilustración 23: HPLC-ESI/MS cromatograma de los picos base de los extractos de
metanol de Fraxinus Oxycarpa para un tiempo óptimo de 0.5 min.
Se han encontrado distintos compuestos fenólicos entre los que destacan los
siguientes grupos:
8.1. Cumarinas.
Se encuentran varios polifenoles de este tipo. Alguno de ellos son, por
ejemplo, los compuestos 1 (esculina), 6 (esculetina), 17 (escuside), entre otros.
8.2. Flavonoides.
Solo se han encontrado tres compuestos polifenólicos de este tipo. Se tratan
de los compuestos 11 (rutina), 12 (quercetina) y 16 (kamferol).
8.3. Lignanos.
Hay varios polifenoles de este conjunto como por ejemplo los compuestos 10
((+)-8-hidroxipinoresinol-4-O-β-D-glucopiranóxido) y 14 (pinoresinol-O-hesóxido).
36
.
8.4. Secoiridoides.
En este grupo se encuentran algunos compuestos fenólicos como por ejemplo
el caso de los compuestos 15 (oleuropeína hesóxido), 18 (oleuropeína), 22
(ligstrósido) entre otros.
Se han seleccionado solamente seis compuestos por dos razones. Por un
lado, por su abundancia, ya que muchos de ellos quedan solapados unos con otros
y no se pueden cuantificar, y por otro lado porque son pertenecientes a distintas
familias. Son los siguientes:
8.5. Esculina.
La Esculina pertenece al grupo de
las cumarinas. Es una especie que
procede del castaño de Indias y presenta
actividad de vitamina P. Se trata de un
glucósido; un derivado de un acetal de un
monosacárido simple (MacFaddin, 2004). La
Esculina es eliminada del castaño de Indias
debido a que es un compuesto tóxico. Puede provocar distintos efectos como por
ejemplo espasmos, dolor de estómago, pudiendo provocar hasta la muerte (Reyes
Jiménez, Hernández Espinal, García Camarera, y Lares Ballesteros, 2011).
8.6. Esculetina.
La esculetina es la aglicona de la
esculina, un glucósido que se encuentra
presente en la corteza y en las hojas del
castaño de Indias. Tiene actividad bactericida y
antifúngica. La capacidad que tiene esta
sustancia como inhibidor de la biosíntesis de
prostanoides le confiere la idoneidad de
comportarse como una sustancia útil para tratamientos de asma y frente algunas
enfermedades inflamatorias (Ricciuti y Cardini, s.f).
Ilustración 24: Estructura de la esculina.
Ilustración 25: Estructura de la esculetina
37
.
8.7. Rutina.
Pertenece al grupo de los
flavonoides. Se trata de un
diglucósido formado por quercetina y
rutinosa. Ésta se encuentra presente
en muchas especies vegetales
(Rutina, s.f.).
La rutina se considera como
uno de los captadores más potentes
de oxígeno. También actúan como
inhibidoras de la NADPH del
citocromo P-450 (Pérez Trueba, 2003).
8.8. Quercetina.
Se trata de otro polifenol perteneciente a la familia de los flavonoides. Se trata
de un flavonoide tricíclico
polihidroxilado, que se puede encontrar
en la naturaleza glicosilado formando
parte de la rutina entre otros. Destacan
por su importancia como productos
medicinales para el tratamiento de
ciertas enfermedades. Presentan un
gran número de efectos beneficiosos
para la salud como por ejemplo para
prevenir tumores, protección cardiovascular, para prevenir las cataratas, etc (Galiano
Ramos, 2010).
8.9. Oleuropeína.
Pertenece a la familia de secoiridoides. Se trata de un compuesto que puede
ser útil para vigiar la frescura de un aceite de oliva virgen extra y controlar el tiempo
de vida útil. Tiene una actividad antioxidante parecida a la vitamina C, la vitamina E y
B (Gutiérrez Rosales, Ríos y Gil, s.f.).
Ilustración 26: Estructura de la rutina.
Ilustración 27: Estructura de la quercetina.
38
.
Es el polifenol que le aporta el
característico amargo a diversos frutos,
aunque también tienen un aporte
importante en el color, sabor y
propiedades nutricionales de la
aceituna de mesa (Ramírez Castro,
2015).
8.10. Ligstrósido.
Al igual que la oleuropeína, el ligstrósido pertenece a la familia de los
secoiridoides. También es un componente que se encuentra en el aceite de oliva
virgen. Este
polifenol es el que le confiere
el atributo positivo “picante”
al aceite de oliva virgen (De
Torres Sánchez, 2013).
Vamos a tener dos tablas distintas, una para cada ensayo para los
compuestos que se han citado anteriormente. En uno de ellos lo que se estudia son
los tiempos de reacción con una cantidad fija de carbón activo. En el otro ensayo, lo
que se estudia, una vez seleccionado el tiempo óptimo en el primer ensayo, son las
distintas cantidades de carbón activo para dicho tiempo. Las áreas de dichos
compuestos se muestran a continuación, con los datos que se obtuvieron una vez ya
normalizados para tener una mayor facilidad a la hora de la interpretación de los
resultados.
Ilustración 28: Estructura de la oleuropeína.
Ilustración 29: Estructura del Ligstrósido.
39
.
Tiempo
(min)
0 0.5 2 7 12
Esculina 152 100 100 112 92
Esculetina 160 100 95 93 47
Rutina 106 100 91 106 81
Quercetina 128 100 116 122 73
Oleuropeína 107 100 122 130 98
Ligstrósido 94 100 269 265 198
Tabla 6: Compuestos fenólicos más abundantes, en cuanto a la influencia del tiempo
de contacto con el carbón activo.
Ilustración 30: Gráfica de los compuesto fenólicos representado en la tabla 6.
0
50
100
150
200
250
300
0 0.5 2 7 12
Áre
a n
orm
ali
zad
a
Tíempo (min)
Esculina
Esculetina
Rutina
Quercetina
Oleuropeína
Ligustrósido
40
.
Ilustración 31: En esta imagen se puede observar la diferencia de color que presenta
un extracto al principio del ensayo con un tiempo de contacto de 0.5 min frente al
otro extracto que ha permanecido durante 12 min en contacto con el carbón activo.
En este ensayo, observando los datos representados en la gráfica anterior se
observa que, excepto para el ligstrósido que se incrementan los datos a partir de 2
min, el tiempo óptimo se fijará a 0.5 min, ya que a 0 min no se añade carbón activo
porque como se verá más adelante están todas las clorofilas presentes por lo cual
aunque para HPLC-MS no llegaran a interferir se usan los mismos extractos para un
posterior ensayo de la actividad antioxidante (aunque no sea necesario en nuestro
caso).
Para la capacidad antioxidante interfieren las clorofilas y ello conlleva utilizar
carbón activo para su eliminación. Se ha determinado el tiempo óptimo de 0.5 min
porque a este tiempo como se verá más adelante se pierden clorofilas pero no se
pierden los compuestos fenólicos.
Para el segundo ensayo se obtuvieron los siguientes resultados:
41
.
Carbón
activo (g)
0 (min) 0.2 0.5 0.75 1
Esculina 297 100 97 54 -
Esculetina 127 100 69 38 -
Rutina 72 100 78 59 51
Quercetina 39 100 56 37 39
Oleuropeína 55 100 105 8 5
Ligustrósido 34 100 71 72 63
Tabla 7: Compuestos fenólicos más abundantes para el segundo ensayo, en el que
se va variando las cantidades de carbón activo.
Ilustración 32: Gráfica de los compuesto fenólicos representado en la tabla 7.
0
50
100
150
200
250
300
0 0.2 0.5 0.75 0.1
Áre
a n
orm
ali
za
da
.
Cantidad de carbón activo (g)
Esculina
Esculetina
Rutina
Quercetina
Oleuropeína
Ligustrósido
42
.
Ilustración 33: En esta imagen se puede observar la diferencia de color que presenta
un extracto al principio del ensayo con una cantidad de 0.2 g de carbón activo frente
al otro extracto que contiene 1.0 g de carbón activo, ambos han permanecido en
contacto con el carbón activo durante 0.5 min.
Para 0.5 g de carbón activo, excepto para la oleuropeína, los demás
compuestos disminuye la señal de los compuestos fenólicos. Al pasar a 0.75 g sigue
disminuyendo la cantidad de esos compuestos fenólico y al llegar a 1.0 g se da el
caso de que en algunos compuestos ni aparecen. Por lo tanto, fijando un tiempo
óptimo de contacto y variando las cantidades de carbono, conforme se aumenta la
cantidad de carbón activo van desapareciendo polifenoles, por lo que se tomó 0.2 g
de carbón activo como valor óptimo.
El ensayo no se ha hecho de forma cuantitativa pero de forma cualitativa se
observa que se van perdiendo ciertas cantidades como por ejemplo en el segundo
caso, en el esculin al pasar de 0.2 g a 0.5 g solamente se ha perdido menos de un
5%, sin embargo al pasar al 0.75 g se observar pérdidas del 50% y en 1 g al no
aparecer la pérdida sería del 100%, en función del valor óptimo. En el caso, por
ejemplo del ligstrósido, apenas hay disminución. Por lo tanto, si se utiliza excesiva
cantidad de carbón activo en algunos casos directamente no llegan ni a aparecer los
compuestos fenólicos o las disminuciones son muy grandes, por lo cual se requiere
la utilización de bajas cantidades de carbón activo.
En las siguientes figuras se muestran los cromatogramas obtenidos para el
extracto de la muestra Fraxinus Oxycarpa empleando detección UV a la longitud de
onda óptima para cada compuesto.
43
.
En primer lugar tenemos los pertenecientes a la familia de los
secoiridoides con una longitud de onda de 240 nm.
Ilustración 34: Compuestos fenólicos pertenecientes a la familia de secoiridoides.
En segundo lugar tenemos los pertenecientes a la familia de las cumarinas
con una longitud de onda de 330 nm.
Ilustración 35: Compuestos fenólicos pertenecientes a la familia de las cumarinas.
Y por último tenemos a los flavonoides con una longitud de onda de 350
nm.
Ligstrósido
44
.
Ilustración 36: Compuestos fenólicos pertenecientes a la familia de flavonoides.
De forma adicional se realizó un ensayo para comprobar si las clorofilas se
eliminan con el carbón activo a distintos tiempos de contacto y distintas cantidades
de carbón activo. Los extractos se introdujeron en el espectrofotómetro UV/Vis
empleando para cada muestra una pipeta pasteur y una cubeta diferente. Las
cubetas que se utilizaron fueron cubetas de plástico de 1 cm de paso óptico. Los
resultados obtenidos fueron los siguientes:
t=0 min
t=0.5 min
t=2 min t=7 min
45
.
Con esto se llega a la conclusión de que la concentración de clorofilas va
disminuyendo durante el primer ensayo conforme va aumentando el tiempo de
contacto con el carbón activo, aunque para los últimos tiempos se aprecia una
menor disminución. La disminución más representativa se observa al pasar del t=0
min a t=0.5 min, ya que a tiempo 0 no se añadió carbón activo, pudiéndose observar
el papel fundamental del carbón activo como adsorbente. Para el segundo ensayo,
se pudo observar lo mismo:
En este caso la mayor disminución en cuanto a la cantidad de clorofilas se
observa al pasar de 0.2 g de carbón activo a 0.5 g. Se observa que para 1.0 g la
cantidad de clorofilas es prácticamente nula.
t=12 min
0.2 g 0.5 g
0.75 g 1.0 g
46
.
9. CONCLUSIÓN
En este trabajo se ha determinado el perfil polifenólico para ver la influencia
del carbón activo sobre los compuestos fenólicos de la especie Fraxinus Oxycarpa
determinado por HPLC-MS. Los valores obtenidos fueron comparados con los
resultados de otros autores de la misma planta. Los resultados fueron similares con
la única diferencia de que en este trabajo, los compuestos fenólicos han salido a un
mayor tiempo de retención debido al empleo de una columna C18 modificada.
Se observa que al aumentar la cantidad de carbón activo, se retienen
polifenoles y se pierden. Sin embargo, el tiempo de reacción influye menos.
Por lo tanto se selecciona un tiempo óptimo de 0.5 min y no puede ser 0 min
porque para este no se añade carbón activo por lo cual no nos interesa contar con la
presencia de las clorofilas para posteriores análisis.
Una vez seleccionado el tiempo óptimo de contacto con el carbón activo se
llega a la conclusión de que el peso óptimo es de 0.2 g de carbón activo por la
misma razón, ya que para esta cantidad se tiene la mayor cantidad de compuestos
fenólicos y la mínima cantidad de clorofilas.
47
.
10. BIBLIOGRAFÍA
1. Ávalos, García, A. y Pérez-Urria, Carril, E. (2009). Metabolismo secundario de
plantas. Reduca (Biología), 2(3), 119-145.
2. Ayora Cañada, M. (s.f.). Técnicas cromatográficas. Jaén: María José Ayora
Cañada, pp.15-18. Descargado de:
http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/Quimica%20analitica%20a
mbiental/Tema6.pdf
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