EVALUACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GIBERELÍCO A PARTIR DE BACTERIAS NATIVAS DEL GENERO Azospirillum sp AISALADA DE SUELOS

DEL DEPARTAMENTO CORDOBA

CARMEN LUCÍA LUNA RAMOS MIGUEL EDUARDO MONTOYA RAMOS

DIRECTORA: Ph.D CECILIA LARA MANTILLA

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE QUÍMICA

MONTERÍA-2014

INTRODUCCIÓN

El crecimiento normal de las plantas es ocasionado en forma armónica por

sustancias que funcionan como hormonas. Los principales grupos de ellas son las

Auxinas, Giberilinas, Citoquininas, Etileno e inhibidores de crecimiento. Estos

compuestos actúan en bajas proporciones. Durante el desarrollo fenológico de las

plantas, estas varían de acuerdo con el estado de desarrollo, mediante un

delicado balance hormona-inhibidor. Una forma de ataque del patógeno consiste

en alterar ese equilibrio, ya sea mediante la obtención de reguladores de

crecimiento, para aumentar su concentración y así crear los inhibidores de esas

hormonas (Aguilar-Piedras, J.J. 2008).

Las Giberilinas (GAs), como reguladores de crecimiento están estrechamente

asociadas a la promoción de la germinación de las semillas, crecimiento del tallo,

inducir la brotación de yemas y el desarrollo de los frutos. Existen varios tipos de

Giberilinas, siendo las más comunes: Giberelina A1 (GA1), ácido Giberelíco (GA3),

Giberelina A4 (GA4), Giberelina A7 (GA7) y Giberelina A9 (GA9). Químicamente son

un grupo de diterpenoides que se definen más por su estructura que por su

actividad biológica, contrario a lo que ocurre con las auxinas y las citoquininas

(Yamaguchi y Kamiya 2000).

Únicamente las Giberilinas biológicamente activas pueden cumplir con estas

funciones, las Giberilinas no bioactivas existen en el tejido vegetal como

precursores de las formas bioactivas o como metabolitos desactivados. Se ha

dilucidado que existe una necesidad estructural, como requerimiento para la

afinidad con el recientemente descubierto receptor de Giberilinas en arroz (GID1),

y sus homólogos en otras especies (Nakajima et ál. 2006). Parece ser que la

regulación de la biosíntesis de Giberilinas y de sus receptores, y vías de

señalización dependen de la especie de estudio (Yamaguchi 2008).

Por tal razón, se ha recurrido a la biotecnología que es una herramienta

que permite manipular microorganismos con potencial biofertilizante, debido a

que una de sus principales funciones es suministrar nutrientes como el

nitrógeno, que se hace disponible a las plantas mediante la acción de

bacterias que habitan en el suelo naturalmente con la capacidad de fijar el

elemento presente en la atmósfera y fijarlo en las raíces de las plantas.

Teniendo en cuenta lo anterior es importante el estudio de bacterias nativas

productoras de Giberilinas que a futuro puedan ser utilizadas en la agricultura.

ANTECEDENTES

En algunos estudios de campo realizados con cereales se ha llegado a observar

una promoción del crecimiento vegetativo (Kapulnik et al, 1983). También se ha

reportado un efecto a simple vista sobre el crecimiento de varios vegetales como

tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), berenjena (Solanum melongena L.),

pimiento (Capsicum annuum) y algodón (Gossypium barbadense) (Bashan et al.

1989)

Bashan & Levanony (1990), Summer (1990), Fages (1994), Okon y Labandera-

González (1994), citados por Dobbelaere et al. (2001), concluyen que la

inoculación con Azospirillum sp. Incrementó significativamente de un 5-30 % en el

rendimiento de materia seca foliar, granos y proteína foliar, así como en el

desarrollo radical, en alrededor de 60 -70 % de los experimentos en campo.

Richards eta, (2001) dice que las Giberilinas son hormonas que regulan el

crecimiento y desarrollo de las plantas; a través de la promoción de la división y

elongación celular Matusa-göttgens y Hedden, (2009).

Weaver (1996) afirma que las Giberilinas son las únicas sustancias químicas

capaces de promover floración en plantas, que de otro modo permanecerían

vegetativas, al remplazar condiciones ambientales específicas que controlan la

formación de flores. Sin embargo, Salisbury y Ross (1994) mencionan que

también las Citoquininas han estimulado la formación de flores en algunas

variedades de crisantemo (Dedranthema sp.) con el empleo de una combinación

de Citoquininas (Benziladenina) y AG5.

Ngamau (2001) probó aplicaciones de BAP (Benzilaminopurina) y/o AG3 sobre

plantas de la variedad ´Green Goddess` de Z. aethiopica. Estas promovieron la

emergencia temprana e incrementaron el número de brotes visibles y el desarrollo

de estos. De Pascale et al. (2003) demostró que la Giberilinas adelantó floración

en aproximadamente 100 días respecto al testigo.

Luria y Weiss (2005) concluyeron que se incrementó el número de brotes y se

obtuvo hasta cinco veces más flores con tratamientos combinados de BA y AG3.

Reiser (1998) reportó que aplicaciones de AG3 en Z. aethiopica y Z. ´Green

Goddess` incrementaron el número de flores por planta de 1.3 a 3.4 y de 1.3 a 3.8,

respectivamente.

(Woodger et al. 2004; Balaguera-López et al. 2009a; Balaguera-López et al.

2009b) dice; que existen muchos estudios sobre la estimulación de la germinación

mediante el uso de giberelinas GA3 en semillas de tomate.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La giberelina es un tipo de regulador de crecimiento vegetal que afecta a una

amplia variedad de fenómenos de desarrollo en las plantas, incluidas la elongación

celular, la germinación de las semillas en muchas especies, y en cereales

movilizan reservas para el crecimiento inicial de la plántula, estimulan la división

celular y afecta tanto a las hojas como a los tallos ya que incrementa la

extensibilidad de la pared. Esta se está usando para incrementar el tamaño del

fruto en viñedos de uvas sin pepitas, haciendo que el racimo se elonge y

permitiendo que la uva este más ventilada reduciendo así las probabilidades de

infección por brotitis (Ueguchi-Tanaka et ál. 2007).

Cárdenas (2007), confirmó estos hallazgos al aislar a partir de suelos y pastos

del Valle del Cesar este tipo de microorganismo. Evaluó la inoculación de

esta bacteria en semillas de pasto Panicum máximum Jacq C.V; aislada de

suelos algodoneros del Cesar. Esta inoculación aumentó hasta 20 % en

proteína cruda y 45% en materia seca comparada con las plantas

fertilizadas con fuentes nutricionales químicas bajo condición de invernadero.

Actualmente los altos costos de los fertilizantes químicos, así como de los

problemas de contaminación que ocasionan, han generado otras formas de

producción, en donde se incentiven a la práctica de nuevas tecnologías. Estudios

de costos de producción señalan la reducción en la utilización de agroquímicos por

los agricultores en los últimos ocho años, debido a los altos costos que generan

estos insumos, para lograr el máximo rendimiento de los cultivos (Laria et al.,

2003).

Los fertilizantes químicos han sido benéficos para el sector agrícola; no obstante,

el abuso en su utilización genera residuos que producen salinización, problemas

en el drenaje, compactación del suelo y disminución de la actividad microbiana

comprometida en la nutrición vegetal. Cada año se incrementa la cantidad de

fertilizantes aplicados debido a la menor eficiencia de adsorción en el suelo y

absorción por la planta, aumentando los costos de producción. Asimismo, se

genera un problema ambiental debido a la producción de gases tóxicos que se

desprenden de los fertilizantes como los óxidos de nitrógeno que dañan la capa de

ozono (Lara et al, 2007).

Es por esto, que como una alternativa a los fertilizantes químicos está la

posibilidad de utilizar bacterias propias del suelo, que como parte de su

metabolismo incrementan la fertilidad y benefician a las plantas, pueden contribuir

con la disminución de fertilizantes de síntesis química, en la generación de nuevas

técnicas de producción agrícola, enfocada al uso eficiente de los recursos que

tiendan a una agricultura sostenible, limpia y de bajo impacto agrícola,

contribuyendo con el mejoramiento de las condiciones medioambientales,

económicas y sociales. Una alternativa viable que contribuye favorablemente con este

propósito es el uso de los biofertilizantes, los cuales recuperan la fertilidad y productividad

del suelo y permiten darle a las plantas los nutrimentos necesarios para su crecimiento

contribuyendo en este sentido a mejorar la calidad de los cultivos para su producción

agrícola. Desde el punto de vista de una agricultura sostenible, los fertilizantes biológicos

constituyen un medio económicamente viable y ecológicamente aceptable al reducir

costos a los productores con acceso limitado a fertilizantes de síntesis química (Dalla et

al, 2004).

En este trabajo buscamos mostrarles porque no es bueno utilizar agroquímicos o

fertilizantes químicos y si es de gran importancia usar productos de origen natural

como lo es la giberelina, ya que ayuda a minimizar los costos de producción y

maximizar mucho más las ganancias en los agricultores del departamento. Y de

esta manera ayudar a prevenir mucho más la contaminación que dejan estos

agroquímicos por el uso excesivo que se les da.

JUSTIFICACIÓN

Debido a la problemática mundial existente hoy en día por el uso indiscriminado de

productos fertilizantes de síntesis química, se han implementado con el paso de

los años soluciones amigables y sostenibles que permitan disminuir el efecto

adverso generado por dichas aplicaciones; de allí que nació el uso de productos

biofertilizantes basados en la potencialización de procesos naturales donde los

actores principales son los microorganismos promotores de crecimiento vegetal

(Aguilar-Piedras, 2008).

Las plantas para su desarrollo, no solo realizan procesos fotosintéticos o toman

sustancias minerales del suelo, también llevan a cabo en su interior una serie de

procesos fisiológicos que ayudan a dicho desarrollo. De la misma manera, las

plantas también se ven afectadas y de cierta forma reguladas por algunos de los

procesos que ocurren en el suelo, la mayoría de los cuales se llevan a cabo por

los microorganismos (Pedraza et al. 2008; Molina-Favero et al. 2008).

El desarrollo normal de una planta depende de la interacción de factores externos:

luz, nutrientes, agua y temperatura, e internos: hormonas. Una definición global

del termino hormona, es considerar bajo este nombre a cualquier producto

químico de naturaleza orgánica, que sirve de mensajero y que es producido en

una parte de la planta, tiene como “blanco” otra parte de ella (Conney & Nonhebel,

1991).

Dentro de las bacterias que producen se tiene el género Azospirillum; este se

caracteriza por ser un microorganismo promotor de crecimiento vegetal, que ha

sido ampliamente estudiado, a partir de sus capacidades para generar efectos

benéficos por su inoculación a distintas especies vegetales. Sin embargo aún falta

información a nivel genético y bioquímico, de la regulación y capacidad de cada

uno de sus componentes enzimáticos presentes en procesos como la producción

de Auxinas. (Carreño-López et al. 2000; Costacurta et al. 994; Ryu & Patten, 2008;

Sergeeva, et al. 2007; Pedraza et al. 2004; Contesto et al. 2010).

Azospirillum ha sido ampliamente estudiado como bacteria promotora de

crecimiento vegetal, ya que tiene la capacidad por un lado, de producir sustancias

como sideróforos, definidos como moléculas de bajo peso molecular que

presentan una alta afinidad por Fe generando un efecto quelante en éste,

igualmente tiene la capacidad de producir bacteriocinas como sustancias

antimicrobianas que generan un efecto de control contra patógenos que puedan

llegar a atacar a las plantas (revisado en Baca, 2009; Somers et al. 2005; Borisov

et al. 2007).

Las Giberilinas son un grupo de diterpenoides que se definen más por su

estructura que por su actividad biológica, contrario a lo que ocurre con las auxinas

y las citoquininas (Yamaguchi y Kamiya 2000).

Las Giberilinas biológicamente activas, actúan como reguladores esenciales del

desarrollo de las plantas, y cubren todos los aspectos de la historia de vida de las

plantas, modulando varias respuestas del crecimiento como la germinación de

semillas, el crecimiento del tallo, la partenocarpia, la expansión foliar, la

elongación de la raíz, la floración y la liberación de enzimas hidrolíticas en algunos

tejidos (Ueguchi-Tanaka et ál. 2007). Únicamente las Giberilinas biológicamente

activas pueden cumplir con estas funciones, las giberelinas no bioactivas existen

en el tejido vegetal como precursores de las formas bioactivas, o como

metabolitos desactivado (Castro-Guerrero, et al, 2011).

La necesidad de sustituir la agricultura convencional a base de agroquímicos por

una agricultura sostenible menos agresiva con el medio ambiente, ha llevado a la

Investigación y desarrollo de nuevos productos que sean biotecnológicamente

viables con un impacto mínimo para el ecosistema y para la salud humana,

permitiendo aumentar la calidad nutricional y rendimientos de los cultivos dentro

de tecnologías más amigables con el ambiente.

Es por esto, que se hace necesario adoptar una estrategia de manejo sustentable

a través de mecanismos que favorezcan la implementación de los inoculantes

biológicos, buscando opciones económicas las cuales promuevan la reducción de

los costos de su producción. Comprender esta situación, nos lleva a buscar y

desarrollar tecnologías limpias y menos costosas que permitan mejorar la calidad

de los cultivos supliendo los nutrimentos necesarios para su producción (Young,

2008).

Es por esto, que esta investigación se realizara para buscar una alternativa que

optimice los procesos para mejorar la producción y generar inoculantes biológicos

con la misma calidad y estabilidad que los fertilizantes nitrogenados en el

mercado, contribuyendo de esta forma al desarrollo de tecnologías integrales para

la conservación del suelo y la nutrición de los cultivos de pasto y pueda ser

rentable

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la producción de ácido giberelíco a partir de bacterias nativas del

genero Azospirillum sp aisladas de suelos del departamento de Córdoba.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Multiplicar y cuantificar las bacterias nativas de genero Azospirillum sp;

Bacilos y Azotobacter, existentes en el banco de cepas del laboratorio de

Biotecnología GRUBIODEQ, teniendo en cuenta las condiciones

nutricionales de crecimiento.

Evaluar la producción del ácido giberelíco por el método de reactivo ácido

fosfomolíbdico (folling-wu).

Seleccionar las mejores bacterias teniendo en cuenta la producción de

ácido giberelíco.

MARCO TEÓRICO

BACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO

Definición

Las bacterias promotoras de crecimiento en vegetales (PGPRs) son un grupo de

diferentes especies de bacterias que pueden incrementar el crecimiento y

productividad vegetal (Bashan y Holguín, 1998). Dentro de los microorganismos

promotores de crecimiento vegetal se clasifican una gran variedad de géneros

dentro de los cuales se incluyen Azospirillum, Azotobacter, Pseudomonas,

Bacillus, Rhizobium (Baca, 2009; Klopper, 1993).

Son capaces de colonizar los diferentes sistemas radicales de las plantas y

promover el crecimiento de éstas, pueden alterar el crecimiento de los tejidos

vegetales directa o indirectamente; indirectamente las PGPR juegan un papel

importante en la disminución o prevención de otros fitopatógenos que puedan

atacar las plantas, mientras que las directamente las PGPR promueven el

crecimiento de la planta al sintetizar compuestos (por ejemplo reguladores del

crecimiento vegetal) que le facilita a la planta la toma de nutrientes del ambiente

(Gray & Smith, 2004).

Historia de Azospirillum Sp; Azotobacter y Bacilos: Spirillum lipoferum, ahora

llamado Azospirillum, fue descrito por primera vez en 1925 por Martinus Willem

Beijerinck, luego de lo cual la bacteria permaneció en el olvido por varias décadas.

Las observaciones de Juan José Peña-Cabriales y Johanna Döbereiner en 1973,

inician la época moderna de este microorganismo.

Hiltner en 1904, observó por primera vez la acumulación de microorganismos en la

zona radical y propuso el término rizósfera. Los exudados radiculares,

conformados por sustancias diversas crean alrededor de las raíces, un ambiente

nutricional enriquecido que favorece el crecimiento bacteriano.

El género Azotobacter pertenece a las familias Azotobacteraceae que agrupa

bacterias Gram negativas, quimioheterotrofas, aerobias estrictas, capaces por sí

solas, de fijar nitrógeno molecular. (Holt, et al, 1994; Ramos, 1992; Espín, 2000).

Fue descrito por primera vez por Beijerinck (1901) y en la actualidad incluye seis

especies: A. chroococcum, A. vinelandii, A. beijerinckii, A. nigricans, A. armeniacus

y A. paspali (Ramos, 1992).

El género Bacillus, es un grupo extenso y muy heterogéneo que abarcaba más de

80 especies de bacterias (Euzeby, 2008), permaneció intacto hasta el año 2004,

cuando fue dividido en varias familias y géneros en base a estudios del RNA de

cadena simple (Blackwood et al, 2004).

Generalidades Género Azospirillum sp; Azotobacter; Bacilos: El género

Azospirillum sp, es una bacteria Gram negativa, perteneciente a la subclase alfa

de las proteobacterias, en el orden de las Rhodospirillaceae, dentro de sus

principales características.

Las bacterias del género Azospirillum sp, tienen la capacidad de producir auxinas,

citoquininas y giberelinas en medios de cultivo. No obstante, el mecanismo

analizado con mayor amplitud ha sido la producción de auxinas, que puede

modificar el contenido de fitohormonas de las plantas conduciendo a la

estimulación del crecimiento de las mismas, como el caso del Ácido Indol Acético

(AIA), el cual induce al aumento de pelos radiculares, logrando una mayor

captación de nutrimentos.

Las bacterias del género Azotobacter forman un grupo especial de

microorganismos fijadores de nitrógeno, se multiplican rápidamente y

proporcionan muchas ventajas, como regular el crecimiento de las plantas,

producir hormonas vegetales y favorecer la solubilidad de la materia orgánica

agregada al suelo como abono (Mishustin & Shilnikova, 1969; Ramos, 1992).

Existe considerable evidencia que apoya el rol especifico de Bacillus sp. En la

solubilización del fosforo. Sin embargo, no todos los ensayos de laboratorio o de

campo han dado resultados positivos. La eficiencia de la inoculación variaría con

el tipo de suelo, el cultivar específico y otros numerosos parámetros. El contenido

de P en el suelo sería probablemente uno de los factores cruciales en determinar

la efectividad del inoculante (Rodríguez y Fraga, 1999).

Metabolismo de Azospirillum sp; Azotobacter; Bacilos: Las especies de

Azospirillum sp, difieren en su capacidad para utilizar diferentes compuestos como

fuentes de carbono y nitrógeno. Estas bacterias usan para su crecimiento unos

pocos monosacáridos y disacáridos así como alcoholes polihidroxilados, y

principalmente diversos ácidos orgánicos tales como málico y succínico y algunos

aminoácidos (Hartmann & Burris, 1988). Para el uso de diferentes fuentes de

carbono, tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen todas las enzimas de la vía

de Embden-Meyerhof-Parnas y de la vía de Entner-Doudoroff (Westby et al, 1983),

así como todas las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Martínez et al,

1984). Tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen la capacidad de crecer

autotróficamente con H2 y CO2, proceso en el que participa la ribulosa-1,5-

difosfato carboxilasa (Tilak et al, 1986).

La capacidad de Azotobacter de estimular el crecimiento de las plantas ha sido

comprobada por numerosos investigadores. Además de la fijación de nitrógeno,

otras propiedades tales como la capacidad de solubilizar fosfatos, la producción de

reguladores del crecimiento, vitaminas, sideroforos y sustancias antifungicas son

considerados como responsables del efecto positivo sobre los vegetales.

Algunos autores postulan que la producción de auxinas y otros reguladores del

crecimiento vegetal podrían ser el mecanismo principal que explicaría los efectos

beneficiosos de Azotobacter (Zahir et al., 2005).

Efectos de factores fisicoquímicos sobre Azospirillum sp; Azotobacter, Bacilos:

Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo óptimo y bajo

condiciones adecuadas de incubación, ocurre un incremento en el número de

células en períodos muy cortos. En algunas especies se alcanza la población

máxima en 24 horas, en cambio, en otras se necesita un período más prolongado

para alcanzar el máximo desarrollo; para determinar el desarrollo se necesita

medir cuantitativamente la población de células al tiempo de sembrar y

nuevamente después de la incubación. El ciclo de desarrollo de las poblaciones

bacterianas es el procedimiento más importante en la multiplicación de los

microorganismos (Peoples & Craswell, 1992).

pH: Azospirillum sp; el Azotobacter y los Bacilos, tiene un crecimiento óptimo en

un rango de pH de 6,5 -7,0. Si el microorganismo no cuenta con el pH

correspondiente, esto provocaría la inhibición de su crecimiento y desarrollo

(Sánchez, 1964

Temperatura: Muchas especies de Azospirillum sp; Azotobacter y Bacilos,

requieren una temperatura óptima de crecimiento cercana a los 30 ºC, excepto

para Azospirillum largimobile que presenta una temperatura de 28 ºC y

Azospirillum halopraeferens 41º C. La modificación de la temperatura, tiene un

efecto notable sobre un proceso. Si el valor utilizado no es adecuado puede

disminuir o aún impedir la formación de un metabolito determinado (Scragg, 2000).

Además, la temperatura puede modificar los requerimientos nutritivos de algún

microorganismo, lo que significa que al modificarse el valor de un factor puede

cambiar los requerimientos de otro.

LA GIBERELINA: Son reguladores del crecimiento de las plantas superiores que

regulan numerosos aspectos del desarrollo vegetal. Ellas promueven el

crecimiento celular debido a que incrementan la hidrólisis de almidón, fructanos y

sacarosa con lo que se originan moléculas de fructosa y glucosa.

Las respuestas que producen o modulan las Giberilinas afectan tanto la regulación

del crecimiento reproductivo de la planta (Azcon & Bieto, 2000). Ellas son

determinantes en el control de la elongación del tallo, también modifican

sustancialmente los procesos reproductivos de los vegetales, participando en el

control del inducción de la floración, en la producción, crecimiento, y desarrollo de

los frutos. Así mismo sustituyen los requerimientos de luz o frio que precisan

muchas de las semillas para germinar (Azcon & Bieto, 2000; Salisbury, 1994).

Para determinar las Giberilinas se usa el método Reactivo de folling-Wu (ácido

fosfomolíbdico); es un método utilizado en la detección de Giberilinas, como un

método sencillo y practico de detección, basado en la reacción de reducción que

presenta el ácido molíbdico frente a soluciones de ácido giberelíco a diferentes

concentraciones. La reacción de reducción ocasiona un cambio de color del

reactivo a azul mostrando la reducción ocasionada por la presencia de Giberilinas

en la solución (Graham & Henderson, 1960)

DETECCIÓN COLORIMETRICA DE GIBERELINAS: REACTIVO ÁCIDO

FOSFOMOLÍBDICO (FOLLING-WU) (Graham & Henderson, 1960)

La reacción colorimétrica a base del reactivo Folling Wu (ácido fosfomolíbdico),

es un método utilizado en la detección de Giberilinas, como un método sencillo y

practico de detección, basado en la reacción de reducción que presenta el ácido

mólibdico frente a soluciones de ácido giberélico a diferentes pH. La reacción de

reducción ocasiona un cambio de color del reactivo a azul mostrando la reducción

ocasionada por la presencia de Giberilinas en solución.

METODOLOGÍA

El trabajo se realizará en el laboratorio de Biotecnología del Departamento de

Química, (GRUPOBIODEQ) de la universidad de Córdoba.

Esta investigación se realizara siguiendo una serie de etapas; estas son:

1. PRIMERA ETAPA: Multiplicar las bacterias nativas de género Azospirillum

sp; Bacillus y Azotobacter sp, existentes en el banco de cepas del

laboratorio de Biotecnología GRUBIODEQ, teniendo en cuenta las

condiciones nutricionales de crecimiento para cada género.

Obtención de las muestras:

Se utilizaran cepas aisladas pertenecientes al banco de muestras del laboratorio

de Biotecnología GRUBIODEQ de la Universidad de Córdoba. Los

microorganismos serán activados utilizándose como medio de cultivo: Nfb; de

acuerdo a lo anterior, se comenzará con la inoculación de los microorganismos y

seguidamente se hará una dilución de dicho inóculo (Solución madre), para así

determinar la cantidad de células de las que se partirá teniendo en cuenta sus

condiciones nutricionales para cada género.

Aislamiento:

Para el aislamiento de bacterias de los género Azotobacter sp, Azospirillum sp, y

Bacillus. Se procederá de la siguiente manera: una vez colectadas las muestras,

se harán sucesivas diluciones y luego se sembraran pequeñas cantidades de

estas diluciones en cajas de petri con medio de cultivo (Nfb, selectivo para cada

género) descrito por (DÖBEREINER et al 1976). Posteriormente se realizara el

proceso de incubación de las muestras pasadas 72 horas se efectuara los conteos

de las colonias propias del género (Sánchez, 1990, Holt et al 1994).

MEDIO DE CULTIVO NFB (Dobereiner et al, 1997)

El medio de cultivo que se utiliza para realizar los bioensayos de crecimiento, será

el NFB, que se usa en la multiplicación de bacterias del género Azospirillum sp,

Bacillus y Azotobacter sp. El cuál es preparado pesando 0.25g K2HPO4, 0.025g

FeSO4*7H2O, 0.005g MnSO4*H2O, 0.05g MgSO4*7H2O, 0.01g NaCl, 0.005g

CaCl2, 0.001g Na2M0O4, utilizando como fuente de carbono succinato; para un

volumen total de 500mL de agua destilada y ajustamos el pH entre 6.6 a 7.0.

Luego lo colocamos en autoclave por un tiempo de 20 minutos a una temperatura

de 121°C aproximadamente, dejamos enfriar a temperatura ambiente e

inoculamos los diferentes microorganismos

SEGUNDA ETAPA: Evaluación de la producción del ácido Giberelíco

por el método de reactivo ácido fosfomolíbdico (folling-wu).

Para la identificación de los microorganismos aislados se realizará ensayos

utilizando patrones de Giberelina a diferentes concentraciones (2.5 ppm, 5.0 ppm,

25 ppm, 30 ppm, 50 ppm y 80 ppm).

DETECCIÓN COLORIMETRICA DE GIBERELINAS: REACTIVO ÁCIDO

FOSFOMOLÍBDICO (FOLLING-WU) (Graham & Henderson, 1960)

La determinación de ácido giberélico con el reactivo Folling-Wu, se realiza a partir

de soluciones stock de Giberilinas comercial Merck; a diferentes concentraciones,

buscando establecer una curva de calibración para la detección de GA3 en base al

reactivo.

Se separarán 500mL del reactivo Folling-Wu, a partir de 35g de ácido molibdico y

5g de Tugstanato de Sodio fueron agregados a un Becker de 1L, luego se agregó

200 cc de NaOH al 10% y después 200 cc de agua destilada. Calentar

vigorosamente el contenido del frasco por 40 minutos para remover cualquier

rastro de amonio presente en el ácido molibdico.

Dejar enfriar y diluir la mezcla hasta 350 cc con agua destilada y agregar 125 cc

de ácido fosfórico al 85%. Finalmente la mezcla fue transferida a un matraz de

500 cc y aforada con agua destilada.

Una vez preparadas las soluciones de reguladores de crecimiento se realizó la

evolución del reactivo, a una proporción de 3mL de la muestra por 1.8mL del

reactivo, el tiempo de relación será de 60 minutos, a baño en ebullición. El tiempo

cero será estimado luego de 2min de sumergidos los tubos, pasados los 60min se

retirarán del baño y se dejan enfriar en un baño de hielo por unos 5 minutos

aproximadamente.

De igual forma, tomaremos 10mL del inóculo a las diferentes concentraciones y se

procederá a medir en el espectrofotómetro Espectronic Thermo GENESYS 20 a

una longitud de onda de 770nm. Lo anterior se hará por triplicado.

TERCERA ETAPA: Seleccionar las mejores bacterias teniendo en cuenta

la producción de ácido giberelíco.

Se evaluará que método es el más efectivo y preciso en la selección de las

mejores bacterias en la producción de ácido giberelíco, teniendo en cuenta

precisión, repetitividad, reproducibilidad.

Precisión: La precisión mide el grado de acuerdo entre los resultados analíticos

obtenidos de una serie de mediciones repetidas del mismo analito realizadas en

las condiciones previstas en el método. La precisión refleja los errores aleatorios

que se producen cuando se utiliza un método. (Validación de métodos analíticos

AEFI 2001)

Se analizarán parámetros como:

Repetibilidad: esta se evaluará haciendo mediciones sobre 4 muestras de igual

concentración, a las cuales se les aplicará el procedimiento analítico bajo las

mismas condiciones operativas (analista, equipo y reactivos).

Reproducibilidad: se realizará a diferentes tiempos y en días diferentes y con el

mismo analista

Esta se evaluará haciendo mediciones sobre cada muestra por triplicado.

La precisión del método analítico se expresará como el coeficiente de variación

(CV) de una serie de medidas y se calculará matemáticamente con la siguiente

ecuación:

CV (%) = S/X * 100 (Ec. 1)

Dónde:

S= desviación estándar.

X=media aritmética de los resultados.

RECURSOS

MATERIALES Y REACTIVOS

Horno Tugstanato de sodio NaCl

Caja de Petri Hidróxido de sodio MgSO4*7H2O

Pipeta Analítica Ácido fosfórico MnSO4*H2O

Vidrio de Reloj GA3 de grado analítico Frasco lavador

Espectrofotómetro

Génesis 20

FeCl3*6H2O Gradilla

Pipeta de vidrio HCl Agua destilada

Autoclave Agar Pera

Becker CaCl2 campana de

esterilización

Tubos de ensayo FeSO4*7H2O Balanza analítica

Espátula K2HPO4 Agitador de vidrio

RECURSO HUMANO: Ph.D Cecilia Lara Mantilla.

INFRAESTRUCTURA

Laboratorio de investigación en biotecnología GRUBIODEQ (Programa de

Química, Universidad de Córdoba).

RECURSOS ECONÓMICOS

GRUBIODEQ (Programa de química, Universidad de Córdoba).

PRESUPUESTO

RUBROS

FUENTE DE

FINANCIACIÓN

VALOR TOTAL

REACTIVOS

Los recursos están

disponibles en el laboratorio

de investigación en

biotecnología GRUBIODEQ

(Programas de Química;

Universidad de Córdoba).

$7’000.000°°

VIDRIERÍA

$4’000.000°°

EQUIPOS:

Autoclave,

espectrofotómetro,

horno, balanza

analítica, Campana de

$9’000.000°°

esterilización.

VALOR TOTAL

$11’000.000°°

CRONOGRAMA

ACTIVIDAD

TIEMPO (MESES)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

REVISIÓN

BIBLIOGRÁFICA

RECOLECCIÓN DE

LA MATERIA PRIMA

CULTIVO DE

MICROORGANISMOS

CUANTIFICACIÓN DE

GIBERELÍNAS CON

REACTIVO DE

FOLLING-WU

ANÁLISIS E

INTERPRETACIÓN

DE RESULTADOS

REDACCIÓN DEL

INFORME FINAL

REFERENCIAS

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