INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALCENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

“EVALUACIÓN DE LAS CEPAS AISLADAS DE BACILLUS DEL FILOPLANO DE LAS SOLANÁCEAS PARA EL CONTROL BIOLÓGICO DE ALTERNARIA EL TIZÓN

TEMPRANO DEL TOMATE”.

Marcelo Santiago Hernández

INTRODUCCIÓN

Tizón Temprano del TomateAlternaria alternata

Filoplano: Microambiente en la superficie de una hoja.

PERDIDAS ECONÓMICAS

DAÑOS

Filoplano

AGENTES DE CONTROL BIOLOGICO

Genero: BacillusGram+

COMBATEB. SubtilisB. AmyloliquefaciensB. LincheniformisB. pumilus

OBJETIVOAislar y caracterizar nuevas cepas de bacterias formadoras de esporas resistentes al calor del filoplano de las solanáceas y seleccionar aquellos queControlen a Alternaria alternata.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento de bacterias del filoplano solanáceas

Se recolectaron trozos de hojas (5 g) Italia, lavaron durante 1 h. Se centrifugaron 50 ml de la suspensión 10 min, se calentaron a 90 °C para 10 min y posteriorse inocularon en agar nutritivo.

Caracterización fisiológica, morfológica y molecular de las bacterias

93 cepas de bacterias

aisladas de filoplano 20 cepas activasCaracterizan por sus rasgos morfológicos y fisiológicos. 4 cepas como bioensayo, identificadas por 16S-rRNA secuenciación parcial del gen como bacillus.

Control de Alternaria alternata

La evaluación cuantitativa de la actividad antagónica de las cepas bacterianas

El crecimiento activo al centro de una placa PDA Petri (90 ml), en el que se sembraron en cultivos puros de cepas bacterianas alrededor del borde.

Las placas inoculadas donde por triplicado y se incubaron a 25 °C. El diámetro de los micelios se midió diariamente.

El porcentaje de inhibición del crecimiento de hongos debido a la actividad antagónica.

Control Biologico de Alternaria enfermedad del tomate

1 de edad, las plantas de tomate (Solanum lycopersicum L. cv. Cor-Barino) se utilizaron para probar la capacidad de las bacterias para controlar, in vivo, Alternaria en medios de PDA, se utilizó para producir el inóculo mediante la recopilación de conidios conídia en una suspensión de agua.

Dos ensayos de control biológico separadas se llevaron a cabo, con el fin de estudiar el efecto de la velocidad y el momento de aplicación de los antagonistas en el control de la enfermedad, 1ra inoculación de una gota (5 ml) de una suspensión bacteriana, 2da se realizaron por pipeteo una gota (5 ml) de las bacterias en suspensión .

Identificación molecular de los candidatos ACB

Las cepas antagonistas confirmadas en los bioensayos seleccionados fueron identificados por 16S rRNA secuenciación y análisis de fragmentos de genes.

La secuencia del gen parcial se amplificó y se secuenció usando el 16SF cebador 50-AGTTTGATCCTGGCTCAG-30 y el cebador inverso 16SR 50-TACCTTGTTACGACTTCACCCCA-30, añadido (0,2 mm cada uno) a una mezcla que contiene 50 gr de ADN, 1,5 ml de MgCl2 , 200 ml de dNTPs y 1 U de Taq ADN polimerasa.

La producción de la enzima constitutiva de las cepas aisladas de control biológicoLa producción de la enzima se determinó mediante la prueba de API-ZYM. El perfil enzimático de las bacterias se llevó a cabo mediante pruebas de 19 ensayos de actividad enzimática por la coloración de la suspensión.

Los microorganismos se cultivaron durante 24 h en placas de agar nutriente a 30 °C. Tres tiras de cada muestra se inocularon y, a continuación, se incubaron a 37 °C para 4 h y al final de la incubación, los reactivos ZYM A y B ZYM.

La intensidad de los colores evaluados en una escala de 1-5 permitió diferenciación entre positivo (3-5) y (1-2) la producción negativo de cada enzima específica.

Observaciones al microscopio óptico

Los efectos de la interacción bacteriana antagónica sobre conidios germinacióny la morfología de las hifas de A. alternata se visualizaron por microscopía de Luz donde se observo cada cepa bacteriana antagónica.

Análisis de los datos

Los datos sobre los efectos de los antagonistas en el crecimiento de la control de patógenos y la enfermedad se sometieron a análisis de una vía de la varianza (ANOVA) y las separaciones medias se realizaron por la prueba de rangos múltiples de Duncan. Las diferencias a P <0,05 se consideró significativo.

RESULTADOS

La selección de las cepas y la selección de los candidatos ACB

Los resultados de un desafío placa cualitativa anterior revelaron un total de 20 cepas Gram-positivas que presentan actividad antibiótica contra el patógeno siendo probada (Tabla 1).

Caracterización fisiológica mostró que 6 de ellos fueron capaces de inhibir el crecimiento de hongos mediante la secreción de compuestos volátiles, mientras que sólo 3 cepas producen sustancias sideróforos similares.

En la evaluación de antagonismo in vivoEfecto de la tasa de aplicación

Las cuatro cepas bacterianas reveló una importante capacidad de control biológico de Alternaria tizón temprano del tomate de acuerdo con su concentración.

Efecto del tiempo de aplicación 

Las cepas de control biológico mostraron la mayor actividad cuando se aplicaron al mismo tiempo del patógeno en tanto replicar experimentos.

Fueron identificados por amplificación del gen 16S rRNA. Las secuencias parciales relativas para cada cepa se determinaron, depositado en GenBank y en comparación con los que ya están en la base de datos mediante la ejecución de BLAST.

La alineación indicó que las cuatro secuencias que coincidan con el más cercano (99%) con otras secuencias parciales de genes 16S rRNA SEV-ral de cepas bacterianas, pertenecían al género Bacillus.

 Las actividades enzimáticas

análisis de la API-ZYM mostró que cada cepa de Bacillus como control biológico posee un patrón típico enzimática bajo condiciones de ensayo. Las cepas mostraron una reacción positiva por leucina y al acido fosfático.

Evaluación morfológica de las estructuras fúngicas antagonizadas

Las observaciones microscópicas luz revelada que la co-cultivo de las bacterias con el hongo, anormalidades morfológicas en las estructuras en germinación y se indujeron hifas (Fig. 5). Las cuatro cepas de hongos producen daños similares.

DISCUSIÓN

El presente trabajo identificado nueva Bacillus efectiva cepas capaces para controlar el tizón temprano del tomate. Género Bacillus pueden ser considerados como un importante reservorio de antagonistas para su uso en la supresión de enfermedades de las plantas, también fueron capaces de antagonizar los micelios y el desarrollo patogénico de A. alternata, que fueron aisladas de la superficie de las hojas.

El análisis filogenético supuestamente ellos relacionado con diferentes especies de Bacillus, incluyendo B. amyloliquefaciens y B. thuringiensis que se encuentran entre los más frecuentemente implicados en el control biológico de enfermedades de las plantas.

Los efectos protectores de Bacillus ACB pueden basarse en mecanismos de diferentes para antagonizar directamente el crecimiento de patógenos mediante la liberación de una variedad de metabolitos antifúngicos bioactivos potencialmente implicados en antibiosis, incluyendo proteínas, lipopéptidos, antibióticos difusibles, compuestos volátiles.

Las cepas de Bacillus seleccionadas demostraron una actividad inhibidora sobre el micelio de A. alternata crecimiento en ensayos de placa, también lo que sugiere que ciertos compuestos volátiles pueden estar implicados en el nivel microambiente.

También se encontró que las cepas de control biológico 3F-II, 3F-VII y 13F-III para producir sideróforos, ligandos de unión a hierro no proteicos que secuestran el hierro del microambiente, que pueden ser importantes en la supresión de las enfermedades fúngicas.

Los sideróforos pueden ser factores de competitividad en condiciones de deficiencia de hierro, tales como los de la superficie de la hoja.